（妇产科学专业论文）小鼠超排周期胚胎发育潜能的研究.pdf

声明 髻 7 9 2 9 0 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四 川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的， 论文成果归四川大学所有，特此声明。 申请人：各瘀枷 指撒厩多办彬 心庆矿 西g j c 学临睐医学2 0 0 2 级博士研究生妈产秘专妲学位论文搔导教师：磬芝兰教授、孝穗为教授 小鼠超排周期胚胎的发育潜能研究 指导教师 彭芝 兰 教授 李 尚为教授 研究生李培旭 中文摘要 目的观察超排卵对小鼠胚胎发育及胚胎着床的影响，分析超排周期胚胎的 着床与作为内膜容受陛标志物之一的i 蛋白和m r n a 的表达水平的关系。 方法建立将超排周期和自然周期孕4 天的胚胎移植于自然周期假孕第4 天 的受体小鼠子宫腔内的妊娠动物模型，比较超排周期组和自然周期组之间的 获卵数目、受精率、卵裂率、优质胚胎率和囊胚形成率，超排卵胚胎和自然 周期胚胎移植后受体鼠的妊娠率、移植胚胎的着床率之间的差异；并用免疫 组织化学s a b c 法、原位杂交法检测胚胎移植日受体鼠子宫内膜中l i f 蛋白 和m r n a 的表达水平，分析作为内膜容受性标志物之一的l w 蛋白和r t f l 铂n a 在超排卵胚胎受体鼠组和自然周期胚胎受体鼠组之间、妊娠受体鼠组和未妊 娠受体鼠组之间、单胎妊娠受体鼠组和多胎妊娠受体鼠组之间的表达水平的 差异及其与胚胎着床的关系。 结果本研究的结果显示超排周期能理想地提高获取卵母缨胞瓤胚胎冉勺数 量。超排周期所获得的卵母细胞的受精率和卵裂率是8 8 5 7 和9 2 1 7 ，分 别与自然周期获得的卵母细胞的受精率9 2 8 6 和卯裂率9 6 7 0 相比较无统 憨8小敏超持羁辩旺髓筮曹辔靛硪究 司 究生：李培坦 四垭尢学幅珠鞋学2 0 0 2 锺博士研究生虹产科专业学位论文指导教蝉：彭艺兰教授、季蠲为教授 计学差异( p o 0 5 ) ；超排周期组的优质胚胎搴和囊胚形成率为7 6 。5 0 和 2 2 。5 0 ，与自然周期组的8 8 6 4 和4 3 1 8 相比蹰显降低( p o 0 5 ) 。将超排 周期的胚胎和自然周期的胚胎分别移植于在同等条件下准备的假孕第四天 自然周期受体鼠，其妊娠率和移植胚胎的着床率分别为5 5 0 0 、3 5 0 0 n i 2 0 0 0 、8 3 3 超排周期组的妊娠率和移植胚胎的着床率明显低于自然周 期( p o 0 5 ) 。 结论超排卵在显著增加获取卵母细胞的数量的同时，不影响卵母细胞的受 精率和卵裂率，但会显著降低优质胚胎率和囊胚形成率i 超排卵的优质胚胎 和囊胚移植于受体鼠后的妊娠率和移植胚胎的着床率也明显低于自然周期。 胚胎的着床与胚胎的质量和内膜的容受性相关，当内膜的容受性相似时胚胎 的着床与胚胎的质量相关。超排卵可能因为影响移植前胚胎的质量而影响胚 胎着床，降低胚胎的发育潜能。 关键词超排卵受精率卵裂率优质胚胎率囊胚形成率 妊娠率移植胚胎的着床率l i f 蛋白l i fm r n a 疆目：小毓趣持凰辐珏始牲葛潜能的研究磅疑生：李培 邑 四锄走学帷采医学2 0 0 2 较梅士研究生妇产科专业学位谚文 指导教霸：彭芝兰教授、季尚为教授 t h ei m p a c to fo v a r i a ns t i m u l a t i o no ne m b r y o s d e v e l o p c m e n t a la b i l i t yi nm i c e t u t o r p r o f p e n gz h i l a n a n d p r o f l is h a n g w e i p o s t g r a d u a t el ip e i x u a b s t r a c t o b j e c t i v e t oo b s e r v et h ei m p a c to f o v a r i a ns t i m u l a t i o no l le m b r y od e v e l o p m e n t a n di m p l a n t a t i o ni nm i c e a n dt oa n a l y s i st h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nl e v e l so ft