（外科学专业论文）乙酰胆碱、p物质对人食管下括约肌细胞的收缩作用.pdf

! 、j j 目录 fiiir fr r r l l lf llu f l l f l f l l lf f li l l f 18 0 0 319 中文摘要l 英文摘要”4 研究论文乙酰胆碱、p 物质对人食管下括约肌细胞的收缩作用 前言”8 嗣舌”芍 材料与方法9 结果1 l 附图1 2 讨论16 结论1 9 参考文献2 0 综述人食管下括约肌的生物学特性及对其调节的常见神经递质2 6 致谢3 9 个人简历4 0 中文摘要 乙酰胆碱、p 物质对人食管下括约肌细胞的收缩作用 摘要 目的：医学界对食管下括约肌( 1 0 w e re s o p h a g e a l s p h i n c t e r ，l e s ) 是否存 在及其结构特点的探讨经历了一个很长的发展过程。直到19 7 9 年， l i e b e r m a n n m e f f e r t 等学者通过对3 2 例尸体标本的解剖研究，详细阐明 了食管胃连接部( e s o p h a g o g a s t r i c j u n c t i o n ，e g j ) 平滑肌束的宏观排列，进 一步提出人类l e s 的肌肉系统由套索纤维( s l i n gf i b e r s ) 和钩状纤维( c l a s p f i b e r s ) 共同构成。套索纤维是一组不完整的u 形肌束悬挂于胃食管交界部， 食管下端的左侧，h i s 角上方。它的开口侧位于胃小弯，闭口侧位于胃大 弯。钩状纤维位于l e s 右侧，呈半环形。这两束肌肉共同维持l e s 的关 闭状态，并形成了l e s 高压带( h i g h p r e s s u r ez o n e ，h p z ，l5 - 3 0m r n h g ) 。 这一理论为进一步研究l e s 的生理、病理和药理学特性奠定了基础。随 后学者们主要对不同动物l e s 的生理学特点和功能调节进行了更进一步 的探讨，发现l e s 具有明显不同于其它平滑肌结构的特性。而且更为重 要的是，构成l e s 的钩状纤维和套索纤维在诸多方面也存在着很大的差 异性。神经递质a c h 是食管下括约肌的最主要的兴奋性神经递质。体外 实验证明套索纤维对乙酰胆碱( a c h ) 的敏感性更高。钩状纤维有更大的自 发张力。造成l e s 套索纤维和钩状纤维结构和功能的不同的机制还未完 全阐明。许多实验证明无论是在离体还是活体情况下，a c h 引起食管下括 约肌环形肌和纵形肌的兴奋。乙酰胆碱能神经元大部分位于食管下括约肌 的左侧壁，右侧壁由轴突支配。这可能是食管下括约肌左侧压力较右侧为 高的原因。p 物质为脑肠肽类神经递质，p 物质免疫相关性神经纤维在猫 和豚鼠的食管下端中数量很多，在肠肌丛和黏膜下丛分布也较多，在环型 肌和纵形肌及黏膜中也有分布。免疫组化证明，p 物质存在于迷走神经末 梢中。食管末端p 物质可能作为对化学伤害感受刺激的神经递质，加强食 管平滑肌的收缩反应。本文试图研究在乙酰胆碱和p 物质这两种不同的神 经递质作用下套索纤维和钩状纤维功能上的差异是否表现在细胞收缩程 度上的不同。本实验应用平滑肌细胞分离技术，在倒置显微镜下通过测量 平滑肌细胞长度变化来测定乙酰胆碱、p 物质分别对人食管下括约肌钩状 中文摘要 纤维、套索纤维、食管环形肌和胃底环行肌的作用，并为将来治疗食管功 能性疾病奠定基础。 方法：选取2 0 0 8 年1 2 月至2 0 0 9 年1 2 月在河北医科大学第四医院因食管 中段癌行食管大部切除术患者3 0 6 4 ，其中男性1 8 6 4 ，女性1 2 例，平均年龄 5 9 3 岁。手术室采集新鲜手术标本，锐性剥去胃贲门部及食管下段的粘膜 层及粘膜下层后，制备食管环形肌、胃底环形肌、套索纤维、钩状纤维的 肌条，将肌条剪成1m m 3 2 m m 3 的小块，用含胶原酶i i 的细胞分离液分离出 单个平滑肌细胞。确认分离细胞活性在9 0 以上。然后用3 7 h e p e s 缓冲 液悬浮备用。细胞存活率测定：取5 滴细胞悬浮液，加1 滴o 2 的台盼蓝 溶液，混匀3m i n 内计数，当细胞死亡时将被染成红色，活细胞无色。用 以下公式计算细胞存活率：存活率( ) = 活性细胞总数( 活性细胞数+ 死 细胞数) 1 0 0 。然后在倒置显微镜下分别测定乙酰胆碱、p 物质作用于 套索纤维和钩状纤维与食管环形肌、胃底环形肌后，这四种肌纤维单细胞 分别的收缩情况。每一个反应的细胞悬液被放在载玻片上，加盖玻片后在 倒置显微镜下观察，随机检n 3 0 个细胞长度。细胞收缩的反应以前后细胞 变化的百分数来表示。 结果：在倒置显微镜下，游离的平滑肌细胞形态呈梭形，胞质密度高， 表面光滑、透明，中间有一圆形或椭圆形的核。