（药物化学专业论文）采用甲基丙烯酸酯类整体柱的芯片血药分析方法研究.pdf

重庆大学硕士学位论文中文摘要 摘要 由于微流控芯片系统具有分析自动化、集成化和缩微化的特点，因此在减少 试剂用量、缩短分析时间等方面表现出显著优势。发展微流控芯片系统中的样品 预处理技术，是实现微流控系统集成化必须突破的瓶颈之一。固相萃取( s p e ) 技术 具有诸多特点，适宜于芯片分析系统中复杂样品的预处理。整体柱又是近年来在 色谱领域发展起来的一种新型分离富集材料，具有制作简单、背压低、分辨率高、 柱容量大等优点，在固相萃取、电色谱等领域也得到广泛的应用。因此，在微流 控芯片上研究以整体柱作为固相萃取柱的样品预处理技术具有非常重要的意义。 本文总结了微流控芯片上有机聚合物整体柱的类型、表征和应用现状。采用 原位聚合方法，在预处理过的玻璃管内分别以甲基丙烯酸丁酯( b m a ) 和甲基丙烯 酸十二烷基酯( l m a ) 为单体，二甲基乙二醇酯( e d m a ) 为交联剂，偶氮二异丁腈 ( a i b n ) 为引发剂，甲醇和正己烷为混合致孔剂，制备了b m a 和l m a 整体微柱。 并采用正交实验优化l m a 整体微柱的制备条件。使用显微镜、扫描隧道显微镜 ( s e m ) 和红外光谱对b m a 和l m a 整体微柱的形貌和结构进行了表征，所制备的 整体微柱具有多孔网状结构，满足课题设计的要求。 将采用原位聚合法制备的b m a 整体微柱与微流控芯片结合起来，形成带有 b m a 整体微柱的复合式微流控芯片。针对k 3 f e ( c n ) 6 一n a o h 一异烟肼化学发光体 系，讨论了各端口进样方式、流速、检测窗口的选择。分析了复合式微流控芯片 b m a 整体微柱的柱预处理、加样、除去干扰杂质、分析物的洗脱等过程。优化了 微流控芯片上k 3 f e ( c n ) 6 一n a o h 一异烟肼体系的发光条件，测得了o l m m ，柱长 2 c m 的b m a 整体微柱对异烟肼交换容量h = 0 2 5 9 9 m g 。在带有b m a 整体微柱 的复合式微流控芯片上测定了b m a 整体微柱对异烟肼的吸附作用，平均富集倍数 为1 5 9 ，平均吸附效率为7 9 5 ，标准偏差r s d = 8 4 4 ( n _ 5 ) 。在微流控芯片上 使用b m a 整体微柱用于异烟肼的血药浓度分析，异烟肼加入量为0 3 6 0 9 9 ，平均 测定值为0 3 3 4 t t g ，平均回收率为9 2 9 ，标准偏差r s d = 4 7 2 ( n - 3 ) 。 另外，在微流控芯片上使用前期制备的2 甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵 ( m e t a ) 阴离子交换型整体微柱对尿液中痕量的头孢哌酮钠进行了分离富集和快速 测定，头孢哌酮钠加入量为o 6 6 0 9 9 ，平均测定值为o 6 2 3 t t g ，平均回收率为9 4 3 ，标准偏差r s d = 2 4 8 ( n = 5 ) 。 通过使用带有原位聚合制备的b m a 整体微柱的复合式微流控芯片和带有 m e t a 整体微柱的复合式微流控芯片分别对血液中痕量的异烟肼和尿样中痕量头 孢哌酮钠进行分离富集和快速测定，建立了带有s p e 整体微柱的复合式微流控芯 重庆大学硕士学位论文 中文摘要 片测定血药浓度和尿药浓度的分析方法。 关键词：微流控芯片，整体柱，异烟肼，头孢哌酮钠，血样，尿样 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 a b s t r a c t f o rt h ec h a r a c t e r i s t i c so fa n a l y s i si n t e g r a t i o n , a u t o m a t i o na n dm i n i a t u r i z a t i o n , r e m a r k a b l ep r e d o m i n a n c ei ss h o w nb ym i c r o - f l u i d i cc h i ps y s t e mi nd e c r e a s i n gr e a g e n t c o n s u m p t i o na n ds h o r t e n i n ga n a l y s i st i m e s a m p l ep r c t r c a t m a n t i so n eo ft h e b o t t l e n e c k si nt h ei n t e g r a t i o np r o c e s so fm i c r o - f l u i d i cc h i ps y s t e m ，s oe x t e n s i v e i n v e s t i g a t i o nh a sb e e nd o n ei n t h i sf i e l d f o rm a n yc h a r a c t e r i s t i c so fs o l i dp h a s e e x 打a c t i o n ( s p e lt e