（有机化学专业论文）风湿性关节炎药物青藤碱的结构修饰.pdf

中文摘要 风湿性关节炎( r a ) 是以对称性多关节滑膜炎为特点的自身免疫性疾病，其特 点为关节骨质破坏、功能丧失甚至残疾j 是严重威胁人类健康的疾病之一。青风 藤作为传统中医药学中治疗各种关节炎的一味主药，经过数百年的临床验证，认 为其能够改善关节症状，且副作用小，病人的耐受性好，适应于上述疾病患者长 期服用。青藤碱( s i n o m e n i n e ，s n ) 是提取自青风藤的生物碱，既往的研究表明s n 具有抗炎、镇痛、抗风湿、免疫抑制等药理作用。青风藤的主要有效成分生物半 衰期短，具有释放组胺而致皮疹等副作用，对光、热也不稳定，需要通过适当的药 物化学方法改变其刺激性和不稳定性。因此，本文以寻找新的有效且副反应较小 的治疗r a 的药物为目标。 本文以青藤碱为先导物，对其结构中四个环的a 环和c 环进行一系列的结 构改造尝试，如氧化、苄基化、酰基化等反应，最终通过卤索取代和格氏反应等 方法，合成了两个青藤碱衍生物，并经过红外和核磁共振氢谱的鉴定支持，期待 对其进一步的药物活性研究测试，希望得到药性改良的青藤碱衍生物。本文还通 过对于青藤碱a 环结构改造的尝试得出a 环中的酚羟基具有化学惰性的结论，推 测其不会与病灶处的靶细胞产生共价结合，并期待寻求更好的方法对a 环进行结 构改造，以确定治疗风湿性关节炎药物青藤碱的药物活性点。 关键词： 风湿性关节炎青藤碱青藤碱衍生物 a bs t r a c t r h e u m a t o i da r t h r i t i s ( i 乙) i ss y m m e t r i cm u l t i - j o i n ts y n o v i t i sc h a r a c t e r i s t i co f a u t o i m m u n ed i s e a s e s ，c h a r a c t e r i z e db yj o i n tb o n ed e s t r u c t i o na n dl o s so ff u n c t i o no r d i s a b i l i t y , i sas e r i o u st h r e a tt oh u m a nh e a l t h c a u l i ss i n o m e n i ia st h et r a d i t i o n a l c h i n e s em e d i c i n ep h a r m a c yt r e a t m e n to fa r t h r i t i sd r u gm a i ni n g r e d i e n t ，a f t e rs e v e r a l y e a r so fc l i n i c a lt e s t s ，i tc a ni m p r o v ej o i n ts y m p t o m sa n ds i d ee f f e c t s s i n o m e n i n e ( s i n o m e n i n es n ) i sa na l k a l o i d , i s o l a t e df r o mc a u l i ss i n o m e n i i p r e v i o u ss t u d i e sh a v e s h o w nt h a ts n p o s s e s e sa n t i i n f l a m m a t o r y ,a n a l g e s i c ， a n t i r h e u m a t i s m , i m m u n o s u p p r e s s i o np h a r m a c o l o g i c a le f f e c t s t h eh a l f - l i f eo ft h em a i nc o m p o n e n t so f c a u l i ss i n o m e n i ii ss h o r t i t sr e l e a s eo fh i s t a m i n ec a nl e a dt oo t h e rs i d ee f f e c t ss u c ha s s k i nr a s h ，a n di n s t a b i l i t yt ol i g h to rh e a t t h e r ei san e e dt om o d i f yt h es t r u c t u r es oa s t oi m p r o v ei t sf u n c t i o n w eh a v em o d i f i e da r i n ga n dcr i n go fs nb yh a l o g e n s u b s t i t u t i o na n dg r i g n a r dr e a c t i o na n ds y n t h e s i z e dt w os i n o m e n i n ed e r i v a t i v e s k e yw o r d s - r h e u m a t o i da r t h r i t i s ，s i n o m e n i n e ，s i n o m e n i n ed e r i v a t i v e s 独创。