（生物化学与分子生物学专业论文）ds9701菌株的诱变及其酶学性质的研究.pdf

一、摘要 ( 聚3 羟基丁酸( p h b ) 不仅具有热塑性塑料的性质，还在自然环 境中具有生物可降解性，因而成为传统石化塑料的替代品，在工业等 领域具有广阔的应用前景，也成为国内外生物材料领域的研究热点。太 自然界中的许多种微生物都具有降解p h b 的能力，这依赖于分泌 一种特殊的胞外p h b 解聚酶。本项工作主要是筛选能高效降解p h b 的突变株，并对其进行酶学性质的研究，主要结果如下： l _ 以青霉( p e n i c i l l i u m s p ) d s 9 7 0 1 为出发菌株，通过紫外线诱变分 生孢子，采用透明圈初筛和摇瓶培养复筛的方法，获得4 个能稳定遗 传的p i - i b 解聚酶高产菌株。其中0 9 菌株的酶活是原始菌株的2 3 倍。 2 初步研究了0 2 、0 4 、0 9 和1 4 菌株粗酶液的基本性质。0 2 菌 株粗酶液的最适反应温度4 5 5 0 。c ，温度稳定范围4 0 5 0 。c ；最适 反应p h5 o ，p h 稳定范围4 5 0 。( 0 4 菌株粗酶液的最适反应温度 5 0 ，温度稳定范围4 0 5 0 ；最适反应p h5 0 ，p h 稳定范围5 0 7 0 。 0 9 菌株粗酶液的最适反应温度5 0 6 0 ，温度稳定范围4 0 5 0 ： 最适反应p h5 0 ，p h 稳定范围5 7 0 。1 4 菌株粗酶液的最适反应温 度4 0 ，4 0 以下稳定；最适反应p h5 8 ，p h 稳定范围5 8 0 。j - 3 经过比较粗酶液的性质后，对0 9 号菌株产生的p h b 解聚酶进 行了分离纯化，并对其解聚酶的特性进行了探讨。以粗酶液为起始，经 硫酸铵分级沉淀、s e p h a d e xg 1 0 0 凝胶过滤后，分离纯化了该酶，纯 化倍数约为3 7 9 ，酶活力回收率8 9 。经1 2 5 s d s p a g e 法测得所 分离纯化酶蛋白的相对分子质量约为4 1 5k d 。该酶反应的最适温度和 p h 分别为5 0 和5 0 。在温度5 0 以下和p h5 0 6 0 范围内稳定。一 些金属离子对p h b 解聚酶有抑制作用。质谱仪测得酶降解p h b 的产 物主要是二聚体。1 7 关键词：聚3 一羟基丁酸( p h b ) ：紫外诱变；p h b 解聚酶；生物降解 a b s t r a c t p o l y ( 3 - h y d r o x y b u t y r a t e ) ( p h b ) a r ea t t r a c t i n gm u c hc o m m e r c i a la n d a c a d e m i ci n t e r e s ta ss u b s t i t u t ef o rn o n - d e g r a d a b l e p e t r o c h e m i c a l l yd e r i v e d p l a s t i c sb e c a u s eo f t h e i rs i m i l a rm a t e r i a lp r o p e r t i e st oc o n v e n t i o n m p l a s t i c s a n d c o m p l e t eb i n d e g r a d a b i l i t yu n d e r n a t u r a le n v i r o n m e n t n e a b i l i t yt od e g r a d ep h b i sw i d e l yd i s t r i b u t e da m o n gb a c t e r i aa n d f u n g i a n d d e p e n d s o nt h es e c r e t i o no f s p e c i f i c e x t r a c e l l u l a rp h b d e p o l y m e r a s e t h ea i mo f t h i sw o r k i st of i n do u tt h em u t a n t ，w h i c hc a nb e a b l et od e g r a d ep h b e f f i c i e n t l ya n dt oi n v e s t i g a t et h ec h a r a c t e r i s t i c so f p h bd e p o l y m e r a s e 1 1 1 em a i nr e s u l t so b t a i n e df r o mt h i sw o r ka r ea s f o l l o w s ： 1 t h ep e n i c i l l i u m s pd $ 9 7 0 1 as t r a i no fd e g r a d i n gp h b w a s m u t a g e n i z e db yu vt r e a t m e n t t h r o u g hs c r e e n i n gal o to f m