h e l i fp r o t e i na n dl i fm r n aa n dt h ei m p l a n t a t i o no f e m b r y o sf r o ms t i m u l a t e da n d 1 2 0 1 1 一s t i m u l a t e dc y c l e s m e t h o d st oe s t a b l i s hp r e g n a n c ym o d e l so f m i c ew h i c ht h et r a n s f e r r e de m b r y o s a r ef r o ms t i m u l a t e da n dn o n - s t i m u l a t e dc y c l e s c o m p a r et h ed i f f e r e n c eo ff e r t i l i t y r a t e ，c l e a v a g e do o c y t er a t e ，g o o dq u a l i t ye m b r y o sr a t e , b l a s t o c y s t sr a t e , p r e g n a n c y r a t e ，a n di m p l a n t a t i o nr a t eb e t w e e nt h eg r o u p so fs t i m u l a t e da n dn o n - s t i m u l a t e d c y c l e s a n dt h el e v e lo f l i fp r o t e i na n dl i fm r n a o nt h ed a yt h a tt h ee m b r y o s w e r et r a n s f e r r e dw e r ec h e c k e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n di ns i mh y b r i d i z a t i o n r e s p e c t i v e l y r e s u l t st h es t u d ys h o w e dt h a tt h eo v a r i a ns t i m u l a t e dm i c eh a v em o r eo o c y t e s 踵：小馥趣持j 茜l 觏珏鼯发曹潜能的研究研究生李培坦文件第3 覆 型茎兰堕堕兰丝丝壅苎兰塑竺丝型兰些望垄丝苎 鲎望! ! 堑! 篁兰兰要堡：至壁垄丝翌 e m b r y o sd e v e l o p e d ，a n dh a v et h es a i r l ef 酣i f i wr a t e ，s a m ed e a g e do o c y t er a t e , b u tl o w e rg o o dq u a l i t ye m b r y o sr a t e , l o w e rb l a s t o c y s t sr a t e , l o w e rp r e g m a n c yr a t e ， a n dl o w e ri m p l a n t a t i o nr a t ew h e nc o m p a r e dw i t ht h en o n s t i m u l a t e dm i c e t h e l e v e lo f l i fp r o t e i na n d l i fm r n a o nt h ed a yt h a tt h ee m b r y o sw e r et r a n s f e r r e d w e r es a l t l ew h e nc o m p a r e db e t w e e nt h eg r o u p so fp s u d o p r e g n a n tr e c i p i e n tr m c e w h i c ht h ee m b ) ，o st r a n s f f e r e dw e r ef r o ms t i m u l a t e da n dn o n - s t i m u l a t e dc y c l e s ，t h e g r o u p sw i t ho n eb a b yp r e 匦锄c ya