陀声嘭j 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导一f 进 l ：的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中h 0 0 5 ) 。 张乃峥等报道青藤碱治疗1 7 2 例，总有效率为9 0 3 。此外，尚有很多以青风藤为 主药配以其它药物治疗风湿病疗效确切的报道。 在报导青风藤治疗类风湿性关节炎疗效的文献中均有肯定疗效的报道，并指 天津大学硕士学位论文第一章前言 出由于青风藤有多种药理作用，所以在治疗风湿病的同时，也会出现副作用，常见 的副作用是皮肤发痒，面潮红发热，皮疹，但1 2h 后症状减轻，继续服药数日后， 可逐渐减轻到消失。 青风藤主要生长于亚热带地区，分布在我国很多地区，药源充足，价格低廉， 制成浸膏片剂工艺成熟简单，质量稳定【。 1 2 青风藤形态特征及化学成分 1 2 1 形态特征 青风藤为多年生木质落叶藤本，长达5 7m ；茎圆柱形灰褐色，有光泽，无毛， 有纵行细沟纹。枝条灰褐色，无毛，具细沟纹。叶互生，叶厚纸质或革质，宽卵形， 长7 1 2c m ，宽5 1 0c m ，顶端渐尖，基部圆形、截形或心形，全缘，基部叶常5 - - - 7 裂，上部的叶偶尔3 - - 5 裂，上面浓绿色，下面苍白色，近无毛，基出脉5 - 一7 条；叶柄 长6 1 0c m 。花单性，雌雄异株；圆锥花序腋生；雄花序长1 0 ，2 0c m ，花小，淡 绿色；雄花萼片6 ，淡黄色，二轮排列，外轮3 片，内轮3 片；花瓣6 ，三角状圆形；雄 蕊8 1 2 ：雌花长8 1 8c m ，雌花的萼片和花瓣与雄花相似；有退化雄蕊9 ；心皮3 ， 离生，子房上位。核果近球形，蓝黑色，长5 - - - 6m m ，宽约4m m 。核扁球形，稍弯曲， 种子半月形。花期6 - 7 月。果期8 1 0 月。生于山区路旁及山坡林缘、沟边等处。 茎入药。夏秋采割茎藤，切段，晒干【2 】。 1 2 2 化学成分 生物碱类青风藤主要成分以青藤碱为主。青藤碱化学名为 m o r p h i n a - 6 一o r l e ，7 ，8 - d i d e h y d r o - 4 - h y d r o x y - 3 ，7 - d i m e t h o x y 一17 一m e t h y l ，( 9 a , 13 a ，14 t t ) 一， 其分子式c 1 9 h 2 3 n 0 4 ，分子量3 2 9 3 8 。从化学结构来看，由氢菲核及乙胺桥组成， 类似吗啡。为长丝状晶体，熔点1 6 1 ，易溶于氯仿、丙酮、乙醇和碱液中，微溶 于水、乙醚，较难溶于醋酸乙酯中，其盐酸溶液加三氯化铁呈草绿色。 q 】2 0 d = 7 0 0 ， ( c ，1 0 ，乙醇) ，u v 胁“一2 6 3n m ( 1 0 9 - = 3 7 9 ) 。其盐酸盐为长针状晶体，熔点2 3 3 ， 易溶于水。除青藤碱外，青风藤中还含有青风藤碱、双青藤碱、四氢表小檗碱、 尖防己碱、土藤碱、木兰碱、异青藤碱、尖防己定碱、白兰花碱、光千金藤碱。 最近从青风藤中还分离出几个微量生物碱，如8 ，1 4 - - 氢萨鲁塔里定碱、千金宁 碱、蝙蝠葛宁和青风藤定碱。 其他成分p 一谷甾醇、豆甾醇、十六烷酸酯等【3 1 。 天津大学硕士学位论文第一章前言 1 3 药理作用 青风藤复杂的化学成分决定其具有很多的药理活性，而目前的研究主要集中 在神经系统、免疫系统和心血管系统。 1 3 1 对神经系统的作用 对中枢神经系统的作用早在上世纪6 0 年代，人们就发现青风藤的主要活性 成分青藤碱对中枢神经系统有镇静、催眠、镇痛以及一定程度的降温作用。以后 的研究也证实了这一点，无论是小鼠热板法、小鼠扭体法，还是小鼠电刺激法，青 藤碱对实验小鼠皆有明显的镇痛作用，其机理可能是青藤碱抑制炎症局部p g e 的合成和释放。以青藤碱为主要成分的青藤碱片能明显减少小鼠扭体次数，且剂 量与抑制率之间有良好的相关性。其临床镇痛、局麻效应可由神经根及神经纤维 钠离子通道的阻滞作用来解释。青风藤中的其他生物碱类有效成分也有相似药理 活性。如青风藤碱甲可以提高痛阈，达到镇痛作用；青风藤碱能明显提高小鼠热 板痛阈，显著减少醋酸所致的小鼠扭体次数，提高小鼠足趾电刺激的痛阈，还能协 同和增强戊巴比妥钠的镇静、催眠作用。 对神经递质的作用青风藤能够对吗啡依赖离体豚鼠回肠的催促戒断收缩 产生明显的抑制和阻断效应，剂量越大，抑制效果越明显。青风藤对脑啡肽受体的 抑制活性在7 5 以上，提示其可能通过阿片受体治疗吗啡戒断症状，表明青风藤 作用于m 胆碱受体可能是其治疗吗啡戒断的作用机理【4 】。 1 3 2 对免疫系统的作用 免疫抗炎青藤碱片对佐剂性关节炎大鼠原发性病变和继发性病变均具有 显著的抑制作用，且能抑制角叉莱胶所致大鼠足跎肿胀和琼脂肉芽肿的形成，表 明青藤碱对急、慢性炎症有明显的抑制作用。