( f i g 1 - f i g 4 ) 在h e p e s 缓冲 液孵育的状态下，钩状纤维平均长度为( 9 7 9 9 士1 2 1 5 ) g m ( n = 2 1 0 ) 、套索纤 维平均长度为( 9 9 3 3 士1 0 9 8 ) g m ( n = 2 1 0 ) 、食管环形肌纤维平均长度为 ( 9 7 8 6 士1 2 2 7 ) “m ( n = 2 1 0 ) 、胃底环形肌纤维平均长度为( 9 9 3 2 士11 5 0 ) p m ( n = 2 1 0 ) 。四组纤维细胞长度间无统计学差异。( p = - 6 5 7 ) 乙酰胆碱可以引起食管下括约肌的钩状纤维、套索纤维及食管环形 肌、胃底环形肌四种类型的肌纤维收缩，这四种肌细胞的收缩程度不同， 收缩百分比分别为( 1 1 9 4 士2 2 1 ) 、( 2 2 6 2 士3 2 2 ) 、( 1 6 6 2 2 9 7 1 ) 和 ( 2 2 8 2 士2 8 4 ) ；四组纤维细胞长度间有统计学差异( 仁o ) ( t a b l e2 ) 。p 物质 引起食管下括约肌钩状纤维、套索纤维及食管环形肌、胃底环形肌的收缩 百分比分别为( 2 2 4 8 士3 3 6 ) 、( 2 4 7 7 士9 0 1 ) 、( 1 9 0 1 2 4 3 5 ) 和 ( 1 9 11 2 3 2 1 ) ；四组纤维细胞长度间有统计学差异( p - - o ) ( t a b l e3 ) 。 结论：乙酰胆碱可以引起食管下括约肌的套索纤维、钩状纤维、食管 环形肌细胞和胃底环形肌细胞产生收缩效应。其中套索纤维产生的收缩效 中文摘要 一一 应最大；p 物质同样可以引起食管下括约肌的套索纤维、钩状纤维、食管 环形肌细胞和胃底环形肌细胞产生收缩效应，其中套索纤维、钩状纤维收 缩效应最明显，两者之间无差异。 关键词：食管下括约肌；套索纤维；钩状纤维；乙酰胆碱； p 物质 英文摘要 t h es t u d yo nt h et h ec o n t r a c t i o no fh u m a nl o w e r e s o p h a g e a ls p h i n c t e ri n d u c e db ya c e t y l c h o l i n ea n ds u b s t a n c ep a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t h e e x i s t e n c ea n ds t r u c t u r a l e q u i v a l e n t o ft h el o w e r e s o p h a g e a ls p h i n c t e r ( l e s ) i nh u m a nb e i n g sh a v e b e e nam a t t e ro fs p e c u l a t i o n f o r m a n yy e a r s a f t e r s t u d y i n g t h e a n a t o m y o f3 2 c a d a v e r s ， l i e b e r m a n n m e f f e r te ta ld e s c r i b e dt h ea r r a n g e m e n to ft h es m o o t hm u s c l e sa t t h ee s o p h a g o g a s t r i cj u n c t i o n ( e g j ) i nd e t a i l t h e yd e m o n s t r a t e dt h a tt h e m u s c u l a t u r eo ft h eh u m a nl e sc o n s i s t e do f s l i n gf i b e r sa n dc l a s pf i b e r s l e s c l a s pf i b e r si sas e m i - c i r c u l a ri nt h er i g h ts i d e ，w h i l es l i n gf i b e r si su - s h a p e d b a n dh o i s t e di nt h eg a s t r o e s o p h a g e a lj u n c t i o n b o t hm u s c l em u s c l e sm a i n t a i n t h ec l o s u r es t a t u so ft h el e s ，a n df o r ma h i g h - p r e s s u r ez o n e ( h p z ， 15 - 3 0 m m h g ) t h i st h e o r yl a i dt h ef o u n d a t i o nf o rf u r t h e rs t u d i e so nt h e p h y s i o l o g y ，p a t h o l o g ya n dp h a r m a c o l o g yo ft h el e s f r o mt h e no n ，s o m