u t a n t sw i t h t h e m e t h o do ft r a n s p a r e n tz o n e sa n dc u l t u r e f i l t r a t e ，t h eb e s tf o a rw e r e o b t a i n e dw i t hh i 曲- y i e l do fs t a b l ep h b d e p o l y m e r a s e ，n a m e da s0 2 ，0 4 ，0 9 a n d1 4 t h ee n z y m ea c t i v i t yo ft h e0 9m u t a n tw a si n c r e a s e dt o5 4u m 1 a sc o m p a r e dw i t h2 3u m lo f t h eo r i g i n a l 2 c o m p a r a t i v es t u d ya m o n gt h ec r u d ee x t r a c t so f0 2 ，0 4 ，0 9a n d1 4 h a sb e e nd o n e 1 1 1 eo p t i m u m a c t i v i t yo f 0 2c r u d ee x t r a c tw a so b s e r v e da t t h e t e m p e r a t u r e4 5 5 0 * ca n da tp h 5 0 t h er a n g eo ft e m p e r a t u r es t a b i l i t y i sf r o m4 0 * ( 2t o5 0 ，t h er a n g eo f p h s t a b i l i t yi sf r o m 4 0t o5 0 n eo p t i m u l t i a c t i v i t y o f0 4c r u d ee x t r a c tw a so b s e r v e da tt h e t e m p e r a t u r e5 0 ca n d a tp h5 0 t h er a n g e o f t e m p e r a t u r es t a b i l i t yi sf r o m 4 0 t o5 0 t h e r a n g eo f p hs t a b i l i t yi sf r o m 5 0t o7 0 n eo p t i m u ma c t i v i t yo f0 9c r u d ee x t r a c tw a so b s e r v e da tt h e t e m p e r a t u r e5 0 6 0 a n da tp h 5 0 t h er a n g eo f t e m p e r a t u r es t a b i l i 够i s f r o m4 0 t o5 0 t h e r a n g eo f p hs t a b i l i t yi sf r o m 5 0t o7 0 t h eo p t i m u ma c t i v i 谚o f1 4c r u d ee x t r a c tw a so b s e r v e da tt h e t e m p e r a t u r e4 0 * ( 2 a n da tp h5 8 n er a n g eo ft e m p e r a t u r es t a b i l i t yi s b e l o w4 0 c t h e r a n g eo f p hs t a b i l i t y i sf r o m5 0t o8 0 t 1 3 t h ee x t r a c e l l u l a rp h b d e p o l y m e r a s ew a sp u r i f i e df r o m0 9b yu s i n g h y d r o p h o b i c c o l m n n c h r o m a t o g r a p h y m a d g e l f i l t r a t i o n t e c h n i q u e i n s e p h a d e x g 一1 0 0 t h e s p e c i f i ca c t i v i t y o ft h e p u r i f i e de n z y m e w a s i n c r e a s e db y3 7 9f o l d so v e rc r u d ee x t r a c t , a n dn l er e c o v e r yy i e l dw a s 8 9 i t sm o l e c u l a r w e i g h t w a sd e t e r m i n e dr m m i n gi ns d s - p a g ea n dw a s f o t m dt ob e4 1 5 龇啊l eo p t i m u ma c t i v i t yo f e n z y m e v e * d so b s e r v e d 敷 t h et e m p e r a t u r e5 0 。