（微生物学专业论文）高产多糖大球盖菇菌株原生质体诱变选育及其抗氧化能力研究.pdf

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p x 高产多糖大球盖菇菌株原生质体诱变选育及其抗氧化能力研究 活性和s o d 活性有所增加。分别在第1 5d 和第9d 达最高，诱交菌株菌 粉制备液组小鼠全血g s h - p x 活性和s o d 活性分别是对照组的1 0 5 5 倍和 1 2 8 4 倍，出发菌株菌粉制备液组的1 0 0 8 倍和1 0 9 9 倍。小鼠全血m d a 含量明显降低，第1 8d 时达最低，诱变菌株菌粉制备液组小鼠全血m d a 含量比对照组降低了o 4 6 5 倍，比出发菌株菌粉制备液组降低了o 1 3 6 倍。 g s h - p x 、s o d 、m d a 实验表明，大球盖菇诱变菌株比出发菌株的抗氧化 能力更强。 关键词：大球盖菇：原生质体；诱变育种；多糖；抗氧化能力 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t s r r o p h a r i ar u g o s o - a n n u l a t a ( r d n g8 t r o p h a r i ao rw m c w a p ) w h i c hb e l o n g s t ob a s i d i o m y c o t a , h y m e n o m y c e t e s , a g a r i c a l e s , s l r o p h a r t a c e a e , s t r o p h a r i a , i s 8g o r g e o u s , n u t r i t i o n a la n df u n c t i o n a lm u s h 咖w i t hap l e a s a n tr e f i e s h i n g t a s t eo f d e l i c a t ef r a g r a n c c ，c r i s pa n ds l i g h t l ys w e e t i t sf m i t b o d i e sc o n t a i nh i g h p r o t e i nl e v e l sw i t ha l lt h ee s s e n t i a l 锄i n oa c i 凼a n do t h e re l e m e n t s s u c ha s t r a c e e l e m e n t s , v i t a m i n sa n dp o l y s a c c h a r i d e s w h i c hh a v e e f f i c a c yo n p r e v e n t i n gc o r o n a r yh e a r td i s e a s e s ，h e l p i n gt od i g e s t i n ga n dw e a k e n i n g m e n t a l l ye x h a u s t i o n t h ei n h i b i t o r ym t e so fp o l y s a c c h a r i d e so fs t r o p h a r i a r u g o s o - a n n u l a t at os - 1 8 0t r m o l i nm i c ea n da ia s c i t c sc a n c ra c h i e v e7 0 u v - i r r a d i a t i o np r o t o p l a s tm u t a g e n e s i si so n eo ft h ee f f e c t i v eb r e e d m g m e t h o d sa n di th a sb e e nw i d e l yu s e du n t i ln o w e d i b l ea n dp h a r m a c e u t i c a l f u n g a lp o l y s a c c h a r i d c sr e g a r d e da s b i o l o g i c a lr e s p o n s em o d i f i e r h a v e b e c o m et h ef o c o u so fr e s e a r c a e si nm a n ya c a d e m i cf i e l d sb e c a u s eo ft h e i r s p e c i a lb i o a c t i v i t y i nt h i sp a p e r , w es