（分析化学专业论文）酶催化光度法在环境及食品分析中的应用.pdf

顾士学住论文 m a s t e r st h e s i s 中文摘要 随着各种分析仪器自动化程度的提高，分析检测的灵敏度、检测限、准确度等 都得到很大的改善，然而这些仪器大都造价昂贵，且需要专门的技术人员，不利于 推广应用。此外，所面对的分析对象日益复杂，采用现代分析仪器直接测定往往比 较困难，因此需要借助各种预处理方法。如液液萃取，微波萃取、蒸馏、离心、沉 淀等，它们操作步骤繁多，处理时间长，试剂用量大，此外，在预处理中还容易损 失样品，产生较大误差。 本论文利用酶法分析方法与简单易行的紫外一可见分光光度法结合起来对环境 及食品样品进行分析检测，将其应用于雨水、白酒及唾液中有关组分的测定。样品 无需预处理，且操作步骤简便。将酶法分析方法直接应用于唾液中乙醇的测定，无 需借助分析仪器，通过反应前后溶液颜色的显著改变，即可定性判断出唾液中是否 含有乙醇，为鉴定酒后驾车肇事提供了良好的判定依据，也为商品化试剂盒的研制 作了基础性的研究，具有较强的实际意义和潜在的社会价值。本工作由以下三部分 组成： l 、采用过氧化氢酶对雨水中过氧化氢的含量进行了测定。它是基于反应产物 在5 0 5 蛐处有较强的吸收，利用此波长下的吸光度值测定过氧化氢的含量。在最佳 实验条件下，线性范围为0 0 0 3 0 0 3 0 0 0 m m o 。回收率为9 5 7 1 0 6 0 ，相 对标准偏差为1 9 9 3 5 8 。该法具有线性范围宽、操作简便、回收率高等特点。 2 、将醇氧化酶的酶促反应和过氧化氢酶的指示反应相结合，对饮酒者唾液中 的乙醇含量进行了测定。本文首次提出用酶催化光度法测定饮酒者唾液中乙醇的含 量。实验表明在最优实验条件下，钡9 量指示反应产物在5 0 5 n m 处的峰值吸收，可间 接测定乙醇的含量。本法在o 0 6 8 6 0 5 1 1 5 m m o l l 范围内呈良好线性关系，回收 率为9 2 1 1 0 3 4 ，相对标准偏差为2 6 0 3 0 6 。用于实际样品的测定， 结果满意。 3 、采用甲醛脱氢酶对白酒中的甲醛进行了测定。它是基于甲醛与n a d + ( 氧化 型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸) 的反应，后者的还原产物在3 4 0 n m 处具有最大吸光度值， 利用此波长下的吸光度值间接测定甲醛的含量。在最优化的实验条件下，测得其线 性范围为o 0 1 4 5 2 o 2 9 0 4 m m o l l ，回收率为9 6 o 1 0 3 8 ，相对标准偏差r s d 硕士荦住论文 m a s t e r st h e s i s 为1 5 0 2 3 2 。此法具有回收率高，精密度好，操作简便等特点。用于实际样 品的测定，获得满意结果。 关键词：过氧化氢；甲醛；乙醇；催化分光光度法；酶 i i a b s t r a c t w i t ht h ee n h 锄c e m e n to fa u t o m a t i o no fa n a l y t i c a li n s t n l m e n t s ，t l l ed c t e c t i o n s e 珊i t i v i t y ，d c t e c t i o nl i m i t 触da c c u r a c yh a v eb e 胁i m p r o v e df e a n y h 州c r t h e s e i n s t 叫e t sa r ea l m o s te x p s i v e ，柚dn e e dm a l l yp m f c s s i o n a lt e 删c a lp e 硌。皿d st o u s e ，s ot h e s ed j s a d v a m a g e sl i m i t 吐l e i ra p p l i c a t i o n h la d d 试o n ，我i sd i f f i c u nt 0d i r e c l y m e a 蛐r eo o m p l i c a t e da n a l y t e sw i t hm o r d e ma j l a l y t i c a li l l s m l l i l e n t s ， t h u sv a i i o u s p r e t r e a t m e n tm e t h ( ) d sa r cd e m 粕d e d s u c ht c c h n i q u e sa sl i q u i dl i q u i dc x t r a d i o n ，t h e m i c m w a v ea s s i s t e de x 打a c