ca n da td h5 0 t h er a n g eo f t e m p e r a t u r es t a b i l i t yi s b e l o w5 0 。c t h er a n g eo f p hs t a b i l i t yi sf r o m5 0 t o6 0 + d i 如r e n tm e t a l i o n sc a u s e di n h i b i t i o no nt h ep h bd e p o l y m e r a s ea c t i v i t y c o m p a r a t i v e s 鼬娃vw i 氇d $ 9 7 0 1p h b d e p o l y m e r a s ea l s oh a db e e nd o n e 。 m o r e o v e r , t h em a s ss p e c t r u ma n a l y s i so f t h eh y d r o l y z e dw a t e rs o l u b l e p r o d u c t s o fp h b p o w d e r a f t e rt r e a t m e n to f e n z y m e w a s p e r f o r m e d a n dt h e m a i n p r o d u c t w a si d e n t i f i e dt ob ed i m e r s 。 k e y w o r d s ：p o l y ( 3 h y d r o x y b u t y r a t e ) ( p h b ) ；u vm u t a g e n e s i s ； p h b d e p o l y m e r a s e ；b i o d e g r a d a t i o n i i i 独创性声明 本人声翻掰里交魏学稼论文是本夫凌导舞螽导下遴芎亍戆赣究工作 殿取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标涟和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获 罨东北师范大学或其毽教窍机构的学像或证书露使翔过戆材瓣。与 我嗣工作静阏恚对本研究所散的往嚣嚣黻均己在论文中作了疆确麴 说明并表示谢意。 学经喜 支终者签名： 墨盏嚣麓：，簪 学位论文版权使愿授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文 的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交举 饿论文的复e p 移和磁盘，允诲论文被查瓣秘借阕。本人授权表j 师范 大学可良将学位论文静全部或謇s 分离容编入有关鼗辩辩迸行捡索，w 烈采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：恳函指导教师签名：! 垒主吐 e t期： 凸生 日期；热壁兰：笸：酗 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 洫潮如矬文蓬 逶识邈城： ! 电话 郯绽： 三、文献综述 3 1 引蠢 蘩秘菠萁蒺轻、徐纛窝毪裁魏嶷等墨垒特臻点蔹广泛蘧疲磊予工、翌、 农业、医疗等领域。然而，塑料在给人类带来方便的同时，也给人类 带来了巨大的麻烦。大量使用尉产生的塑料鹰弃物与日俱增。据统计， 目前上海市生活垃圾翡7 为废旧塑料包装物，每年总量约为1 9 万吨： 毓垒黼范围来看，我莺塑料静年生产量是3 0 0 万吨，清费髓在6 0 0 万 吨以上，是世界上十大塑料制品生产和消费国之一。如果按每年1 5 的塑料废弃量计算，中国的年塑料废弃量在1 0 0 万吨以上，废弃塑料 在垃圾孛懿 l 捌占爨4 0 。 圈前，我国市场上大量使用的塑料制茹玛为不可降解灏料，是以 发泡聚苯乙烯、聚己烯或聚丙稀为原料，相对分子质量达2 万以上。 只有棚对分子质量降低到2 0 0 0 以下，才能被巍然环境下的微生物所利 蘑，变藏求帮其德露疑质，嚣遂过程轰要2 0 0 年；翔暴褥宅掩堙， 会使环境恶化，将影响农作物吸收养分和水分，导致减产；对它焚烧 会释放出多种有毒化学气体，其中有一种n q - 恶英的化合物，毒性极 大，臻使在摄入缀小量靛。 主猛下，逛悲镬鸟娄鞠鱼类出现穗黟帮琵亡， 对生态环境造成破坏，同时对人体有着很大的赶害。 前不久英国卫报评出“人类最糟糕的发明”，塑料袋“荣获” 这一称号。 3 2 可降解塑料的现状 幽前治理白色污染的主要谂径是使用可降解塑料。有三种可降解 塑料：光降勰塑料、半降解塑料和完全生物酶蜒塑料。光麟辫塑料的 主链缭梅中，捶入肖光敏感基露。数周至数弼的紫羚照瓣麓分解塑辩 的聚合结构，使之分解后的小片段更易进行嗽物降解“3 。但在阳光不 足的条件下，这种魍料无法降解。半降解塑料是指生物崩坏性塑料。 主要爨褥一定量熬淀耪或爨麓羧浆酝等具毒生痨洚薅特靛貔缓分填充 至i 通粥塑料中。1 ，潞其制品消费腋，经一定时间可生物障解组分降解， 致使其制品丧失力学性能与形状，以很小的粒子或碎片分散在自然界 中。