t u d i e dt h ec o n d i t i o n so fp r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n d r e g e n e r a t i o nf r o mt h em y c c l i ao fs t r o p h a r i ar u g o s o - a n n u l a t a as t r o p h a r i a r u g o s o - a n n u l a t as t r a i nw i t hh i 【g hp o l y s a c c h a r i d e s p r o d u c t i o nw a so b t a i n e d t h r o u g hu v - i r r a d i a t i o np r o t o p l a s tm u t a g e n e s i s 皿ea n t i o x i d a t i o ne f f e c t so f m u t a n t sa n do r i g i n a lm a i no fs t r o p h a r i ar u g o s o - a n n u l a t aw c r es t u d i e d t h e r e s u l t sw e r c 鹤f o l l o w s ： 1 k h i g l l e s ty i c i do f p r o t o p l a s t k l 3 6 x 1 0 7 m l ) c a nb eo b t a i n e db yu s i n g 1 5 l y w a l l z y m el n a d eb y0 6m o l lm a n n i t 0 1 d i g e s t i n gf o r2 5h o u r sa tt h e c o n d i t i o no f3 0 a n dp hv a l u e5 5 t h eo p t i m a lm e d i u mf o rp r o t o p l a s t r e g e n e r a t i o no fs t r o p h a r i ar u g o s o - a n n u l a t aw a s ：p o t a t o2 0 0 舀s 啪辩2 0 舀 p e p t o n e2 易y e a s te x t r a c t s2g ，谚0 4 1 5g ，k 2 h p 0 4 1 5g ，m g s 0 4 t i - h o 1 5g ，v i t a m i nb 10 1g ，v i t a m i nb 6o 1g ，d i s t i l l e dw a t e r10 0 0m l ，a g e r2 0g w i t ha b o v eo p t i m a lr e g e n e r a t i o nm e d i u mc o n t a i n i n g0 6m o l lm a n n i t o la n d t w ol a y e rp l a t i n gm e t h o d , r e g e n e r a t i o nr a t ei n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya n dt h e h i g h e s tr e g e n e r a t i o nr a t ew a so 9 6 3 高产多塘大球盖菇菌株原生质体诱变选育及其抗氧化能力研究 t h em e d i u ml e t h a ld o s eo f u vi r r a d i a t i o no ns t r o p h a r i ar u g o s o - a n n u l a t a p r o t o p l a s t sw a s2 0s a c c o r d i n gt oa n t a g o n i s t i ce f f e c ta n ds t a t eo fg r o w t h , w e s c r e e n e d1 0 0s w d i l 塔w h i c hp o l y s a c e h a f i d e s y i e l dw e h i g h e rt h a nc o n t r 0 1 f i n a l l y , w es c r e e n e ds t r a i n0 9 3f o ri t s h i g l lp o l y s a c e h a r i d e s y i e l da n dg e n e t i c s t a b i l i t y c o