腹腔注射青藤碱可抑制由角叉菜胶 诱发的大鼠足跎肿胀，显著降低大鼠足趾炎症渗出液中p g e 含量，提示青藤碱抑制 炎症局部p g e 的合成可能是其抗炎的机制之一。青藤碱的抗炎机理还可能是其通 过选择性的抑制环氧化酶2 的活性，以达到抑制前列腺素e 2 的合成。进一步的试 验证实了青藤碱对环氧化酶1 作用较弱，对环氧化酶2 的抑制作用较强。这也可 能是青藤碱抗炎作用强而副作用又小的原因之一。 免疫抑制青藤碱可引起小鼠胸腺及脾脏重量减轻，对小鼠抗羊红细胞抗体 产生及对羊红细胞诱导的d t h 反应均有明显的抑制作用，并可延长小鼠同种异体 移植心肌的存活时间。在体外，青藤碱对小鼠脾细胞的增殖反应也呈较强抑制作 用。青风藤提取物具有抗移植排斥反应的作用。青藤碱对大鼠肾移植的急性排斥 天津大学硕士学位论文第一章前言 反应也具有一定的抑制作用，其机理可能是抑制n l 细胞产生i l 2 ，与c s a 的作用 机制相似【4 1 。 1 3 3 对心血管系统的作用 降压作用国内研究最早发现青风藤有降压作用是在其毒性试验中。研究发 现无论是青风藤总碱还是单用青藤碱都有很好的降压作用。前者对正常大鼠、犬、 麻醉猫及慢性肾型高血压犬均有降压作用，后者能够消除或显著抑制去甲肾上腺 素的升压作用。其机制可能是试药具有抗肾上腺素作用和神经节阻断作用，并抑 制中枢性的加压反射。青藤碱可以明显抑制血管平滑肌细胞增殖反应及d n a 合 成，呈剂量依赖关系，表明青藤碱具有抗血管平滑肌细胞增殖作用，这也可能是青 藤碱的降压机制之一。 抗心律失常作用青风藤的主要成分青藤碱能有效拮抗各种实验因素诱发 的心律失常。 青藤碱可缩短印防己毒素诱发家兔心律失常的持续时间；具有对抗b a c l 2 诱 发大鼠和b a c l 2 a c h 诱发小鼠心律失常的作用：能使印防己毒素、b a c h 、 b a c l 2 a c h 所致心律失常复转为窦性心律，并对缺血性心律失常有明显的对抗作 用。其抗心律失常以及延长心肌复极的离子机制可能是它对心室肌细胞膜钾离子 通道以及钙离子通道的浓度依赖性有阻滞作用。 对心脏的作用 从青风藤根茎中提取的生物碱8 ，1 4 - - - 氢萨鲁塔里啶碱对缺 血大鼠心脏的舒张功能有明显保护作用，可改善收缩功能。并可显著降低缺血后 血清磷酸激酶同工酶的释放，提示其对膜代谢损伤也有一定保护作用。表明青风 藤具有保护心功能的作用【3 1 。 1 3 4 对脑血管系统的作用 采用非开颅可逆性大鼠大脑中动脉栓塞法观察青藤碱对大鼠局灶性脑缺血 再灌注后神经功能障碍、脑水肿及脑栓塞范围的影响，结果表明，于大脑中动脉阻 断前1 0m i n p 舭射青藤碱3 0 ，6 0m g 蚝，可明显减轻行为障碍，减轻脑水肿及 缩小脑栓死范围。实验显示，青藤碱对局灶性脑缺血再灌注损伤有保护作用【3 1 。 1 3 5 对家兔c b s a 肾炎模型影响 实验研究表明，青藤碱在减轻肾小球免疫性炎症，改善肾功能方面有较好作 用【”。 天津大学硕士学位论文第一章前言 1 3 6 对平滑肌的作用 据实验研究表明，青藤碱除可抑制兔肠收缩外，还可明显抑制血管平滑肌细 胞增殖反应及合成，呈剂量依赖关系3 1 。 1 3 7 释放组胺作用 青藤碱是目前所知的植物中最强的组胺释放剂之一，体外实验发现青藤碱能 使豚鼠大动脉、气管、膈肌、心脏、子宫、皮肤、胃等组织和器官释放组胺。用 大鼠腹腔中分离出的肥大细胞悬液加入青藤碱，可使肥大细胞9 0 脱颗粒【3 1 。 1 3 8 对阿片类依赖的防治作用 青风藤提取液及青藤碱能显著抑制吗啡依赖豚鼠体外回肠的戒断性收缩反 应，明显减轻吗啡依赖小鼠的催促戒断症状和体重下降。青藤碱对吗啡依赖大鼠 的催促戒断症状及体重减轻具有显著的拮抗作用，并能调节吗啡依赖大鼠脑内神 经递质水平的紊乱，降低戒断后骤增的单胺类神经递质。这预示着青风藤及有效 成分在戒毒领域中可能具有较大的实用意义【3 1 。 1 3 9 毒性作用 青藤碱一次或多次给药脏器中分布浓度依次为肝、心、肾、肺、脑，睾丸中 未检出。组织切片表明药物对肝细胞有轻度影响，对其他脏器影响甚少。且青藤 碱对体细胞无致突变活性，也无致诱变性【4 】。 1 4 药动学研究 对实验大鼠以青藤碱一次给药1h 后、连续给药6 周后以及连续给药6 周后停 药1 周，分别取大鼠血及各重要器官，用h p l c 法测定青藤碱在体内脏器的浓度，同 时进行脏器组织切片及血液生化指标等检查。结果青藤碱一次或多次给药脏器分 布浓度依次为肝、心、肾、肺、脑，睾丸中未检出。组织切片表明药物对肝细胞 有轻度影响，对其他脏器影响甚岁3 1 。 1 5 毒理学研究 青藤碱对小鼠i p ，s c ，i g l 拘l d 5 0 分别为( 2 8 5 0 0 士2 9 0 0 ) ，( 5 3 5 0 0 - & 4 1 9 ) 和 天津大学硕士学位论文第一章前言 ( 5 8 0 0 0 - 土：5 1 0 0 ) i n g k g 。大鼠1 次口服6 9 4m g k g 。无不良反应。犬及猴分别i ：ij 艮4 5 3 乏9 5m g k g ，有显著镇静作用及肠胃道反应，静脉注射5 1 3 5m g k g 。