n dm o r et h a n o r l eb a b yp r e g n a n c y , b u ti th a da 1 1 i 曲c rl e v e lo fl i fp r o t e i na n dl i fm r n a i nt h ep r e g n a n c yg r o u pw h e n c o m p a r e dw i t ht h eg r o u pt h a th a dn op r e g n a n t c o n d u f i o n so v a r i a ns t i n a u l a l i o nm a yi m p a i r et h ed e v e l o p m e n t a lc o m p e t e n c e a n dt h eq u e r yo fo o c y t e s e m b r y o s ，t h u sm a yr e d u c et h ep r e g n a n c yr a t ea n d i m p l a n t a t i o nr a t ee v e ni ft h ep s u d o p r e g n a n tr e c i p i e n tm i c eh a st h es a j t i el e v e l so f l wp r o t e i na n dl i fm r n ao nd a y4o f p s u d o p r e g n a n c y k e yw o r d s o v a r i a ns t i m u l a t i o n , f e r t i l i t yr a t e ，c l e a v a g e do o c ”er a t e ， g o o dq u e r ye m b r y o sr a t e ，b l a s t o c y s t sr a t e , p r e g n a n c yr a t e ， i m p l a n t a t i o nr a t e , l i fp r o t e i n , l i f m r n a ， 疆| - 小鼠超棰商鞘艇髓靛青酱能曲母 究 研究夸：李培旭文件第4 妻 西m 走学醢索医学2 0 0 2 锺博士研究生妇产辩专业学位连文指导教舒：彭芝兰教授、李商为教授 第一部分 超排卵对小鼠胚胎发育及着床的影晌 前言 体外受精- 胚胎移植( h lv i 劬f e r t i l i z a t i o na n de m b r y ot r a n s f e r , i v f e t ，) 技术在输卵管性不孕【“和少、弱、无精予症陛不育脚等的广泛应用使过去难以 治疗的不育不孕夫妇有了获得自己亲生孩子的可能。超排卵能募集卵泡、获 得冶当数量的卵母细胞，是保证体外受精胚胎移顺利实施的重要方法。但超 排卵也有可能影响卵母细胞和胚胎的质量p j 。超排卵影响胚胎着床的原因文 献报道较多的是由于体内高雌激素水平，特别是雌激素和孕激素的比例不当 造成母婴界面中各种细胞因子形成的网络失衡、内膜的结构改变，使得内膜 的容受性降低，进而导致胚胎着床失败阳。本研究通过体内动物模型来研究 超排卵对小鼠胚胎发育的影响。通过比较超排卵孕第4 天获得的胚胎和自然 周期孕第4 天获得的胚胎移植于条件相似的自然周期同步假孕小鼠子宫腔内 后的着床情况，来观察超排卵对胚胎着床的影响。 材料与方法 研究对象 昆明纯种性成熟小鼠，通过四川大学成都市武侯区华西实验动物供应站 ( 西川大学华西校区) 购于成都中医药大学实验动物中心( 动物合格证号： 川实动管质第1 1 号) 。雌性总数1 2 0 只，6 8 周龄，体重2 5 3 0 克；雄性总数 2 0 只，8 1 0 周龄，体重3 0 3 5 克。雌鼠每笼4 6 只群养；雄鼠每笼1 只单独 饲养。饲养条件为自由摄食、饮水，1 2 小时光照，环境温度1 8 - 2 2 。c ，相对 题目：小馘超括两期疑骀发育漕齄的研究研究生李墙姆吏卡宇第s 史 强f 太学校赢医学2 0 0 2 级博士研究生招产9 4 专业学拉i j c禚导教师：彭芝兰教授、李尚为教授 湿度6 0 - 8 0 。 主要试剂 孕马雌激素( p m s g ) ，天津实验动物中心，批号：2 0 0 4 0 3 2 9 ；人绒毛膜 健| 生腺激素( h c g ) ，上海生物化学制药厂，批号：2 0 0 4 0 5 1 1 ；通用f 培 养液，丹麦m e d i c u l t 公司，货号：1 0 9 5 0 0 6 0 ；e a r l e s 缓冲平衡盐溶液( 船s s ) ， 美国g i b c o 公司，货号：1 2 0 2 0 7 4 。 