c h n o l o g y , i ti sv e r ys u i t a b l ef o rt h ep r e t r e a t m e n to fc e m p l e xs a m p l e s i nt h ei n t e g r a t i o np r o c e s so fm i c r o f l u i d i cc h i ps y s t e m m o n o l i t h i cc o l u n mi san e w k i n do fm a t e r i a lf o rc h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o na n de n r i c h m e n ti nr e c e n ty e a r s ，w h i c h h a st h ea d v a n t a g e so fs i m p l ep r e p a r a t i o n , l o wb a c k p r e s s u r e ，h i g hr e s o l u t i o na n dl a r g e c a p a c i t yf o rs o l u t e s i th a sb e e nw i d e l ya p p l i e di ns p ea n de l e c t r o - c h r o m a t o g r a p h y s o i t sv e r ys i g n i f l c a t i v et os t u d ys a m p l ep r e t r e a t m e n tt e c h n i q u eo nm i c r o - f l u i d i cc h i p u s i n gm o n o l i t h i cc o l u m n sa ss p e c o l u m s i nt h i sp a p e r , t h et y p e s ，c h a r a c t e r i z a t i o nt e c h n i q u e sa n da p p l i c a t i o na c t u a l i t i e so f m o n o l i t h i cc o l u m n sw e f er e v i e w e d b u t y lm e t h a c r y l a t e ( b m a ) a n dl a u r y l m e t h a c r y l a t e ( l m a ) m o n o l i t h i cc o l u m n sw e r ep r e p a r e di np r e t r e a t e dg l a s st u b eb y i n - s i t uc o p o l y m e r i z a t i o no fb m ao rl m a e d m aa n da i b nw e r eu s e da sc r o s s - l i n k e r a n di n i t i a t o r , r e s p e c t i v e l yi nt h er e a c t i o np r o c e s s m o r e o v e r , m e t h a n o la n dh e x a n ew e r e u s e da sp o r o g e n i cr e a g e n t s t h ep r e p a r a t i o nc o n d i t i o n so fl m am o n o l i t h i cc o l u m n w e r eo p t i m i z e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h es t r u c t u r ea n di m a g e so fb m aa n dl m a m o n o l i t h i cc o l u m n sw e r ec h a r a c t e r i z e db ym i c r o s c o p y , s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o g r a p h ( $ e i v oa n di n f r a r e ds p e c t r u m ( 瓜) r e s u l t ss h o w e dt h a tp o r o u sa n dn e t t yb m a a n d l m am o n o l i t h i cc o l u m n sw e r es u c c e s s f u l l yp r e p a r e d b m am o n o l i t h i cm i c r o c o l u m np r e p a r e db yi n - s i t up o l y m e r i z a t i o nw a sc o m b i n e d w i t hm i c