这样能避免造成宏观污染，但微观上的影响依然存在，不能从根 本上解决“白色污染”。第三种是可完全生物降解塑料。这是一类新型 的具有广泛应用前景的塑料。包括：聚羟基烷酸( p h a ) 、聚乳酸( p l a ) 和脂肪族聚酯( 如，聚己内酯) 等。其中，p h a 还具有热塑性、光学 活性、压电性等特殊性能，而且它耐紫外线，不易引起炎症，生物相 容性好，完全不含重金属等有毒物质，是极“洁净”的塑料，成为替 代石化合成塑料、减少塑料废物污染的最有潜力的材料。 3 3 聚羟基烷酸简介 聚羟基烷酸( p h a ) 是细菌体内含有的一类碳源和能量的贮藏物 质。它们能由许多种革兰氏阴性菌及阳性菌在生长处于不平衡状态时 合成。这种不平衡状态是指有过多的碳源，而其余的营养( 如：氮源) 则不足。p h a 是以“颗粒状”( 直径1 0 0 - 5 0 0 n m ) 存在于细胞内，有 时甚至能达到占细胞干重的9 0 以上。”“。p h a 的通式为： 卜0 c h ( c h 2 ) m 其中m = 1 ，2 或3 ，但是大多数情况下m = 1 ，即3 一羟基烷酸( 3 - h a ) 。 n 为循环链节数，r 则代表侧基，多为不同链长的正烷基，也可以是支 链的，不饱和的或带取代基的烷基。r 为甲基，m = 1 时的聚合物为 p h b ，r 为乙基，m = 1 时的聚合物为聚3 羟基戊酸酯( p h v ) ，以此 类推。己发现的最大的r 为壬基，循环链节可看作是3 一羟基十二酸。 此外，在一定的培养条件下，微生物细胞内两种或两种以上的单体还 能形成共聚物，其代表是3 h b 和3 h v 组成的共聚物，记做 p o l “3 h b c o 3 h v ) 。聚3 羟基丁酸酯口h b ) 是p h a 家族中最早被发现 的( l e m o i g n e ，1 9 2 5 ) ，而它也是细菌体内含量最丰富的聚酯。在过去 的三十多年里，除p h b 外，还分离鉴定了1 5 0 种p h a 家族中的成员” 。根据单体的碳原子数目的不同，可以把p h a 分成短链p h a ( p h a s c l ； 3 5 个碳原子) ，中链p h a ( p h a m c l ；6 - 1 5 个碳原子) 和长链p h a ， ( p h a l c t ；1 5 令碳联予强上) 。寿一些缎麓溅戆合或p h a s ，叉戆合 成p h a m e l 。p h a 中肇俸的数嚣蠢缝残秘炎决定了聚合裙兹物理住学 性质。以下几个条件影响单体的组成：( 1 ) p h a 合成酶的生化特性。 ( 2 ) 菌体的代谢。( 3 ) 聚合物积累过程中碳源的利用。在p h a 家族 中，只有p o l y ( 3 h b c o w 3 h v ) 和p h b 己经被生产销售。 3 。4 骞关p i t a 酶舞魏磷突 3 4 1 概述 任何对于p h a 嫩物降解的研究，首嫩都要区分是胞外p h a 的降 解，还是胞内p h a 的降解。天然的、具谢究整被膜的胞内p h a 颗粒 称为n _ p h a ( 相应的黪解戆为n - p h a 解聚黼) ；处于部分结晶状态的胞 # t - p h a 蘸受d - p h a ( 藤疲豹海舞酶为玉p 淞瓣聚酶) 。 ( 1 ) 脆外降解怒缀生物对于异澡磺源( 能量) 的秘震。邋蹙徽生 物不一定能够在自身体内积累p h a ，外源的p h a 是由于其他合成p h a 的微生物死后，细胞裂解所释放出来的。很多微生物都具有降解p h a 的能力，这依赖于分泌一种特殊的胞外d - p h a 解聚酶。这种粥能够把 漆勰予承豹p h a 承瓣藏擎蒋或寡聚体。 ( 2 ) 胞内降褥楚耱够台藏p h a 懿藏髂垂隽建内漾瑗源懿代爨造 稷。这一过程是通过臌内n - p h a 解聚酶来寅现的。 ( 3 ) p h a 的胞内、胞外降解过程的不同就在于菌体内外的p h a 有不同的物理特性。 胞内的( 天然的) p h a 颗粒，相对分予膜量很大( m w1 0 5 一1 0 6 d a ) 。 它爨蹙予一秘无定形貔“撵淫”狳菠，鸯缀大筑滚动接，分露恣无蔑 僚“o 。颗粒的表面存一层由蛋自质组成簿被膜。当p h a 颗粒被分离出 胞外后，这层被膜就会被破坏甚至完全丢必。这时p h a 内部就趋向有 规律的排列，而处于晶体阶段“”( 图1 ) 。例如，胞外的d - p o h b ) 就是 部分晶体化的聚合物( 始体化程度达5 0 6 0 ) 。其中无定形都分有着 与天然p h b 翅霜瓣渡璃态转诬嚣度( t g 妣) ，鑫髂部分在 1 7 0 , - - 1 8 0 范霭内熔纯。 圈l 。p h a 虢凌理蔽态 上方：p h b 台成苗的电镜照片 左下：天然n - p h r 瓣螺蟊示意麓。 结构、功能戳白与磷脂媳成表面被膜 正下：缝势离窭熬郝势最蒋纯瓣d - p h 8 器意疆 右下：由袭面活性剂分子包被的人工p h b 颗粒 懿橱蘑示意黧 3 。4 2 艟舞瓣壬a 静辩解 1 ) 历史回顾 m a i n i c e l c m o i g n e 予1 9 2 5 年在最m e g a t e r i u m 盔发骚p ( 3 h b ) 。