n t e n to f p o l y s a c c h a r i d e so f m u t a n t0 9 3i n c r e a s e d2 5 3 t h a nt h a t o f o r i g i n a ls t r a i n t h ea n t i o x i d a t i o ne f f e c t so ng l u t a t h i o n e p e r o x i d s a d e ( g s h p ) 【) ， s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) a n dm a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) o f m u t a n t0 9 3a n d o r i g i n a l s t r a i no ft h eb l o o di ni n t r a g a s u i cr a t sw e r es t u d i e d n 坞r e s u l t s s h o w e dt h a tg s h - p xa n ds o da c t i v i t i e so ft h eb l o o di ni n t r a g a s t r i cm r sw i t h o r i g i n a ls t r a i na n dm u t a n t0 9 3o fs t r o p h a r i ar u g o s o - a n n u l a t aw e r ei n c r e a s e d , a n dc o n c e n t r a t i o no f m d aw 私d e c r e a s e ds h a r p l y n 峙a n t i o x i d a t i o ne f f e c to f m u t a n t0 9 3 o fs t r o p h a r i ar u g o s o a n n u l a t aw a sb e t t e rt h a nt h a to fo r i g i n a l s t r a i n k e y w o r d s ：s t r o p h a r i ar u g o s o - a n n u l a t a ；p r o t o p l a s t ； m u t a g e n e s b ； p o l y s a e e h a r i d e s ；a n t i o x i d a t i o n 4 山东农业大学磺士学位论文 l 引言 1 1 大球盖菇研究现状 1 1 1 分类地位与形态特征 大球盖菇( s i r o p h a r i a r u g o s o - a n n u l a t a ) ，又名皱环球盖菇、皱球盖菇、 酒红色球盖菇、斐氏球盖菇、斐氏假黑伞，属于担子菌门( b a s i d i o m y c o t a ) ， 层菌纲( h y m e n o m y c e t e s ) ，伞菌目( a g a r i c a l e s ) ，球盖菇科( s t r o p h a r i a c e a e ) ， 球盖菇属( s t r o p h a r i a ) ( 黄年来，1 9 9 5 ；i - i a w k s w o r t hd l e t 耐，1 9 9 6 ) 。 大球盖菇于春至秋生长在林中或林缘草地上，或路旁草地上。分布于 欧洲、北美洲、亚洲等地。野生大球盖菇在我国分布于云南、吉林、西藏 等地。2 0 世纪6 0 年代，德国最早进行人工驯化栽培，现在波兰、美国及 荷兰也进行了人工栽培。2 0 世纪9 0 年代，中国开始引种栽培。其子实体 单生、群生或丛生。菌盖直径5 5 1 5 0 锄，初期近半球形，后展平，葡 萄酒红色至暗红色，表面光滑，有纤维状鳞片，菌肉肥厚、白色，菌褶直 生，近白色，后变深褐色或紫黑色，稍宽，褶缘有不规则的缺刻，菌柄长 9 - - 1 5c n l ，直径1 - - 4 咖，中实，后期中空，表面光滑，白色至淡黄褐色。 菌环厚，膜质，环上有深沟纹，深裂或星形，易脱落，孢子印紫褐色，孢 子椭圆形，1 2 0 1 5 0 6 5 - - 9 0 岬，顶端具有明显芽孔、壁厚，褶侧囊 状体为典型的黄囊体，棍棒状，顶端小突起2 4 o 一5 3 0 6 5 1 3 5p l n ， 具菌缘囊状体，比褶侧囊状体稍小( 黄年来，1 9 9 5 ；黄年来，1 9 9 8 ；v a g n e r g c 甜a ，2 0 0 4 ) 。菌落形态上有绒状，毡状和絮状，菌丝细胞含有双核， 并且有明显的锁状联合结构，大都无无性孢子( 何华奇等，2 0 0 3 ) 。 