（微生物学专业论文）东北地区药用植物根际土壤真菌多样性的研究.pdf

学位论文独创性声明 啪l i i | l 1 1 i i i 1 l f f 1 l i i l i | | f f 删 y 17 9 5 7 0 2 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注和 致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的 启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名：匦矗 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名 豳魂! 一 指导教师签名： 签名日期：& d l c 7 年5 月门日 辽宁师范大学硕士学位论文 摘要 在我国东北地区药用植物栽培非常广泛。近些年来，伴随着药用植物种植面积的扩 大和复种指数的提高，药用植物土传病害发生越来越重，严重影响了中药材的产量与品 质。另外，由于药用植物的特殊化学成份及其特殊的根系分泌物，在药用植物根际土壤 中孕育着丰富的微生物资源与独特的微生物区系。本文将主要针对东北地区药用植物根 际土壤真菌的物种多样性开展系统研究，明确主要真菌种类资源和区系分布规律，分离 获得有经济价值的真菌种类资源，为药用植物土传病害的生物防治和筛选有生物活性的 真菌菌株，奠定坚实理论基础。 作者于2 0 0 7 和2 0 0 8 年的5 1 0 月间在辽宁省的丹东、凤城、清原、桓仁，吉林省 的集安、靖宇、抚松、桦甸、黄松甸、和龙、汪清，黑龙江省的哈尔滨、清河、五常等 药材产区采集土壤样品8 0 0 余份，通过采用稀释平板法和土壤颗粒平板法进行土壤真菌 的分离和培养，共分离和鉴定出3 8 属8 9 种真菌，其中接合菌4 属9 种、子囊菌2 属4 种、无性型真菌3 2 属7 4 种，未鉴定2 种，其中中国新记录种5 个。分离到的部分真菌 种类是重要的药用植物病原菌，如c y l i n d r o c a r p o nd e s t r u c t a n s 、f u s a r i u mo x y s p o r u m 夫疆f 。s o l a n i o 丙酞弓毛菽觋p e n i c i l l i u mp a x i l n ，p e x p a n s u m 、t r i c h o d e r m aa t r o v i r i d e 及zm j 幽的分离频率最高，是东北地区药用植物根际土壤真菌的优势菌群。 本文对每种真菌均作了形态描述。针对其海拔高度、土壤类型，气候条件比较有代 表性的辽宁桓仁，吉林集安、抚松等大型人参种植区的要参根际土壤真菌进行生态学调 查，分析了其物种的多样性指数。研究显示，在此三个地区分离频率比较高的真菌为青 霉 木霉 镰孢菌。从生态学调查研究来看，在吉林集安地区人参根际土壤真菌多样性 指数( h ) 为2 2 7 9 4 ，p i e l o u 均匀度指数( j ) 为0 8 0 4 5 ，两项指数均高于辽宁桓仁和抚 松，说明生态环境的多样性对真菌分布存在着直接的影响。 关键词：东北地区；药用植物；形态鉴定 东北地区药用植物根际土壤真菌多样性研究 f u n g a ld i v e r s i t yi nr h i z o s p h e r es o i lo f m e d i c i n a lp l a n t s i nn o r t h e a s t e r nc h i n a a b s tr a c t c h i n e s eh e m sa rew i d e l yc u l t i v a t e di nn o r t h e a s t e r nc h i n a i nr e c e n ty e a r s ，t h es o i l - b o r n e d i s e a s e sa r eb e c o m i n gs e r i o u sd u ot ot h ei n c r e a s i n gc u l t i v a t i o na r e aa n dc o n t i n u o u sc r o p p i n g i n d e xo fv a r i o u sm e d i c a lp l a n t s ，a n dt h ed i s e a s e ss i g n i f i c a n t l ya f f e c tt h eq u a n t i t ya n d q u a l i t yo f m e d i c a lp l a n t s o nt h eo t h e rh a n d ，p l e n t i f u la n ds p e c i f i cg r o u p so f m i c r o o r g a n i s m sg r o wi nt h e r h i z o s p h e r es o i lo f m e d i c a lp