3 0 多年 后，第一篇关于p h a 胞外降解的文章才公开发表。这时有人利用胞外 d - p ( 3 h b ) 醛解蘩戆以d 。p ( 3 h b ) 终荛唯一碳瀑翡特点袋臻建将宅分离滋 “。这种菌能在浑浊的d p ( 3 h b ) 培养基上形成透明圈。在早期的研究 玲羧，对予终织d p ( 3 h b ) 戆革兰氏辍挂蓥、骝性菌发教线藏戆跨勰戆 力都有记泶。但遗憾的是，这些早期所分离出的菌种未能保留下来。 但缓据这些菌株的生理生化特性及它们的蝣聚酶的性质( 捌如，最适 p h9 5 1 0 ，水解届的主要产物是3 h b 单体镶) i 可以推断p s e d o m o n a s 4 s p p 1 与c o m a m o n a s s p 和c o m a m o n a sa c i d o v o r a n s 目关。c h o w d h u r y 分离 纯化出了一种能彤藏孢子的d - p ( 3 h b ) 降解菌。懊是，由于这神菌形成 的透明鬻太小，因而并没膏被详细研究。这些早期翡研究常常被忽略， 主要是因为它们仅以德文发浅“。笫= 篇关于胞外d p ( 3 h b ) 降解的报 道是由d e l a f i e l d 巍m ，d o u d o r o f f 在1 9 6 5 零发表翡。这蔟擐遴描述了大蹩 的阻革兰氏阴性菌为主的d p o h b ) 降解菌。其中一些菌表现出了对 d - p ( 3 h b ) 的高度邋应牲。它们不能在水溶性物质( 如，糖类、氨基酸 浸萁稳凝源) t 生长。莫中分离整懿令瑟耱皱务名鸯p s e u d o m o n a s l e m o i g n e i ，以纪念m a u r i c el e m o i g n e ，是他首先发现了p o h b ) 。这个种 最近被蕊新命名为p a u c i m o n a sl e m o i g n e i 。它具越至少七种胞； - p ( 3 i - i b ) 解聚酶，因而受到酱遍静关注。 2 ) 胞强d - p h a 黪瓣菌静分凌鉴定 p h a 降解菌能在以d - p h a 为难一碳源的圈体培养基中富集。在这 种选择性培养条件下，首先获得的最那些具有璇快生长速率的菌株。 这些不定砉蒌是囊效降瓣d p h a 豹蘩耱。一些杂蓥，虽然劳没有黪瓣 d - p h a ，但它们能够利用最初的降解产物( 一魑寡聚物) ，因而长褥很 快，而且很难去除。更好的办法是把土壤稀释液涂布于以d - p h a 乳化 滚为难镶澡静圈伟培养蘩上。洚辩鏊麓分澄特殊兹d 零 耋a 降解瓣， 这种酶熊在胞外水解聚合物，使之成为水溶睫的产物，夜菌落的周围 形成透蹬圈。这转方法在露畿、厌氧及摇瓶条传下完成，以分离黩i 好 氧菌、捩氧菌及微好氧菌。 但是只有p h a s c l ( 如：p h b ) 能够被制成乳化液。其余的p h a ，包 括p ( 4 h b ) 霹蘸煮瓣p h a m c o 只魏影残较大兹蔽炊戆蒙纂携，恧不戆誊 接用于透明圈方法。而含有薄层这种聚集物的琼脂平檄，在加入染 料( 如：苏丹红、尼罗红) 后，可用于分离p h a m c l 降解菌“。然而 使用这耪方法，可会漏簿那些酶活鞍低豹d - p h a 簿嚣蘩。 乳化方法的发展促进了d - p h a 降解菌的分离。一种稳定且耐热的 乳剂的测釜方法楚把溶有霹浆的d - p h a 加入到冷水中，褥蒸发渡钵飚 得到。这种孚l 荆可用于透明豳实验。由于这种方法对于不问的p h a 缀 5 少囊辍翻要求，爱以可叛援子分离诲多穆类瀚p h a m c l ，洚麓蘩“”1 。 男一个方法是由h o r o w i t z 秘s a n d e r s 改遵懿。“”1 。他们翻各p h a 乳裁 的方法为：把聚合物溶于氯仿，然后加入表面活性剂，经过趣声波处 理使之乳化，再用透析躐蒸发的方法除掉氯仿。这样就得到一种袭面 包被脊表面活性物质的非透明、稳定的颗粒状悬浮物质。由于p h a 通 誊溶麟予氯仿，这秘方法可跌瑁亲把各耪p 敬裁成毳纯滚。但遮耱方 法蕊不是之延是表蟊活髓麓麓够帮裁萤锌鹣生长鞍p h a 簿聚熬静法 性。近来，又发明了一种制备d - p h b 乳化液的方法“。这种方法是先 把含肖晶体d p h b 的水溶液加热到熔点( 1 8 0 ) 以上，再迅逋将其 冷却刹室温。熔化的d - p h b 能在几周之内保持种亚稳定的无定形状 态。邀转方法似乎也能墩瘸于d - p h b 以外的p h a 。 使麓隧主麴方法，霹皴鉴定霸分毫窭够酶熬d - p h a 并萎爨鬻转 解产物生长的微生物。可以通过测量菌落及透明圈大小的方法，撼那 些生长旺盛、降解率高的菌株同那些降解能力低的菌株区别开。 舆有降解d - p h a 能力的菌种很多，它们存在于几乎所有类烈的陆 地及水域的生态系统中。关于d - p h a 降解菌的生态和分类学研究，参 考文簸【1 9 - 2 3 。其煮瓣籁d - p h a 戆力戆徽懋臻劳不仅羧予缎麓，艺 笈魂了诲多可降藤p h a 的霉菌。 2 8 。一硬既较研究表明，在好辩舜 解d - p h a 的霉菌中，予囊菌1 8 种，担子菌类4 6 种，半知菌类2 6 种， 鞭琵菌类1 种，粘菌2 种，接合菌2 种”。