主要仪器 超净工作台，苏净集团安泰公司；倒置显微镜，x s z - d r ，重庆光学仪 器厂；解剖显微镜，中国科学院成都分院仪器厂；手术器械等。 供鼠模型 下午1 6 时，自然周期组供鼠为性成熟雌鼠与性成熟雄鼠2 ：1 合笼，次 日起每日8 时及1 8 时各观察一次阴道栓，见阴道栓( 图1 - 1 ) 目为孕第一天， 并按见阴道栓的先后顺序编号。超排卵周期组供鼠为性成熟雌鼠腹腔内注射 孕马雌激素( p m s g ) 1 0 u ，4 8 5 0 小时后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素( h c g ) 1ou ，随即号生成熟雄鼠2 ：1 合笼，同法观察阴道栓、计算孕天和编号。并 将序号相同的自然周期组供鼠和超排卵周期组供鼠配对，本研究成功获得供 鼠共6 对。 韪g ：小鼠翘捧局期胚昭发育潜能的研究 立锌第6 兔 月f j l 太学螨床医学2 0 0 2 数博士霹 宄生妇产科专业学位论文 指导教静：棼芝兰教投，李商奄教授 图l 一1 观察阴道拴( 2 ) 受鼠准备 自然周期的性成熟雌鼠与结扎1 5 天以上的性成熟雄鼠2 ：1 合笼，合笼 时间与自然周期供鼠合笼时间相同或者与超排卵周期供鼠注射孕马雌激素 ( p m s g ) 的时间相同。同上观察阴道栓。 胚胎获取 孕4 天上午8 时( 相当于见阴道栓7 2 小时或注射h c g 后9 2 小时) 采 用脱臼法处死供鼠，剖开腹腔找出子宫，自双卵巢与输卵管连接部切断输卵 管，并向下游离输卵管和子宫直达宫颈分叉处，在分叉处略上避开宫颈切断 j 叹便9 子宫，将切下的子宫立即放入预热至3 7 的e a r l e s 缓冲平衡盐溶液中， 并用1 号注射器针尖纵行拨开子宫，e a r l e s 缓冲平衡盐溶液冲洗宫腔，3 7 。c 孵箱内静置3 0 分钟后在体视显微镜下寻找观察卵母细胞和胚胎，并按卵母 细胞、受精卵、劣质胚胎( 2 - 7 细胞胚胎及8 细胞以上但细胞大小明显不均 匀、碎片体积太于胚胎总体积5 傩以上的胚胎，图1 2 ) 、优质胚胎( 8 细胞 最耘：乖鬣趣捧两期珏齄发青潜麓的研究研究生：事壤枢文件第7 嚣 四蜥走学拉睐瞻学2 0 0 2 壤麟士硪究生虹产科专啦学位论文指导教辘l i ：彭芝兰教授，李巍为教授 以上且细胞大小均匀、碎片体积小于或等于胚胎总体积5 0 的胚胎，图l 一3 ) 和囊胚。小鼠胚胎的评分参照人类胚胎的评分标准问并作适当的修改。将优 质胚胎( 8 细胞以上且细胞碎片体积小于或等于胚胎总体积5 0 的胚胎) 和 囊胚置于清洁培养皿内培养供胚胎移植用。 图1 - 2 孕4 天丢弃小鼠胚胎 ( 8 0 ) 图1 - 3 ：孕4 天移植用小鼠胚胎 ( 8 0 ) 胚胎移植 将与获取胚胎的供鼠同h 见阴道栓的受鼠随机分为2 组，分别作为自然 周期组和超排卵组胚胎移植的受体。将受体鼠用速眠新i i 麻醉后，于其双侧 背部切开皮肤，分离肌层等组织暴露双侧子宫，切除小鼠左侧子宫远段约 l e m ，用含o 1 d e p c 的舷多聚甲醛液固定脱水后石蜡包埋备用；并将3 个胚胎移植入右侧子宫腔内。 结果观察 移植后第8 天采用脱臼法处死小鼠，解剖子宫，计数妊娠小鼠及其着床 胚胎数目( 图1 4 ) ，分别计算自然周期组和超排卵组胚胎移植后的妊娠率和 胚胎着床率。 粤目? 小膏窟带用硝座脂发声搏艚钟肝疗矸窟芏j 蜡眉 卫舻第8 页 凸m j 学崎珠魄学2 0 0 2 级祷士磺竞莲蛹；盘辩阜监学位论文 指导教榔：彭芝兰教授事礴免教授 a 孕1 2 天1 胎妊娠b 孕1 2 天2 胎妊娠c 孕1 2 天3 胎妊娠 图1 - 4 ：着床胚胎数目( 1 ) 统计分析 用t 检验分析超排卵组和自然周期组的卵母细胞和胚胎数目的差异，采 用卡方检验( s t a t i s t i c a lp a c k a g eo fs o c i a ls c i e n c e ，简称s p s s 软件包) 分析超排卵组和自然周期组的受精率、卵裂率、优质胚胎率、囊胚形成率、 移植胚胎的着床率和受体鼠妊娠率的差异。 结果 1 超排周期和自然周期组获取卵母细胞和胚胎的总数比较：超排周期组 和自然周期组卵母细胞和胚胎的总数比较显示超排周期组获取的卵母细胞 和胚胎的总数显著高于自然周期g l ( p o 0 1 = ，祥见表卜1 和图l 一5 。 