1 1 2 化学成分研究 大球盖菇是国际菇类交易市场的十大菇类之一，也是联合国粮农组织 ( f a o ) 向发展中国家推荐栽培的重要食用菌之一。其子实体内含有丰富 的蛋白质及对人体健康有益的糖类、矿质元素、维生素等物质，氨基酸含 量达1 7 种，人体必需氨基酸齐全，刘本洪等分析了简阳市石盘镇生产的 大球盖菇，其氨基酸含量见表1 。其多糖对小白鼠s 1 8 0 肿瘤及艾氏腹 水癌抑制率达7 0 ( 颜淑婉等，1 9 9 7 ；闫培生，2 0 0 1 a ；刘本洪等，2 0 0 5 ) 。 大球盖菇干品中含灰分1 1 4 0 ，碳水化合物3 2 7 3 ，蛋白质 2 5 8 1 ，脂类2 6 0 。无机元素中p 含量最多，1 0 0 9 干品中含p12 0 4 6 5 高产多糖大球盖菇菌株原生质体诱变选育及其抗氯化能力研究 m g ，之后依次为c a ( 9 8 3 4r a g ) ，f e ( 3 2 5 1m g ) ，m n ( 1 0 4 5m g ) ，c u ( 8 。6 3 m g ) ，a s ( 5 4 2m g ) ，c o ( o 3 8m g ) 。还含有丰富的葡萄糖、半乳糖、甘露 糖、核糖和乳糖。此外，还含有多种维生素，如1 0 0g 干品中含烟酸5 1 3 8 m g ，核黄素3 8 8n a g ，硫胺素o 51m g ，维生素b 6 0 4 2m g ，维生素b 1 20 4 1 m g ( b r o d z i n s k aze ta 1 ，1 9 8 1 ；m a r u s z e w s k a m g h ，1 9 7 9 ；l a s o t aw e ta 1 ， 1 9 8 3 ) 。l a s o t aw 等报道，大球盖菇中含胆碱、甜菜碱、组胺、鸟嘌呤、 胍和乙醇胺等多种生物胺，其中组胺、乙醇胺和胆碱含量较高( l a s o t aw 甜a l 1 9 8 1 ) 。 表i 大球盖菇氨基酸含量 t a b 1 a m i n o a c i dc o n t e n t o f s t r o p h a r a r u g o s o - a n r a z l a t a 氨基酸种类含量( 干基) 氨基酸种类含量( 于基) 天门冬氨酸 2 5 l 异亮氨酸 1 4 0 苏氨酸 i 5 7 亮氨酸 2 ，3 5 丝氨酸 1 3 3 酪氨酸 1 0 8 谷氨酸 4 蹦 苯丙氨酸 1 撕 甘氨酸 1 2 i 赖氨酸 i 9 2 丙氨酸 2 2 3组氨醴075 簏氨酸0 4 5糟氨酸 j 2 7 缬氨酸 2 2 6 脯氨酸 1 3 7 蛋氨酸0 4 8 1 1 3 胞外酶的研究 大球盏菇降解木质素过程中锰过氧化物酶( m a n g a n e s e p e r o x d a s e ， m a p ) ，木质素过氧化物酶( l i g a i n p e r o x i d a s e ，l i p ) 和漆酶( l a c c a s e ，l a c ) 起关键作用。此三种酶均在细胞内合成，而分泌到细胞外，属胞外酶( 萨 仁图雅等，2 0 0 5 ) 。 y o o k h ( 1 9 9 9 ) 报道了大球盖菇降解纤维素的3 种酶，即微晶纤维素 酶( a v i c e l a s e ) 、b 一葡莓瞢酶( 母一g h 瑚西d 蹴) 和羧甲基纤维素酶 ( c i v i c a s e ) 。 王红等( 2 0 0 3 ) 对液体培养时胞外酶活性与p h 值的关系进行了研究， 发现漆酶最适p h 值为3 8 ，淀粉酶最适p h 值为5 8 ，液体培养7 d 时无多 6 山东农业大学硕士学位论文 酚氧化酶和纤维素酶活力。 1 1 4 生物学特征 张琪林等( 2 0 0 2 ) 研究了多种碳源、氮源以及碳氮比对大球盖菇液 体培养菌丝生物量的影响。结果表明，碳源以蔗糖为佳，氮源以铵盐为好， 碳氮比以2 4 ：1 为最适。闫培生等( 2 0 0 1 a ) 报道，所测无机盐中，n a 3 p 0 4 对大球盖菇菌丝生长具有显著的促进作用，c 和m 矿对菌丝生长有微弱 的抑制作用，c a 则有显著的抑制作用，f e 2 + 却无影响。 大球盖菇生长发育需要适宜的环境条件，如温度、p h 值、湿度、光 照、通风等。菌丝生长温度范围为5 3 5 ，最适温度为2 5 3 0 。菌丝 在怔l4 1 1 范围内均可生长，最适p g5 8 ，这时菌丝不仅生长速度快， 而且菌丝健壮；p h 8 时，随着p h 升高，菌丝细弱且生长速度减慢；p h 为6 时，大球盖菇菌丝生长最快，最健壮。闰培生等报道，菌丝在含水量 为6 5 - - 8 0 的培养基上均能正常生长，最适含水量为6 5 - - 7 5 ；原 基形成时要求空气相对湿度9 0 一9 5 ；子实体生长发育阶段的空气相 对湿度一般要求在8 5 以上，其中以9 5o o ；左右的相对湿度为适宜。