t i 衄， t h e d i s t i l l a t i o n ， t h e c c n t f i f i l g a l i z a t i o n ， 孤dt l l e p r e c i p i t a t i o na r et e d j o u s ，l a b o r i o u s 趾ds o l v e n t c o n s u m i n g f u n h e 皿o r e ，i l it h ep r o c e s so f p r e t r e a t m e n t ，t l l el o s eo fs 锄p l c 锄de f r o r sa r ee a s i l yb r o u g h t a b _ o u t i n t h i s s t u d y ，t h ed i r c c t d c t e c t i 傩m e t h o do f s 锄m e so f 锄m 咖璐c n t 锄d f o o d b y 也e c o m b i n a t i o no ft h ee n z y m a t i ca n a l y s i sa i l du l t r a v i o l e t v i s i b l es p e c t r o p h o t o m e 仃yh a s b e e nd e v e l o p e d i ti sa p p i i e dt oa n a l y z et h es u b s t a i 成si nr a i nw a t e r ，w i n ea n ds a l i v a t h e p m p o s e dm e t 量l o di ss i m p l e ，s e n s i 啪ea dn op r c t r c a t m e n tp r o c e s s t h ee i l z y m a t i ca i l a l y s i s i sd h c t l ya p p l i e dt od e t c c te t h a lhs a l i v aw i m o u to t h e ri n s 血豳e n l s 。w h e l h c re t h a o l i si ns a l i v ac a nb eq u a l i t a t i v e l yd e t e c t e db yt h eo b v i 叫sc h a l l g eo ft h er e a c t i o ns o l u t i o c o l o r w h j c hp r o v j d e st l l e o r e t i c a lb 雏i sf o rt h em e 嬲u r 锄e n to f 曲v i l l ga f t e rd i i k i n g 锄d m a k e so u tt 1 1 eb a s i cr e s e a r c hf b rt h ep r e p 缸a t i o no fm e r c h 弛d i s er c a 目tb o x t h em e t l l o d h a ss t 砌呜a d u a ls i 弘i f i c a n c e 锄dp o t e n t i a ls o c i a lv a l u e t l i i sw o r ki n d u d e st h r c ep a n s ： 1 ld e t e 姗i n a t i o no fh y d r o g e np e r o x i d ei nr a i nw a t e rw i t hc a t a l a s e t h ev a r i o u s a n a l ”i c a lc o n d i t i o n sa r cs t u d i e d ni sb a s e do nt h es t r o n ga b s o r p t i o no ft l i ep r o d u c ti n 5 0 5 眦，d e t e m i n et h e 锄o u n to f h y d r o g e np e m x i d ea c c o r d i gt 0p r o d u c t sa b s o r p t i o n 血 5 0 5 m u n d e tt h eo p t i m j z e dc o n d i t i o n s ，t h el i n e a ri 蛐g ci s0 0 0 3 0 0 3 0 0 0m m o l l ，t h e r e c o v e r yi s9 5 7 1 0 6 o a n dt l l er s d i sr