l a n t sb e c a u s eo f s p e c i f i cc h e m i c a lc o m p o u n d sc o n t a i n e di na n d s e c r e t e db yt h er o o t l e t so fm e d i c a lp l a n t s t h i sp a p e ri sd e s i g n e dt oi n v e s t i g a t et h ef u n g a l d i v e r s i t yi nr h i z o s p h e r es o i lo fm e d i c a lp l a n t si nn o r t h e a s t e r nc h i n a i no r d e rt ou n d e r s t a n dt h e m a i nf u n g a ls p e c i e si nt h es o i la n dt h e i rd i s t r i b u t i o nc h a r a c t e r i s t i c s b yt h ew a ys o m e e c o n o m i c a l l yi n v a l u a b l ef u n g a lr e s o u r c e sw i l lb ea c q u i r e d ，t h e yc a nb ep o t e n t i a l l yu s e di n b i o c o n t r o lo fm e d i c a lp l a n ts o i l - b o m ed i s e a s e sa n db i o - t r a n s f o r m a t i o ni nm e d i c a l s d u r i n gm a ya n do c t o b e ri n2 0 0 7a n d2 0 0 8 ，m o r e 也a n8 0 0 s o i ls a m p l e sw e r ec o l l e c t e d f r o mt h er h i z o s p h e r eo fm e d i c i n a lp l a n t si nh e r bg r o w i n ga r e a so f n o r t h e a s t e mc h i n a t h es o i l s a m p l i n gs i t e si n c l u d ed a n d o n g ，f e n g c h e n g ，q i n g y u a n ，h u a n r e no fl i a o n i n gp r o v i n c e ；j i a m j i n g y u ，f u s o n g ，h u a d i a n ，h u a n g s o n g d i a n ，h e l o n g ，w a n g q i n go f j i l i np r o v i n c e ；h a e r b i n ， q i n g h e ，w u c h a n go fh e i l o n g i i a n gp r o v i n c e t h cm e t h o do fs o i ld i l u t i n gp l a t ea n ds o i lp a r t i c l e p l a t ew e r et a k e nt oi s o l a t ef u n g i b a s e do nm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s8 9f u n g a ls p e c i e s b e l o n g i n gt 0 3 8g e n e r aw e r ei s o l a t e da n di d e n t i f i e d a m o n gt h e m ，9s p e c i e si n4g e n e r ab e l o n g t oz y g o m y c e t e s ，4s p e c i e si n2g e n e r ab e l o n gt oa s c o m y c e t e s ，w h i l e7 4s p e c i e si n3 2g e n e r a a r ea n a m o r p h i cf u n g i ，2s p e c i e su n i d e n t i f i e d o fw h i c h5s p e c i e sa l en e w l yr e c o r d e di nc h i n a s o m eo ft h ef u n g ia r ei m p o r t a n tp a t h o g e n so fm e d i c i n a lp l a n t s ，s u c ha sc y l i n d r o