表卜l 超排周期组和自然周期组获取的卵胚总数的比较 t 检验p o 0 5 ，两组的受精率相似 图卜6 更直观地显示超排周期组和自然周期组的受精率相似( p o 0 5 ) ， 说明超排卵对受精率无明显影响。 照目：4 、鼠超持两魏珏糖发曹礴能的聩究研竞争。车培尴童转锛l0 斑 西椭| 大学雅瘫医学2 0 0 2 镊博t 研究生妇产彝 专业学啦趋盅指导教瞬：彭芝兰教授，李商旁慧授 受 精 室 小氟编号 图卜6 超排周期组和自然周期组受精率的比较 3 超排周期组和自然周期组的卵裂率的比较：表1 - - 3 显示两组的卵裂率 无统计学差异( p o 0 5 ) 。 表卜3 超排周期组和自然周期组的卵裂率的比较 卡方检验p o ，0 5 ，两组的卵裂率相似 上表的结果用图表示如下( 图i - 7 ) 鞋妊书氍趣持两壤娃礁笸甍港砖曲研r j j 甏生亭培趱史释纂 面 西m 大学嫡瘴医学2 0 0 2 瑗博士研究生_ 蛤产t 4 专业学位谁文拯导教师! 够芝兰教授李尚为教授 卵 裂 塞 小鼠编号 图1 7 超排周期组和自然周期组卵裂率比较 4 超排周期组和自然周期组的优质胚胎率的比较：自然周期的优质胚胎 率显著高于超排卵组( p 0 0 9 2 5 ) ，见表l 一4 。 表l 一4 超排卵组和自然周期组优质胚胎率的比较 卡方检验p o 0 2 5 ，对照组的优质胚胎率明显高于实验组。 上表的结果用直方图表示如下( 图卜8 ) 越b ：，j 、鼠趣接碗帮肛髓笸青潜能的罚 宄研究生：李培蟪 西强太学犏来医学2 0 0 2 缓博i 1 研究生螅产f g 专啦学拉谴变指导教师：彭芝兰教授，季瑚舟张授 优 胚 直 小自啸号 图卜8 超排周期组和自然周期组优质胚胎率比较 5 超排周期组和自然周期组囊胚形成率的比较：自然周期的囊胚形成率 显著高于超排卵组( p ，见表l 一4 。 表卜5 超排周期组和自然周期组囊胚形成率的比较 成 囊 塞 卡方检验p o 0 1 ，自然周期组的囊胚形成率明显高于超排卵组 上表的结果图示如下( 图1 - 9 ) ： 小鼠编号 图1 - 9 超排周期组和自然周期组囊胚形成率比较 疆羁t 小虢趣摊周辐琏船发曹谱程的料究 碗嚣警：幸培坦| 肆鬻l3 虫 四m 太学蟾瘩医学2 0 0 2 镪博士研究熏妊产科专业犟位诧立强导教师：彭芝兰教授，李啦为教授 6 自然周期组和超排周期组宫腔内胚胎移植后的妊娠率比较，经统计 分析自然周期组的妊娠率显著高于超排周期组( p 0 0 2 5 ) ，见表1 - 6 。 表1 - 6 自然周期组和超排卵组的妊娠率比较 卡方检验p o 0 2 5 ，自然周期组的妊娠率显著高于超排卵周期组。 7 自然周期组和超排卵组宫腔内胚胎移植后的胚胎着床率比较，经统 计分析自然周期组的胚胎着床率显著高于超排峁周期组( p o 0 0 5 ) ，见表 1 7 。 表1 7 自然周期组和超排卵组的胚胎着床率比较 卡方检验p o 0 0 5 ，自然周期组的胚胎着床率显著高于超排卵周期组。 建g ：小虢盏撵两糯轻齄发青；_ 彗耗曲研究研究生：毒培趣文捧摹14 页 日m 大学 | 盎瘩鞋学2 0 0 2 级博士研究生妇产科专监学位论文指导教怖；彭芝兰教授、李稳为教授 讨论 超排卵是体外受精j 胚胎移植技术中常用雨又非常重要的方法，是体岁卜受 精一胚胎移植技术能够广泛顺利开展的前提和保障。但超排卵也有其不良作 用，除卵巢过度刺激综合症外，超排卵还影响胚胎的着床。超排卵影响胚胎 着床主要表现在对胚胎质量的影响和对子宫内膜容受性的影响两个方面。而 超排卵对胚胎质量的影响虽有报道，但结果并不一致。c o m b e u e s 川等的研究 发现当小鼠反复促性腺激素刺激超排卵时，在生殖泡期多周期刺激的卵母细 胞的细胞大小、与体细胞的联系程度、染色质的排列和转录抑制的时间等与 单周期刺激的卵母细胞相比都会发生改变。在体内卵母细胞的减数分裂不受 影响，而在体外减数分裂的能力则随促性艨激素刺激周期数的增加而逐渐减 弱。体内成熟卵母细胞的a t p 酶的浓度也会因刺激周期数的增加而刚氐。尽 管单周期刺激后体外成熟的卵母细胞的a t p 的浓度较单周期刺激后体内成 熟的卵母细胞的低，但间隔周期刺激后体外成熟的卵母细胞的a t p 的浓度相 对稳定。此外，多周期刺激时体内成熟的卵母细胞受精后体外培养的发育能 力与其它组相似；体内实验发现多周期刺激后的雌鼠与雄鼠交配后其胚胎的 着床率和吸收率与单周期刺激的相同，提示小鼠体内实验时，多周期超排卵 刺激对卵母细胞的损伤可能存在补偿机制来最小化对卵母细胞发育潜力的 影响。