1 立即出现 高度衰弱、血压下降、心率加速、呼吸困难等反应。青藤碱皮下注射4 5d 内剂量 从5m g k g j 递增至8 0m g k g ，对猴无戒断症状，说明无成瘾性，但对其镇痛作用 有耐受性【3 1 。 1 6 临床应用 治疗风湿、类风湿性关节炎治疗风湿、类风湿性关节炎是青风藤最主要的 临床应用之一。它的药理基础是青风藤中含有的生物碱具有抗炎镇痛、免疫抑制 作用。临床用药既有有效成分( 如青藤碱) 、单味药，也有复方制剂。杨小恒等采 用正清风痛宁治疗类风湿性关节炎1 1 8 例，总有效率为9 1 5 2 ，副作用小。董庚生 等运用大剂量青风藤治疗风湿病1 8 0 例，取得了较为理想的结果，有效率达到 9 0 。 治疗肾小球疾病基于青风藤所具有的免疫抑制、抗炎、抗凝及膜保护的药 理基础，周静等采用青风藤制剂治疗肾小球疾病，发现其不但能降蛋白尿，也能降 血尿，且副作用明显低于临床上常用的雷公藤多苷片。 其他应用青风藤制剂特别是复方制剂还被广泛的用于骨质增生、脊椎炎的 治疗，此外，青风藤制剂还被用于心律失常、红斑性狼疮等疾病以及海洛因依赖戒 断症状的治疗【4 】。 1 7 制剂情况 目前，青风藤制剂包括有效成分、单味药、联合及复方用药。市场上销售的 主要有正清风痛宁注射液( 湖南正清制药) 、正清风痛宁片( 盐酸青藤碱片，广州白 云山制药) 、正清风痛宁片( 肠溶片，西安利君制药) 、风湿止痛药酒( 长春英平药 业) 、追风活络胶囊( 贵州老来福药业) 、芪麝颈康丸( 上海中药一厂) 等，临床上使 用的还有很多是医院药剂室配制的各种复方制剂。此外，还在研究中的青风藤制 剂有软胶囊、贴剂和凝胶剂等【4 】。 1 8 问题 现在临床上使用的青风藤制剂主要有注射剂以及片剂、丸剂、胶囊等口服剂 天津大学硕士学位论文 第一章前言 型，但是，青风藤的主要有效成分生物半衰期短，具有释放组胺而致皮疹等副作用， 对光、热也不稳定，需要通过适当的药剂学方法改变其刺激性和不稳定性。透皮 给药可以避免口服给药造成的毒副作用，目前已经有青藤碱凝胶剂和贴剂的研 究。但凝胶剂易失水和霉变，而贴剂的载药量较少且对皮肤有刺激性，对于大剂量 的中药制剂，巴布剂是一个更合适的剂型。研究表明中药巴布剂已成为一种用于 治疗关节炎、软组织损伤、腱鞘炎、腰椎突出、神经痛、骨质增生、腹腔疾病以 及由癌症等疾病引起的疼痛的新剂型，将青风藤制成巴布剂更适合青风藤临床应 用的特点。同时巴布剂具有优良的柔韧性和黏着性，具有更好的患者顺应性。因 此将青风藤制剂进行二次开发，制成巴布剂，将会极大地改善青风藤的临床应用 状况【4 l 。 天津大学硕士学位论文第二章青藤碱的提取工艺和研究进展 第二章青藤碱的提取工艺和研究进展 2 1 提取工艺研究 由于青藤碱具有较强的药理作用，国内学者为提取青风藤中青藤碱进行了一 系列的实验研究。工业生产盐酸青藤碱提取工艺为碱化、回流提取和精制等步骤 或稀酸渗漉、碱中和渗漉液、再用苯进行萃取纯化等。从中草药中提取有效成分 的常规方法主要有：热提取法( 热回流法、索氏法、煎煮法等) 和浸泡提取法( 渗滤 法、冷热浸泡法等) 两类。目前，伴随着新技术在药材成分提取中的研究和应用， 新方法不断出现，例如：二氧化碳超临界气体提取法，微波提取法，超声提取法等。 现在较为常用的提取方法简要概括如下： 2 1 1 回流提取法 青风藤中青藤碱含量较高，其基本母核为吗啡烷，有较好的脂溶性。侯文峰等 采用正交实验设计，优选出青风藤中青藤碱最佳提取工艺为：用8 倍量7 0 乙醇， 回流提取2 次，每次1 5h 。结果表明：乙醇浓度对青藤碱提取率有极显著影响，而 提取次数和提取时间对青藤碱提取率无明显影响。潘林梅等通过对一常用抗风湿 性关节炎的验方中同时含有的青风藤、雷公藤、稀莶草等3 种中药进行了含量测 定研究，并考察了复方中青风藤单提及与雷公藤、稀莶草共提时青藤碱提取率的 变化。结果表明：不同药味与青风藤共提时对青藤碱提取率有不同影响。张晓伟 等改进了盐酸青藤碱的提取工艺，通过在提取青藤碱过程中，碱化和精制两个关 键步骤方面进行实验，得出盐酸青藤碱最优化提取工艺为：以7 5 1 0 的熟石灰， 1 8 倍量水进行碱化，用1 5 倍量乙醚回流提取，所得粗品在p h = 2 5 3 5 ，密度 = 1 0 5 1 1 0 9 c m 3 的条件下进行精制。经测定，青藤碱含量大于9 5 。此工艺进一 步提高了青藤碱的产品纯度，为我国制药企业提供了可靠的青风藤提取工艺流程 【5 1 。 2 1 2 超声提取法 提取分离工艺流程 称取一定量经粉碎的青风藤根，按文献的最佳提取条件加水1 1 8 倍及熟石灰 0 0 7 5 倍，碱化一段时间，加入工业苯超声提取三次，合并提取液，减压浓缩得超声 天津大学硕士学位论文 第二章青藤碱的提取工艺和研究进展 提取物。超声提取物中加入l 盐酸搅拌制成悬浮液，用活性碳脱色、抽滤，滤液 经浓缩、静置，析出盐酸青藤碱粗品。将粗品于水中用盐酸酸化至全溶，p h 至1 2 ，静置过夜析出晶体，过滤，干燥得白色针状盐酸青藤碱晶体产品( 图2 1 ) 。 