c a r p o n d e s t r u c t a n s ，f u s a r i u mo x y s p o r u m ，f s o l a n lp e n i c i l l i u mp a x i l l i ，p e x p a n s u m ，w h i l e t r i c h o d e r m aa t r o v i r i d ea n dzv i r i d ea r et h ep r e d o m i n a n tg r o u p so ff u n g ii nt h er h i z o s p h e r eo f m e d i c i n a lp l a n t si nn o r t h e a s t e r nc h i n a i nt h i sp a p e r , e a c hf u n g u sw a s m o r p h o l o g i c a l l yd e s c r i b e da n di l l u s t r a t e dt o g e t h e rw i t h m i c r o g r a p h s t h ee f f e c to fd i f f e r e n te l e v a t i o n ，s o i lt y p ea n df o r e s tt y p e so nf u n g a ld i v e r s i t yi n j i a n ，f u s o n go fj i l i np r o v i n c e ，h u a n r e no fl i a o n i n gp r o v i n c ew a sb r i e f l ya n a l y z e da n d d i s c u s s e d t h ef u n g a ls p e c i e sa b u n d a n c e sw e r ei n v e s t i g a t e d n er e s u l t ss h o wt h a tt h e c o m p o s i t i o n ，q u a n t i t ya n dd i s t r i b u t i o no ff u n g a lp o p u l a t i o n sw e r ec l o s e l ya s s o c i a t e dw i t ht h e c l i m a t ea n dg i n s e n gs o i lt y p e t h er e s u l t sa l s oi n d i c a t et h a tt h ed o m i n a t ef u n g a ls p e c i e si nt h e t h r e ea r e a sw e r ep e n i c i l l i u m t r i c h o d e r m a f u s a r i u m a f t e rf u n g a le c o l o g i c a la n a l y s i s ，t h e s h a n n o n - - r w i e n n e ri n d e xo fj i a ni s 2 2 7 9 4 , a n s t dt 】t h 【l e a i p i e 懵l o u u l v i n l d a e x v i u s ，0 8 0 4 5 一t h e y a r ea l lb i g g e r t h a i li nh _ u a n r e na n df u s o n g t h e r e s u l t ss u g g e s tm a 【k u 1 1 v 汕“” e 虢c to ns o i lf u n g a ld i s t r i b u t i o n k e yw o r d s ：n 。m 蝴c h i n a ；m e d i c i n a l p l a n t s ；m 。枷l 。酉c a l i d e n t i f i c a t i 。n i i i 东北地区药用植物根际土壤真菌多样性研究 目录 摘要i a b s t r a c t i i 引言1 1 文献综述2 1 1 东北地区药用植物的生产概况2 1 2 药用植物根际土壤中的真菌2 1 2 1 药用植物根际土壤中的植物病原真菌2 1 2 2 药用植物根际土壤中存在植物病原真菌的拮抗菌5 1 3 土壤真菌多样性的研究5 1 3 1 真菌分类研究5 1 3 2 真菌分类系统6 1 4 土壤真菌多样性的研究进展6 1 4 1 国外土壤真菌多样性的研究6 1 4 2 国内土壤真菌的研究进展7 1 5 展望8 2 东北地区药用植物根际土壤真菌多样性研究8 2 1 材料与方法8 2 1 1 材料8 2 1 2 方法9 2 2 真菌分类标准的讨论1 0 2 2 1 属级分类标准1 0 2 2 2 种级分类标准1 1 2 3 结果与讨论1 1 2 3 1 接合菌门z y g o m