（微生物学专业论文）已糖转运子hxt7p对酿酒酵母生长及发酵的影响.pdf

浙江大学硕士毕业论文 摘要 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的己糖转运子对酿酒酵母的生长和酒 精发酵具有重要的作用。本文研究的是尼搬基因中编码高亲和力转运因子h x t t p 的册基因( h e x o s e t r a n s p o r t e r g e n e ，己糖转运子基因) 根据同源重组的原 理，i j j , p u g 6 质粒中的c r c l o x p 系统将z s 1 3 菌株携带的h _ x t 7 基因敲除，并在敲除 的位置插入报告基因肠聆倒( 卡那霉素抗性基因) 将聊基因从z s 1 3 菌株中 克隆，然后转x p u g 6 质粒，并在其开放阅读框的上游插入强启动子p g k 来实现 过表达即盯7 基因。 将改造过的菌株进行酒精发酵，并测定其生长曲线以及发酵动力学发现 缺失聊基因n z s 1 3 菌株在发酵末期对糖的摄入率降低，而过表达该基因则使 得该菌株能够较多的摄取底物中的己糖。但是己糖摄入量的改变并未明显的影 响到酒精及甘油的产量，在后继工作中应该引入代谢流的研究，以期将多吸收 的己糖尽可能的转化为乙醇。 关键词 己糖转运基因；基因敲除；过表达；g 4 1 8 筛选；酒精发酵；残糖 a b s t r a c t 浙江大学硕士毕业论文 t h eh e x o s et r a n s p o r t e r so fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea r eo fi m p o r t a n c et oi t s g r o w t ha n da l c o h o l i cf e r m e n t a t i o n i nt h i ss t u d y , w ef o c u so nh x t 7g e n ew h i c h e n c o d e sah i g h a f f i n i t yh e x o s et r a n s p o r t e rh x t 7 p b a s e do nt h ep r i n c i p l eo f h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n , t h ed e l e t i o nw a sc a r r i e do u tb yu s i n gt h ec r e l o x ps y s t e m o b t a i n e df r o mp l a s m i dp u g 6 ，w i t hi n s e r t i o nt h ek a n m _ x g e n ea sar e p o r t e r w ea l s o c l o n e dt h eh x t 7g e n ef r o my e a s ts t r a i nz s 13 ，t r a n s f o r m e di n t ot h ep l a s m i d p u g 6 ， a n di n s e r t e das t r o n gp r o m o t e rp g ki nf r o n to ft h eo p e nr e a d i n gf r a m eo fh x t 7 g e n e ， i nt h i sw a yw ea c h i e v e dt h eo v e r - e x p r e s s i o no fh x t 7 g e n e t h e ng r o w t ha n df e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u t ，t h eg r o w t hc u r v e s a n df e r m e n t a t i o nd y n a m i c sw e r em e a s u r e d ，f o u n dt h a ti n t h ee n do ff e r m e n t a t i o n ，t h e z s 一13s t r a i nl a c k sh x t 7g e n eh a dal o wh e x o s ei n t a k er a t e ；a n dt h ez s 13s t r a i nw i t h ao v e r - e x p r e s s e dh x t 7g e n ei n c e p tm o r eh e x o s e b u tt h ec h a n g eo fh e x o s ei n t a k e a m o u n th a sn os i g n i f i c a n ti n f l u e n c eo ne t h a n o lo rg l y c e r o ly i e l d ，t h em e t a b o l i cf