熟石灰水工业苯 青风藤根壅重 a 匿二虿) - 岖亘量匿垂卜叫匿垂鎏孙 稀盐酸活性碳稀盐酸 啼 至 互 二屿圆( 盐酸青藤碱) 图2 1青藤碱提取分离流程 超声提取法与常规提取法相比具有：设备简单、提取时间缩短、产率高、成 本低等诸多优点。潘娓婕等报道了在最佳提取条件下，以苯为溶剂采用超声法对 青风藤根进行提取。在实验过程中确定了3 次超声提取时间分别为：4 5 3 5 和3 0m i n ( 图2 2 ) 。由于超声法不会影响青藤碱的分子结构，所以本方法与常规提取法相 比，青藤碱提取率较高，并在一定程度上节约了苯的用量【6 1 。 2 2 含量分析 图2 2 超声法提取青藤碱工艺流程 高效液相色谱法在测定青藤碱片中青藤碱的含量中，以氯霉素为内标，以 甲醇0 0 1m o l l 。磷酸二氢钠溶液( 5 0 ：5 0 ) 为流动相可将青藤碱、内标与辅料分开， 不干扰主药的测定，结果线性范围2 5 一- - 2 5 9 9 m l 。平均回收率9 9 8 ，r s d 1 3 。该方法简便、快捷。青藤碱在甲醇中超声振荡提取较完全，回收率高，重现 性好。 天津大学硕： ：学位论文第二章青藤碱的提取工艺和研究进展 薄层色谱法采用硅胶g f 2 5 4 高效薄层色谱法双波长扫描法对青风藤中青藤 碱进行含量测定，具有简便快捷、重现性好、稳定性高、数据可靠、板间误差小 等优点，平均回收率9 9 7 7 ，变异系数1 2 8 ，为该中药中有效成分的含量测定 及质量控制提供了可靠的方法和依据。 等速电泳法本法简便，准确，结果可靠。成风桂等用等速电泳法测定青风藤 中青藤碱的含量，实验结果表明该方法分离效果好，精确度高，与高效液相色谱法 ( h p l c ) 的测定结果比较，两种测定结果基本相刚引。 2 3 已报道的青藤碱衍生物的合成 青藤碱骨架是由a ，b ，c ，d 四个环组成，其中a 环为苯环，b 环是与a 环相接的 半椅式六元环，c 环是与b 环相连的具有，b 不饱和酮结构的扭椅式六元环，d 环是 处于b 环下面的含氮椅式六元环。 结构如下： 2 m o o 其中c 环有3 个活泼部位：c 6 位羰基，c 7 位烯甲醚和7 ，8 位双键。叶仙蓉等以青 藤碱为先导物，重点对c 环进行结构修饰，共合成7 个衍生物，化合物的结构和制 备方法见图2 3 。 天津大学硕士学位论文第二章青藤碱的提取工艺和研究进展 o m e 6 o s i n o m e n i n e p o m e 2 0 1 6 料c 电 。n c 卜b m e t h o d s ：i ：n a b h 4 ，c h 3 0 h ；i i ：l o p d c , h c i ；i i i ：1 0 h c i ，8 0 c ； i v ：a c 2 0 ，n e t 3 ，d m a p ；v ：d a s t ，n e t 3 ，0 c 图2 3 青藤碱衍生物的合成路线 生物活性该文合成的7 个化合物，经药理室程桂芳教授研究组采用巴豆油 致小鼠耳肿胀法和大鼠角叉菜胶足肿胀法分别进行抗炎活性筛选，采用小鼠醋酸 扭体法进行镇痛活性筛选。筛选结果显示，与青藤碱的活性比较，采用巴豆油致小 鼠耳肿胀法，化合物2 ，4 的抗炎活性基本保持，5 的抗炎活性略高于青藤碱。采用小 鼠醋酸扭体法，化合物2 的镇痛作用较好【7 1 们。 2 4 本文的选题 类风湿关节炎( r a ) 是v 2 对称性多关节滑膜炎为特点的自身免疫性疾病，其特 点为关节骨质破坏、功能丧失甚至残疾，是严重威胁人类健康的疾病之一。目前 认为有可能控制r a 炎症进展的药物即慢作用抗风湿药( d m a r d s ) ，以甲氨喋呤 ( m t x ) 为代表的此类药物具有一定的免疫抑制效应，但尚无有力证据证实其治疗 3i 天津大学硕士学位论文 第二章青藤碱的提取工艺和研究进展 可控制或逆转骨侵蚀的发生，且因伴随严重的消化道反应、骨髓抑制等副作用而 导致病人无法长期服用。近期用于临床的免疫制剂如i l 1 受体拮抗剂1 等，对其 疗效尚无肯定的结论，并且因易伴发感染、狼疮样病变及淋巴瘤等副作用而限制 了其进一步应用。因此，寻找新的有效且副反应较小的治疗r a 的药物是国内外 风湿学界普遍关注的问题。 青藤碱的生物碱盐酸盐应用于临床治疗风湿性关节炎有较好的疗效，但其用 药剂量偏大，有过敏等不良副作用。本课题以青藤碱为先导物，对a 环和c 环进 行结构修饰。我们想通过对青藤碱的结构修饰与优化研究，以寻找高效、低毒的 新一类青藤碱衍生物。 天津大学硕士学位论文第三章实验部分 第三章实验部分 已知青藤碱类药物用于治疗风湿性关节炎和神经病。因此我们以青藤碱为母 体，对其进行了结构改造研究，以其获得药理活性较好的化合物。 3 1 实验仪器和溶剂的精制 3 1 1 实验仪器 熔点仪：y a n a g i m o t om p 5 0 0 ( 温度计未校正) ； 红外光谱仪：b i o r a df t s3 0 0 0 ( 扫描范围：4 0 0 0 - - - 4 0 0c m 1 ，k b r 压片) ； 核磁共振谱仪：b r u k e ra v 5 0 0 ( t m s 内标) ； 测试方法：c d c l 3 和d 2 0 为溶剂，t m s 为内标； 化合物的瓜和1 hn m r 谱图见附图。 