a d d a e n s 【目等用小鼠卵巢的窦前卵泡组织在7 种不同浓度的f s h 培养 液中培养1 2 天，第1 3 天加h c g 促排卵，获得的卵丘复合物行体外受精并 培养到囊胚期，结果显示当f s h 缺如或单次使用对卵泡的成活率明显降低， 卵母细胞的质量受损，几乎没有卵母细胞供胚胎培养。最晚应在开始培养的 第4 天补充f s h 才能保证最好的卵泡存活率；晚于4 天添加f s h 时，卵泡 存活率和排卵数都明显刚氐。当在窦前卵泡期添加f s h 时，受精率和移植前 器g ：4 毓趣捧周期轻聩发育湛能的研究研究生：李培坦 题大挚临雍曝学2 0 0 2 缎l v f 研究生妈产科专盘学位论盘抬导教硒：彭芝兰羲授、享武为鼓授 胚胎发育率是最高的。提示在窦卵泡形成之前使用f s h 能够增加窦卵泡存活 率和提高卵细胞的质量。e d w a r d s 归肄在研究用不同剂量的重组人f s h ( o ， 2 5 ，5 , 0 ，1 0 0o t2 0 0 单位) 或5 单位马绒毛膜促性腺激素对小鼠移植前胚 胎发育的影响时发现重组人f s h 在小鼠超排卵体外培养过程中会损害移植 前胚胎的发育，这种损害有可能成为临床超排卵治疗不孕症时影响胚胎质量 的潜在因素。z j e h , ) - 1 田等的研究则表明使用外源性促性腺激素不会影响卵裂能 力和随后的胚胎评分。 本研究通过采用体内实验的小鼠动物模型来观察超排卵与胚胎的发育， 避免了体外培养体系对胚胎发育的不利影响，结果显示超排卵实验组获取的 卵母细胞和胚胎的总数明显高于自然周期对照组，超t t l d p 实验组和自然周期 对照组的受精率和卵裂率相似但超排卵实验组的优质胚胎率、囊胚形成率 和自然周期对照组相比明显降低。表明超排卵虽能明显增加卵母细胞和胚胎 的数量，对受精率和卵裂率也无明显影响，但对优质胚胎率、囊胚形成率有 明显影响，即超排卵组的移植前胚胎的质量明显降低。超排卵影响胚胎质量 的机制还不清楚。据文献超排卵对卵母细胞的染色体的结构和功能均有影 响。t a m 等 ” 的研究发现超排卵会增加小鼠的染色体异常的卵母细胞的比例； 现代分子生物学技术也已证实促性腺激素对哺乳类动物的卵母细胞的减数 分裂起着重要而又复杂的调节作用l 】”。且反映胚胎质量的两个指标：胚胎的 形态和发育速率，都是以基因的表达和控制为基础的 b j 。此外超摊卵获取的 卵母细胞的质量与促性腺激素使用的时机和剂量也有关系i s 。 子宫内膜容受性的标志物包括子宫内膜胞饮突、白血病抑制因子、整合 素等，其中子宫内膜中的自血病抑制因子、整合素等多种细胞因子共同构成 细胞因子网络，细胞因子网络处于相对稳定的动态平衡状态，控制着予宫内 膜的容受性。超排卵时由于体内激素水平失衡导致内膜结构的改变和细胞因 露e ：小鼠鳢接属鹈娅稿发育潜辘的研究研究生：车培越立蚌第i6 页 西诎大学甑寐医学2 0 0 2 镀樽士碍竞生妊产科专啦学证论史 指导教蜂：錾芝兰教授、李尚为教授 子网络平衡的破坏，使子宫内膜的容受性受到影响。c r c 璐等【1 4 】的研究发现 不孕妇女用c c 促排卵后黄体中期子宫内膜胞饮突的形成明显减少；n i l ( a s 等1 5 1 观察到人g n r h a f s h h c g 方案超排卵后子宫内膜胞饮突的形成较自 然周期平均提前1 - 2 天；m e y e r 等【1 q 在g n r h a f s h h c g 促排卵组的研究 发现整合素b3 的表达较自然周期组明显刚氐。此外e r t z e i d 等【17 l 的研究发现 p m s g 联合h c g 超排卵的小鼠子宫内膜接受胚胎移植后其胚胎着床率较对 照组明显降低；超排卵可能影响胚胎的发育和质量，进丽影响胚胎的着床。 本研究采用自然周期受体小鼠动物模型来比较自然周期获取的胚胎与 超排卵周期获取的胚胎移植于自然周期受体小鼠后的妊娠率和胚胎着床率 的差异，其优点在于它避免了超排卵对受体小鼠内膜容受性的干扰而影响胚 胎的着床。本研究结果显示自然周期组的胚胎行富腔内胚胎移植后的妊娠率 和胚胎着床率显著高于超排卵周期组。提示超排卵周对胚胎的质量和发育的 影响会直接导致妊娠率和胚胎着床率的降低。 由此可见，由于精子和卵子的基本功能就是受精和卵裂，在受精和卵裂 阶段参与调节的酶等基因产物的种类和能量消耗是有限的，因此超排卵对卵 母细胞的受精率和卵裂率的影响不大。