a l l g e df r o m1 9 9 t o3 5 8 t h ep r o p o s e d m e t h o di ss i m p l e ，a c c u r a t ea n dh a sw i d el i n e a rr a n g e 2 d e t e n n i n a t i o no fe t h a n o li ns a l i v ab yu s i n ge n z y m a t i cr e a c t i o no fa l c o h o lo x i d a s e a i l di n d i c a t i v er e a c t i o no fc a t a l a s e t h ec a t a l y t i cs p e c 咖p h o t o m e t r yw i t he i l z y m ef o r d e t e 珊i n a t i o no fe t h a n o li ns a l i v ao fd r i n k e ri sf i r s t l yr 印o n e d u n d e rt h eo p t i m i z e d c o n d i t i o n s ，t h e 砌o u n to fe t h a i i o l i sm e a s u r e di n d i f e c t l yb yt h ed e t e n n i n “i o no ft h ef i n a l p r o d u c ta t 坫0 5 n m ，w l i i c hi sf o 蛳e di ni n d i c a t i v er e a c t i o n t h el i n e a r i t yi sr a n g e d 丘o m i i i 勰怒。 0 ( _ 6 8 6 0m m 0 2 ，lt o 5 1 1 5m m o j l ，出er e c o v e f yi s9 2 1 l ( ) 3 4 a n df h er s di s 2 6 0 t o3 0 6 t h eo p t i m i z e dm e t h o dc a nb ea p p l i e dt od e t e r m i n ee t h a n o li n r e a l s a m 皿e s 3 d e t 咖i i l a t i o no ff o m l a l d ej i lw i n ew i t l lf 0 姗a l d el i ”r o g e n a s e ni sb a s c do nt h e s l r o j 培a b s 唧l i 彻0 fn a d hj n3 4 踟i 1m a lj sp m d u c e db yt h er e a c t j o n0 ff o r m a l d e 柚d n a d + ，t h ea m o u n to ff 0 i l l l a l d ec 盐b ed e t e c t c d 煳r d j n gt 0n a d h sa b s o r p 晰i t yi n 3 4 0 l l m t h ec o n d i t i o n so fc x p e r i m e n t 盯ei i i v e s t i g a t e d 皿el i l i e 盯r 卸g ei s0 0 1 4 5 2 0 2 9 0 4m m 曲l ，t h er c i ，e r yi s9 6 0 1 0 3 8 0 ，柚dn l er s di sr a n g e d 纳m1 5 0 t o2 3 2 皿es i m p l em e m o di sa p p l i e dt dd e t e 肌mf o 珊a l d ei nw i i l c ，姐di t 锄o b t a i n g o o dr e s u l t sw i t hg o o dp r e c i s i a i i dh i g l lr e c o v e 珥 k e y w o r d s h y 出o g e np 口o x i d e ；硒强a l d c ；e t l l 卸o l ；口t a l y l i cs p e 吐p h o t o m e h y ；锄【z y m e i v 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：蓐鼍仅 日期： 。6 年5 月，1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 作者签名：离丽莨 日期：d 6 年5 月， 日 导师签名 日期：0 6 年步刖7 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。