e r e s e a c h e r sh a v ei n v e s t i g a t e dt h ep h y s i o l o g ya n dr e g u l a t i o nm e c h a n i s mo fl e s f r o md i f f e r e n ta n i m a l s ，a n df o u n dt h a tl e sh a dd i f f e m tp r o p e r t yd i f f e r e n t f r o mo t h e rs m o o t hm u s c l es t r u c t u r e a n dm o r e i m p o r t a n t l y ，t h e r ea r ea l s o g r e a td i f f e r e n c e si nt h es l i n gf i b e r sa n dc l a s pf i b e r s t h e r e f o r e ，t h ea b n o r m a l c h a n g e so fl e ss t r u c t u r ea n df u n c t i o nm a yb et h ep a t h o l o g i c a lb a s i so fa v a r i e t yo fe s o p h a g e a ld i s e a s e s a c e t y l c h o l i n e ( a c h ) i st h em o s ti m p o r t a n t e x c i t a t o r yn e u r o t r a n s m i t t e ri nt h el o w e re s o p h a g e a ls p h i n c t e r s l i n gf i b e ri s m o r es e n s i t i v et oa c hi nv i t r o c l a s pf i b e r sh a v eg r e a t e rs p o n t a n e o u st e n s i o n t h ed i f f e r e n tm e c h a n i s m so fs t r u c t u r ea n df u n c t i o no ft h es l i n ga n dc l a s p f i b e r si nl e sa r en o tw e l lk n o w n y e t m a n ye x p e r i m e n t sh a v ep r o v e dt h a ta c h c o u l di n d u c ec o n t r a c t i o no fc i r c u l a rm u s c l ea n dl o n g i t u d i n a lm u s c l eo ft h e l o w e re s o p h a g e a ls p h i n c t e re i t h e ri nv i t r oo ri nv i v o a c e t y l c h o l i n en e u r o n s m o s t l yi nt h el e f to ft h el o w e re s o p h a g e a ls p h i n c t e r , a n di nt h er i g h ti st h e a x o n t h i sm i g h tb et h er i g h tr e a s o nf o rt h eh i g h e rp r e s s u r eo nl e f ts i d eo ft h e l o w e re s o p h a g e a ls p h i n c t e r ps u b s t a n c ei so n eo ft h eb r a i n g u tp e p t i d e 4 英文摘要 n e u r o t r a n s m i t t e r s ，a n dm o s to fi t si m m u n en e r v ef i b e r sd i s t r i b u t e di nt h el o w e r e s o p h a g e a lm u s c l e s ，i n t e s t i n a ls u b m u c o s a lp l e x u sa n dp l e x u s ，a n dt h er i n ga n d l o n g i t u d i n a l m u s c l e sa n dm u c o s ao f c a t sa n d g u i n e ap i g s i m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t u