l u x r e s e a r c hs h o u l db ei n t r o d u c e di nf u t u r es t u d i e s ，e x p e c t i n gt oc o n v e r tt h ee x t r ah e x o s e t oe t h a n o la sm u c ha sp o s s i b l e k e y w o r d s h e x o s et r a n s p o r t e rg e n e ；g e n ed e l e t i o n ；o v e re x p r e s s i o n ；g 418s c r e e n ；a l c o h o l i c f e r m e n t a t i o n ；r e s i d u a ls u g a r i i i 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：亏 斐签字日期：) 一子 年6 月f 多日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解滥姿基堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘鲎 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 学位论文作者签名：于曼 导师签 签字日期：m 暑年6 月f 多日签字日期：卯释多月乏日 浙江大学硕士毕业论文 致谢 终于到了要说再见的时候。研究生的两年，紧张而忙碌，充满了汗水与快 乐，更有巨大的收获。辛苦忙碌的时候总觉得时间过的太慢，然而在此时，却 发现两年的时间是那么的短暂。 进入实验室两年多以来，吴老师以及实验室的每个人，给了我一个温馨融 洽的大家庭。吴老师不仅在学 - - j 工作上给与我耐心的指导，更是在生活中给与 我关怀。吴老师在处事方法与态度上对我的影响，不仅将在我以后的人生成为 我不断前进的巨大动力，更将在我迷茫的时候让我时刻保持正直诚实的本性。 在此，我衷心的感谢您在我学 - - j 、科研及生活等方面对我的关怀和教导，能成 为您的学生是我的幸运，谨致以最诚挚的感谢。 感谢实验室的师兄师姐们，你们在我进入实验室之前就已经在实验室里营 造了快乐轻松的气氛，这让我这两年的研究生涯过的快乐充实。还要感谢师兄 师姐们在科研中给我的巨大帮助，没有你们的帮助和指导，我不可能完成这篇 论文以及其他的研究工作。在此，我衷心的感谢钱朝东师兄，李欧师兄，郦萍 师姐，王品美师姐，池小琴师姐，杨瑞娟师姐和戴朝波师兄，他们开阔的思想、 广博的知识、熟练的实验技能以及耐心的帮助对我提供了极大的帮助。特别是 郦萍师姐，在我研究的多个阶段都给与我非常重要的指导和帮助，我要再次衷 心感谢你。以及池小琴师姐，没有你的帮助，我的实验不会进展的这般顺利 感谢和我同时进入实验室的周建英，丁锐，文艳萍，陈伟峰，周银燕，没 有你们对我的帮助，我的研究工作不可能完成；没有你们在身边，我的研究生 生活也不可能如此快乐充实。特别是周建英和丁锐，你们两人对我的帮助和照 顾，给了我巨大的温暖和信心，谢谢你们 感谢实验室的师弟师妹在实验中给与我的帮助和支持，以及在生活中给我 带来的快乐郑道琼，方海环，蒋莹，谢谢你们特别是郑道琼，你在我的研 究工作中给了我巨大的帮助，再次谢谢你 再次感谢所有人，谢谢你们陪我度过了这段快乐而充实的研究生生活 浙江大学硕士毕业论文 前言 能源是人类生存和发展的基本需求随着社会经济的持续高速发展，用以 支撑社会进步的一次能源的代表石油已成为现代文明赖以生存的“血液” 然而，地球上的一次资源是有限的，并且已呈逐渐枯竭之势。据联合国能源组 织多次评估，再过5 0 年左右，地球上的石油储量大工业化开采将趋结束。我国 的时间将更短，据专家预计只有3 0 年左右能源短缺已是现代社会面临的一个 重大问题。 为了寻求替代能源，几十年来，人们做出了不懈努力，通过大量的研究、 对比和实践，来寻找可方便制取、使用的可再生能源。近些年来，许多人都把 目光又集中在传统产品乙醇上来【l 】。美国是世界上最大的以谷物为原料生产生物 燃料乙醇的国家，2 0 0 4 年，美国生产乙醇消耗了3 2 0 0 万吨玉米，占产量的1 1 。 另一个生物燃料乙醇生产大国是巴西。巴西主要用甘蔗为原料生产生物燃料乙 醇，美国和巴西生物燃料乙醇产量之和比全世界其他所有国家生产生物燃料乙 醇的总量还要多。随着各国对环保问题的重视，以及对循环能源需求的增加， 生物燃料乙醇市场需求越来越大，各国对生物燃料乙醇都规定了具体的添加计 划巴西要求加入比率为2 5 ；欧洲国家目前为2 ，2 0 1 0 年要达到5 7 5 ；加拿 大萨斯喀彻温省为7 5 ，温尼泊省为1 0 ；哥伦比亚为l o ；泰国为1 0 ；阿根 廷要求在未来5 年内达到5 ，我国于2 0 0 0 年开始启动车用乙醇汽油项目，已在部 分省要求在汽油中加入一定比例的生物燃料乙醇，取得了较好的效果，并在全 国推广。