r o - f l u i d i cc h i pt oo b t a i nh y b r i dm i c r o f l u i d i cc h i pw i t hb m am o n o l i t h i c m i c r o - c o l u m n f o rt h ec ls y s t e mo f k 3 f e ( c n ) 6 - - n a o h - - i s o n i a z i e d ，s a m p l i n gm o d e s ， f l o wv e l o c i t ya n dd e t e c t i o np o i n tw e r ed i s c u s s e d t h ep r e t r e a t m a n t ，s a m p l i n g , i m p u r i t y e l i m i n a t i o na n ds a m p l ee l u t i o no fh y b r i dm i c r o f l u i d i cc h i pw i t l lb m am o n o l i t h i c m i c r o c o l u m nw e r ea n a l y z e d k 3 f e ( c n ) 6 - - n a o h - - i s o n i a z i e dc lc o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e d d e t e c t e dc o l u m nc a p a c i t y o fb m am o n o l i t h i cm i c r o c o l u m n ( 1 m m l d x 2 0 c m lw a so 2 5 t t g m g 一a b s o r p t i o no fb m am o n o l i t h i cm i c r o c o l u m no nt h e h y b r i dm i c r o f l u i d i cc h i pw a sd e t e c t e db yc h e m i l u m i n e s c e n c eo fi s o n i a z i e d t h e i i i 重庆大学硕士学位论文英文摘要 a v e r a g ee n r i c h m e n te f f i c i e n tw a s15 ，9a n dt h ea v e r a g ea b s o r p t i o ne f f i c i e n c yw a s7 9 5 ( c o r r e s p o n d i n gr s dw a s8 4 4 ，n - 5 ) s e r u ms a m p l ew i t l li s o n i a z i e dw a sa n a l y z e do n t h eh y b r i dm i c r o f l u i d i cc h i pw i t i lb m am o n o l i t h i cm i c r o - c o l u m n r e s u l t ss h o w e dt h a t t h ea v e r a g ed e t e c t e dv a l u eo fi s o n i a z i e dw a s0 3 4 4 p ga n dt h ea v e r a g er e c o v e r yw a s 9 2 9 ( c o r r e s p o n d i n ga d d i t i o na m o u n tw a s0 3 6 0 p g ，r s dw a s4 7 2 ，n = 3 ) i na d d i t i o n ，u r i n es a m p l ew i t hc e f o p e r a z o n es o d i u mw a sa n a l y z e do nt h eh y b r i d m i c r o - f l u i d i cc h i p 谢m 【2 ( m e t h a c r y l o y l o x y ) e t h y l 】t r i m e t h y l a m m o n i u mc h l o r i d e ( m e t a ) m o n o l i t h i cm i c r o - c o l u m n t h ea v e r a g ed e t e c t e d v a l u eo fc e f o p e r a z o n e s o d i u mw a so 6 2 3 p ga n dt h ea v e r a g er e c o v e r yw a s9 4 3 ( c o r r e s p o n d i n ga d d i t i o n a m o u n tw a so 6 6 0 p g ，r s dw a s2 4 8 ，n = 5 ) f o rs e r t u ns a m p l ew i t hi s o n i a z i