菌丝 生长阶段不需要光照，但子实体分化和生长发育阶段要求有一定的散射 光。大球盖菇属于好气性真菌，菌丝生长阶段对通风要求较敏感。大球盖 菇栽培时需要覆土，因为土壤中的茵群可诱导子实体形成，不覆土也能出 菇，但出菇迟、产量低( 刘胜贵等，1 9 9 9 ；颜淑婉，2 0 0 2 ；闫培生等，2 0 0 1 a ； 张琪林等，2 0 0 2 ) 。 1 1 5 原生质体再生和单核化的研究 研究表明，马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、甘露醇( p g p m ) 为大球盖菇 原生质体再生的最佳培养基。大球盖菇原生质体再生速度非常快，三个不 同菌株的再生率为o 9 7 一2 0 0 。原生质体单核化率高达7 7 6 ，且再 生双核体和单核体在形成再生菌落时无时间差，其生长速度亦无快慢之 分，液体预培养可显著减少单核化率。再生单核体中存在亲本两种交配型， 但这两种交配型的比率不为1 ：l ( 闫培生等，2 0 0 1 b , y a h p se t a l ，2 0 0 4 ) 。 1 1 6 应用价值研究 大球盖菇降解木质素的能力很强( k a m md ne ta l ，1 9 8 5 ；b u t aj ge t a 1 1 9 8 9 ) 。赵德清等( 2 0 0 3 ) 报道，真菌降解木质素的机理为：菌丝在生 7 高产多糖大球盏菇菌株原生质体诱变选育及其抗氧化能力研究 长蔓延的过程中分泌出大量的胞外氧化酶，其中关键的两类过氧化物酶一 锰过氧化物酶( m a p ) 和木质素过氧化物酶( l i p ) ，在分子氧的参与下， 依靠自身形成的h 2 0 2 ，触发启动一系列自由基链反应，使木质素结构中 的苯环氧化形成阳离子基团，而后发生系列自发反应而降解。木质素的 降解产物继而再被菌丝吸收，最终氧化成为c 0 2 和1 - 1 2 0 。 大球盖菇能有效降解土壤和废水中的2 ，4 ，6 三硝基甲苯( n 盯) 及 其他芳香族化合物。s c h e i b n e rk 等( 1 9 9 7 ) 测定了不同真菌的9 1 个菌株， 结果表明大球盖菇对t n t 降解率达3 6 ，仅次于c l i t o c y b u l a d u s e n i i n 伯1 2 ( 4 2 ) 。s t e f f e nk t 等( 2 0 0 2 ) 报道，在试验过的9 种蘑菇中。大球 盏菇降解芳香族化合物的能力最强，在加有2 0 0 心岱缸( u 嫩培养基中，6 周内对苯并芘0 3 0 ) 、蒽、芘的转化率分别高达1 0 0 、9 5 * 0 年1 18 5 。它 还能降解氯化苯酚、苯胺化合物、氯苯、多氯联苯、甲酚、苯甲酚和二甲 苯等对境造成严重污染的耐熔有机物质( s c h e i b n e rke t 耐，1 9 9 7 ；h e r r ea 甜a ，1 9 9 8 ；s c h e i b n c rk e ta l ，1 9 9 8 ；s t e f f e nk t 甜以，2 0 0 2 ；w 幽sme ta 1 ， 2 0 0 3 ；w e i s sme t 甜，2 0 0 4 ) 。 1 2 食用菌育种现状 为了使食用菌达到优质高产、抗逆强、适温宽等育种目标，人们采取 了选择育种、杂交育种、诱变育种等常规手段。近年来，分子生物学的迅 猛发展和生物技术的广泛应用，为食用菌新品种的选育提供了新的途径。 1 2 1 选择育种 选择育种是利用自然条件下发生的有益变异，通过去劣存优，选育满 足人类需要的菌株。要达到选择育种目的，必须细心观察产生了明显有益 变异的个体，广泛收集不同地域、不同生态型的菌株，以便从中择优。单 孢分离和组织分离是选择育种的主要方法。 1 2 2 诱变育种 诱变育种是利用物理或化学因素诱发食用菌遗传性变异，通过筛选获 得新品种。诱变育种步骤大体包括：出发菌株一制备孢子悬浮液一诱变处 理一涂布培养皿一挑菌移植一斜面传代一试验、示范、推广。物理诱变方 式有) 卜射线诱变、紫外线诱变、r 射线诱变、激光诱变、空间诱变等。 化学诱变剂有烷化剂、碱基类似物等( 刘祖同等，1 9 9 9 ) 。 8 山东农业大学硬士学位论文 1 2 3 杂交育种 杂交是遗传物质在细胞水平上的一种重组过程。杂交育种大体步骤包 括：选择亲本一单孢分离一单孢菌丝培养与选择一孢子单核菌丝配对一杂 交菌株初筛一杂交菌株复筛一试验、示范、推广。 杂交亲本应选择性状优势互补的亲本。在杂交育种中，亲代必须有标 记。对于异宗结合品种，由于自交不孕，因此亲本的性别本身可作为标记。 而对于同宗结合的品种，由于自交可孕，因此需对亲本进行标记，如营养 缺陷型标记、抗药性标记等。杂交育种目的性和方向性都比较明确，这比 诱变育种前进了一大步。 1 1 2 4 原生质体融合 原生质体融合步骤包括：原生质体制备一遗传标记一原生质体融合一 再生培养基上再生一杂交子鉴定。 