2 l 世纪，燃料乙醇将会成为主要的新兴能源之一 燃料乙醇作为一种新兴能源，具有相当重大的环境意义国内外大量研究 表明，变性燃料乙醇的使用对改善大气环境有积极的意义，在汽油中少量添加 变性燃料乙醇后，c 0 2 、c o ，和h c 等污染物的排放量均有明显下降，而n o x 排 放量则在小范围内增加或减少汽车尾气污染是城市空气污染的重要来源之一 而实验表明，在汽油中加入1 0 的燃料乙醇，汽车尾气中的一氧化碳可减少3 0 浙江大学硕士毕业论文 以上，碳氢化合物可减少1 5 左右。随着我国工业化进程的加快，汽车数量也迅 速增加。目前以汽油为动力的汽车尾气对大气的污染程度，已占所有大气污染 源的6 0 左右。因此，国际上对汽车尾气造成大气污染非常重视，在寻找、研究 和开发汽油替代品方面做了很多工作，比如风能、电能、氢能等，但这些能源 都有各自的局限性。据权威部门验证，燃料乙醇具有自供氧性，可增加汽油的 含氧量，使汽油燃烧更充分。使用含有1 0 燃料乙醇的车用乙醇汽油，在大大减 少汽车尾气中一氧化碳，碳氢化合物排放的同时，还使尾气中氮氧化物、酮类 等污染物的浓度明显降低，有利于改善大气环境。 使用燃料乙醇代替石油燃料，还有重要的社会意义 2 1 变性燃料乙醇推广使 用后，乙醇汽油的生产、管理和使用在政策上都将作相应的调整，必将涉及 不同利益群体，这些群体包括不同职能的政府管理部门、生产和消费人群等。 例如：大力发展变性燃料乙醇工业，给美国带来了诸多有利影响：首先是提高 了国家能源安全性；其次是刺激了农业发展；三是保护了城市的环境；四是增 加了就业机会。 酵母菌在自然界中分布很广，尤其喜欢在偏酸性且含糖较多的环境中生长， 例如，在水果、蔬菜、花蜜的表面和在果园土壤中最为常见，它是单细胞真核 微生物，早在数千年前就和人类的日常生活息息相关。直到现今酵母仍然是我 们日常生活不可或缺的酵母的用途主要体现在以下几点：首先在酿酒上的应 用其次酵母可以作为食品的调味剂和增香剂【3 一。另外酵母还被广泛地用作饲 料蛋白质的补充物【5 1 。酵母的另外一个作用是在生物化学，遗传学和分子生物学 等学科中扮演了模式生物这一重要角色嘲。伴随着现代分子遗传学与生物技术的 发展，酵母作为重要的工业菌株将发挥它更大的作用。 目前的生物乙醇的生产主要是以玉米和面粉等粮食作物为原料，通过酿酒酵 母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的无氧发酵，来生产乙醇。以下是发酵过程中的 主要反应： c 6 h 1 2 0 6 2 c 2 h s o h + 2 c 0 2 2 浙江大学硕士毕业论文 全球能源紧缺的警钟早已敲响，有人估计石油和天然气的开采寿命只有数 十年，而煤的开采寿命约有4 0 0 年，所以全球都已行动起来，加紧寻找可替代能 源。酿酒酵母以可再生资源如淀粉、纤维素等生产酒精来替代几近耗尽的化石 能源引入注目，燃料乙醇作为一种替代能源有以下两个优势：其一它的原料来 源广，且可再生，主要是作物以及作物的秸秆；其二乙醇作为绿色环保能源可 缓解目前日趋严重的环境污染和温室效应问题现在各国都在致力发展此种清 洁能源，我国政府也已将燃料乙醇的项目列入“十五”示范工程重大项目目前全 球乙醇制造大国有巴西，美国等。2 0 0 3 年，巴西燃料乙醇的年使用量就已达1 3 0 0 万吨。如此大量的制造乙醇使得原本低廉的玉米价格顿时上涨就目前形势看， 乙醇生产仍然存在诸多问题，如原料价格过高，工业用酵母菌株糖酒转化率偏 低等。 事实上，虽然酵母进行酒精发酵的主要底物是葡萄糖，但是对于其他己糖， 主要包括果糖，甘露糖等，也可以利用。在无氧发酵过程中，发酵主要是由非 增殖细胞来进行的。当酵母生长进入稳定期后，这些细胞的发酵活力就会逐渐 降低，与此同时发酵效率也随之下降。在酒精发酵过程中，这一发酵活力的下 降并不是因为糖酵解相关酶的活力的下降所致，事实上，酵母厌氧发酵受到的 限制主要来自于其对已糖的转运效率 目前对工业菌株的改造，使其可以在高发酵温度高渗透压仍保持高的酒精发 酵率，高效的将底物中的糖转化为目标产物乙醇。但是对发酵末期底物中残留 的低浓度糖却无法有效的利用，这就在一定意义上造成了生产原料的浪费。若 能将对残糖的利用率提高1b r i x ( 糖度单位) ，并将其有效的转化为目标产物乙 醇，那么将进一步降低生物乙醇的生产成本，带来巨大的经济利益 研究表明，酵母中存在有高亲和力己糖转运因子和低亲和力己糖转运因子 其中高亲和力己糖转运因子h x t 6 p 和h x t 7 p 主要在发酵末期培养基中己糖浓度较 低时保证酵母高效的摄入己糖 7 1 。若能通过对h x t 6 和h x t 7 基因的研究而提高 发酵醪中的糖利用率，那么就能首先达到提高底物利用率的目的 浙江大学硕士毕业论文 材料与方法 1 菌株 本实验室的工业菌株经产孢获得的高酒精产率单倍体酵母细胞z s 1 3 ( m a t a ) 2 n x t 7 缺陷型工业菌株的构建 参c r e l o x p 系统 8 , 9 3 0 来进行酵母基因敲除： 1 ) 以p u g 6 质粒为模板，1 ) j , h 1 h 2 为引物进行p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ， 聚合酶链反应) ，获得仞盯7 基因敲除组件； 2 ) 经测序验证后转化酵母菌株z s 1 3 ，g 4 1 8 筛选，挑出重组子，斜面培养； 3 ) 抽提基因组，以k 1 k 2 引物对验证转入的勋玎 锻基因； 4 ) 随后再以硒k 4 引物对验证转入的k a n m x 基插入位置，确定其替换掉的是 尼耵7 基因； 5 ) 获得h x t 7 缺陷型工业菌株。 