d yd e m o n s t r a y e dt h a ts u b s t a n c epw a sd i s t r i b u t e di n n e r v e e n d i n g so ft h ev a g u s t h es u b s t a n c epm i g h tb eac h e m i c a l n e u r o t r a n s m i t t e r sf o rn o c i c e p t i v es t i m u l a t i o no ft h ee n do fe s o p h a g o u st o i n d u c e e s o p h a g e a l s m o o t hm u s c l ec o n t r a c t i o n i nt h i s e x p e r i m e n t ，w e m e a s u r e dt h ec o n t r a c t i o no ft h ec l a s pf i b e r s ，s l i n gf i b e r s ，c i r c u l a rm u s c l eo f t h eg a s t r i cf u n d u s ，c i r c u l a rm u s c l eo ft h ee s o p h a g u sw h i c hw a si n d u c e db y a c e t y l c h o l i n ea n ds u b s t a n c ep ，f o rt h ep u e p o s eo fu n d e r s t a n d i n ga n df u t u r e t r e a t m e n to f e s o p h a g e a lm o t i l i t yd i s o r d e r s m e t h o d s ：s m o o t hm u s c l e so ft h es l i n gf i b e r s ，c l a s pf i b e r s ，c i r c u l a r m u s c l e so ft h ee s o p h a g u sa n dg a s t r i cf u n d u sw e r eo b t a i n e df r o m3 0p a t i e n t s w h ou n d e r w e n ts u b t o t a l e s o p h a g e c t o m yf o rm i d d l et h o r a c i ce s o p h a g e a l c a r c i n o m ai nt h ef o u r t hh o s p i t a l ，h e b e im e d i c a lu n i v e r s i t yf r o md e c e m b e r 2 0 0 8t od e c e m b e r2 0 0 9 t h e r ew e r e18m a l e sa n d12f e m a l e sw i t ham e a n a g e o f5 9 3y e a r s f r e s hs p e c i m e n so fe g jw a sc o l l e c t e df r o mo p e r a t i n gr o o m s h a r pd i s s e c t i o no fm u c o s a la n ds u b m u c o s a ll a y e r sw e r ep e r f o r m e d t h e m u s c l es t r i p so fs l i n ga n dc l a s pf i b e r sw e r es e p e r a t e da n dt h e nc u tt os m a l l p i e c e so f1m m j 2n l l n = s i n g l ec e l l sw a si s o l a t e du s i n gc e l ls e p a r a t i o n s o l u t i o nc o n t a i n i n gc o l l a g e n a s ei i a r e rm o r et h a n9 0p e r c e n tv i a b i l i t yo ft h e c e l l sw a sc o n f i r m e d ，t h ec e l l sw e r er e s u s p e n d e di nh e p e sb u f f e ra t3 7 。