1 2 5 分子生物学技术 近年来，由于分子生物学的迅猛发展和生物技术的广泛应用，随机扩 增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e d 删驴r p 啦cd n a ，r a p d ) 标记、线粒 体d n a ( m i t o e h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) 、转基因等技术用于育种工作， 为食用菌新品种的选育，尤其是那些常规育种手段受到限制的食用菌种类 的育种带来了曙光，并取得了一些成果。 z h a n g ? 等( 1 9 9 5 ) 利用r a p d 通过7 个引物就可将1 5 个香菇品种中 的1 3 个区分开，说明r a p d 技术在香菇遗传育种和品种改良中有重要作 用。贾建航等( 1 9 9 7 ) 采用氯化苄方法提取香菇总d n a ，用g e n ep u l s e r i i 电击系统将香菇d n a 导入平菇单核原生质体，获得了转化子1 2 1 和1 3 2 4 8 。 1 3 原生质体技术 原生质体( p r o t o p l a s t ) 这一术语来自于细胞植物学，而把它应用到微 生物上，始于1 9 5 2 年s a l t o n 为了分离细胞壁。用溶菌酶酶解微球菌细胞 壁( s m t o nm r ，1 9 5 2 ) 。将细胞壁分离掉以后余下的那部分结构称为原生 质体。原生质体具备该细胞的内容结构，但由于缺乏坚韧的细胞壁，失去 了细胞的刚性而成球形，且对环境条件尤其是渗透压特别敏感。 1 3 1 食用菌细胞壁结构及脱壁酶 食用菌的细胞壁中，均聚集杂多糖( h o m o - h e t r e o - p o l y s a e e h a z i d e s ) 9 高产多糖大球盖菇菌株琢生质体诱变选育及其抗氧化能力研究 占8 0 盼9 0 ( 包括s 一葡聚糖、r - 葡聚糖、几丁质等) ，其余为蛋白质， 朊多聚糖混合物及少量类脂。非水溶性多聚糖微纤丝及几丁质构成细胞壁 的骨架，而配糖朊则填充于其空隙问，具有胶合作用。菌丝细胞壁按其化 学成分可为四层：最内层为浸埋于蛋白质基质中的几丁质微纤丝。然后是 一层蛋白质，然后是浸透了葡聚褚的蛋白质网格，最外层为一层混合葡聚 糖( 杨新美，1 9 8 7 ) 。 最早的脱壁方法是用机械方法剥离细胞壁来制备植物细胞的原生质 体。1 9 6 0 年前后开始有大量关于用酶法制备植物和微生物原生质体的报 道。此后虽然也有人尝试用过物理方法( 如研磨和超声波等) 制各原生质 体，但远不如用酶法普遍。1 9 7 2 年荷兰的d ev r i c s 和w e s s e l s 首次用裂解 酶分离了裂褶菌的原生质体，随后又分离了双孢蘑菇和草菇的原生质体。 1 9 8 0 年以后，由于商品脱壁酶的出现，开始有大量的关于从真菌中分离 原生质体的报道( 刘祖同等，1 9 9 9 ) 。 酶法制备原生质体最关键的是根据不同物种的细胞壁的结构及其化 学组成选用具有不同酶活性的脱壁酶。由于食用菌细胞壁的结构复杂，由 配糖键所连接的葡萄糖分支数量往往又因食用菌种类而异，所以对于不同 的菌株需选用不同的脱壁酶及相应的酶解条件。常见的脱壁酶有纤维素酶 ( c e l l u l o s e ) 、新生酶( n o v o z y m l2 3 4 ) 、溶壁酶( l y w a l l z y m e ) 、蜗牛酶 ( h e l i e a s e ) 、溶菌酶( l y s o z y m e ) 等。由于各种酶的活性不一样，所以需 要针对不同菌株从酶的种类、浓度、酶解时间、温度等方面进行最优化实 验。尽管几丁质和1 3 一葡聚糖是细胞壁的主要成分，但一些次要组分的降 解在脱壁过程中仍然很关键。因而有时侯粗制的脱壁酶或几种脱壁酶组合 在一起使用能得到更好的酶解效果( 刘祖同等，1 9 9 9 ) 。 1 3 2 食用菌原生质体分离与再生 原生质体制备是原生质体技术的前提和基础，目前食用菌原生质体技 术已作为研究食用菌生理、生化、遗传等基础理论和进行菌种改良的一种 重要方法和有效手段( 杨新美，1 9 9 8 ) 。 影响食用菌原生质体形成与再生的因素主要包括酶种类、酶浓度、作 用时间、温度、稳渗剂、再生培养基组成等。在这些影响因素中，目前的 报道已大体趋于一致：一是用幼龄菌丝制备原生质体；二是1 5 3 的溶 i o 山东农业大学硕士学位论文 壁酶( l y w a l l z y m e ) 破壁效果较好，酶浓度过高易引起原生质体变形或破 裂，过低易导致产率降低；三是稳渗剂种类一般采用0 4 一o 6m o l l 的 k c i 或m g s 0 4 溶液。