e da n a l y z e do i lt h eh y b r i dm i c r o f l u i d i cc h i pw i m b m am o n o l i t h i cm i c r o c o l u m np r e p a r e db yi n - s i t uc o p o l y m e r i z a t i o na n du r i n es a m p l e w i t hc e f o p e r a z o n es o d i u mw a sa n a l y z e do nt h eh y b r i dm i c r o f l u i d i cc h i pw i t l lm e t a m o n o l i t h i cm i c r o c o l u m n , t h ea n a l y s i sm e t h o do fd r u gi nb l o o da n df i n es a m p l e sh a d b ee s t a b l i s h e d k e y w o r d s ：m i c r o f l u i d i cc h i p ，m o n o l i t h i cc o l u m n ，i s o n i a z i e d ，c e f o p e r a z o n es o d i u m ， b l o o d ，u r i n e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重麽太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：街讲签字日期：文。p 7 年月矽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解重麽太堂有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权重废太堂可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 保密() ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密( x ) 。 ( 请只在上述一个括号内打“4 ”) 学位论文作者签名：绦平、计 签字日期：0 2 。刁年，月，g 日 导师签名：f 错 签字日期：衣。哆年厂月胗日 重庆大学硕士学位论文1 前言 1 前言 1 1 引言 近年来，随着国内外微型全分析系统( m i c r o t o t a l a n a l y s i ss y s t e m ，p t a s ) 的迅速 发展及其应用前景的不断扩大，p t a s 在i 临床检验、新药的合成与筛选、生物医学 中人类基因与疾病关系的研究，以及商品检验、环境检测、刑事科学、军事科学 及航天科学等领域发挥了巨大的潜力，但是p t a s 在这些领域中都离不开样品的分 离与富集。目前国内外学者在微芯片样品预处理微分离技术方面做了一些研究， 但是除了毛细管电泳芯片外，其它微芯片上的微分离技术也只是一些初步研究， 发展相对比较薄弱。微分离是在微型全分析系统的基础上提出来的，它是以 a s 研 究的一个重要的部分。微分离是指在几厘米大小的芯片上实现样品的分离与富集， 以取代常规分析实验中的分离方法，使整个分析过程微型化、自动化、集成化和 便携化的分离技术。 现有的微分离技术较多，包括色谱、萃取、离子交换与吸附、膜分离等分离 手段，其中固相萃取( s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ，s p e l 主要用于样品的分离、纯化和浓 缩，广泛地应用在医药、食品、环保、商检、农药残留等领域。并且s p e 不同于毛 细管电泳，它不受液流驱动方式的限制，不仅可以分离干扰物质，而且可以浓缩 待测物。同时，这种分离方式适用于所有的液体，包括水溶液和有机溶剂，而且 可采用高灵敏的荧光检测器。对于固相萃取技术，s p e 柱是其核心。由于原位聚 合的整体柱的制备方法简易，重复性好、柱压低、传质速度快并且易于实现色谱 填料表面化学性质多样性，其在多种色谱模式下获得了成功的应用。因此，将色 谱柱制备中的原位聚合整体柱技术引入s p e 微柱中，本课题选择聚合物整体柱作 为微流控芯片上的s p e 柱，构建带有整体微柱的复合式微流控芯片，因此，本章 主要对相关研究进行了综述。 1 2 有机聚合物整体柱 所谓整体柱( m o n o l i t h i cc o l u m n ) ”，又称整体固定相( m o n o l i t h i cs t a t i o n a r y p h a s e ) 、棒柱( r o d ) 、连续床层( c o n t i n u o u sb e d ) ，其早期发展可以追溯到6 0 年代 后期，是一种用有机或无机聚合方法，用功能单体、引发剂、致孔剂、交联剂等 混合物在色谱柱内通过原位聚合形成一个连续床固定相的色谱柱。