3 1 2 溶剂的精制 3 1 2 1 无水t h f 的精制 在少量二苯酮存在下，t h f 与n a 回流，至溶液变为紫黑色，然后蒸出即可。 若回流时间过长，可以先将t h f 蒸出，再加入n a ，在二苯酮存在下回流，这样可 以大大缩短时间。整个过程都需要在n 2 保护下。沸点6 7 。c ，折射率n d 2 0 1 4 0 5 0 ， 相对密度0 9 8 5 ( 2 0 4 。c ) 3 1 2 2 无水d m s o 的精制 二甲亚砜沸点1 8 9 ，熔点1 8 5 ，折光率i i d 2 5 1 4 9 3 ，比重1 0 9 5 。为无色、 无嗅、微带苦味的吸湿性液体。在常压下加热至沸腾可部分分解。纯化的方法是 在5 0 0m l 干燥的圆底烧瓶中加入3 0 0m l - - 甲亚砜及其适量的c a o 粉末，搅拌并微 微加热回流过夜，过滤，再减压蒸馏收集沸点6 4 - - - 6 5 。c 5 m m h g 馏分，得无水二 甲基亚砜。 一 3 1 2 3 无水乙醚的精制 在少量二苯甲酮存在下，乙醚与n a 回流( n 2 保护) 至溶液变为紫黑色，然后蒸 天津大学硕士学位论文 第三章实验部分 出即可。 3 1 2 4 无水氯仿的精制 取5 0 0m l 圆底烧瓶，向其中加入3 0 0m l 氯仿及适量的无水五氧化磷，装好 干燥的冷凝管和干燥管，回流3 4 , 时，然后常压蒸馏，得无水氯仿，密封待用。 ( 氯仿的沸点6 1 2 ，折光率为n d2 5 1 4 4 5 ，比重为1 4 9 8 ) 3 1 2 5 无水氯化苄的精制 用无水n a 2 s 0 4 保温浸泡氯化苄，约5 0 6 0 ，连接空气冷凝管，干燥管。保 温几小时后，倾倒出n a 2 s 0 4 。减压蒸馏，收集中间馏分，8 0 。 无色透明液体，可燃，具有强烈刺激性气味。有催泪性。相对密度 1 1 0 0 2 ( 2 0 2 0 c ) 。熔点一3 9 2 c 。沸点1 7 9 4 c 。折射率r i d 2 0 1 5 3 9 2 。与空气形成爆 炸性混合物，爆炸极限1 1 1 4 ( 体积) 。闪点( 开杯) 6 0 。溶于乙醚、酒 精，氯仿等有机溶剂，不溶于水，但能与水蒸气一同挥发。 3 1 2 6 无水溴丁烷的精制 低于5 0 ，由正丁烷和溴化氢在硫酸作用下制得。制得后称量c 棚9 b r1 0 0 m l ，加入五氧化二磷3 4g ，回流2 3h ，然后蒸出即可，无水保存备用。 纯正溴丁烷为无色透明液体，沸点1 0 1 6 c ，密度1 2 7 5 8g m e 。不溶于水，易 溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂。 3 1 2 7 无水乙酸乙酯的精制 取5 0 0m l 干燥圆底烧瓶，向其中加入3 0 0m l 乙酸乙酯及适量的无水k 2 c 0 3 ， 装好干燥的冷凝管和干燥管，在室温下浸泡2 天，然后将乙酸乙酯倾倒到另一个 5 0 0m l 圆底烧瓶中，常压蒸馏，得无水乙酸乙酯，密封待用。 3 2 青藤碱溴代 将n b s ( 5 8 2 8g ，3 2 7r e t 0 0 1 ) 加入到2 5 0m l 圆底烧瓶中，加入1 0 0m l 冰 醋酸，搅拌，冰水浴，于半小时内分批加入青藤碱盐酸盐( 1 0 0 7 3g ，2 7 5m m 0 1 ) 。 继续搅拌，2 4h 后经t l c 检测反应，有约4 0 原料青藤碱未反应，冰水浴下继 续分批加入n b s ( 1 9 3 8g ，1 0 9r e t 0 0 1 ) ，3 h 后反应基本完全。 向反应体系中加入大量水，放热，搅拌，约半小时后，用c h c l 3 萃取( 3 x 5 0 m l ) ，有机层用5 n a o h 、水、饱和食盐水洗涤，m g s 0 4 干燥，浓缩得粗产品。 天津大学硕士学位论文第三章实验部分 用1 0 h c l 水溶液溶解粗产品，力h n a c 0 3 调p h 至8 ，析出沉淀，收集此沉淀， 用c h c l 3 溶解，滤出不溶物，浓缩滤液，得产品9 3 8 8g ，产率为8 4 1 1 , 1 2 。i r ( k b r , e m - 1 ) ：3 4 4 5 ，1 6 8 3 ，1 6 3 2 ，1 4 7 0 ，1 4 3 4 ，1 2 8 0 ，1 2 0 2 ，11 4 8 ，1 0 5 3 ，7 4 9 。核磁数据见第四 章核磁共振氢谱解析。红外、核磁谱图见附图。 2 迪墨- h o a c 3 3 青藤碱溴代产物与苄基氯化镁的格氏反应 2 取5 0 0m l 三口圆底烧瓶，连接恒压滴液漏斗和回流冷凝管，冷凝管顶部连 接真空线。整个装置在烘箱中干燥过2 4h ，抽真空后换n 2 。取m g 屑( 3 5 2 6g ，0 1 4 7 m 0 1 ) 和一小粒1 2 放入三口瓶中，用注射器取1 0 0m l 经n a 干燥过的无水t h f 加入 到三口瓶中。搅拌下再次缓慢抽真空，换n 2 ，以排出溶剂中混有的空气。用注射 器取无水氯化苄( 2 3 2 4 6g ，0 1 8 4m 0 1 ) 加入到滴液漏斗中，再加入约2 0m l 无水 t h f 使其混合成溶液。 