但目前，对从霉菌中纯化 出的d 。p h a 解聚酶的研究还很少。 大部分豹d 。p h a 降熬毽零只能专一氇东解p h a s c l 或p h a m c t , t 8 l 。 灵鸯多帮分豹篾麓簿簿p h a s c l ，又爱簿瓣p h a m c l 。 3 ) d p i j a 解聚酶的生化特性 许多种细菌的胞外d - p h a 解聚酶都已被纯化和鉴定“8 。目前的 实验结果表明，d - p h a 麟聚酶有以下几点特性：( 1 ) 它的稳定憾在不 弱豹祭孛下穗l ：p h 、激痰、枣子强度等) 都缀寒。( 2 ) 稷对分予豢羹 狠小( 小于7 0 k d a ，大多数的d - p h a 解聚酶的相对分子餍蹙为 4 0 5 0 k d a ) ，并且大部分的解聚酶仅由一条多肽链构成。( 3 ) d p h a 6 越羧酶著不韪缝合鞠璃子交换裁，翅：d e a e ( 在垂熬蕾l 下) ，毽对巯 东髓纯舍耪有穰稠羹添装和力。( 4 ) 最逶p 联毽在碱性范围内( 7 + 5 固s ) 。 只谢r p i c k e t t i i 和p e n i c i l t i c m f u n i c u t o s u m 中解聚酶的最适p h 分别为 5 5 和6 0 。( 5 ) 大部分d - p h a 解聚酶能被魑氨酸水解酶的抑制物所抑 制。如：二异丙基氟化磷酸盐( d f p ) 和磺酰基化合物。它们与丝氨 酸永孵酶活性位点上豹丝氨馥潋共份键穗结台。大部分可降解 d - p h a 兹绥萤哭显蓑稳含窍一静鼹蒙酶。磷究交多懿是赣氏鬏攀您萤 ( p l e m o i g n e i ) 1 ，因为它能够合成七种胞外p h a 解聚酶 ( p h a z 】p h a z 7 ) 。其中的六种水解d p h a ，而且这些酶的生化特性有 细微的差别。第七种则专一地水解无定型p h a 。 所有纯化出的d - p h a 解聚酶都专一蛾像用于p h a s c l 或p h a m c l 。 黢吁链霉蓉( s e x f o t i a t u s ) k 1 0 萤赣本麓黢能舞鼹d - p h b 又戆洚簿 d ，艄o ，然而经纯纯躐的解聚酶却只髓专堍作用于p f l 堍c l “。困此， 脱叶链霉菌( s e x f o l i a t u s ) 一定是还含有鬣少一种其他的解聚酶来专一 作用于d - p h o 。用a f a e c a l i s 的解聚酶作用于p o l y ( 3 h b - c o 一3 h v ) ，相同 单体间的酯键被水解，瓶3 h b 和3 h v 阃的酯键则不能被水解1 。 与其恁秘细菌搭海豹d p h a 解聚瓣不霆，勒氏暇零缒菌 ( p t e m o i g n e i ) 窥那黧粪核镦生裙俸肉瓣辩蒙酶有糖基纯终麓，含有 n ，艺酰葡萄糖胺和葡萄糖。虽然糖基化作用并不对酶的活性越主要作 用，怛它能提高胞外酶对高温和其他微生物蛋白酶水解作用的抵抗能 力”。在没有水的条件f ( 如，在有机溶剂中) p h a 解聚酶熊催化相 爱嬲化学反应( 如，麓瓣合或彳乍用) 。”“。 4 ) d 增h a 解聚酶的分子生物学 自1 9 8 9 年以来，融经克隆和分析了1 2 种d - p h a 解聚酶的基因 ( p h a z ) 和一种寡聚物水解酶基因( o h a z ) 。除脱叶链霉菌 se x f o j y s t v s ) k 1 0 ”1 1 菌株的p h b 解聚酶基因外，其余的均是来源 予攀兰氏骤毪菌a f a e c a l i st 1 ”，c o m a m o n a s s p ，9 “，a c i d o v o r a n s ， p f l u o r e s c e n sg k l 3 嘲，r p i c k e t t i i 嘲，p s e u d o m o n a s ，s pa 1 ”秘勒氏 假单胞菌( p t e m o i g n e i ) 4 0 4 2 o 其中1 1 种慕因编码的解聚酶鼹专一地 作用于p h a s c l ，尤其是p h b 。pf t u o r e s c e n sg k l 3 解聚酶基因所编 码的解聚酶作用于p h a m c l ”“。此外，关于一种能水解聚己内酯的 f u s a r i u ms o l 卸i 角质酶。”“1 与p h a 解聚酶的关系，目前尚不清楚。 图2 d - p h a 解聚酶的种类 所有的p h b 解聚酶蛋白都有一个复合的结构区域( 图2 ) 。它的组 成：( 1 ) 一段2 5 5 8 个氨基酸残基的信号肽。该信号肽在穿透细胞膜 时被信号肽酶切除。( 2 ) 在n 端有一个较大的催化区域。( 3 ) 在c 端有一 个底物结合区域。h ) 一个连接催化区域和底物结合区的连接区。催化 区的活性中心是由丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸这三个十分保守的氨基 酸组成。丝氨酸水解酶参与组成l i p a s e b o x 五肽 g l y x a a ( 1 l s e r _ x a a ( 2 _ ) 一g y 。这个结构存在于所有己知的丝氨酸水解酶 ( 如：脂肪酶、酯酶和丝氨酸蛋白酶) 中”。