固意迨塞握窑唇滥蜃! 旦圭生i 旦二生i 旦三生蕴查! 作者签名： 日期：年月 日 导师签名： 日期：年 月日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s 1 1 引言 第一章绪论 约在1 4 0 年前，人们就发现了酶的存在。自从1 9 2 6 年，j s u m n e r 第一次从刀 豆中提取制备出结晶的尿酶( 尿酰胺水解酶，e c 3 5 1 5 ) 以来，有许多酶陆续被 提纯。二十世纪以来对酶的应用和研究有着急速的发展，酶的化学本质、作用机理 等基础研究也取得了不少成就。此外，在酶化学结构研究的基础上，已进一步开展 了酶的空间构象，酶分子的结构与功能关系的研究，并在酶的化学修饰、酶的改性 等方面作了许多工作。酶以其独特的优势一催化能力的高效性和特异性，在医疗 诊断、工农业生产、化学研究等领域广泛应用。 人们将酶从生物体内提取出来或人工合成，对其进行含量或活力测定，此种分 析称为“酶活力测定”，它是生物化学研究的一个重要分支。而将酶作为一种分析 工具或分折试剂，用以测定样品中一般化学方法难以分离检测的物质的方法称为酶 法分析，此种方法广泛应用于化学研究领域。这些难以分离检测的物质可以是酶的 底物、酶的抑制剂、活化剂、或是酶的辅助因子等。二者虽然目的不同，但都需要 利用分析测试方法进行检测。常见的分析方法有气相色谱法、高效液相色谱法、化 学发光法、荧光法等，这些方法均需要昂贵的仪器和专门的分析人员，而分光光度 法所用仪器简单，操作方便，更易于普及应用。它应用于酶法分析上，即为酶催化 分光光度法。 随着科技的发展，酶催化光度法与各种分析技术进行联用，显现出更大的优势。 例如：与流动注射分析法联用，具有分析速度快、重现性好、节省试剂、自动化程 度高等特点，例如f ：l a z a r o 【1 】采用流动注射技术与酶法相结合，用分光光度法单独 和同时测定了酒中的乙醇和乙醛。f o r s t e r 【2 j 将酶催化分光光度法与停留技术联用， 测定了纳克级的醇混合物。此外，近些年来，随着交叉学科的发展，在放射免疫学 分析法的基础上又兴起了酶联免疫分析法，该法与分光光度法联用的文献报道甚 多，已广泛应用于食品安全、环境监测、生物医疗等方面。 1 2 酶催化作用的机制f 3 】 酶具有催化效率高，反应条件温和，对底物有较强选择性，以及不发生副反应 等显著的优点。酶之所以具有这种特点，可以用目前比较公认的中间产物学说的理 论进行解释。酶( e ) 在发挥催化作用时，首先与底物( s ) 特异地结合，生成不稳 硕士学位论文 m a s t e r l st h e s l s 定的酶一底物复合物( e s ) ，然后，e s 再分解为产物( p ) ，并释放出酶，酶又可以 与底物结合，继续发挥作用。可用下式表示： e + s 斗e s e + p 酶底物复合物的形成，可用诱导契合学说解释：酶与底物接触时，相互诱导， 其结构发生变形以相互适应，进而结合成复合物，这一过程称为酶一底物结合的诱 导契合作用，见图1 。如果不是酶的底物，上述过程不能发生。因此表现出上述反 应的高度特异性。 底糟 + s 复音体 图l 诱导契合学说示意图( a ，b ，c 为酶的契合基团) 酶之所以具有很高的催化效率，就是它能够降低活化能，我们可以用图2 进行 解释。 酶反应的底物具有一定的活化能，当底物和酶结合成过渡态的中间复合物时， 要释放部分结合能，这部分能量的释放使得过渡态的中间物处于比e + s 更低的能 级，因此使整个反应的活化能降低，使反应大大加速。 分 子 能 量 图2 非催化过程与催化过程的自由能变化 2 反应过程 硕士学住论文 m a s t e r st h e s i s 1 3 酶催化作用的特性 酶和一般化学催化剂一样，它能够改变化学反应的速率，但是不能改变化学反 应平衡。酶能够稳定底物形成的过渡态，降低反应的活化能，从而加速反应的进行， 所以一般的化学催化理论和规律，同样适用于生物催化体系。但是它又是一类特殊 的蛋白质，在生物体内不仅作为各种复杂生物化学反应的催化剂，而且也作为生物 体内不同能量之间转换的中间体。与普通化学催化剂相比，它具有以下几个方面的 特性： 1 、高效性 在一个化学反应体系中，只有具备一定能量的底物分子( 即活化分子) 才能发 生化学反应。而活化分子的数量与反应所需的活化能有关，反应所需的活化能越低， 活化分子越多，化学反应的速度就越快。酶能显著降低化学反应所需的活化能，因 此催化效率极高，比一般化学催化剂的催化效率高1 0 7 1 0 ”科4 】。 2 、选择性 酶对其催化底物的选择性又称为酶的特异性，其特异性表现在以下两个方面： ( 1 ) 反应专一性：酶一般只能选择性地催化一种或一类相同类型的化学反应， 酶催化的反应几乎不产生副反应。 ( 2 ) 底物专一性：一种酶只能作用于某一种或某一类结构相近、性质相似的 物质。根据酶对底物专一性的程度和类型，大致可分为以下三类：结构专一性、手 性专一性和几何专一性。 3 、反应条件温和 酶催化反应一般在p h = 5 8 的水溶液中进行，反应温度范围为2 0 4 0 ，由 于反应条件温和，使某些不希望的副反应，如分解反应、异构化反应和消旋化反应 等可以尽量减少。由于酶本身是蛋白质，高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引 起酶的失活。 4 、酶反应容易控制 酶反应条件容易控制，可以通过调节p h 、温度和添加剂等方法来控制酶反应 的进行。 1 4 酶分析法的分类 1 4 1 动力学分析法 动力学法是对酶促反应的速度以及反应速度的影响因素进行研究的一种方法。 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 这些因素主要包括酶的浓度、底物的浓度、p h 、温度、抑制剂和激活剂等。它基于 的原理即为米氏方程 v = v 【s 】( k m + 【s 1 ) 其中v 指反应的初速度，k m 指米氏常数，【s 】指底物浓度。 采用此法进行分析时需制备两条曲线，酶反应进程曲线和酶浓度曲线，从前者 求得反应初速度，根据初速度绘制酶浓度曲线。并通过后者来检验酶反应系统是否 适宜，只有在反应开始很短时间t o 内测得的反应速度和酶浓度间才具有合乎要求的 线性比例关系。 1 4 2 终点测定法 借助某种酶作用，使被测物质定量地进行转变，然后在转换完成后，测定底物、 产物或辅酶等物质的变化量的方法称为终点测定法。采用该法一般要注意以下几 点：( 1 ) 酶的底物的专一性；( 2 ) 反应液中的酶量；( 3 ) 反应的平衡。该法又分为 单酶反应定量法和偶联酶反应定量法。 1 4 2 1 单酶反应定量法 单酶反应只需要一种催化酶，如下式所示： 底物( s ) 鸟产物( p ) 用这种反应作定量检测分析时，可以测定底物的减少量，也可以测定产物的增 加量。对将辅酶作为酶反应的反应物时，测定其辅酶的变化量也是有效的方法。 1 4 2 2 偶联酶反应定量法 当单酶反应产物和原始底物用物理化学手段无法区别时，往往可借助另一种酶 作为指示酶，通过偶联反应进行定量分析。 a _ 王岭b ! l c 通常为脱氢酶，当然也可用氧化酶、过氧化物酶等酶。 例如用葡糖氧化酶钡4 定葡萄糖时，在反应过程中产生h 2 0 2 ，便可借助指示反应， 即根据无色的染料隐色体( 如邻联( 二) 茴香胺) 生成有色的染料进行测定。 酶促反应；萄糖+ h ：。+ 0 2 苎堇竺萄酸+ h ：。： 指示反应： h 2 0 ：+ 无色染料( 隐色体) 塾墨些塑堕 h ：o + 有色染料 测得有色染料的吸光度即可表示葡萄糖实际浓度。 4 硕士学位论文 m a s t e r s t h e s i s 此种方法多用于酶促反应中底物浓度的测定。 1 4 3 酶标免疫测定法 酶标免疫测定法是7 0 年代在放射免疫分析法的基础上发展起来的一种新的免 疫分析方法1 5 - 9 j ，它将酶催化反应的放大作用和抗原抗体亲和反应的高专一性、特异 性相结合，以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫测定方法。 该法通过化学的方法将酶与抗体或抗原结合起来，形成酶标记物；或通过免疫 学的方法将酶与抗原抗体结合起来，形成免疫复合物。结合在酶标记物或免疫复合 物上的酶在遇到相应的底物时，催化其发生水解、氧化或还原反应，形成有色的或 发光的或荧光的产物，然后通过不同的分析方法进行定性、定量测定。该法主要应 用于生物医学领域。 因为酶是一种催化剂，它只能影响反应的速度，但不改变反应的平衡，因此其 活性必须用动力学法( 即速度法) 测定，或者通过直接滴定其活性中心的方法加以 测定f “。同样，对于能影响酶催化效率的激活剂或抑制剂，也只能根据速度的变化 进行检测。然而，底物既可以用终点法也可以用动力学法测量。终点法对分析仪器 自动化程度要求不高，但动力学法是测量反应的初速度，又受p h 、温度、离子强 度以及时间等因素的影响，故实验条件必须要严格控制，方能获得良好效果【1 l _ 1 2 】。 其实这两种方法的准确度和精密度是相差无几的【1 3 1 ，终点测定法在实际应用中较动 力学分析法更为广泛。而酶标免疫测定法则要求选择合适的抗体或抗原，相对于以 上两种方法来说，它的灵敏度最高，其检测下限可达到n g 甚至p g 级水平。 1 5 酶催化反应的测定方法 酶分析法包括两种类型：一是直接测定样品中所含的酶含量或酶活力；二是用 酶测定样品中某种物质的含量，这种物质一般为酶的底物、酶的抑制剂、活化剂、 或是酶的辅助因子等。