3 n x r t ；基因过表达工业菌株的构建 由于鼢与且耵7 基因高度相似( 长度均为1 7 1 3 ，其中只有5 个碱基不同) ， 但其上游序列则差异很大，因此需要先将丘砑7 基因及其上游序列用p c r 的方式 ( h 3 h 4 引物对) 切出，然后再以切出的这段长序列为模板，用引物对h 5 h 6 p j , p c r 方式切下，并在两端加上酶切位点p 似i i 和s a li ，等待转化连接质粒。 带p 似片段质粒构建步骤： 1 ) 设计引物从酵母基因组中扩增出尸嗽带( 片段两端：5 端带_ e n d ei 酶切 位点，3 端带上 ul i 酶切位点) ，p c r 3 0 0 9 l 体系，5 0 山送测，剩余2 5 0 p 1 经 p c r 试剂盒纯化后用于后面的酶切连接； 2 ) 将纯化后的尸傩片段- 与p u g 6 质粒分别用砒i 和p v u l i 双酶切过夜( 酶切体 4 浙江大学硕士毕业论文 系2 0 p 1 ) ，片段酶切产物直接纯化，质粒则进行割胶回收； 3 ) 回收后的产物加d n a t 4 连接酶4 c 连接过夜( 体系1 0 1 t 1 ) ； 4 ) 制备感受态进行转化，并涂a m p ( 氨苄，抗生素的一种) 平板，3 7 c 倒置培 养约1 2 1 6 h ，挑单菌落p c r 验证阳性重组子，2 0 甘油管保存备用。 对质粒进行两步酶切，然后与制备的带转入尼砑琏接，将尼耵7 基因准确的 插入质粒上的相应位点，紧连在强启动子p 傩的序列之后，得到带有过表达的 尼耵7 基因的质粒p u g 6 h x t 7 。 将该质粒转化大肠杆菌感受态细胞，然后加n p 平板筛选，挑单菌落，以h 5 h 6 引物对进行p c r ，验证其中是否转入了带有聊基因的质粒，获得带有 p u g 6 h x t 7 质粒的大肠杆菌。大量培养后抽提其中的质粒，醋酸锂法转化z s 1 3 酵母细胞，g 4 1 8 平板筛选，挑单菌落斜面保存，提基因组，以硒k 4 引物对进 行p c r ，检验是否转入了带有砌刀臌因的p u g 6 h x t 7 质粒，获得上游带有强 启动子p g k 的兄耵7 基因的酵母菌株。 表1 ：实验中所使用的引物( 自行设计) 浙江大学硕士毕业论文 4 酵母醋酸锂转化 1 ) 挑单菌落n 5 m ly a p d 液体培养基中，3 0 。c2 0 0 r p m 过夜( 1 2 1 6 h ) 培养； 2 ) 加l m l 培养液到2 5 m l 预暖的2 y a p d 液体培养基中，3 0 c2 0 0 r p m 培养4 h ； 3 ) 室温条件下4 0 0 0 g 离心5 m i n ，收集细胞，用无菌水洗，最后用l m l 超纯水重 悬，吸1 0 0 1 x l 转移至1 5 m l 离心管中，1 2 0 0 0 g 离心3 0 s ，弃上清，待转化； 4 ) 取一管单链d n a ( 鲑精d n a ) 变性，煮沸5 m i n ，然后快速至于冰水混合物 中待用； 5 ) 在待转化细胞的离心管中加入以下： p e g 3 3 5 0 ( 5 0 w ，v ) 2 4 0 h 1 l i a c ( 1 0 m ) 3 6 p l 单链d n a ( 2 m g m 1 )5 0 p l 待转入d n a 3 4 1 - l 1 总体积 3 6 0 p 1 混匀后重悬酵母细胞，作对照； 6 ) 4 2 c 热激1 5 - 4 0 m i n ，1 2 0 0 0 g 离心3 0 s ，弃上清； 7 ) l m ly p d 液体加入转化后的管中重悬细胞，3 0 c 培养2 3 h ，吸取一定量涂平 板，3 0 c 培养3 4 天，挑单菌落斜面保存。 所需试剂： 醋酸锂( l i a e ) ：5 1 9 定容至5 0 m l ，用稀h a c 调p h 至7 5 ，室温保存 g 4 1 8 ：取1 0 0 m g 加入0 5 m l 无菌超纯水中至浓度2 0 0 m g m l ，使用浓度2 0 0 3 0 0 p , g m 1 5 0 p e g ：5 0 9p e g 定容至1 0 0 r n l ，缓慢加热溶解 y p a d ：1 酵母粉，2 蛋白胨，2 葡萄糖，8 0 “g l 腺嘌呤半硫酸。 2 x y p a d ：2 酵母粉，4 蛋白胨，4 葡萄糖，8 0 腭几腺嘌呤半硫酸。 