丝氨酸侧链中的氧原子 是一种亲核物质。它作用于酯键，以组氨酸的咪唑环作为载体。组氨 酸的正电荷通过与天冬氨酸的羧基作用而中和。l i p a s e b o x 上发生的由 丝氨酸 s e r l 3 8 ( 尸1 e m o i g n e i 解聚酶a ) ：s e r l 3 9 似f a e c a l i s ) ；s e r l 3 9 ( p f l u o r e s c e n sg k l 3 1 变成丙氨酸和苏氨酸的定点突变导致了蛋白质的 彻底失活。证明了一定的侧链结构是保持酶活所必需的“3 14 “。与大多 数的细菌的脂肪酶相比较，这里l i p a s e b o x 中的x a a 是组氨酸。所有 的p h a s c l 解聚酶都含有亮氨酸，也许是因为亮氨酸的疏水侧链比带正 电荷的咪唑环更适合于疏水性的聚合物。 p h a s c l 解聚酶专门结合p h b 颗粒。当缺少c 端区域时，酶就丧 失了这种能力。并且这种修饰酶也不能够水解p h b ”10 1 。但是由于它 与寡聚物或人造的水溶性底物( 如对硝基苯酯) 相作用的括性并没有 受影响，所以可以说它的催化区域并未受到影响。显然，c 末端部分 包括一个底物结合位区域或者至少是构成它的一个主要部分。这个结 论与d o i 等和k a s u y a 等发现的结论相一致。后者提出酶水解聚合物的 反应包括2 步，即酶与聚合物的吸附和随之进行的水解。近来，一种 含有e s c h e r i c h i ac o l i 麦芽糖结合蛋白( m a l e ) 和p 1 e m o i g n e ip h b 解 聚酶a ( p h a z 5 ) c 端区域的融合蛋白可以专一地结合p h b 颗粒，这就说 明c 端区域具有与p h b 专一结合的功能。 对于p h a s c l ，解聚酶上的催化区域和底物结合位点区域中间部分 的功能，目前尚不清楚。在来源于勒氏假单胞菌( p 1 e m o i g n e i ) 的5 种d p h b 的解聚酶p h a z l ，p h a z 2 ，p h a z 3 ，p h a z 5 和p h a z 6 中，这 个区域含有一段4 0 个氨基酸长的序列，其中富含苏氨酸。这个结构共 有4 个苏氨酸重复区，每个重复区含4 , - 6 个苏氨酸残基。而在其它 p h a s c i ，解聚酶中，这段富含苏氨酸的区域被纤连蛋白( f n 3 ， 图2 ) 指纹结构所替代。f n 3 序列已经在许多真核的胞外基质蛋白及原核的 水解聚酯蛋白( 如几丁质酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶) 中描述过。 在b a c i l l u sc i c o u l a n s 几丁质酶中，f n 3 序列并不是保持酶活的基本成 分，但在与非水溶性底物作用时起到一定的作用“”。f n 3 序列和苏氨 酸富含区可能是提供一个位于底物结合位点和酶催化中心之间的必须 区域( 连接点) “。细菌的f n 3 序列与真核生物的f n 3 序列含有许多 相同的保守氨基酸，而且它们的三维结构也很相似，都含有重复区域， 每个重复区由2 - - 6 个羟基氨基酸( 丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸) 组成。 这些羟基与d p i - i b 分子相互作用并使之靠近酶的活性中心。 在大多数的p h a 解聚酶和脂肪酶中，催化三联体氨基酸的顺序是 组氨酸( 含氧离子) 一丝氨酸一天冬氨酸一组氨酸( t y p ei ，图2 ) 。 而在se x f o l h ，t u s 和c o m a m o n a ss p 解聚酶中组氨酸( 含氧离子) 却位 于催化三联体的c 端。“，顺序为丝氨酸一天冬氨酸一组氨酸一组氨 酸( 含氧离子) ，这是蛋白质的不同结构。因而c o m a m o n a ss p 和矗 e x f o l i a t u sk 1 0 的解聚酶与其他的p h b 解聚酶不同。虽然在基因库中已 把它们鉴定为丝氨酸水解酶，然而它们却对p m s f 非常不敏感。因而 有人把这两种菌的解聚酶归于p h b s c l 解聚酶家族中的一类( t y p ei i ， 图2 ) 。近来，又有人从新分离的菌种中分离鉴定出4 种d - p h b 解聚 酶“，其中有两种还表现出了很高的水解3 羟基丁酸二聚体的活性( 1 3 和1 7 u r a g ) 。所以这两种菌( t 1 0 7 和z 9 2 5 ) 作用的水解产物中只有 3 羟基丁酸单体。经研究发现t 1 0 7 和z 9 2 5 解聚酶的n 末端氨基酸分 别与c o m a m o n a ss p 和se x f o h a t u s 解聚酶相似，而且与它们的生化 性质也相同。5 ：( 1 ) 专一地作用于p h b 和3 羟基丁酸含量高的3 一羟基 丁酸与3 一羟基戊酸共聚物。( 2 ) 相同的最适p h 值( p h i 9 ) 。( 3 ) 相 近的相对分子质量( 4 5 , - - 4 9 k d a ) 。