cf o r s u b s e q u e n tu s e f i v ed r o p so fc e l ls u s p e n t i o na n d1d r o po f0 2 t h et r y p a n b l u ew a sm i x e df o r3m i nf o rc e l lv i a b i l i t yd e t e r m i n a t i o n d e a dc e l l sw e r e d y e dr e d ，a n dl i v i n gc e l l sc o l o r l e s s t h ep e r c e n t a g eo fc e l lv i a b i l i t yw a s c a l c u l a t e dw i t ht h ef o l l o w i n gf o r m u l a ：s u r v i v a lp e r c e n t a g e = n u m b e ro fv i a b l e c e l l s t o t a ln u m b e ro fc e l l s ( v i a b l ec e l l + d e a dc e l l ) xl0 0 c e l l sf r o mc l a s p f i b e r s l i n gf i b e r , c i r c u l a rm u s c l e so ft h ee s o p h a g u sa n dg a s t r i cf u n d u sw e r e c o n t r a c t e db ye x p o s u r et oa c e t y l c h o l i n e ，s u b s t a n c ep t h e nw em e a s u r e dt h e c o n t r a c t i o no ft h es l i n gf i b e r s ，c l a s pf i b e r s ，c i r c u l a rm u s c l e so ft h ee s o p h a g u s a n dg a s t r i cf u n d u sw h i c hi n d u c e db ya c e t y l c h o l i n ea n ds u b s t a n c ep ad r o po f 5 英文摘要 t h ec e l l c o n t a i n i n gm e d i u mw a sp l a c e do nag l a s ss l i d ea n dc o v e r e dw i t ha c o v e rs l i p t h el e n g t ho f3 0c o n s e c u t i v ei n t a c tc e l l se n c o u n t e r e da tr a n d o mi n e a c hs l i d ew a sm e a s u r e dw i t hap h a s e c o n t r a s tm i c r o s c o p e t h ea v e r a g e l e n g t ho f 3 0c e l l sm e a s u r e di nt h ea b s e n c eo fa g o n i s t sw a st a k e na s c o n t r o l l e n g t h i na d d i t i o n ，a v e r a g ec e l ll e n g t hw a sm e a s u r e da f t e ra d d i t i o no ft e s t a g e n t s r e s u l t s ：u n d e rp h o t o m i c r o g r a p h ，t h es m o o t hm u s c l ec e l l sw e r es p i n d l e a n dh a dah i g hd e n s i t yo fn u c l e u s i t ss u r f a c ew a ss m o o t ha n dt r a n s p a r e n t ， a n dt h e r ew a sar o u n do ro v a ln u c l e u si nt h em i d d l eo ft h ec e l l i nh e p e s b u f f e ri n c u b a t i o n ，t h ea v e r a g el e n g t h o fc l a s pf i b e r sw a s9 4 0 94 - 17 5 3 岬( n = 2 1 0 ) i nl e n g t h ，s l i n gf i b e r sw a s9 7 0 5 土1 1 7 9p m ( n = 2 1 0 ) ，e s o p h a g e a l c i r c u l a rm u s c l ef i b e r sw a s9 7 214 - 10 7 6 肛m ( n = 210 ) ，a n dg a s t r i cc i r c u l a r m u s c l ef i b e rw a s9 7 2 54 - 13 719 p m ( n = 21o ) t h e r ew a sn os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c eb e t w e e nt h el e n g t ho ff o u rg r o u p sf i b e rc e l l s ( f = 2 6 7 ，p = 0 0 7 ) a c e t y l c h o l i n e c o u l di n d u c ec o n t r a c t i o no ft h ec l a s pf i b e r s ，s l i n g f i b e r s ， c i r c u l a rm u s c l e so ft h ee s o p h a g u sa n dg a s t r i cf u n d u s ，t h ep e r c e n t a g eo f m u s c l ec e l lc o n t r a c t i o nw a s ( 11 9 44 - 2 2 1 ) ，( 2 2 6 2 - 4 - 3 2 2 ) ，( 1 6 6 24 - 9 71 ) a n d ( 2 2 8 24 - 2 8 4 ) ，r e s p e c t i v e l y t h e r ew a ss t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c eo f t h el e n g t ho ff o u rs m o o t hm u s l ec e l l sg r o u p s ( ( f = 19 6 9 7 ，p = o ) s u b s t a n c ep c o u l di n d u c ec o n t r a c t i o no fc l a s pf i b e r s ，s l i n gf i b e r s ，c i r c u l a rm u s c l e so ft h e e s o p h a g u sa n dg a s t r i cf u n d u sa n dt h ep e r c e n t a g eo fc o n t r a c t i o nw a s ( 2 2 4 84 - 3 3 6 ) ，( 2 4 7 74 - 9 0 1 ) ，( 1 9 0 14 - 4 3 5 ) a n d ( 1 9 1 l4 - 3 2 1 ) r e s p e c t i v e l y t h e r ew a ss t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c ef o rf o u rg r o u p so ff i b e rc e l l s ( f = 15 2 2 7 ，p = o ) c o n c l u s i o n s ：a c e t y l c h o l i n ec o u l dc a u s et h ec o n t r a c t i o no fs l i n gf i b e r s ， c l a s pf i b e r s ，c i r c u l a rm u s c l e so ft h ee s o p h a g u sa n dg a s t r i cf u n d u s ，a n dt h e s t r o n g e s tc o n t r a c t i o ni so nt h es l i n gf i b e r s s u b s t a n c epc o u l da l s oc a u s e c o n t r a c t i o no ft h ef o u rk i n d so ff i b e r s ，a n ds l i n gf i b e r sa n dc l a s pf i b e r s c o n t r a c tg t r o n g e s t k e yw o r d s ：l e s ；s l i n gf i b e r s ；c l a s pf i b e r s ；c i r c u l a rm u s c l eo ft h e 6 英文摘要 _ 一_ 一 g a s t r i cf u n d u s ；c i r c u l a rm u s c l eo f t h ee s o p h a g u s ；s u b s t a n c ep ；a c e t y l c h o l i n e 一 7 研究论文 乙酰胆碱、p 物质对人食管下括约肌细胞的收缩作用 - 上- 一 刖吾 食管运动功能障碍性疾病如贲门失弛缓症、弥漫性食管痉挛、弥胃食 管反流病( g e r d ) 等的发病率日益增高【l 2 】，严重威胁人类生命健康。