整体柱在近几 年迅猛地发展起来，比起传统的色谱柱而言，它具有色谱柱制备方法简单；聚合 单体的选择范围广，可以由不同的聚合方法往固定相中引入各种可能的作用基团， 得到不同性质的聚合柱，从而可满足不同样品的分析要求，有十分多变的灵活性； 重庆大学硕士学位论文1 前言 具有更好的多孔性和渗透性，有更高的相比和柱空间利用率、有较快的溶质扩散 传质速度，且操作压力低等优点。但它同时也存在一些不足：如聚合物在有机溶 剂中有溶胀收缩效应，影响其稳定性；表面积和柱容量都低于填充柱：合成制各 整体柱仍然存在诸多问题。 目前整体柱按其制备方法可分为三类：有机聚合物整体柱、硅胶整体柱、以填 充柱为基础的整体柱。其中聚合物整体柱由于在制备时选材较广，因而可有不同的 选择性，其可适用的p h 范围也较宽，且制备方法简单、省时、重复性高。聚合物整体 柱按其制备方法可分为聚甲基丙烯酸酯类整体柱，聚丙烯酰胺类整体柱，聚苯乙 烯类整体柱和分子印迹类整体柱。 1 2 1 聚丙烯酰胺类整体柱 制备该类整体柱的单体主要有丙烯酰胺( a a ) 、甲基丙烯酰胺、n 一异丙基丙烯 酰胺等，交联剂有亚甲基双丙烯酰胺( b i s ) 、哌嗪二丙烯酰胺等。这种整体柱的主 要分离机理为筛分而不是溶质与固定相之间的相互作用。该类整体柱由于紫外透 明，可柱内检测，但其基质较软不宜在液相模式下使用，通常用于c e c 。 f u j i m o t o 等1 2 1 将丙烯酰胺、b i s 、2 丙烯酰胺2 甲基1 丙磺酸( a m p s ) 在毛细 管柱内聚合，在c e c 模式下柱效达1 5 0 0 0 0 塔板数，米。之后他又采用疏水性较强 的n 一异丙基丙烯酰胺替代丙烯酰胺，柱效能有所改善。聚合物凝胶作为固定相 分离疏水化合物表现出一些反相色谱的性质，同最初的聚合物酰胺凝胶相比，体 积排阻不再是唯一的分离机理，溶质与整体固定相的疏水相互作用也有助于分离。 e r i c s o n 等嘲报道了高交联度的丙烯酰胺整体柱，但最初制备方法复杂，分离所 需时间长。之后e r i c s o n 进行了改进，在反应混合物中加入甲基丙烯酸十八烷酯或 甲基丙烯酸丁酯，经超声处理形成乳液，装入表面处理过的柱子中聚合而成棒状 整体柱，大大缩短了分离时间，在c e c 模式下五分钟内可分离五种多环芳烃 4 1 。 近来，w g v 甜等p 用聚酰胺为基质，以2 羟基丙烯氧丙基取代的p 环糊精作为 手性选择剂，制备了整体手性柱。该柱子对环己烯巴比妥酸对映体的分离柱效达到 了5 7 0 0 0 0 塔板数米。 刘彤等嘲以丙烯酰胺、甲基丙烯酸丁酯、n n - 亚甲基双丙烯酰胺为单体混合 物，采用原位聚合的方法，合成了一种连续棒状疏水相互作用色谱柱，该柱子分 离性能良好，细胞色素c 、核糖核酸酶a 、溶解酵素3 种标准蛋白质，在含有1 0 甲基丙烯酸丁酯的聚合物连续棒状疏水色谱柱中，在1 5 分钟内均能达到良好的稳 定，且该柱有较好的稳定性，合成方法也有良好的重现性，不仅可用于蛋白质分 离纯化，而且还可用于蛋白质的保留机理研究。 1 2 2 聚苯乙烯类整体柱 该类整体柱可供使用的单体种类较少，目前所使用的单体仅为苯乙烯、氯甲基 2 重庆大学硕士学位论文1 前言 苯乙烯、二乙烯基苯。采用氯甲基苯乙烯作为反应单体聚合后，氯甲基与十八烷基 二甲基胺反应，进而实现在固定相中引入季胺基团，可在离子交换模式下使用 7 1 。 z o u 等口1 根据r y a n t w 等提出的“微流量模式下，当柱内径由x 变为y 时，分析 灵敏度为原来的x 2 y 2 倍，溶剂消耗量可以大大降低。”的理论，在内径较小的 1 0 0 t u ni d 和5 9 m i d 烧结毛细管柱中通过苯乙烯、二乙烯基苯单步制备了聚苯乙烯 整体柱，在纳升级液相色谱( n a n o - - l c ) 模式下用于蛋白质分离，与经n ，n 二甲基 丁胺修饰引入季铵基和丁基链而改变表面宫能度的整体柱对比发现；未经修饰的 整体柱具有高度交联的双孔结构和较大的表面积，而经修饰的整体柱具有明显的 大孔结构。 张玉奎等9 埔4 备了聚( 苯乙烯二乙烯基苯。甲基丙烯酸) 共聚物整体柱。他们系 统地研究了操作参数如电压、电解液、有机改性剂的影响，并证实其分离机制为反 相机理。 1 2 3 聚甲基丙烯酸酯类整体柱 甲基丙烯酸酯类整体柱具有制备过程简单、重复性好、易于改性、柱压低及 传质速度快等优点，是当前色谱研究领域的热点f l “。常用的功能单体有甲基丙烯 酸酯、a m p s 、甲基丙烯酸缩水甘油酯、n 一烯丙基二甲基胺等。常用的交联剂为二 丙烯酰哌嗪( p d a ) 、b i s 、二乙烯基苯( d v a ) 、二甲基丙烯酸乙二醇酯( e d m a ) 、 三聚异氰尿酸三烯丙酯( t a i c ) 等。常用的致孔剂有1 丙醇、l ，4 _ 丁二醇、甲醇、 环己醇、壬醇等一种或几种混和醇为致孔剂【l l 】。 杨俊佼等采用热引发共聚交联制备了一种新型毛细管整体柱。其固定相包 含一个用来分离的疏水长碳链( c 1 6 ) 、一个产生强电渗流的结构单元a m p s 以及保 持固定相有一定亲水性的醇羟基在施加外电压后，分析物的分离柱效从6 00 0 0 7 00 0 0 塔板m 提高至f j l o o0 0 0 1 2 00 0 0 塔板m 。并用这种聚合物毛细管整体柱对 寡核苷酸进行了纯化分离，实现了对4 种b 2 受体阻滞剂( 阿替洛尔、卡替洛尔、噻利 洛尔和噻吗洛尔) 的分离。 