y c o t a 4 0 1 1 2 3 2 子囊菌门a s c o m y c o t a 2 0 2 3 3 无性型真菌a n a m o r p h i cf u n g i 2 3 3 药用植物根际土壤真菌分布特点及分析7 7 3 1 药用植物根际土壤真菌优势菌种的数量及分布特点7 7 3 1 1 青霉菌在药用植物根际土壤中的分布7 7 3 1 2 曲霉菌在药用植物根际土壤中的分布7 8 3 1 3 镰孢菌在药用植物根际土壤中的分布7 9 塑塑塑墼 3 1 4 木霉菌在药用植物根际土壤中的分布7 9 3 2 不同药用植物根际土壤真菌的多样性特点7 9 3 3 讨论8 0 4 不同栽培方式人参土壤真菌多样性及丰富度的研究8 1 4 1 不同栽培方式人参的生长环境概述8 l 结论8 3 参考文献8 4 攻读硕士学位期间发表学术论文情况8 9 致谢9 0 一v 一 辽宁师范大学硕士学位论文 引言 土壤是真菌生长繁殖的天然基质，土壤中存在着大量的真菌，其中许多种类是重要 的植物病原菌。而中药是中华民族医疗保健的宝库，在全球范围内越来越得到广泛的认 可，国际上也掀起了研究和应用中药的热潮，促进了我国药用植物种植业的蓬勃发展。 但是近些年来伴随着药用植物种植面积的扩大和复种指数的提高，在药用植物上发生的 病害种类越来越多，且危害程度也越来越大，其中土传病害对药用植物生产的影响最大。 土传病害的主要病原体为真菌并且危害最大。 一方面真菌的多样性受到土壤质地、土壤温度、酸碱度、土壤中含有的矿物质和有 机质等因素的影响：另一方面真菌的多样性还受到其他土壤理化性质的影响，土壤质地 是重要的影响因子之一嵋1 。 我国药用植物资源极为丰富，是中药种植和出r z j 大国。中药的安全、有效、可控、 稳定是中药现代化的关键。而东北地区更以其独特的地理位置和气候条件成为了中药材 主要分布区。 研究药用植物根际土壤真菌的生物多样性，有望分离和筛选获得可用于病害生物防 治或具有生物催化功能的真菌种类资源，同时对于认识土传病害的发生规律也具有重要 的研究意义。本文通过对东北地区药用植物根际土壤真菌的分离和培养，采用形态学方 法鉴定其真菌种类，从而丰富药用植物根际土壤真菌的主要种类，另外，还可以筛选到 一些有益拮抗菌( 如木霉t r i o h o d e r m a ) 用于土传植物病害的生物防治，为认识土壤真 菌生态学特点和筛选有经济价值的真菌奠定基础。 东北地区药用植物根际土壤真菌多样性研究 1 文献综述 1 1 东北地区药用植物的生产概况 吉林、黑龙江、辽宁是我国中药材的主要产区，包括素有我国三大“中药材基因库” 之称的长白山和大、小兴安岭山脉。东北地区以其独特的气候条件和地理位置成为了我 国中药材的主要分布区。 辽宁是我国中药材的主要生产地之一，尤其辽宁东部地区( 抚顺、本溪、丹东) 栽 培的药用植物种类较多，产量大，其中五味子、细辛、人参等药材的栽培面积大，而且 品质享誉海内外。根据国家中医药管理局2 0 0 5 年发布的统计数据，2 0 0 3 年本溪已发展 山地中药材3 8 万亩，包括山地林下人参、细辛、五味子、防风、龙胆草、柴胡、黄芪 等3 0 余种药用植物，合计5 万亩，年产中药材2 0 万公斤，产值5 亿元。目前，本溪市 拥有百亩药材的村达到8 0 多个，拥有千亩药材的村有5 个。2 0 0 5 年抚顺的中药材种植 面积为3 0 万亩，已发展各类中药材1 0 4 种，年产量高达1 7 万吨，其中人参、细辛、龙 胆草、玉竹闻名国内。在辽宁省各地药用植物栽培比较普遍，一些地区已发展成为特色 药用植物生产基地，如丹东凤城大梨树镇建立了全国最大的北五味子生产基地；铁岭也 正在利用其山区特点，大力发展林下药用植物栽培，如林下栽培人参和五味子等。 吉林省启动了人参、五昧子、西洋参、黄芪、林蛙、甘草、柴胡、龙胆草、细辛、 平贝母、穿山龙、防风、刺五加等共2 6 个无公害规范化生产示范基地建设项目。几年来， 吉林省中药材规范化生产意识得到普遍提高，规范化生产开发已取得实质性的进展。一 部分野生抚育基地改为人工护育可持续开发模式，实现了经济和社会效益双丰收。 黑龙江省药用植物种植品种有人参、龙胆草、刺五加、防风、西洋参、黄柏、五味 子等。黑龙江目前有中药材保护地3 6 处，保护地面积超过5 9 万亩。 1 2 药用植物根际土壤中的真菌 1 2 1 药用植物根际土壤中的植物病原真菌 土壤中存在着大量的真菌，其中许多是重要的药用植物病原菌，如灰霉菌 b o t r y t i 射、镰孢菌f u s a r i u n 钉晦1 、丝核菌r h i z o c t o n i a 嘲等可以引起土传病害。这些病 原菌通常侵染药用植物的根部，造成减产或降低中药材的品质，给生产上造成难以估计 的损失，一直是药用植物生产中的重点问题。其中，药用植物根部腐烂病害主要病原为 真菌，并且危害最大川。 药用植物的土传病害主要有根腐病、枯萎病、立枯病、疫病、菌核病等。病原真菌 2 辽宁师范大学硕士学位论文 以菌丝体在受侵染的植株内越冬或越夏或以休眠体的形式在植物体内外存活，有的甚至 可以腐生的方式在植株的残体和土壤中生活。