在欧 美发达国家高达到1 0 【3 训，在我国虽然没有确切的统计数据，但是临床 存在大量胸骨后返酸、灼痛、吞咽困难的患者被证实与此类疾病有关。长 期慢性病变可以导致慢性食管炎、b a r r e t t 食管、吸入性肺炎、食管狭窄、 甚至癌变，严重威胁人类生命健康【5 】。以胃食管反流病为例，对其发生机 制所做的研究，对未来临床食管功能性疾病及食管癌的研究有重大的临床 意义。食管功能障碍性疾病是多因素疾病，其中食管收缩、舒张功能障碍 成为其发病的主要原因。因此，研究食管的功能，尤其是收缩、舒张机制 成为其关键由于l e s 解剖结构，神经支配的复杂性及生理功能的重要性， 学术界对l e s 的调节机制的研究一直是一个热点。正常状态下，l e s 持 续保持的收缩状态限制了胃内容物向食管方向的异常反流；另一方面， l e s 可以适时开放以允许营养物质进入胃内【6 1 。食管三维测压技术发现 l e s 套索纤维方向上的压力明显高于其它三个方向。也就是是说它们之间 的呈不对称分布，l e s 邻近食管的部位较厚【7 1 0 1 ，这直接与高压带的形成 相关。研究发现阿托品阻滞胆碱能受体可使这一高压显著的降低【6 】，这说 明l e s 压力形成过程中存在胆碱能敏感区域性差异。p r e i k s a i t i s t 7 等研究 发现套索纤维对m 受体激动剂卡巴胆碱刺激有更大的收缩反应，而钩状 纤维有较套索纤维更大的自发张力。p 物质为脑肠肽类神经递质，p 物质 免疫相关性神经纤维在猫和豚鼠的食管下端中数量很多，在肠肌丛和黏 膜下丛分布也较多，在环型肌和纵形肌及黏膜中也有分布。免疫组化证 明，p 物质存在于迷走神经末梢中。食管末端p 物质可能作为对化学伤害 感受刺激的神经递质，加强食管平滑肌的收缩反应，这与生理学研究提出 迷走神经传入纤维在食管蠕动中起到的效应器作用是通过释放p 物质来 完成是相符合的【1 1 1 。国内外对此的研究主要集中在形态学、食管腔内压力 测定、食管p h 测定，以及体外模型和动物实验等方面1 6 - 1 0 】对不同种属动 物l e s 的生理学特点和功能调节进行了较为深入的探讨。因为哺乳动物 研究论丈 食管的肌组织构成有着较大的种属差异，因此，有必要对人的食管平滑肌 细胞的作用做进一步的研究，在细胞水平上观察其作用机制。分离哺乳动 物胃肠平滑肌细胞的技术的建立，为进一步研究平滑肌细胞的功能提供了 新的途径。由于细胞离散，排除了在体内或离体水平神经、体液因素的影 响，使细胞扩散屏障减到最低程度，有利于研究平滑肌细胞动力变化的关 系。 本实验应用平滑肌细胞分离技术分离平滑肌细胞，在倒置显微镜下通 过测量平滑肌细胞长度变化来测定乙酰胆碱、p 物质分别对人食管下括约 肌钩状纤维、套索纤维、食管环形肌和胃底环行肌的作用，进一步了解引 起套索纤维和钩状纤维、食管环形肌、胃底环行肌功能差异的原因，并为 将来治疗食管功能性疾病奠定基础。 1 材料与仪器 超级数字恒温槽 气体储存灌注系统 g r 0 2 0 0 精密电子天平 i x 7 0 荧光倒置显微镜 图像采集系统 p h s 3 c 型酸度仪 尼龙筛网 胶原酶i i p 物质 小牛血清 h e p e s 混合气( 0 29 5 ，c 0 25 ) 乙酰胆碱 其它为国产分析纯 2 方法 2 1h e p e s 溶液的配制 材料与方法 宁波天恒仪器厂 北京普莱克斯气体有限公司 日本a n d 公司 日本尼康公司 日本尼康公司 上海康仪仪器有限公司 南京美易科技有限公司 美国i n v i t r o g e n 公司 美国a l e x i s 公司 杭州四季青有限公司 美国s i g m a 公司 北京普莱克斯气体有限公司 美国a l e x i s 公司 天津市北方天医化学试剂厂 研究论文 h e p e s2 0 m m o lll ，n a c i 12 5 m m o l l ，k c i8 0 m m o l | l ，c a c l 2 、8 m m o l l ，n a h 2 p 0 22 5 m m o l l ，m g c l 21 2 m m o l l ，g l u c o s e11 5 m m o l l ， 用去离子水溶解，n a o h0 1m m o l l 滴定，酸度仪调至p h 7 2 。 2 2 细胞分离液的配制 胶原酶1 10 5 m g m l ，小牛血清1 0 ，h e p e s 液。 2 3 研究对象的选择 选取2 0 0 9 年2 月至2 0 0 9 年1 2 月在河北医科大学第四医院因食管中、上段癌 行食管大部切除术患者3 0 例，其中男性1 8 例，女性1 2 例，年龄4 7 岁6 9 岁， 平均年龄5 9 3 岁。病人术前均无烧心、返酸症状，亦无贲门失弛缓症及硬 皮病等可能导致l e s 功能障碍的病史或药物服用史。本研究经河北医科大 学伦理委员会批准，所有患者均知情同意。 