p e t e r s 等1 1 3 1 将甲基丙烯酸丁酯作为功能单体聚合后，首次实现了在电渗流驱动 体积排阻色谱模式下分离相对分子质量为10 0 00 0 0 的聚苯乙烯。他还选择含有手 性选择基的单体制备整体固定相，制成手性连续床，实现了在毛细管电色谱模式下 拆分手性化合物。 黄晓佳等1 1 1 首次采用以甲基丙烯酸辛酯为单体，在0 5 3 r a m p q 径的石英玻璃毛 细管内原位聚合制备了具有优良通透性能的整体拄材料，详细考察了单体交联剂 比例，单体混合物与致孔剂之间的比例对所制得材料的通透性、孔径分布、粒度大 小等性能的影响；应用包括扫描电镜( s e m ) 和压汞法对其进行表征；同时在c - h p l c 操作模式下进行了初步的色谱评价，取得了较理想的效果。 3 重庆大学硕士学位论文1 前言 p a v e l 等嗍以b m a 为单体，e d m a 为交联剂，正丙醇、丁二醇和蒸馏水为致孔剂， 在3 2 0 p m 内径的毛细管内原位聚合了用于c l c 的整体柱，在1 6 分钟内分离5 种有机 物，分离效果与传统c 1 8 柱类似。 1 2 4 分子印迹类整体柱 分子印迹技术是一种使所得到的聚合物中的作用点对目标分析物具有预定识 别选择性的聚合物制备技术1 1 6 1 。它的制备过程是先用功能单体和模板分子以共价 键或非共价键( 氢键，静电作用力，金属螯合作用力，分子间作用力，基团之间作用力 以及疏水作用等) 形成复合物，再加入交联剂，引发剂和有机溶剂，在一定的条件下 ( 加热，紫外光或其它射线照射) 聚合，使之生成聚合物，最后通过洗脱的方法，将模板 分子从聚合物中除去，这样就在聚合物上留下了和模板分子在空间结构，结合点位 完全匹配的三维空穴，这个三维空穴可以重新专一的，高选择的再和模板分子结合， 从而使该聚合物对模板分子具有专一的识别功能m 】。 闫伟英等8 1 以4 一氨基吡啶( 4 一a p ) 为印迹分子，热引发原位合成了分子印迹聚 合物毛细管整体柱，聚合物通过共价键和石英毛细管内壁相连。在最佳电色谱条 件下，4 - a p 和2 a p 之闯的分离度在印迹聚合物柱上高达2 5 。而在不含印迹的对照 柱上仅为0 3 5 。 罗国安等【1 9 1 以咖啡因为模板分子，经紫外光引发原位聚合制备了分子印迹毛 细管整体柱。建立了一种新型高选择性分离测定咖啡因的微柱液相色谱法。并将 这一方法用于测定绿茶饮料、百事可乐和复方药片中咖啡因含量，获得满意结果。 l i n 等【2 0 1 通过热引发合成了l 苯丙氨酸印迹的高分子连续床固定相，在7 5 p m i d 的毛细管柱内，用乙腈醋酸一水流动相分离对映体苯丙氨酸和相似的氨基酸如酪 氨酸、苯基甘氨酸等。该法首先通过格氏反应给毛细管管壁上引入乙烯基然后将 印迹分子、m a a 、乙烯基吡啶、e d m a 、a m n 及乙酸铵和氯仿的混合物置于6 0 水浴2 4 h 即制成该柱。 本法选择性高，但柱重现性差，柱效也不高。从目前的研究现状来看，印迹整体柱 的柱效往往不高。因此，寻找新型交联剂、提高印迹聚合物孔径的均匀性和获得较 高的柱效是今后的研究方向。 1 3 整体柱的表征 整体柱的结构表征主要有扫描电子显微镜( s e m ) 、压汞法和氮吸附法。 通过扫描电镜可以观察到整体固定相的孔径分布模式，及孔结构是否均匀。用 压汞法可以测定固定相的孔径分布、孔隙率及比表面积等参数，考察致孔剂组成、 聚合温度及交联剂含量等参数对固定相孔结构的影响。氮吸附法是利用氮气在其 沸点温度下的吸附量与分压的关系。来计算整体柱的孔隙率。 4 重庆大学硕士学位论文1 前言 虽然压汞法可以测定大孔和中孔的孔径分布，然而柱管不能承受压汞法的操作 压力。采用氮吸附法时，尽管整体柱具有高渗透性，但柱入口和出口处压力会有很 大差别，因此等温线数据不是在等压条件下获得的，获得的数据难以解释，所得信 息的适用条件与其应用条件不匹配，置信度及置信区间下降。 另外，杨长龙等采用体积排阻色谱( s e c ) 技术，在径向流动模式的整体柱上， 通过测定聚苯乙烯标准品的保留数据，方便地得到了色谱柱的总孔隙率、外部孔隙 率和内部孔隙率，同样获得了整体固定相的孔径分布。这种方法具有快速、无破坏 性、原位表征等特点，是一种方便、有效、实用的技术。 1 4 聚合物整体柱的分离模式及应用 作为分离介质，整体柱是近年来才发展起来的新型技术，在分析化学的发展 中起着越来越重要的作用。目前，科学工作者已在离子交换色谱、反相色谱、疏 水作用色谱、亲和色谱、分子印迹、毛细管电色谱等多种色谱分离模式中对整体 柱的应用进行了尝试，取得了很大的进展。 1 4 1 毛细管电色谱 毛细管电色谱是近年来发展起来的一种高校、快速的新型微柱分离方法。它 以电渗流驱动流动相，溶质根据它们在固定相和流动相之间分配系数及电泳淌度 的不同得以分离。 z o u 等叫通过甲基丙烯酸十二烷基酯和二甲基丙烯酸乙二醇原位聚合而形成 c 1 2 疏水固定相，制备了在c e c 中用于分离离子混合物的整体柱，表现出良好的渗 透性和较低的流动阻力，他们还发现即使流动相的p h = 8 0 ，电渗流仍然很弱。并 在相同的缓冲液中分离了在c z e 中不能分离的缩氨酸异构体。 