在再生培养基中多采用0 6m o l l 甘露醇作为稳渗剂； 四是酶解适宜温度一般高于菌丝最适生长温度；五是酶解时间因种类而 异。一般与温度呈负相关；六是p h 值多以自然p h 为宜，p h 值过高对原 生质体形成明显不利( 戴秉丽，1 9 9 5 ) 。 目前已对多种食用菌进行了原生质体形成与再生研究，如灵芝( 李刚 等，1 9 9 9 ) 、松茸( 王淑珍等，2 0 0 2 ) 、姬松茸( 张卉等，2 0 0 3 ) 、羊肚菌 ( 崔宗强等，2 0 0 3 ) 、银耳( 谢宝贵等，2 0 0 3 ) 、冬虫夏草( 张华等，2 0 0 4 ) 、 杏鲍菇( 刘敏等，2 0 0 5 ) 、金针菇( 陈力力等，2 0 0 5 ) 、白灵菇( 李轶超等， 2 0 0 6 ) 等。 1 3 3 食用菌原生质体诱变育种技术 诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞 群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方 法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。 利用诱变育种，可获得供工业和实验室应用的各种菌株，如高产突变株、 各种抗性突变株和营养缺陷突变株。诱变育种具有简便易行、条件和设备 要求较低等优点，故至今仍广泛应用( 周德庆，2 0 0 2 ) 。 迄今，各国学者已成功地制备了几十种食用菌原生质体，并利用这些 原生质体在杂交、诱变育种、外源d n a 导入、基因文库的建立、无性变 异株系的建立及单核化原生质体种群资源的利用等多种领域进行了深入 细致的探索。虽然原生质体的应用是多方面的，但大多数研究者的兴趣主 要集中在菌种选育上( 戴秉丽，1 9 9 5 ；王澄辙等，2 0 0 0 ) 。在一般情况下 进行原生质体融合育种时，总要对双亲株加上必要的遗传标记，这项工作 不但费时费力，而且常常影响菌体的活力和某些性状。另外，有些丝状真 菌产生孢子能力很低，甚至不产生孢子，常规诱变育种的实施受到限制。 原生质体诱变技术是一种行之有效的育种方法( m w k b e r j e em 1 8 8 6 ； s a n t i a g oc m ，1 9 9 1 ；y u m r im ，1 9 8 5 ) 。作为诱变材料应注意两个问题：一是 诱变材料应是单个、分散的细胞，最好呈悬浮状态，以利于均匀接触诱变 剂：二是诱变材料的细胞核越少越好，最好是单核，以避免后代出现不纯 高产多糖大球盖菇菌株原生质体诱变选育及其抗氧化能力研究 菌落。原生质体作为单个脱壁的细胞，在渗透压稳定剂中处于悬浮状态， 并且原生质体在释放过程中，包含较少的核，因此，原生质体符合诱变的 两个条件。用原生质体直接诱变育种，简单可行，脱壁后的原生质体对诱 变因子的敏感性增强，增加了变异机会，提高了变异率，又可以提高正变 株的变异幅度，对于不能形成孢子的丝状真菌来说，原生质体可以作为单 个细胞单位而便于控制，可以避免子代出现过多分离的现象。 迄今，各国学者应用原生质体诱变育种技术成功选育出营养缺陷型、 高产量、高产多糖、无孢、高酶活等菌株。如以往在平菇收获期，菇房人 员常因吸入大量平菇孢子引起呼吸道及全身性过敏症状。西德在1 9 8 5 年 已有无孢平菇上市。其菌株已在许多国家登记专利。国内培育无孢或少孢 平菇已有许多成功报道( 朱宝成，1 9 9 4 ；刘振岳等，1 9 9 4 ) 。梁枝荣等( 2 0 0 1 ) 进行了香菇菌丝原生质体的紫外线诱变育种研究。徐志祥等( 2 0 0 4 ) 利用 原生质体诱变技术选育出两株比原始菌株更优秀的稳定高产、高多糖含量 的灰树花新菌株。 1 4 食用菌多糖抗氧化作用 1 4 1 食用菌多糖研究概况 食用菌多藉主要是从担子菌与子囊菌子实体、菌丝体和发酵液中分离 出的代谢产物。到目前为此，国内外已从近3 0 0 种真菌( 分属5 l 科7 0 多 个属) 中筛选到2 0 0 余种有生物活性的多糖物质，其中我国发现有重要价 值的真菌多糖3 0 多种( 肖建辉等，2 0 0 2 ；陈倩等，2 0 0 3 ；曾凯宏等，2 0 0 1 ； 黄益丽，2 0 0 1 ；孟庆虹等，2 0 0 3 ) 。 通过近二十年科学工作者对各类真菌多糖的组成和结构的研究，发现 食用菌多糖主要包括以下几种类型：葡聚糖真菌多糖中的主要构成部 分，其结构是主链由b 1 ，3 糖苷键，支链为p l ，6 糖苷键连接，香菇多 糖、茯苓多糖、云芝多糖等都属于这种连接；甘露聚糖主要由静糖苷键 连接的主链，如虫草多糖是小1 ，2 糖昔键连接，银耳多糖是舡l ，3 糖苷 键连接，灵芝多糖是静l ，4 糖苷键连接；杂多糖；糖蛋白和多糖肽， 国内对这一类物质的研究很少，日本、南韩的研究较为深入( 白日霞 2 0 0 1 ：姚金风等，2 0 0 4 ) 。