2 4 标本的制备 2 4 1 将手术室采集的食管胃结合部标本迅速锐性剥去胃贲门部及食管下 段的粘膜层和粘膜下层，小心游离出套索纤维和钩状纤维，以及食管体部 环行肌和胃底环行肌，套索纤维和钩状纤维的获取部位尽量靠近贲门口附 近，食管和胃底环行肌的获取部位要尽可能远离食管胃连接处，胃底部环 行肌条的获取部位要远离食管胃结合部2 5 c m 以上，食管环行肌条的获取 部位要远离食管胄接合部3 c m 以上。在游离肌条过程中，仔细进行解剖 以确保肌条的长轴平行于肌束的走行，且要去除纵行肌。如因肿瘤侵犯或 切取范围过小而不能满足同时获取四束肌条的标本均弃去不用。只有在显 微镜下观察正常组织才能使用。然后将肌条剪成lm m 3 _ 2 m m 3 小块。放入 3 7 的充以混合气体( 0 2 9 5 ，c 0 2 5 ) 半小时以后的h e p e s 溶液中。用 3 7 。c h e p e s 液漂洗2 3 次，最后加入细胞分离液中，在3 7 恒温摇床中孵 育6 0 m i n ；消化完成后过4 0 0 目滤网，收集细胞悬液，注入尖体离心管， 离心去上清，h e p e s 缓冲液清洗两遍，用尖端抛光、开口较大的吸管柔 和吹打3m i n ，分离出单个平滑肌细胞。台盼蓝染色法评价细胞活性。 2 4 2 细胞存活率测定：取5 滴细胞悬浮液，加l 滴o 2 的台盼蓝溶液，混 匀3m i n 内计数，当细胞死亡时将被染成红色，活细胞无色。用以下公式 计算细胞存活率：存活率( ) = 活性细胞总数( 活性细胞数+ 死细胞 数) 1 0 0 。要求存活率在9 0 以上有意义。 2 4 3 细胞长度的测定分别取钩状纤维细胞悬液、放在载玻片上，加盖 研究论文 玻片后观察，在倒置显微镜下观察其长度，随机检测3 0 个细胞长度，用“m 表示。同样的方法依次对套索纤维、食管环形肌和胃底环形肌细胞分别进 行进行测量。 2 4 4 细胞收缩长度的测定 每一种平滑肌细胞悬液在激动剂溶液中缩小的现象，可以用加入激动剂前 7 后细胞长度变化的百分数来表示，随机3 0 个细胞长度计算其长度比，计算 公式为：细胞收缩百分率= ( 对照组细胞平均长度一给药组细胞平均长度) 对照组细胞平均长度1 0 0 。 2 5 统计学处理实验数据用均数4 - 标准差表示，采用s p s s1 7 0 统计分析软 件进行组间及组内方差分析。 结果 1 游离的单个食管、胃平滑肌细胞形态特点 在倒置显微镜下，游离的平滑肌细胞形态呈梭形，胞质密度高，表面 光滑、透明，中间有一圆形或椭圆形的核。( f i g 1 f i g 4 ) 在h e p e s 缓冲液孵 育的状态下，钩状纤维平均长度为( 9 4 0 9 m 7 5 3 ) g i n ( n = 2 1 0 ) 、套索纤维平 均长度为( 9 7 0 5 4 - 11 7 9 ) g m ( n = 2 1 0 ) 、食管环形肌纤维平均长度为 ( 9 7 2 1 4 - 1 0 7 6 ) g i n ( n = 2 1 0 ) 、胃底环形肌纤维平均长度为( 9 7 2 5 4 - 1 3 7 2 ) g i n ( n - 2 1 0 ) 。四组纤维细胞长度间无统计学差异。( f = 2 6 7 ，p = 0 0 7 ) 2 乙酰胆碱可以引起食管下括约肌的套索纤维、钩状纤维、食管环形肌细 胞和胃底环形肌细胞产生收缩效应。乙酰胆碱引起的收缩效应的比较：其 中钩状纤维、套索纤维及食管环形肌、胃底环形肌的收缩百分比分别为 ( 11 9 4 4 - 2 2 1 ) 、( 2 2 6 2 - 4 ：3 2 2 ) 、( 1 6 6 2 4 - 9 7 1 ) 和( 2 2 8 2 4 2 8 4 ) ；1 0 7 m o l l ， 四组纤维细胞长度间有统计学差异。( f = 1 9 6 9 7 ，p - o ) 其中套索纤维产生 的收缩效应最大。p 物质同样可以引起食管下括约肌的套索纤维、钩状纤 维、食管环形肌细胞和胃底环形肌细胞产生收缩效应，钩状纤维、套索纤 维及食管环形肌、胃底环形肌的收缩百分比分别为( 2 2 4 8 4 - 3 3 6 ) 、 ( 2 4 7 6 4 - 9 0 1 ) 、( 1 9 0 1 4 - 4 3 ) 和( 1 9 1 0 4 3 2 1 ) ；四组纤维细胞长度间有统 计学差异。( f = 15 2 2 7 产o ) ( f i g 5 f i g 7 ) 。 研究论文 附图 f i g 1p h o t o m i c r o g r a p ho fi s o l a t e ds m o o t hm u s c l ec e l l sf r o mc l a s pf i b e r so f h u m a n t h es m o o t hm u s c l ec e l l sa r es p i n d l ea n di t ss u r f a c ei ss m o o t ha n d t r a n s p a r e n t ，a n dt h e r ei sar o u n do ro v a ln u c l e u si nt h em