超排卵对卵母细胞的染色体的结构和 功能的影响主要同随后的与胚胎进一步发育密切相关的基因的表达有关，进 而影响胚胎的质量和胚胎的着床，降低胚胎的发育潜能。 结论 超排卵是保证体外受精期! 胎移植时获取恰当数量胚胎的前提，超排卵对 胚胎的早期发育( 如受精和卵裂) 的影响不大，但对移植前胚胎( 8 细胞以 上的胚胎和囊胚) 的发育和质量有明显影响。超排卵对胚胎的质量和发育的 踺h 小鼠赶持商辘旺鼯发育潜鸵的研究研究生李培担文搏第l7 硬 酉i | t 大学幅赤医学2 0 0 2 镀辫士研究生妇产辩专业学位论文指导教肺：彭芝兰教授，李豳为教授 影响可能会影响胚胎的着床。超封 卵周期获取的胚胎的移植予自然周期受体 鼠，其妊娠率和移植胚胎的者床率与自然周期获取的胚胎相比均明显降低， 表明超排卵会降低胚胎的发育潜能。 参考文献 1 s t e p t o ep c ，e d w a r d sr gb i r t ha f t e rt h er e i m p l a n t a t i o no fah u m a ne m b r y o l a n e e g1 9 7 8 ，1 2 ：2 ( 8 0 5 8 ) ：3 6 6 、 2 p a l e r m ogj 0 6 sh ，d e w o e yee ta 1 p r e g n a n c i e sa f t e ri n 缸a c y t o p l a s m i c 硒e c t i o ns i n g l es p e r m a t o z o o ni n t oa ! lo o g y t g 。l a n c e t ，1 9 9 2 ；3 4 0 ( 8 8 1 0 ) ：1 7 3 e r t z i e dgs t o r e n gr ，t h ei m p a c to fo v a r i a ns t i m u l a t i o no l li m p l a n t a t i o nm i d f e t a ld e v e l o p m e n ti nm i c e ，h u mr e p m d , 2 0 0 1 ，1 6 ( 2 ) ：2 2 1 2 2 5 4 t a v a n i o t o ua ，a l b m a oc ，s r n i t zj ，e ta 1 i m p a c to fo v a r i a ns t i m u l a t i o n0 1 2 c o r p u sl u t e u mf u n c t i o na n de m b r y o n i ci m p l a n t a t i o n jr e p m d r r m l u n o l ，2 0 0 2 ， 5 5 ：1 2 3 1 3 0 5 m aw c 4s o n gh ，d a ss k , e ta 1 e s 抒o g e ni sac r i t i c a ld e t e r m j r m n tt h a t s p e c i f i e st h ed u r a t i o no ft h ew i n d o wo fu t e r i n er e c e p t i v i t yf o ri m p l a n t a t i o n p r o cn a t l & c a ds c iu s a ，2 0 0 3 ，1 0 0 ( 5 ) ：2 9 6 3 2 9 6 8 6 p e t e r1 1 1 3 ，at e x t b o o ko fi nv i 缸 of e r t i l i z a t i o na n da s g s t e dr e p r o d u c t i o n s e c o n de d i t i o n ，b o u r nh a l lc l i n i c ，b o u r n , c a m b r i d g e ，u k , t h ep a r t h e n o n p u b f i c a f i o ng r o u p ，1 9 9 9 ：1 8 5 2 0 1 7 c o m b e l l e sc m ，a l b m i n id f a s s i s s m e n to f o o c y t eq u a l i t yf o l l o w i n gr e p e a t e d g o n a d o t r o p i ns t i m u l a t i o n i