二者虽然目的不同，但都需要利用酶反应，采用分析测试方 法进行检测，其测定方法有多种，一般多见于电化学法、旋光测量法、荧光法、化 学发光法、放射化学法及紫外一可见分光光度法等。 1 5 1 电化学法 在酶法分析中，根据检测方式的不同，电化学法有离子选择性电极法、微电流 电位法、电流法、电量法和极谱法，它们是将酶固定在电极上制成酶电极即酶传感 器予以测定。其原理是将固定化酶或固定化细胞的酶涂布在电极的敏感膜上，通过 酶催化作用，与底物进行特异性反应而产生化学信号，然后将其转化成电信号，我 们可以通过电位、电流、电导、电量等变化定量测定某个化学变化。近些年来，人 们建立了电化学酶联免疫分析法，该法减少了繁琐的酶固定化步骤，并且也能快速 灵敏地对样品进行分析检测。其原理是将酶联免疫吸附分析同酶催化产物的电化学 检测相结合，根据某些酶催化底物而生成的产物具有电活性的特征，采用多种电分 析化学方法进行测定。表1 列出了酶法与电化学法联用分析各样品的实例。 表1 电化学法检测各样品的实例 测定物质样品 线性范围参考文献 t m v 、t r s v p s a 氯苯类 总甲状腺素 类风湿因子 亚硫酸酯 磷酸酯 t m v 烟草 血清 血清 血清 血清 酒 过氧化物酶 铁蛋白血清 过氧化物酶 耶e a b 血清 h b c a b 血清 青霉素 c a l 5 3 山 乙酰胆碱 杂色曲酶素 维生素 辣根过氧化物酶1 m v tmv 1 0 5 0 n 咖l 0 0 2 1 _ o ug ，l 0 叭1 0u g ，m l 0 5 3 2 0 岫班 1 2 5 2 0 o u ，m l 1 1 0 - 5 2 1 0 3 m o l ，l 2 1 旷5 1 0 4i n o l ，l 0 2 5 5 0 0 0 l l 咖l 2 5 1 旷 5 0 1 0 4 m u i o 2 5 3 2 0 咖l 2 5 2 5 1 0 2 m u l 0 0 5 0 9 0 n i l o l l 1 5 0 2 5 0 u h l 4 0 x 1 0 2 1 0 1 0 6 m u ，l o 2 1 0 0pl i l o l l 8 3 2 1 0 。5 6 6 5 6 1 0 4 m 咖l 1 3 0 0 n 咖l 1 0 l o 。6 1 o 1 0 4 牡 2 5 o 3 4 0 0 l l 咖l 1 5 2 旋光测量法 由于许多酶仅能催化底物的一种光学异构体，并使之生成一种无旋光性的产 物，因此该反应即可依据旋光度的变化来跟踪。同样地，由无旋光的底物生成有旋 光的异构体也易于检测。如以糖类为底物的某些酶，像蔗糖酶之类，仅需一台市售 h 坫m 他 殂 丝m巧拍打勰凹n 的带恒温水管的旋光计即能进行检测。若底物或产物的旋光度太小，致使不能直接 测量时，则可通过生成络合物来提高旋光度。例如乳酸及其他羟基酸与钼酸生成的 络合物，就具有很高的比旋光度。 1 5 j 荧光法 荧光法是利用底物或酶反应生成物所产生的荧光，对待测物质进行定性和定量 分析，它的灵敏度高，与分光光度法相比，荧光是从入射光的直角方向检测，即在 黑背景下检测荧光的底物，所以其灵敏度要比紫外可见分光光度法高2 4 个数量 级，而且试样用量少，方法简便，但不能用目测的方式定性分析，只能借助特殊的 仪器设备。表2 列出了酶法与荧光法联用分析各样品的实例。 表2 荧光法检测各样品实例 7 硕士擘住论文 m a s t e r st h e s i s 1 5 4 化学发光法 化学发光是指某些物质在进行化学反应时，吸收化学反应过程中产生的化学 能，而使分子激发所发出的光。如果底物通过酶的转化，生成化学发光的产物，然 后再进行化学发光反应，根据化学发光强度就可以测定出底物含量。化学发光法的 灵敏度高，检测下限可达p g m l ，而且仪器简单，无放射性污染，检测周期长，线 性范围宽。表3 列出了酶法与化学发光法联用分析样品的实例。 表3 化学发光法检测各样品实例 硕士学住论文 m a s t e r st h e s i s 1 5 5 放射免疫法 酶的活性可以采用同位素标记的方法进行测量，经过酶解后产生含放射性的产 物，随时间所生成的放射性产物含量与酶浓度成正比。表4 列出了酶法与放射免疫 法联用分析样品的实例。 表4 放射免疫法检测各样品实例 1 6 酶催化光度法 1 6 1 概述 1 8 5 2 年，比尔( b e e r ) 提出了光强度与吸收介质中吸光物质浓度之间的关系【黯】， 继比尔定律之后，分光光度法在定性和定量分析上得到了快速的发展。早期主要集 中在无机化学领域，即对为数众多的无机离子和化合物进行定性和定量分析【跚。