5 酵母基因组提取 6 浙江大学硕士毕业论文 1 ) 将斜面上的酵母取l 2 环，用5 0 0 p l 裂解缓冲液悬浮( 4 0 0 p 1 t b ，l o o p l + - 烷 基磺酸钠) ，6 5 水浴l h ； 2 ) 5 0 0 0 g 离心5 m i n ，将上清液转移至另一1 5 m l 离心管中，加入等体积酚：氯 仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，振荡混匀后1 2 0 0 0 g 离心l o m i n ，取上清液；此步 重复2 3 次； 3 ) 回收上清液，加2 倍体积预冷的无水乙醇和1 1 0 体积3 m 的醋酸钠，2 0 c 静置 2 0 - 3 0 m i n ； 4 ) 1 2 0 0 0 x g 离心1 0 m i n ，弃上清液，用7 5 乙醇洗一次，干燥后溶于1 0 0 肛1t e 中， 每管加2 斗lr n a 酶( 1 0 0 m g m 1 ) ，3 7 c 水浴处理o 5 h 后2 0 c 保存备用。 所需试剂： t e 缓冲液：l m me d t a n a 2 ，l o m mt r i s h c l ，p h 8 0 6 质粒抽取 1 ) 挑单菌落接种至含抗生素( a m p ) 的l b 液体培养集中，3 7 c 2 5 0 r p m 培养过 2 ) 3 ) 4 ) 5 ) 6 ) 7 ) 8 ) 9 ) 夜； 6 0 0 0 g 离心1 0 m i n 收集菌体； 无菌水洗菌体，并成两管，加6 0 0 “i 溶液i ； 加1 2 0 0 1 上i 溶液i i ，快速颠倒数次，置于冰上3 5 r a i n ( 溶液i i 现用现配) ； 加9 0 0 1 l 1 冰预冷的溶液i i i ，反复颠倒数次，置于冰上3 5 m i n ； 1 2 0 0 0 x gl o m i n 离心，移上清于另一7 m l 离心管； 加等体积酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽提，1 2 0 0 0 x gl o m i n ，吸上清至 另一7 m l 离心管，此步进行两次，然后上清分装在1 5 m l 的离心管中，每管 3 5 0 p 1 ； 每管加预冷的无水l 醇8 7 5 p , i ，2 0 c 放置2 0 r a i n ； 1 2 0 0 0 x gl o m i n ，弃上清，7 0 酒精洗一次，晾干；每管加入5 0 m 双蒸水及1 m r n a 酶，3 7 c 反应3 0 m i n ，- 2 0 c 保存待用。 7 浙江大学硕士毕业论文 所需试剂： 溶液i ：秤取o 9 3 9 葡萄糖，0 3 7 9 e d t a n a 2 h 2 0 ，0 3 0 9 t r i s ，h c i 调p h i 8 0 ， 定容至1 0 0 m 1 溶液i i ：先配好母液，1 0 m o l l n a o h ，1 0 s d s ；用时将4 4 m ld d h 2 0 ，l o o u ln a o h 与5 0 0 p 1s d s 混匀 溶液i i i ：3 mk a c ( p h 4 8 ) ( 取2 9 5 m l ，加k o h 颗粒至p h 4 8 ，加水 1 0 0 m 1 ) 。 7 感受态细胞制备及转化大肠杆菌 1 ) 接大肠杆菌菌液2 0 l 至1 0 m ll b 液体培养基中，3 7 c2 5 0 r p m 培养过夜( 1 2 h ) ； 2 ) 吸0 5 m l 培养液至5 0 m ll b 培养液中，3 7 c2 5 0 r p m 培养2 - 3 h ； 3 ) 倒入离心管( 5 或7 m 1 ) ，冰上放置1 0 m i n ，离心手机细胞，用双蒸水洗两次， 并成两管； 4 ) 每管加3 m lc a c l 2 ( 0 0 5 m ) 洗一遍； 5 ) 再加5 m lc a c l 2 ，冰上放置3 0 m i n ，6 0 0 0 g 离心1 0 m i i l ，弃上清，加c a c l 2l m l 管，4 c 放置备用，2 4 h 内转化； 6 ) 转化：l o o p l 感受态细胞悬浮液中加, n i o i a 待转混合液( 质粒n g 级) ，温和混 匀，冰浴3 0 m i n ，4 2 c 水浴热激1 5 m i n ，再迅速2 1 0 m i n ，加4 0 0 “1l b 液体( 含 a m p ) ，2 2 0 - 2 5 0 r p m3 7 c 摇1 h ，吸适量涂平板，并在1 2 - 1 6 h 内挑单菌落 所需试剂： l b 培养基：1 n a c i ，0 5 酵母粉，1 蛋白胨。 平板：l b 液体加2 琼脂，灭菌后冷却至6 0 时加入氨苄霉素( a m p ) 至终浓度 10 0 肛g m 1 8 菌株发酵方法 1 ) 从斜面接种酵母菌一环至一级试管培养基中，3 0 c 静置培养过夜( 1 2 - 1 6 h ) ； 2 ) 将试管中的培养液倒入二级三角瓶液体培养基中，2 0 0 r p m3 0 c 培养1 0 1 2 h ； 8 浙江大学硕士毕业论文 3 ) 接二级种子培养基至三级发酵培养基中，继续3 0 c 静置培养过夜，8 1 0 h 后 无菌水封口，调温至3 4 ，静置发酵8 0 h 后测定相关数据。 