三口瓶用电吹风稍加热，约lr a i n ，1 2 溶液很快由深红色变浅黄至无色，说 明1 2 已引发反应。改为冰浴，7h 后仍有剩余m g 屑未反应，持续冰浴反应一天后 m g 屑全部消失，加入溶解于无水t h f 的溴代青藤碱( 5 0 0 0g ，1 2 2r e t 0 0 1 ) 。过夜 后经t l c 检测，约有一半原料未反应。 将反应液倒在冰块上，加入n h 4 c l ，使溶液由混浊变澄清，此过程变化缓慢， 应慢慢加入n h 4 c l ，否贝j j n h 4 c l 力 1 多了会破坏产物。倾倒出溶液，乙酸乙酯萃取， 旋蒸得粘稠液。用石油醚超声洗涤出杂质，将沉淀抽干，得粗产品约6g 。用氯 仿：乙醇= 1 0 ：0 5 条件柱色谱提纯，得产品1 8 3 2g 。产率为3 0 。用氯仿正 己烷重结副1 3 j 。核磁谱图见附图。 天津大学硕士学位论文第三章实验部分 2 3 4 青藤碱溴代产物与正丁基溴化镁的格氏反应尝试 3 4 11 溴丁烷的制备 n a b r + h s 0 4 + h b r + n a h s 0 4 c h 3 c h 2 c h 2 c h 2 0 h + h b r = ；= = 兰=c h s c h 2 c h 2 c h 2 b r + h 2 0 主反应为可逆反应，为提高产率反应时采用溴化氢过量，并用溴化钠和浓硫 酸代替溴化氢，边生成溴化氢边参与反应，可提高溴化氢的利用率；浓硫酸还起 到催化脱水作用。 反应时硫酸应缓慢加入，温度也不宜过高，否则易发生下列副反应： 2 c h 3 伽2 c h 2 c n 2 0 n 掣轴c h 3 c h 2 c h 2 c h 2 0 c n 2 c h 2 c h e c n 3 + n 2 0 厶 2 h b r + h 2 s 0 4 _ b r 2 + s 0 2t + 2 h 2 0 c h 3 c h 2 c n 2 c h 2 0 h 辈k c h 3 c h 2 c h = c h e + h 2 0 凸 在1 0 0m l 圆底烧瓶中，放入1 2m l 水，置烧瓶于冰水浴中，在振摇下分批 加入1 5m l 浓硫酸，混匀并冷至室温，再分四次加入9 7m l 正丁醇，混合均匀， 然后在搅拌下加入1 3 3g 研细的溴化钠，充分旋动烧瓶以免结块，撤去冰浴，擦 干烧瓶外壁，加入l - - 2 粒沸石，安装带气体吸收的回流装置。用2 5 0m l 烧杯 盛放1 0 0m l5 氢氧化钠溶液作吸收液。 用电热套加热，并经常摇动烧瓶，促使溴化钠不断溶解，加热过程中始终保 持反应液呈微沸，缓缓回流约1 h 。反应结束，溴化钠固体消失，溶液出现分层。 蒸馏稍冷后拆去回流冷凝管，补加1 - - 2 粒沸石，在圆底烧瓶上安装蒸馏弯 头改为蒸馏装置，用5 0m l 锥形瓶作为接受器。加热蒸馏，直至馏出液中无油 滴生成为止。停止蒸馏后，烧瓶中的残液应趁热倒入废酸缸中。 将蒸出的粗产品倒入分液漏斗，用1 0m l 水洗涤一次，将下层的1 溴丁烷 天津大学硕士学位论文第三章实验部分 分入一干燥的5 0m l 锥形瓶中。再向盛粗产品的锥形瓶中滴入4m l 浓硫酸，用 冰水浴冷却并加以振摇，倒入一个干燥的分液漏斗中，静置片刻，小心地尽量分 去下层浓硫酸。油层依次用1 2m l 水、6r o l l 0 碳酸钠溶液、1 2m l 水各洗涤 一次。 经洗涤后的粗1 溴丁烷由分液漏斗上口倒入干燥的锥形瓶中，加入2g 无水 氯化钙，配上塞子，充分振摇后，放置3 0m i n 。 安装普通蒸馏装置。将干燥好的粗1 溴丁烷用漏斗( 漏斗口上铺一薄层棉花) 小心滤入干燥的蒸馏烧瓶中，放入1 - 2 粒沸石，加热蒸馏。收集9 9 1 0 3 馏 分，并做无水处理【1 4 】。 3 4 2 青藤碱溴代产物与正丁基溴化镁格氏试剂的反应 取5 0m l 三口圆底烧瓶，连接恒压滴液漏斗和回流冷凝管，冷凝管顶部连接 真空线。整个装置在烘箱中干燥过2 4h ，抽真空后换n 2 。取m g 屑( 0 1 1 8g ，4 9 2 r e t 0 0 1 ) 和一小粒1 2 放入三口瓶中，用注射器取2 0m l 经n a 干燥过的无水t h f 加入 到三口瓶中。搅拌下再次缓慢抽真空，换n 2 ，以排出溶剂中混有的空气。用注射 器取无水溴丁烷( 0 8 3 9g ，6 1 2r e t 0 0 1 ) 加入到滴液漏斗中，再加入约1 0m l 无水 t h f 使其混合成溶液。 三口瓶用电吹风稍加热，约lr a i n ，1 2 溶液很快由深红色变浅黄至无色，说 明1 2 已引发反应。改为油浴，4h 后m g 屑全部反应完。该为冰浴，加入溶解于无 水t h f 的溴代青藤碱。过夜后经t l c 检测j 仍有大部分原料。反应一天后只反应 一半，改为油浴欲加快反应，最终得复杂混合物。 天津大学硕士学位论文 第三章实验部分 3 5 青藤碱氧化的尝试 3 5 1f r e m y 盐的制备 n a n 0 2 + 2 n a h s 0 3 。h o n ( s 0 3 n a ) 2 + n a o h 3 h o n ( s 0 3 m ) 2 + k m n 0 4 。