有 机物的光度分析较无机物晚，但发展迅速，已经从定性、半定量分析发展到定量分 析，方法的灵敏度和选择性也有了很大的提高，能够用光度法进行分析测定的物质 种类也在不断增加1 9 0 9 2 1 。 将分光光度法应用在酶法分析上，即为酶催化光度法，它是一种先通过酶反应 生成或减少某一种特定物质，然后将它们放在紫外光、可见光或近红外区段的光路 中，最后根据它们对相应波长光的吸收程度进行检测定量的方法。该法具有设备简 单、实用性强、操作简便、准确度高、精密度好及选择性好的特点。此外该法还具 有干扰少或干扰易消除、维修方便、几乎无运转费用等优点。它可与流动注射i ”、 停留技术【2 j 等联用，使得方法的精密度、检测限得到很大提高，从而也扩展了其应 用范围。 9 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 6 2 酶催化光度法实验条件的优化 l ，6 2 1 温度的影响 酶反应对温度十分敏感，因为温度能直接影响化学反应速度，也能影响酶的稳 定性，还可能影响酶的构象和酶的催化机制。温度升高，反应速度加快，温度降低， 反应速度减慢。酶催化反应在一定温度范围内也服从这个规律，但酶是蛋白质，温 度升高，则蛋白质变性速度也加快，从而使反应速度降低或使酶完全失去活性。在 酶催化反应中使反应速度加快与酶失活这两个相反的因素是同时存在的，在温度低 时，前一影响较大，所以反应速度随温度上升而加快：当温度继续上升时，则酶蛋 白变性这一因素占主导地位。因此随着酶的有效浓度的减小，反应速度也减慢。我 们就将酶促反应速度最大时的温度称为最适温度，但酶催化反应的最适温度并非一 个恒定不变的常数，而是与反应所需的时间有关，如反应时间越短，则酶的最适温 度也可以提高。 1 6 2 卸h 的影响 | i + 能对酶产生多种影响：它可能改变酶活性中心的解离状况，升高或降低酶的 活性；也可能破坏酶的结构与构象导致失效；还可能作用于反应系统的其它组成成 分，影响酶反应，甚至改变可逆反应进行的方向。例如，乳酸脱氢酶反应在p h 为 7 时向乳酸生成方向进行，而在p h 为1 0 时则倾向于丙酮酸的形成。因此溶液的p h 值对反应的影响很大，所有的酶反应都有一个最适p h ，这是酶作用的一个重要特 征，但它并不是一个特有的常数，它受许多因素的影响，如酶的纯度、底物的种类 和浓度、缓冲剂的种类和浓度等。 1 。6 。2 3 辅助因子的影响 辅助因子包括酶的激活剂、抑制剂、稳定剂等。激活剂即能提高酶的活性，加 速酶反应的进行；抑制剂则是降低酶的活性甚至使酶完全失活：而稳定剂则能使酶 具有更强的稳定性，不易失活。这些因素均对酶的活性产生影响，从而也影响着酶 催化反应。 1 6 0 酶催化光度法在分析化学上的应用 酶是生物体产生、并在体内发挥作用的生物催化剂，但是随着酶学的发展，人 们将它们从机体提取出来或者直接人工合成进行固定化，现已广泛应用于许多领 域。表5 列出了酶催化光度法在分析化学中的应用实例。 1 0 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 表5 酶催化光度法检测样品实例 1 ，6 3 1 医药与生物样品分析 生命现象在某种意义上说是由多种酶催化的连续化学反应，因而其中一种酶的 缺失也会给代谢过程带来严重影响，而这些影响又都和疾病的症状联系起来，所以 借测定生物体内酶的活性水平或用外源酶来分析生物体内的组成成分，对医疗诊断 具有重要意义。 1 6 3 2 食品安全检测 对于原料基本上来源于生物的食品来说，其食品的质量很大程度上取决于原料 和加工、贮存以及运输等方法。因为这些生物体内还有许多酶残存着，因此可以通 过测定这些酶的活性予以判断食品原料或新鲜食品的成熟程度与新鲜度，进而也可 用作判断收获期及保存是否适宜，加工是否符合要求的有力指标。对于某些食品， 也可通过分析生物体内含有的特定化学成分进行安全检测。此外，酶催化光度法也 可检测出混入食品中的污染物和毒物。 1 6 3 3 环境分析 人类的生存环境正在急剧变化，对大气、土壤、水资源等污染物的分析是现代 分析学的一个重要任务。在环境污染物质中，有的成分复杂，且需检测的都是微量 或超微量的物质，运用酶分析法将分光光度法相结合，则减少了样品预处理的繁冗 操作。有的物质对特定酶可显示强大的抑制作用，因而通过研究对这种酶活性的影 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 响程度就可知道环境的污染程度。例如在农业上长期使用的对硫磷( 马拉磷) ，它 是胆碱酯酶的非竞争性抑制剂，因此以乙酰胆碱为底物进行胆碱酯酶反应时，如果 存在对硫磷，那么酶活性就会降低，根据下降的程度可以对对硫磷进行定量分析。 1 7 本论文的选题思想及主要内容 如今，随着各种分析仪器自动化程度的提高，分析检测的灵敏度、检测限、准 确度等都达到很大的改善，然而面对日益复杂的分析对象，采用现代分析仪器直接 测定往往比较困难，因此需要借助各种预处理方法。