这些真菌的不同侵染方式构成了土壤真菌 多样性的一部分。 ( 1 ) 枯萎病类 黄芪枯萎病 症状及危害情况：主要危害植株根部，地上枝叶发黄，萎蔫死亡。地下部主根顶端 或侧根首先染病，逐渐向上蔓延。 病原：黄芪枯萎病病原物有三种，木贼镰孢( f u s a r i u me q u i s e t i ) 、半裸镰孢( 只 s e m it e c t u m ) 、茄病镰孢蓝色变种( f u s a r i u ms o l a n iv a r c o e r l c u m ) h 1 。 ( 2 ) 根腐病类 人参、丹参、地黄、黄芪、白芷等均可发生根腐病 人参根腐病 症状及危害情况：症状为根部腐烂。人参锈腐病为主要病害。 病原：人参根腐病病原菌为根腐菌( r h i z o p u sn i g r i c a n s ) s p p ) 、灰链孢菌( m o n i l i ac i n e r e a ) 嘲。 丹参根腐病 症状及危害情况：危害植物根部。受害植株细根先发生褐色干腐，逐渐蔓延至粗根， 根部腐烂，地上部分萎蔫。 病原：木贼镰孢菌( f u s a r i u me q u i s e t i ) 归1 。 黄芪根腐病 症状及危害情况：植株多从主根头部开始腐烂，根上可见变褐色斑枯，严重的根腐 烂呈纤维状。 病原：立枯丝核菌( r h i z o c t o n f as o l a n i ) 、尖孢镰孢( fo x y s p o r u m ) 和茄病镰 孢( 尸s o a n dn 叫。 地黄根腐病 症状及危害：病原菌只能通过伤口或萎蔫的白芷来侵染，伤口是侵染的主要途径， 根周皮在抵抗病菌侵入中起重要作用。 病原：菜豆壳球孢( m a c r o p h o m i n ap h a s e o h n a ) 旧1 。 白芷根腐病 症状及危害：主要危害根及根茎部，初期在近地面根茎和叶柄处呈水渍样黄褐色 斑，逐渐向上扩展，叶片萎蔫。 病原：茄病镰孢( 只s o l a n i ) 、立枯丝核菌( r h i z o c t o n i as o l a n i ) 、恶疫霉 东北地区药用植物根际土壤真菌多样性研究 ( p h y t o p ht h o r ao a ot o r u m ) 嘲。 ( 3 ) 疫病类 人参、西洋参可发生疫病 人参疫病 症状及危害：危害根部及茎叶，叶片病斑呈水浸状，无规则边缘，病斑迅速扩展腐 烂，茎软化倒伏。 病原：恶疫霉( p h y t o p h t h o r ac a c t o r u m ) m 1 。 西洋参疫病 症状及危害：各部位均可受害，被害叶片和叶柄呈水浸状，黑绿色，软化下垂。 病原：恶疫霉( p h y t o p h t h o r ac a c t o r u m ) 渤。 ( 4 ) 菌核病类 人参、细辛可发生菌核病 人参菌核病 症状与危害：主要危害3 年以上人参，还可危害茎部和芦头，初期为水浸状黄褐色 病斑，上有白色菌丝体，后呈灰褐色软腐，烂根表面和茎部均有不规则黑色菌核，芦头 受害春季不能出苗，发病后期地上部萎蔫，易从土中拔出。 病原：人参核盘菌( s o l e r o t i n i as c h i n s e n g ) 踟。 细辛菌核病 症状与危害：主要危害根、茎、叶，初期与健株无异，叶片逐渐变黄，出现圆形、 褐色或粉红色病斑，后出现萎缩，根系溃烂，内部组织腐败分解，表皮内外附有大量黑 色菌核。 病原：细辛核盘菌( s c l e r o t i n i aa s a t l ) 1 。 ( 5 ) 炭疽病类 山药炭疽病 症状与危害：主要危害叶片、叶柄、茎，其他部位也可受害。叶上病斑近圆形，凹 陷，红褐色至黑褐色，叶柄和茎上病斑长圆形，茎基部发病常导致枯萎。 病原：胶孢炭疽菌( c o l l e t o t r i c h u mg l o e o s p o r i o i d e s ) 嘲。 ( 6 ) 灰霉病类 芍药灰霉病 症状与危害：主要危害叶、幼茎、花。叶缘处产生近圆形或不规则形水浸状大斑， 病斑褐色，天气潮湿时常在叶背产生灰色霉层。叶柄、茎上病斑长条形、水渍状，暗绿 色后变为褐色，凹陷软腐，植株折倒。 4 辽宁师范大学硕士学位论文 病原：牡丹葡萄孢( b o t r y t i sp a e o n i a 曲嘲。 1 2 2 药用植物根际土壤中存在植物病原真菌的拮抗菌 药用植物根际土壤中既存在着病原真菌也存在着拮抗菌，1 9 9 8 年任守让等人从人 参生境中的9 0 0 0 余株微生物菌株筛选出2 株绿色木霉( t r i c h o d e r m av i r i d e ) ，温室 栽培结果发现，绿色木霉对人参锈腐病原菌有强烈的抑制作用，具有一定的防治效果。 丁万隆从东北地区人参产区的土壤中分离出木霉( t r i c h o d e r m as p ) 菌株，经研究对立 枯丝核菌( r h i z o c t o n i as o l a n d 具有抑制作用。曾华兰从川红花等土壤筛选出6 2 株木 霉，并初步证实了t 2 3 、t 5 6 对土传病害的防治作用n 2 ，埘。 