所用试剂及原料： 面粉：河南天冠燃料乙醇有限公司； 玉米粉：河南天冠燃料乙醇有限公司； a 淀粉酶：偌维信耐高温淀粉酶，2 0 0 0 0u g ； 糖化酶：偌维信，1 0 0 0 0 0u g ； 自制糖化醪( 具体见糖化醪制备方法) ； 9 生长曲线测定 1 ) 蒸煮制备得到的1 5 b r i x 糖化液，离心去渣，分装2 5 0 m l 三角瓶，灭菌备用； 2 ) 接种一环菌体至试管液体培养基中预培养，3 0 c 静置过夜； 3 ) 将试管中的培养液整个倒入三角瓶中，3 0 * ( 22 2 0 r p m 振荡培养； 4 ) 间隔一定时间取样，持续4 0 5 0 h ，测定o d 6 0 0 。 1 0 发酵动力学测定 见菌株方法。二级种子培养基接入发酵醪混匀后进行第一次取样；1 0 h 封1 7 1 时第二次取样；随后每隔1 2 h 取样一次，直至发酵结束( 9 2 5 h ) 鉴于酵母的酒精发酵是在无氧的条件下进行的，而取样会破坏这一无氧状 态，因而每个待测菌株设置多组平行，每瓶取样测定后都不在使用。 1 1 糖化醪的制备方法 1 ) 发酵培养基 将玉米粉、面粉、水按照料水比1 ：2 混合，并使之浸润( 半小时以上) 后， 先按每克淀粉加入5 个单位的a 淀粉酶( 即液化酶2 0 0 0 0 u m 1 ) ，然后逐步升温 9 浙江大学硕士毕业论文 加热，至7 0 8 0 c ( 当升至5 0 。c 以上时充分搅拌，防止结块) ；升至8 0 c 后封1 7 i ， 放入灭菌锅中继续升温，至1 2 1 保持1 h ；逐步降温并充分搅拌糖化醪，9 5 1 2 左右时按每克淀粉加5 个单位的液化酶，然后边搅拌边降温；降至6 0 c 时，按 每克淀粉加入2 0 0 个单位的糖化酶( 1 0 万u m 1 ) ，糖化作为发酵培养基； 2 ) 二次培养基( 种子培养基) 将制备好的糖化醪保温在5 5 6 0 。c 的水浴中，糖化2 0 h ；用两层纱布过滤，取 滤过液( 即糖化醪) ；测定糖度，取该糖化醪稀释至最终所需糖度( 根据需求可 选择加入0 5 ( n n 4 ) 2 s 0 4 作为氮源) ，根据量的要求分装三角瓶中，八层纱布两层 报纸封口，1 1 5 高压灭菌3 0 m i n ； 1 2 实验器材与仪器 1 tg r a d i e n tp c r 仪( b i o m e t r a ) ； 2 d y y - 1 2 型电脑三恒多用电泳仪( 北京市六一仪器厂) ； 3 h p l c ( 高效液相色谱) ； 4 d h p 9 0 8 2 型电热恒温培养箱，上海恒科； 5 s a n y oa u t oc l a v e ，s a n y oe l e c t r i cc o l t d ： 6 p z x 3 5 8 1 型座式自动电热压力灭菌锅，上海申安医疗器械厂； 7 4 冰箱，2 0 冰箱； 8 t g l 1 6 c 台式离心机，上海安亭科学仪器厂； 9 h 2 9 3 1 0 k 8 型摇床，h 2 9 2 1 1 k 型摇床，大仓市华利达实验设备有限公司； 1 0 d k - s b 型电热恒温水槽，上海精密实验器材有限公司； 1 1 电子天平； 1 2 p h 计，酒精计，糖度计，温度计 1 0 浙江大学顿士毕业论文 结果与分析 i 敲除工业菌株z s 1 3 的脚均 因 1 1 敲除验证 在以基因重组的方式敲除e 订7 基因时，为了验证敲除( 即五巩 删基因的插 入) 是否发生在正确的位置，于是设计了引物k i - k 2 ，其中k 1 为丘耵7 基因o r f 上游启动子的一段独特序列，k 2 为缸巩 捌基因中的一段独特序列，p c r ：物长 度为1 2 7 6 b p 以k 1 j o 为引物，证明了基因的重组确实发生在盥嗍因启动子 之后d - 1 9 与d 2 0 菌株的尼盯7 基因的开放阅读框被献棘，并且插入了- l l 倒基 因作为报告基因 1 2 7 6 一 旦 o i 口 鲁 i 1 4 0 0 1 2 0 0 、 1 0 0 0 7 5 0 图1 ：在皿盯7 基因后插入蜀埘 o 藩因的骚证鼓字单位：b p 1 2 皿柚7 基因敲除对z s - 1 3 生长发酵的影响 对z s 1 3 菌株进行改造，通过g 4 1 8 捧选，从平扳单茁落中挑出的两株 玎材 的z s 1 3 菌株，分别命名为d - 1 9 和i n 2 0 发酵，测定其发酵数据选m - 1 9 茁株进 浙江大学硕士毕业论文 行生长曲线与发酵动力学的测定，以z s 1 3 作为对比菌株。 从图2 所示的两种菌株的生长曲线对比可以看出，敲除脚7 基因的d 1 9 菌 株，在生长初期与对照菌株几乎没有区别，两条曲线几乎重叠；但是一进入指 数生长期，d - 1 9 的生长势就明显弱于对照菌株z s 1 3 ；在进入稳定期后，d 1 9 菌 株的生长势逐渐接近对照菌株。两条生长曲线的对比暗示了h x r 7 基因对该工业 菌株的生长起着较为重要的作用。 