_ - 3 o n ( s 0 3 m ) 2 + m n 0 2 + m o h + h 2 0 o n ( s 0 3 m ) 2 + k c l 。1 卜o n ( s 0 3 k ) 2 + m o m = n a 或k 将1 0 0m l5m o l l 亚硝酸钠盛于1l 的烧杯中，外用冰浴冷却。在溶液中加 入约2 0 0g 碎冰，在平稳的搅拌下加入1 0 0m l3 5 o v n ) 新配的亚硫酸氢钠溶液， 然后加2 0m l 冰乙酸。几分钟内反应液颜色迅速变深，为棕黄色。取样品滴入紫 色碘液，颜色不变。加入2 5m l 浓氨水( 含量2 5 ) 。冰浴冷却。继续向反应混 合物中加碎冰，以保持下一步反应仍有冰存在，在约lh 内搅拌下滴加冷的4 0 0m l o 2m o l l 的k m n 0 4 溶液。 将反应液抽滤，以滤去m n 0 2 棕色沉淀，尚待过滤的悬浮液仍在冰浴中。 取1 1m l 滤液用等体积的饱和k c l 溶液沉淀出f r e m y 盐，以作为主要部分 结晶时的晶种。若无结晶则可多加些k c i ，析出橙色沉淀。其余大部分滤液在搅 拌下于4 5m i l l 内滴加2 5 0m l 饱和k c l 溶液。在即将滴完时加入前已制成的晶种， 冰浴下继续搅拌使沉淀完全。 过滤混合液，将橙色固体收集在布氏漏斗上，不要滤干。用氨化的饱和k c l 溶液( 含5 v 的氨水) ，约2 0 0m l 。再用氨化甲醇( 含5 v 的氨水) 2 0 0 m l 洗涤。最后用丙酮洗，整个洗涤过程完了再抽干固体，至表面潮湿即可，不 要太干。将固体铺在表面皿上，使丙酮在1 5m i n 内自然蒸发，称重为4 1 9 2 6g ， 产率约为9 3 。 将此产品放于盛有c a o 和f n r h ) 2 c 0 3 的容器中，使其在有n h 3 下贮存。 3 5 2 青藤碱的氧化 5 0m l 水中溶解f r e m y 盐( 0 9 3 4 g ，3 4 7r e t 0 0 1 ) ，橙色固体变为紫色溶液，加 入n a o a c ( 0 2 5 0g ，3 0 5r e t 0 0 1 ) ，溶液变为棕色。 再加入5 0m l 乙醇，分批加入青藤碱盐酸盐( o 5 0 0g ，1 3 7r e t 0 0 1 ) 。停搅拌后， 一1 9 天津大学硕士学位论文第三章实验部分 发现有悬浮不溶物，又加入3 0m l 乙醇，继续搅拌。2m i l l 后溶液颜色微变黄， 后逐渐加深变红。 1 7h 后经t l c 检测发现有两个产物，且原料没有反应完全。又向反应液中 再分批加入f r e m y 盐( 0 3 6 3g ，1 3 5m m 0 1 ) 。 5h 后经t l c 检测发现原料已反应完全，但产物仍为两个。 加水欲使产品沉淀出，但加水后溶液变澄清， j h n a h c 0 3 碱化亦无明显现象。 用3 x 5 0m l 氯仿萃取，少量水洗后旋蒸，抽干约得0 5g 产品。用乙酸乙酯己烷 重结晶。氯仿：甲醇= 1 0 ：0 2 柱分离，做红外和核磁共振氢谱，醌的红外特征吸 收在1 6 6 9c n l ，氢谱位移在6 7 8p p m ，对比得到的谱图，未得到预期产物【1 5 - 1 9 1 。 重新做该反应，改变n a o a c 用量，或者不加n a o a c ，仍没有得到预期产物。 2 2 设想如果此步成醌的尝试成功，则使其与胺加热回流反应，如下图所示，得 到a 环结构改造的产物，期望该产物能具有改善青藤碱药物副作用的效果。 m o o 垦：垦：笪旦- r e f l u x r n 附 天津大学硕士学位论文 第三章实验部分 3 6 青藤碱苄基化的尝试 取青藤碱盐酸盐( o 5 0 0g ，1 3 7m m 0 1 ) 于1 0 0m l 圆底烧瓶中，用5 0m l 丙酮作 溶剂，j j h , 入k 2 c 0 3 ( 1 1 7 7g ，8 5 2r e t 0 0 1 ) ，无水氯化苄( 0 4 0 2g ，3 1 8r e t 0 0 1 ) ，搅拌 下加热回流，防止溶剂挥发干。每隔lh 作t l c 检测，反应没有变化。 过夜反应，2 4h 后经t l c 检测，仍有大量氯化苄存在，反应基本没有发生 2 0 - 2 2 o 2 3 7 青藤碱酰化的尝试 m 2 取青藤碱盐酸盐( 1 0 0 0 0g ，0 0 2 7t 0 0 1 ) 放入圆底烧瓶中，加入3 0m l k , 酸酐， n a o a c ( 6 7 7 3g ，0 0 8 2t 0 0 1 ) ，约6 0 c 油浴，过夜回流【2 3 2 4 。 2 4h 后反应液由无色变为棕黄色，旋蒸出大部分溶剂，加5 h c l 溶解，调 p h 为3 ，氯仿洗涤，用n a o h 水溶液碱化至p h 为1 1 ，出现大量黄色沉淀，抽 滤。 2 2 天津大学硕士学位论文 第四章实验讨论及结果分析 第四章实验讨论及结果分析 4 1 格氏反应相关介绍 格氏试剂与n 、p 不饱和醛反应生成共轭烯剧2 5 ，2 6 】： p h c h = c h c h = o + c h 3 m g b r - - - p h c h =