1 3 土壤真菌多样性的研究 1 3 1 真菌分类研究 ( 1 ) 真菌分类等级 真菌的分类等级依次为界( k i n g d o m ) 、门( p h y l u m ，d i v i s i o n ) 、纲( c l a s s ) 、目 一 ( o r d e r ) 、科( f a m il y ) 、属( g e n u s ) 、种( s p e c i e s ) 。 ( 2 ) 真菌分类单位 形态学种 根据形态特征的不连续性，对真菌个体进行区分的类群，目前，大多数真菌的种是以形 态学种来定义的。 生物学种 一， 任何一个种群的生物，必然起源于某个特定的地区，然后不断向适于向自己生存和繁衍 后代的环境中分化和扩散，在这个过程中，有的种群遭到淘汰，有的则局限在某个相对 隔离的地域，不断地适应外界的环境，能在地球上不同的地域和水域生活。 系统发育种 在现实的真菌分类研究中，一些真菌在形态上很难观察到差异，但借助于系统发育 研究手段，可明显将其区分为明显的不同系谱关系，故产生了系统发育种的概念，即“分 子种”。 ( 3 ) 真菌书写格式 国际植物命名法规对种的命名有严格的规定，一个真菌只能有一个学名，而且 要用拉丁文书写。在书写属以下分类单位时，采用双命名法，用属名+ 种加词来表示， 同时要求写上定名人。属名和种加词用斜体表示，定名人用正体，属名第一个字母要求 大写。书写属级以上的分类单位时，则用正体而不用斜体，书写种下的变种或专化型时， 5 东北地区药用植物根际土壤真菌多样性研究 在种名后加v a r 表变种，用f s p 表示“专化型 ，并在其后加上表示变种或专化型的 形容词和定名人，所加形容词要求斜体书写。 ( 4 ) 真菌在生物界中的地位 英国动物学家c a v a l i e r - s m i t h 提出生物八界学说，将生物分为细菌总界和真核总 界，细菌总界包括真细菌界和古细菌界；真核总界包括原始动物界、原生动物界、植物 界、动物界、真菌界、藻物界。将壶菌、担子菌、子囊菌归为真菌界“引。 1 3 2 真菌分类系统 从1 9 世纪开始，p e r s o o n 、l i n k 等人对一些包含无性态的真菌进行了初步分类研究， 成为了真菌分类命名的起点。f r i e s 在1 8 2 1 年发表的( s y s t e m am y c o l o g i c u m 一书中 将真菌分成四个纲：分生孢子菌纲、腹菌纲、丝孢纲和层菌纲。f u c k e l 在1 8 6 9 年首次 将真菌划分为完全真菌和不完全真菌。s a c c a r d o 在1 8 8 2 1 9 3 1 年 s y l l o g ef u n g o r u m 一书中，首次建立了半知菌分类系统。h u g e s 在1 9 5 3 年首次提出了以分生孢子的形成方 式和产孢特征作为丝孢纲分类的依据口5 1 。自2 0 世纪6 0 年代开始，真菌分类进展迅速。 一些真菌分类技术和手段的使用，如电镜技术、同工酶及蛋白质电泳，使真菌的分类研 究进入到超微结构的水平。在1 9 7 3 - 1 9 8 3 这1 0 年间，半知菌分类系统提出了很多新 观点，最具代表性的就是a i n s w o r t h h a w k s w o r t h 系统。 近些年来分子生物学的研究，尤其是关于r d n a 序列分析研究使子囊菌的真菌分类 发生了根本性的变化。真菌字典第8 版把腹菌和层菌合并在一个系统，承认担子菌 的3 2 个目。将半知菌归到相应的分类系统中“钔。真菌字典第9 版，将菌物的生物 体划分成三界：原生动物界( p r o t o z o a ) 、假菌界( c h r o m i s t a ) 和真菌界( f u n g i ， e u m y c o t a ) 。真菌界下包含4 个门，即壶菌门( c h y t r i d i o m y c o t a ) 、担子菌门 ( b a s i d i o m y c o t a ) 、子囊菌门( a s c o m y c o t a ) 和接合菌门( z y g o m y c o t a ) 。无性型真菌 代替了以前的半知菌，向下又分为丝孢菌( h y p h o m y c e t e s ) 、腔孢菌( c o e l o m y c e t e s ) 和无孢菌( a g o n o m y c e t e s ) 。真菌字典第9 版子囊菌分类中将子囊菌分为 s c h i z o s a c c h a r o m y c e t e s 、a s c o m y c e t e s 、m e o l e c t o m y c e t e s 、 s a c c h a r o m y c e t e s 、 p n e u m o c y s t i d o m y c e t e s 、t a p h r i n o m y e t e s 6 个纲。同时还改写了担子菌门的分类系统u 。 1 4 土壤真菌多样性的研究进展 1 4 1 国外土壤真菌多样性的研究 1 9 0 2 年，k o n i n g 和o u d e m a n s 等人对土壤中真菌的分离方法进行了改进，这是真 正意义上土壤真菌多样性研究的开端。