图2 ：d 1 9 与对照菌株z s 1 3 生长曲线比较 图3 与图4 显示，d 1 9 在发酵过程中，随着培养基中糖度的下降，酒精与甘 油的产量都不断升高，两者浓度的升高趋势很相似：在发酵过程的大约前3 0 个 小时，伴随着培养基中糖度的快速下降，酒精度与甘油浓度都快速的上升；在 4 0 5 0 h ，随着酵母细胞的生长进入稳定期，这一快速变化的趋势逐渐减缓；有趣 的是，在发酵末期( 8 0 9 0 h ) ，随着残糖的下降，酒精度并没有随之升高，而是 甘油浓度有所提升，这可能暗示了敲除h x t t 基因对发酵末期酵母代谢流的影响 1 2 浙江大学硕士毕业论文 图3 ：d 1 9 酒精发酵动力学 图4 ：d 1 9 产甘油动力学 从表2 所示的h x t t z l 菌株d 1 9 和d 2 0 的发酵结果可以看到，敲除尼臌因的 z s 1 3 菌株，在发酵末期( 8 2 5 h 和9 0 5 h ) ，对糖化醪中残余糖的转运能力明显下 降：d 1 9 的残糖度比对照菌株明显要高；而d 2 0 ，甚至高出数倍从残糖度来 看，发酵末期培养基中低浓度糖的的利用能力，无论d 1 9 还是d 2 0 都较显著的 弱于对照菌株z s 1 3 ，而这种差距在d - 2 0 更为明显。 浙江大学硕士毕业论文 但是兄耵7 基因的敲除对酒精产量的影响并不显著。不过从d 1 9 和d 2 0 的情 况看来，酒精度还是有一定的下降。主要发现的是一种趋势，即越到发酵后期， h x t 7 a 菌株的产酒率与对照菌株的比率就越低这种现象应该与糖摄入效率的变 化相关：越到发酵后期，利用低浓度糖能力的差距越发凸显，反映在发酵产物 产量上的变化也与之一致。无论如何，敲除册基因改变了降低了酵母在低浓 度下利用糖的能力。 表2 ：h x t 7 z j 菌株d 1 9 及d 2 0 与对照菌株z s 1 3 的发酵数据比较。 2 过表达工业菌株z s 1 3 的h x t t ；) 基因 2 1 过表达验证 携带p g k 启动子序列的质粒与两端带有酶切位点财i - 与p v u i i 的聊基因 4 c 连接过夜后，将连接体系转化感受态细胞，挑出单菌落后进行p c r ，验证转 入质粒中的兄蹴因。图中的1 7 3 5 b p 的序列即为引物h 5 h 6 的目的产物长度 1 4 浙扛大学琢士毕业论文 1 7 3 5 一 圈5 ：转化感受态细胞肼基目电泳挂潮 ：直接班大肠杆苗为模板进行p c r ；b ：特大 肠杆菌沸水薷煮1 0 m i n 后进行p c r 数字单位：b p 2 2l t 7 基园过表达对z s - 1 3 生长发酵的影响 对z s 1 3 菌株进行改造后，通过g 4 1 8 筛选，从平板上的单苗落中挑出的一株 过表达冠嬲囡的z s 一1 3 菌株，命名o e - 4 ，其中过表达的尼魄因携带于转入 的质粒内测定其发酵数据，井进行生长曲线与发酵动力学的测定，以z s 1 3 作 为对比菌株 从围6 可以看出，在生长初期o e 4 - 与对照苗株的生长势并没有什么区别，两 条曲线几乎重叠；但是进入指数生长期后，o e - 4 0 9 生长势就明显弱于对照菌株 z s 1 3 ；不过在进入稳定期后，o e - 4 苗棒的生长势又逐渐接近对照苗株，并蕞终 达到相同的水平在指数生长期o e 4 的这种低于对照菌株的生长势是没有预科 到的因为携带过表达册基因的质粒应该对酵母基因组的表达没有很大的影 响况且，即使过表达，也应该在发酵后期显现出影响，而不是在发酵簪中己 糖浓度还较高( 糖度约1 5 b r x ) 时即出现差别 7 5 2 - ：_ 一 一， 浙江大学硕士毕业论文 图6 ：o e 4 与对照菌株z s 1 3 生长曲线比较 图7 和图8 显示，o e 4 在发酵过程中，随着培养基中糖度的下降，酒精与甘 油的产量都减速升高，并保持一致；而这种升高也自然而然的与糖浓度的减速 下降保持高度的一致性。酒精度与甘油浓度的一致性保持的相当好，即使在发 酵末期8 2 5 h 曲线的一个跳跃上也是同时的。这一跳跃大概只是平行批次间的差 异造成的，这种差异在酒精度上升缓慢的发酵后期尤为明显。 1 至1 7 ：o e - 4 酒精发酵动力学 1 6 浙江大学硕士毕业论文 图8 ：o e - 4 产甘油动力学 在构建n x r t 基因过表达菌株的过程中，在p u g 6 质粒内插入了强启动子p g k 序列，并在其后边连上了从z s 1 3 菌株中克隆的肼基因，获得质粒p u g 6 h x t 7 将该质粒转化酵母后通过g 4 1 8 筛选得到的菌株o e - 4 ，发现质粒中的片段并未连 入酵母基因组中，而可能只是作为质粒中的基因在酵母生长发酵过程中表达 由表3 可以看出，虽然增强h x t 7 基因的表达( 强度以及丰度) 并未提高酒精 的产率，但是在发酵末期( 8 2 5 h ，9 0 5 h ) ，却降低了残糖度，提高了对底物中 糖的利用率，而且这种差距越到发酵后期越明显，显示y h x 7 基因对己糖的高 亲和力，这种亲和力在发酵末期明显发挥了作用考虑到实验操作或是批次间 的误差，从表2 中的数字或许仅能推测糖度改变的趋势。 另外，o e - 4 - 与对照菌株z s 1 3 的酒度比率变化趋势似乎也符合丘臌因的 表达特性：即越到发酵后期，过表达h x r 7 基因带来的影响就更明显。