1 4 2 体积排阻色谱 a 1 b o k a r i 等1 利用分子尺寸较小并且已知平均分子质量的聚苯乙烯样品在体 积排阻色谱体系中对整体柱和传统填充柱的外部、内部、总体的多孔性以及吸附 介质中的孔尺寸分配进行了测定。数据表明整体柱外部及总体的多孔性要比传统 填充柱高很多，而且整体柱为色谱柱的亲水平衡和质量传递动力学性质带来了深 刻的变化。 1 4 3 亲和色谱 b r a n o v i e 等 2 3 1 将亲和色谱整体柱和离子交换整体柱联用起来，在5 分钟之内分 离了铁传递蛋白，白蛋白和免疫球蛋白。 5 重庆大学硕士学位论文1 前言 1 4 4 液相色谱 z e n g 等 2 4 1 在高效液相色谱中利用整体柱分离与高流速在线萃取联用对多种被 分析物进行快速萃取和分离，在1 0 | 时内可以将血浆中4 0 0 多个样品进行萃取和分 离。 张微等叫采用配备了整体柱的高效液相色谱对草甘膦原药中痕量甲醛含量进 行了测定，在2 0 - 2 0 0 岭m l - 1 浓度范围呈良好线性，添加回收率在8 8 1 0 5 之间， 相对标准偏差小于5 。灵敏度较常规反相色谱柱提高了约1 0 倍。 虽然还存在诸如机械性能差；在溶剂作用下，柱体会发生收缩或溶胀现象，致使 柱性能发生变化，导致柱寿命缩短等缺点。但是整体柱的优点是显而易见的。随着 制备技术的不断改进和完善，整体柱在生物、药物、环境等领域必将拥有更为广 阔的应用前景。 1 5 微流控芯片上原位聚合整体柱的发展 由于具有分析速度快，高通量，所需样品少及费用低等优点，微流控芯片有 望成为一种强有力的分析工具。但是微流控芯片的优势只有在将几种装置的操作 集成在一个芯片上后才能充分体现出来，因此出现了微全分系统( m i c r ot o t a l a n a l y t i c a ls y s t e m ，“t a s ) 。微全分系统已经成功地用于酶分析，聚合酶链扩增反应 ( p c r ) ，免疫分析，等电聚焦毛细管区带电泳，以及d n a 的测序、杂交和图谱分 析等多个方面，但这项技术也存在一个主要问题即溶液在通道内的混合不充分， 这对迸样、梯度洗脱、在线衍生化及化学反应等过程十分不利。当溶液流过多孔 介质时，液流分散成为多股细小的微流，这样大大地缩短了扩散路程从而使液体 混合得更均匀。但是芯片上通道的体积很小，制备一个如此小得混合器需要采用 特殊得微加工技术，操作难度高。e o h 等以2 羟乙基甲基丙烯酸酯为单体，e d m a 为交联剂采用光引发聚合技术在芯片上成功的制备了聚合物混样器。 微流控芯片技术地另一个不足在于几乎所有报道地微流控芯片都是“开通 道”( o p e n - c h a n n e l ) 结构，因此通道地表面积很小。这对于色谱分离和圃相萃取等依 赖于与固定相作用的过程来说是一个严重地不足。在芯片的通道里填充多孔物质 存在技术的困难。c o n g 等0 1 采用光引发聚合反应，在微流控芯片上原位聚合了甲 基丙烯酸酯反相整体柱和2 - 甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵( m e t a ) 阴离子交换整 体柱。并对香豆精5 1 9 ，香豆精5 1 9 一肽化合物、绿色荧光蛋白质等分子量不同的 化合物进行富集，获得1 0 3 以上的富集倍数；通过改变不同的聚合物条件，可以获 得满足不同需要的吸附剂类型。t a n 等【2 8 1 在带有8 个平行通道( 1 0 m m 长，3 6 0 1 t i ni d 1 6 重庆大学硕士学位论文1 前言 的有机聚合物芯片上，在微通道内利用紫外引发单体溶液发生原位聚合反应制备 整体柱，从而获得了具有分离富集能力的八阵列式微整体柱芯片。进一步实现了 人尿样品及p 4 5 0 药物的固相萃取分析。y a n g 等在微流控芯片上将s p e 与m s 结合起来用于样品的预处理。在芯片上用紫外引发原位聚合了甲基丙烯酸丁酯类 整体柱用于样品的预处理，用于丙咪嗪药物的富集，富集倍数高达2 0 8 倍。 1 6 课题研究意义和目标 近年来，随着临床药理学、药动学、生物药剂学及临床治疗药物浓度监测等 研究领域的迅猛发展，以人或动物体液及各种组织器官中药物及其代谢物浓度测 定为基础的生物药物分析，即体内药物分析( b i o p h a r m a c e u t i c a la n a l y s i s ，b p a ) 已成为 国内外药学研究领域最引人注目的前沿技术之一。但在对体内药物进行分析时，体 液成份十分复杂，干扰物质多，而待测药物浓度一般都很低。如何方便、快捷地对样 品进行预处理，将少量的药物从大量复杂的生物基质中分离出来，以便准确定性、定 量，是体内药物分析面临的首要问题。传统的萃取方式回收率低、繁琐费时、溶剂 毒性大、易乳化等不足。固相萃取技术是较佳的样品预处理方法。考虑到例如血 液等体液采样量应很少，以原位聚合的聚合物整体柱作为固相萃取柱，与微流控 芯片结合，形成带有整体微柱的复合式微流控芯片，用于体内药物的预处理及快 速测定。为芯片上的微分离技术打下初步的基础，为l l t a s 对整个分析过程的微 型化、自动化、集成化与便携化的要求打下基础。将这种复合式的微流控芯片应 用干扰成分多且药物浓度低的体内药物进行分析，建立微流控芯片在体内药物分 析的方法。 