如液液萃取、索式提取、层析、 蒸馏、离心、沉淀等，它们操作步骤繁多、处理时间长、试剂用量大，此外，在预 处理中还容易损失样品，产生较大误差。 本论文则利用生物酶分析方法与简单易行的紫外可见分光光度法结合起来对 环境及食品样品进行分析检测，将其应用于雨水、白酒及唾液中有关组分的测定。 此外，本论文的研究具有较强的实际意义和潜在的社会效益，尤其是对唾液中乙醇 的测定，通过反应前后溶液颜色的显著改变，可更为直观地定性或定量测定出饮酒 者唾液中乙醇的含量，为鉴定酒后驾车肇事等提供了良好的判定依据，同时，也可 为商品化试剂盒的研制作基础性的研究。本论文的主要内容有以下三个方面： ( 1 ) 利用过氧化氢酶对过氧化氢的高度选择性，探讨了实验的最优条件，可 直接对雨水中微量过氧化氢进行分析测定。 ( 2 ) 利用醇氧化酶的酶促反应和过氧化氢酶的显色指示反应，在第一部分的 条件实验研究基础上，进一步优化了介质p h 值、反应温度、时间和酶用量等实验 条件，对饮酒者唾液中乙醇的含量进行了测定。 ( 3 ) 利用甲醛脱氢酶对甲醛的高度选择性，探讨了实验的最优条件，直接用 于酒中微量甲醛的检测分析。 硕士学住论文 m a s t e r st h e s i s 参考文献 【1 】k a r 0 ，f ；l u q u ed ec a s 咖，m d ；v a l c a r c e l ，m 爿n 口fc h 妇血招1 9 8 6 ，1 8 5 ：5 7 6 4 【2 】f 0 临t c r ，e _ ；s i l v a ，m a i i u e l ，m o ；爿n 口f 国砌爿c f 。1 9 9 3 ，2 7 4 ：1 0 9 1 1 6 【3 】李宗根，黄平，竺笏纪学与莹发术( 第一版) ，人民卫生出版杜，2 0 略 f 4 】古练权，许家喜，段玉峰，垡笏纪学( 第一版) ，高等教育出版社，2 0 【5 】a v r 锄e 瞩s ；n a 】【锄e ，p k ；p a p a l l l i 叫l ，m ；2 见缸墙d 厂砌m 柳d 吼册口如i 酗眺鹤 a l n s t e r d a m ，e l s e v i e r 1 9 9 2 【6 】n 9 0 ，t t ；h l l 咀h m 二砌母铆8 - 胁枥脚加州堋置则；n e wy o i k ：p l e 肌m ，1 9 8 5 【7 】1 t i j s p 斗馏c 出g 朋d 刀l 即wd ，勘习栅e 砌m 蛐d 口船缈a m s t e r d a m ：e l s e v ie r 1 9 艏 【8 】k e m 伽y ，a ；c h a l l c o m b e ，s j 刃洳口耐d 腩e r 勋胞珊厦站砌研m d 4 础哆声? 劢已d 枷 c 口f4 积a 硷c 矗f 4 胖c 纽c h i d l c s t e f ：w i l e y ，1 9 嬲 【9 】g o s l j i l 舀j p ；e ta 1 a d e c a d eo f d e v e l o p m e n t i n i m i l l u n o 嬲s a ym e t l l o d o l o g y a 加 c h 硎，1 9 9 0 ，3 6 ：1 4 0 8 f 1 叫巳d 翘g c r b f ；b u r b a u m ，s n ；s a c k ，r a ；姐d 娜r a g 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】张书圣，韦璐，刘澄凡，分析实验室，1 9 9 6 ，1 5 ( 3 ) ：1 0 - 1 3 【2 4 】李青山，刘铠，张嗣良，华南理工大学学报，1 9 9 5 ，2 1 ( 2 ) ：1 6 1 1 1 4 【2 5 】z h a n g x l ；p e n g ，x w ；血，w r r ；爿n 讲凸泐彳c 帆2 0 0 6 ，5 5 8 ：1 1 0 - 1 1 4 【2 6 】焦奎，孙伟，王海玉，分析化学，2 1 ，2 9 ( 1 0 ) ：1 1 7 4 1 1 7 7 【2 7 】叶惟冷，马晓峰，梅镇彤，色谱，1 9 赔，1 6 ( 5 ) ：3 7 5 3 7 8 【2 8 】姚冬生，文胜梅，刘大岭，生物工程学报，2 呻4 ，2 0 ( 4 ) ：6 0 1 6 0 6 f 2 9 】g u 0 ，l h ；g ，x q n 口舾f ，2 0 0 s ，1 3 叩) ：1 0 2 7 - 1 0 3 1 【3 0 l 焦国嵩，朱丽华，要虹，青岛科技大学学报，2 0 咐，2 5 ( 2 ) ：9 8 1 0 1 【3 1 】焦奎，要红，徐铮，中国科学b 辑，2 0 0 4 ，( 1 ) ：8 1