在1 9 2 2 年，一些学者开始了对土壤真菌的定量 6 辽宁师范大学硕士学位论文 研究。1 9 4 0 年，c h e s t e r s 将装有灭菌培养基的试管放置于土壤中，用此方法来分离真 菌，从此，土壤真菌的分类研究步入了快速发展的轨道。d o m s c h 在1 9 8 0 年出版了土壤 真菌多样性研究的专著，其中列出了1 5 9 属4 1 0 种真菌，包括藻状菌、接合菌、子囊 菌、半知菌和担子菌。2 0 0 0 年，v i a u 通过r d n a i t s 限制性片段长度多态性分析，对农 田土壤真菌多样性进行分析和研究。d a v e t 编辑了土壤真菌检测和分离技术。2 0 0 2 年， v a l i n s k y 用寡核苷酸指纹图谱进行了农田土壤真菌多样性的研究n 钔。g o m e 在2 0 0 3 年 对热带玉米根际与非根际土壤真菌动态变化的研究，对1 8 s r d n a 序列进行了扩增、克 隆、测序及d g g e 谱带分析n 引。 1 4 2 国内土壤真菌的研究进展 我国真菌研究与发达国家之间存在较大差距。土壤真菌多样性的研究起步较晚， 国内主要针对a s p e r g i l l u s , f u s a r i u m , p e n i c i l l i u m , p y t h i u m 等重要类群及有关 重要土传病原真菌或用于生物防治的一些土壤真菌( 如t r i c h o d e r m a , a r t h r o b o t r y s 等) 进行过研究，但对更为广泛的土壤真菌的分类研究还较少。1 9 9 9 年，陆勇军对广州市郊 种植的小白菜根际土壤真菌进行了分类鉴定，得到2 9 属7 7 属真菌，结果表明小白菜根 际土壤真菌区系具有多样性。2 0 0 1 年，粱晨等对辽宁地区水稻根际土壤真菌的多样性进 行了研究，得到6 个新记录属和1 个新记录种乜。2 0 0 3 年，李建平等对金沙江区域植 物根际土壤真菌进行了分离和鉴定，得到4 4 种丛枝菌根真菌，分属于原囊霉属、巨孢 囊霉属、无梗囊霉属等。2 0 0 2 年，韩芳等人对黄甫川流域土壤真菌多样性进行了研究。 张天宇等人在2 0 0 4 年对土壤中暗色丝孢菌进行了分类研究，发现许多新种乜剀。杨瑞秀 等人对辽宁、山东地区蔬菜保护地土壤真菌进行了分类研究，发现一些新记录种乜3 孔1 ： 刘会梅等人采用稀释平板法和土壤平板法从黄河三角洲鉴定出1 3 属2 3 种暗色丝孢菌 晒。史铭儡研究了东北地区不同肥力下黑色土壤真菌数量的年变化，说明不同肥力土壤 真菌数量高峰值出现在每一年的不同月份。 东北地区药用植物根际土壤真菌多样性研究 1 5 展望 近些年来，国内外一些学者对土壤真菌多样性进行了初步研究，但对药用植物根际 土壤真菌的种类和数量的研究还比较少。药用植物根际生态系统中有丰富的微生物资 源，土壤中真菌种类十分丰富。通过对不同种类、不同生境下药用植物根际土壤真菌多 样性的研究，明确药用植物根际土壤真菌的种类、数量及其分布规律，可以填补这方面 研究的空白。通过对药用植物根际土壤真菌的分离和鉴定，为建立药用植物根际土壤菌 种库提供种质资源，也将为有益真菌的进一步应用提供原始的资料。因此，药用植物根 际土壤真菌多样性研究对于土壤真菌研究具有重要的意义。 辽宁师范大学硕士学位论文 2 东北地区药用植物根际土壤真菌多样性研究 2 1 材料与方法 2 1 1 材料 供试土壤样品采集地： 辽宁丹东、风城：刺五加( a c a n t h o p a n a xs e n t i c o s u s ) 、 c h i n e n s i s ) 清原：细辛( a s a r u mh e t e r o t r o p o i d e s ) 、玉竹( p o l y g a t u mo d o r a t u m ) 、龙胆草 ( g e nt i a n am a n s h u r i c a ) 、穿山龙( d i o s c o r e an i p p o n i c a ) 、桔梗 ( p at y c o d o ng r a n d i f l o r u s ) 桓仁：人参( p a n a xg i n s e n g ) 吉林集安：人参( p a n a xg i n s e n g ) 、西洋参( p a n a xq u i n q u e f o i u m ) 、五味子 ( s c h i s a n d r ac h i n e n s i s ) 靖宇、抚松：人参( p a n a xg i n s e n g ) 桦甸：川贝母( 乃n j - 盯妇c i r r h o s a ) 和龙、汪清：五味子( s c h i s a n d r ac h i n e n s i s ) 黄松甸：灵芝( g a n o d e r m al u c i d u m ) 黑龙江哈尔滨：五味子( s c h i s a n d r ac h i n e n s i s ) 2 1 2 方法 ( 1 ) 土壤样品的采集 采集前先用采样地点的土样擦拭土铲的表面，采用三点法或五点法，取根际土壤表 面下5 - 2 0 c m 土样，装入无菌聚乙烯袋中，同时详细记录采样地点的地形和土壤类型， 将土样带回实验室立即进行真菌的分离，或将土样保存在4 冰箱中备用。 ( 2 ) 土壤真菌的分离 稀释平板法：称取l o g 土壤样品，加入盛有9 0 m l 无菌水的三角瓶中，使土壤中 的菌丝或孢子均匀地分散在稀释液中制成菌悬液，按l o 倍稀释法用无菌水将其分别稀 释至l o 、1 0 一、1 0 4 倍。吸取一定浓度的菌悬液l m l 滴于培养皿上，与已熔化的4 0 左右的孟加拉红培养基混合均匀，每个样品平行分离3 个平板，然后将其置于2 5 温箱 中光暗交替培养7 天左右。待培养基上长出微小菌落后用p d a 或标准培养基纯化培养， 然后进行真菌的显微镜下形态鉴定。 9 东北地区药用植物根际土壤真菌多样性研究 土壤平板法：称取0 0 0 1 5 9 土壤样品，分散、弄碎，放入培养皿中，然后倒入 已熔化的4 0 。c 的孟加拉红培养基混合均匀，然后将其置于2 5 。c 温箱中光暗交替培养7 天左右。待培养基上长出微小菌落后用p d a 或标准培养基纯化培养，然后进行真菌的显 微镜下形态鉴定。 ( 3 ) 培养基 土壤真菌培养基的使用汹儿明 1 马铃薯葡萄糖琼脂培养基( p o t a t od e x t r o s ea g a r ，p d a ) 马铃薯2 0 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，琼脂1 8 2 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l 2 马铃薯蔗糖琼脂培养基( p o t a t os u c r o s ea g a r ，p s a ) 马铃薯2 0 0 9 ，蔗糖2 0 9 ，琼脂2 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l 3 s n a m g s q 7 h 2 00 5 9 ，k h 2 p 0 41 o g ， k n 0 31 o g ，k c l0 5 9 ，蔗糖0 2 9 ，葡萄糖0 2 9 ， 琼脂2 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l 4 麦芽浸膏琼脂培养基( m a l te x t r a c ta g a r ，m e a ) 麦芽浸膏2 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，琼脂1 5 9 ，蛋白胨1 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l 5 s m a d e x t r o s e l o g ，a s p a r a g i n e2 9 ，k h 2 p 0 40 5 9 ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 5 9 ，t h i a m i n ec h l o r i d e 0 5 m g ，琼脂1 5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l 6 查氏琼脂培养基( c z a p e ka g a r ，c a ) n a n o 。3 9 ，k 2 h p 0 4i g ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 ，k c l0 5 9 ，f e s 0 4 7 h ：00 o l g ，琼脂1 5 9 ， 蔗糖3 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 毫升 7 查氏酵母浸膏培养基( c z a p e ky e a s ta g a r ，c y a ) 查氏浓缩液1 0m l ，k ：h p 0 41 o g ，酵母膏5 0 9 ，琼脂1 5 9 。蔗糖3 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l 。 8 燕麦片琼脂培养基( o a t m e a la g a r ，o a ) 琼脂2 0 克，燕麦片3 0 克，蒸馏水1 0 0 0 m l 9 子囊琼脂培养基( h s c u sa g a r ) n a c i5 9 ，牛肉浸膏l o g ，琼脂l o g ，葡萄糖2 5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l 培养方法 在进行纯化和标准培养时，将f u s a r i u m 转移至s n a 培养基上汹1 ，将m u c o r 转移至 s m a 培养基上晒】，将p e n i c i l l i u m 和a s p e r g i l l u s 转移至c a