所以可以推测，t 1 0 7 和z 9 2 5 解聚 酶与c o m a m o n a ss p 和矗e x f o l i a t u s 解聚酶有相似的结构，在分类上 属于同一类型( t y p e i i ，图2 ) 。目前，数据库中已经有c o m a m o m a s a c i d o v o r a n sd p h b 解聚酶的核苷酸序列( a b 0 0 3 1 8 6 ) ，由于推测出的 氨基酸序列也与c o m a m o n a ss p 和se x f o l i a t u s 解聚酶的相似，而且 活性位点结构完全相同。所以c o m a m o m a sa c i d o v o r a n sp h b 解聚酶也 属于第二种类( t y p e i i ) 。 第三种类p h a 解聚酶( t y p e l l _ i ，图2 ) 与第一种类的活性位点结 构相同，只是以富含苏氨酸的区域代替了f n 3 区( 如，p 1 e m o i g n e i 解 聚酶) 。 与d - p h a s c l 解聚酶相比，对于d - p h a m c l 解聚酶的研究还很少。 p 1 u o r e s c e n sg k l 3d p h o 解聚酶是唯一的被纯化出并研究到分子水 平的d - p h a m c l 解聚酶。“”“。对降解d - p h a m c l 细菌的研究概述，参 考文献 2 3 3 。p 舰o ，邪c h sg k l 3d - p h o 解聚酶( t y p e ，图2 ) 与 d - p h a s c l 解聚酶商明显的不同，它不能被d t t 或e d t a 所抑制，而 且也不依赖c a 2 + 簿二徐鬻离子。舅一秘具有降解脆韩d - p h a m c l 灞洼 的细菌熄c o m a m o n a ss pp 3 7 c ”1 ，其液体培养液能够降解p h o ，邂对 p h b 有鞍弱的水壤作用。懊髫前尚不清楚，这秘菡是分泌蹰辩不嗣的 解聚酶，还是分泌一种对p h 0 和p h b 均有作嗣的解聚酶。 克隧，f l u o r e s c e n sg k l 3d - p h o 解聚酶基因后，推测出的氨撼酸 疼疑与d - p h a s c l 薅聚跨没存甥显熬阉滚蛙。只是在 l i p a s e - b o x ( g l y - x a a = 一s e r i 7 2 一x a a 2 g l y ) ，a s p 2 2 8 ，h i s 2 6 0 处棚同。定点诱 变证明了这些氨旗酸对维持酶的活性起了主要作用删。催化三联体 ( s e r l 7 2 ，a s p 2 2 8 ，h i s s 0 ) 倥予酶翁c 寒壤。这一点与囊鸯躲d p h a s c l 解聚酶不同。而殿研究还证明了在此酶的n 末端具有底物结合区嘲1 。 5 ) p i t a z 口：置l e m o i g n e i 中专一逮董篝用于无寇滋p i t a s c l 雏一稀熬嗜 碱性水解酶 历煮豹d 。p h a 求解酶郝专一遗承麟晶体粒d - p h a ，褥对于无患型 的n - p h a 颗粒不怒作用。德是，当m p h a 颗粒表面的被膜被破坏溅是 部分地除去( 用鬣自酶处理) 时，d p h a 解聚酶就能够与之发生作用。 嚣且，爱虚弱速度簧跑拳髂爨箨d - p h a 懿速痰蠢密3 - - 4 貉。最运，有 人研究了p o l y 【( r ，s ) 3 h b 】的水解。由于对映异构体的存在和无序 排列，p o l y ( r ，s 1 3 h b l 悬竞全的炙定型状态，所以几乎不能被p l e m o i g n ed - p h b 解聚酶( p h a z s ，p h a z 2 ) 孬军承解。然两令人意怒不瓣静 是，又发现了一种pl e m o i g n e i 胞外解聚酶( p h a z 7 ) 。这种酶专门 承簿套突整被骥戆n - p h b 鞠p o l y ( r ，s ) - 3 h b 这些无定型p h b ，蕊对 d - p h a 凭作用。因此，p h a z 7 成为第一个被描述的胞外m p h a s c l 解聚 酶。纯化出的p h a z 7 在高温( 5 9 ) 平口碱性条件下( p h9 - - - 1 2 ) ，仍很 稳定，纛傈持潘魏。宅终瓣n p h b 熬溪活缀毫，浸寿醋瓣、煮囊黪、 酰胺酶、d n a 酶、r n a 酶活性，而对于对硝蒸苯酰酯有较低的活性。 因此，p h a z ，不属于一般的黼酶或脂酶“。 觚d n a 推嚣出的p h a z 7 的氨基蔽序蠢与其它p h b 祷聚酶浸礴爨 显晌相似之处，而只与丑s u b t i l i s 脂酶l o b 有些相似，具有l i p a s e ，b o x 五躲廖舜a l a h i s - s e r l 3 6 - m e t - g l y 私i - t i s 4 7 鲶静氧离子霞。确a z 7 还对丝 氨酸水解酶抑制剂d f p 敏感。所咀推测，p h a z 7 与融知的p h a 解聚酶 j 霹箨酶不霹，它嚣予翼有骥纯三联髂( s e r l 3 6 ，a s p 2 4 2 ，h i s 3 澌) 鹣丝 氨酸水解酶“”3 。 6 ) d p h a