食用菌多糖的结构可分为；一级结构：包括 糖基的组成、糖基的排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头物构型及糖链 1 2 山东农业大学硕士学位论文 有无分支、分支的位置与长短性等，与蛋白质和核酸相比，糖的一级结构 更加复杂，例如，两种氨基酸只能构成一种二肽，而两种相同单糖能结合 成1 1 种不同的多糖：二级结构；指多糖骨架链间以氢键结合所形成的 各种聚合体，只关系到多糖分子中主链的构象，不涉及支链的空间排布： 三级及四级结构：三级结构是指二级结构由于糖单体的羟基、羧基、氨 基及硫酸基之间的非共价相互作用而导致的有规则而粗大的构象；四级结 构则指多聚链间非共价键结合形成的聚集体( 黄益丽，2 0 0 1 ；白日霞， 2 0 0 1 ) 。 食用菌多糖的提取及分离纯化，通常是用水或碱提取，经乙醇沉淀后 得到租多糖。粗多糖需进行脱蛋白、脱色素以及去除低聚糖、氨基酸等小 分子物质。脱蛋白可采用s e v a g 法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法以及蛋 白酶法( k o m k h a i p r o m m a e t a l ，1 9 9 7 ；秦俊哲等，2 0 0 4 ) 。脱色一般采用活 性碳法或过氧化氢脱色法，然后再经过d e a e - - c e l l u l o s e5 2 、s e p h a d e x 或s e p h a r o s e 柱色谱，可得较纯的多糖。多糖的纯度分析可采用高压液相 色谱法、凝胶柱层析法、高压电泳法等( 盛家荣等，1 9 9 9 ) 。 多糖含量测定的方法很多，有3 ，5 - 二硝基水杨酸( d n s ) 法、s o m o g y i - - n e l s o n 法、苯酚一硫酸法、葸酮一硫酸法、滴定法等( 丁刚强等，2 0 0 0 ) 。 食药用真菌多糖具有提高免疫功能、抗肿瘤、降血压和血脂、健胃保 肝、抗氧化、延缓衰老、抗感染、抗辐射、促进核酸和蛋白质的生物合成， 修复损伤的组织细胞等多种功效( 曾凯宏等，2 0 0 1 ；凌关庭，2 0 0 2 ；朱建 燕等，2 0 0 2 ) 。因其生物活性高和安全无毒副作用而备受青睐，人们近年 来开始重视真菌多糖的开发，研制出一系列药品和保健品( 郭嘉铭等， 1 9 9 4 ) 。 1 4 2 抗氧化作用检测指标 红细胞是血液的主要细胞成分，在机体内主要起着运送0 2 和c 0 2 的 作用。研究表明，红细胞具有识别、黏附、浓缩、杀伤异己、清除免疫复 合物的能力，参与机体的免疫调控( 刘景田等，1 9 9 5 ) 。在许多疾病发生 机理中，红细胞免疫缺陷占有很重要的地位。而在多种病理生理状态下， 红细胞会发生脂质过氧化，引起抗氧化酶系诸如s o d 、g s h p x 等和脂质 过氧化物，如m d a 的变化( 黄益民等，1 9 9 7 ) ，从而影响红细胞生理功 高产多糖大球盖菇菌株原生厦体诱变选育及其抗氧化能力研究 能的发挥。 目前对多糖的抗氧化活性的研究，常采用体外或体内模型，以超氧化 歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、谷胱甘肽氧化酶( g s h - p x ) 等体内抗 氧化酶的活性，丙二醛( m d a ) 、过氧化脂质( l p 0 ) 等体内氧化反应产物 的含量，以及清除自由基的效率等项目为检测指标，从离体或整体水平上 来衡量多糖抗氧化作用的大小。 1 4 2 1 谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p 】【) 1 9 5 7 年m i l l s 等首先发现谷胱甘肽过氧化物酶( g s h - p x ) ，1 9 7 3 年 r o t r u e k 等证明g s h - p x 为含硒酶。g s h p x 是机体内广泛存在的一种重要的 催化过氧化氢分解的酶。它能特异催化还原型g s h - p x 对过氧化氢的还 原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。g s h - p x 的活性中 心是硒半胱氨酸，硒是g s h p x 的必需部分，每克分子酶含4 克原子硒。 g s h - p x 可特异性催化g s h 与过氧化物的氧化还原反应，反应式如 下： 2 g s h + i 2 0 2g s h = - g s s g + 2 h 2 0 2 g s h + r o o h g s h 生x- g s s g + r o h + h 2 0 可利用这些反应中底物量的改变来测定g s h p x 的活力，即以单位时 间内g s h 减少量来表示g s h p x 的活力。在合适p h 值条件下，5 ，5 l - 二硫硝基苯甲酸( 5 ，