本论文采用原位聚合法在玻璃管内制备了通透性良好的甲基丙烯酸丁酯 ( b m a ) 和甲基丙烯酸十二烷基酯( l m a ) 类整体微柱，采用正交实验优化了制备 l m a 整体柱的聚合反应条件，包括反应时间、反应温度、聚合反应功能单体含量、 交联剂含量等因素、聚合反应各组分比例等。并对两种整体微柱进行了形貌表征 和性能分析。将原位聚合的b m a 整体微柱与微流控芯片结合起来，构成带有整体 微柱的复合式微流控芯片，通过k 3 f c ( c n ) 6 一n a o h 一异烟肼化学发光体系，使用 带有整体柱的复合式微流控芯片测定血液中异烟肼浓度。采用实验室前期已经制 备的2 甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵( m e t a ) 阴离子交换型整体微柱，与微流控 芯片相接合，形成带有整体微柱的复合式微流控芯片，通过k m n 0 4 - - h c i - - s d b s 一头孢哌酮钠化学发光体系，测定了尿液中头孢哌酮钠的浓度。为芯片上的微分 离技术打下初步的基础，为n t a s 对整个分析过程的微型化、自动化、集成化与便 携化的要求打下基础。将这种复合式的微流控芯片应用干扰成分多且药物浓度低 7 重庆大学硕士学位论文1 前言 的体内药物进行分析，建立微流控芯片在体内药物分析的方法。 本论文有以下几个方面的特点： 一、将采用原位聚合的方法制备的反相有机聚合物整体柱作为固相萃取的介 质材料，用于微流控芯片分析系统中复杂样品的分离富集，建立了微流控芯片上 复杂微量试样预处理技术的新途径； 二、将聚合物整体柱与微流控芯片接合起来，构成带有整体微柱的复合式微 流控芯片，并将其应用于干扰成分多且药物浓度低的体内药物分析，建立了对血 液、尿液等体液中的药物进行预处理和分析检测的方法，达到快速、准确测定的 目的。 重庆大学硕士学位论文2 理论部分 2 理论部分 2 1 原位聚合有机聚合物整体柱 原位聚合有机聚合物整体柱是将单体、引发剂、致孔剂、交联剂的混合液( 或 悬浊液) 灌入毛细管或玻璃管中，在一定温度条件下通过原位聚合形成的一个棒状 整体。具有分辨率高，可在高流速下操作，制备成本低，使用寿命长，稳定性好， 且分辨率、吸附容量、流速( 给定压力下的运行时间) 都可通过改变制备过程中单 体溶液的组成来调节等优点。因此有人将其喻为继多聚糖、交联与涂渍、单分散 之后的第四代色谱填料。 2 1 1 有机聚合物整体柱的微分离富集方式 整体柱用于复杂样品体系的高效微分离富集方式与整体柱材料上键合的功能 团与待测分离化合物之间作用力有关，可分为正相吸附、反相吸附、离子交换、 亲合色谱、疏水作用色谱、手性分离等主要的六种。 正相吸附主要通过目标物的极性官能团与固定相表面的极性官能团之间的氢 键、万一石相互作用等来保留溶于非极性介质的极性化合物。正相吸附主要取决于 溶质和固定相及流动相之间的分子间作用力，其中氢键力和静电力起着重要的作 用。此类材料主要应用于分离富集甾醇类、类脂化合物、磷脂类化合物、脂肪酸 以及其它有机物。 反相吸附主要通过目标物的碳氢键同硅胶表面的官能团产生非极性的范德华 力或色散力来保留目标物。在反相吸附中，溶质的分离是以它们的疏水结构差异 为依据的，溶质的极性越弱，疏水性越强，保留值( 1 c7 ) 越大。烷基的疏水特性随 碳链的增长而增加，溶质的保留值也随烷基碳链长度的增加而增大。此类材料的 应用非常广泛，从一般小分子有机物到药物、农药、氨基酸、低聚核苷酸、肽和 分子量不大的蛋白质( 耋5 0 k d ) 的分析均可应用。 离子交换则主要通过目标物的带电荷基团与固定相上的带电荷基团相互静电 吸引实现吸附分离的。被分离的离子的电荷密度和等电点( p d 值与整体柱材料上的 离子交换剂的离子容量大小决定保留能力的强弱。此类材料可用于生物医学领域， 如氨基酸分析，肽和蛋白质的分离，也可作为有机和无机混合物的分离和从有机 物和溶液中去除离子型杂质等。 亲合色谱是整体柱材料上键合的配位体与被分离的生物活性分子之间特异、 可逆性的相互作用，这种专属性涉及分子间的范德华力、疏水作用力、静电吸引 力、络合作用力及空间阻效应等多种因素。此材料可用于分离、纯化具有不同分 子量的生物活性物质，如氨基酸、肽、蛋白质、核碱、核苷、核糖核酸和脱氧核 9 重庆大学硕士学位论文2 理论部分 糖核酸等。 疏水作用色谱是利用各组分具有不同的疏水作用的性质进行分离的方法。此 类材料的表面为疏水性基团，它的疏水性要比反相整体柱的低几十到几百倍。主 要应用对象是蛋白质。 手性分离是手性化合物分子与手性整体柱之间至少存在氢键、偶级偶级作用、 窟一t 作用、静电作用、疏水作用或空间作用中三种相互作用。手性分离效果是多 种相互作用共同作用的结果。这些相互作用通过影响包埋复合物的形成，特殊位 点与分析物的键合等而改变手性分离结果。主要应用于手性药物和蛋白质等的拆 分。 2 1 2 有机聚合物整体柱的聚合原理 原位聚合整体柱的反应属于无搅动的原位聚合过程，固定相的成孔机理一般 用相分离机理解释，单体、交联剂、引发剂及致孔剂在反应开始前构成稳定的均 相反应体系。当温度升高到一定值时，引发剂分解产生自由基引发聚合反应，形 成一定分子量大小的齐聚物链。随着聚合反应的进行，齐聚物链不断增长，交联 单体