无论是对 残糖的利用率上，还是在酒度的提高上不过酒度的提高率似乎并不明显，加 之不同发酵批次无法保证完全一样的发酵条件，因此这种酒度的提高还需要进 一步证实。 1 7 浙江大学硕士毕业论文 表3 ：o e - 4 - 与对照菌株z s 1 3 的发酵数据比较 3 敲除与过表达团臌因的综合比较 3 1 生长曲线的比较 就生长曲线来看，无论是敲除还是过表达仞盯7 基因，都使得改造后菌株在 进去指数生长期后的生长速度慢于未经改造的工业菌株；不过在进入稳定期后， 都逐渐达到了相似的o d 值。而d 1 9 与o e 4 的曲线则几乎重合这种指数期生长 慢于原菌株的现象，猜测可能是对h x t 7 ；基因进行改造而造成的 1 至9 ：h x t 7 a 突变菌株d 1 9 ，过表达菌株o e - 4 - 与对照工业菌株z s 1 3 的生长曲线比较 浙江大学硕士毕业论文 3 2 发酵残糖度 对菌株z s 1 3 、d 1 9 和o e 4 的发酵共进行过两次，两次的培养基制备过程及 发酵醪的糖度，发酵时间上都存在差异，加之批次之间的区别，因此最终的发 酵结果存在一定差距。不过将两次发酵的数据进行一些处理后，仍发现了明显 的趋势。 表4 ：两次发酵残糖度比较 见表4 ，虽然两次发酵的发酵时间与起始发酵醪糖度都有一定差别，但是敲 除尼聊堪因确实削弱了工业菌株z s 1 3 在低糖浓度下利用培养基中糖分的能力。 这种影响在第二次发酵中更为明显，这应该是由于延长的发酵时间和较低的起 始发酵糖度所致。较低的起始发酵糖度使得发酵过程可以较快的进入残糖度很 低的发酵末期，使表达的高亲和力转运子h x t 7 p 发挥作用；而较长的发酵时间也 保证了高亲和力转运子h x t 7 p 有足够的时间发挥作用 两次发酵中，d 1 9 和d - 2 0 在发酵结束时( 将三角瓶拿出培养箱，破坏其无 1 9 浙江大学硕士毕业论文 氧状态，开始测定相关数据) ，培养基中残留的糖都比对照菌株要高，而o e - 4 则 比对照低。这一现象在第二次发酵结果中更为明显。鉴于第一次发酵测定数据 时，培养基中还有较高浓度的糖，因此第二次发酵的数据更能证明h x t 7 p 在低浓 度下转运己糖的能力。 3 3 酒精产量与甘油产量的关系 从图1 0 和图1 1 可以看出，z s 1 3 、d 1 9 和o e - 4 甘油的合成与乙醇的产生是一 致升高的。 原先认为，既然产生甘油是酵母细胞应对高渗透压的反应，那么随着发酵 过程的进行，发酵醪中酒精的不断积累必将刺激甘油的合成然而意外的是， 虽然甘油的产率与酒精的产量都是减速升高的，然后其浓度比( 甘油( g l ) 酒精 ( g l ) ) 却是在发酵的初期最高，随后逐渐下降，在发酵进行到大约5 0 h ，酒精度 达到约1 2 时，甘油与酒精的浓度比就稳定不变了，见图1 2 囹1 0 ：三个菌株酒精产量与时问的关系 2 0 浙江大学硕士毕业论文 图l l ：三个菌株甘油产量与时间的关系 图1 2 ：在发酵的不同时间段，三个菌株发酵醪中甘油与酒精的质量比率变化 浙江大学硕士毕业论文 讨论 1 敲除与过表达h 耵7 基因对工业菌株z s 1 3 发酵末期己糖转运的影 响 之前有针对兄灯7 基因的专门研究认为，虽然h x t 6 ；基因与脚7 基因的开放阅 读框及其上游9 6 b pd n a 序列是几乎完全一样，而更远的上游才出现区别 i h ， 但是这两个基因的表达活力显然受其上游启动子的序列影响而不同一般情况 下，脚7 基因的表达是强于劂基因的，因而本文主要针对h x r 7 基因进行了 敲除和过表达的操作，以研究其对在工业菌株z s 1 3 的影响。 虽然有研究显示，单独敲除脚基因与兄耵7 基因中的任何一个后，其发酵 特性与野生型都没有什么区别【1 2 1 ；但是本文的研究结果显示，敲除且耵7 基因后， 工业菌株z s 1 3 在发酵后期对底物中残糖的利用率还是明显下降了。 就表4 中的结果来看，虽然两次发酵批次间的条件差异比较大，但是最终揭 示了一致的结果。两株h x t t a 菌株d 1 9 、d 2 0 在发酵结束时，残糖都高于对照菌 株。第一次发酵时，由于所使用的发酵醪糖度较高，因为8 7 h 的时间看来还不够 使发酵完成，因而底物中的残糖度还保持在一个较高的水平( 接近3 b r i x ) 就拿 来测定数据了但是几个菌株已经显示了不同的己糖利用率：d 1 9 、d 2 0 的残 糖度明显高于对照菌株z s 1 3 ；而o e 4 菌株则明显高于对照菌株；在第二次发酵 结束时这一趋势更为明显，这也意味着越到发酵的后期，随着培养基中残糖的 降低，i 妇h x t 7 基因所编码的高己糖亲和力转运因子h x t 7 p 的作用也越发显现出 来 敲除h a t 7 基因，虽然对发酵的起始和进行没有明显影响，但是在发酵末期 却显示了作用。研究显示，脚7 基因并非因受高浓度葡萄糖的抑制而到发酵末 期才被诱导表达，而是在酵母生长进入稳定期( 4 0 5 0 h ) ，培养基中仍存在较高 浓度糖( 约l s 0 9 l ) 即被诱导表达，发挥其特定作用【1 3 1 。直至发酵结束，其表 浙江大学硕士毕业论文 达产物h