n t h e l r l o u s e b i o l r e p r i d 2 0 0 3 ，6 8 0 ) ：8 1 2 8 2 1 8 a d r i a e n si ，c o r t v r i n d trs m i t zj d i f f e r e n t i a lf s he x p o s u r ei n p r e a n w a l 麓a ：小鼠超持焉麴珏驺发曹 彗能的研究碗究遵：车墙娌文件第8 硬 固m 大学植珠氍学2 0 0 2 诬麟士研究生虹产载专业学位论文 指导教螂：彭芝兰教授、李尚为教授 f o l l i c l ec u l t u r eh a sm a r k e de f f e c t so i lf o l l i c u l o g e n e s i sa n do o c y t e d e v d o p m e n t a lc o m p e t e n c e 。h u mr e p r o d 。2 0 0 4 , 1 9 ( 2 ) ：3 9 8 4 0 8 9 e d w a r d su ，k i n dk l ，a r m s t r o n gd t , e ta 1 t h ee f f e c t so fr e c o m b i n a n t h u m a nf o l l i c l es t i m u l a t i o nh o r m o n e ( r h f s mo ne m b r y od e v e l o p m e n ti nm i c e a mjp h y s i o le n d o e r i n o lm e t a b 2 0 0 4 ，d e c1 4 ： e p u ba h e a do f p r i n t 1 0 z i e b e s ，b a n g s b o u s ，s c h m i d t k l t ，e t a l e m b r y o q u a l i t y i n n a t u r a l v e r s u s s t i m u l a t e d1 v fc y d e s 。h m nr e p m d 2 0 0 4 ，1 9 ( 6 ) ：1 4 5 7 - 1 4 6 0 ， 11 t a i nc f , g o hv h h ，n gs c e f f e c to fh y p e r s t i m u l a f i o nw i t hg o n a d o t r o p i n s a n da g eo ff e m a l eo no o c y t e sa n dt h e i rm e t a p h a s ei is t a t u si nr a t s m o l r e l x - o d d e v 2 0 0 0 ，5 5 ：1 0 4 - 1 0 8 1 2 p i c t o i leb r i g g sd ，g o s d e n1 lt h em o l e c u l a rb a s i so fo o c y t eg r o w t ha n d d e v e l o p m e n t m o lc e l ie n d o c r i n 0 1 1 9 9 8 ，1 4 5 ：2 7 3 7 1 3 w a m e rc m ，c a ow ：e x l e yg e e ta 1 g e n e t i cr e g u l a t i o no f e g ga n de m b r y o s u r v i v a l h u mr e p m d 1 9 9 8 ，1 3 ( s u p p l 3 ) ：1 7 8 1 9 0 1 4 c r e u sm ，o r d ij ，f a b r e g u e sf , e ta 1 t h ee f f e c to f d i f f e r e n th o r m o n et h e r a p i e s o ni n t e g f i ne x p r e s s i o na n dp i n o p o d ef o r m a t i o ni nt h eh u m a ne n d o m e t r i u m ：a c o n t r o l l e ds t u d y h u mr e p m d , 2 0 0 3 ，1 8 ( 4 ) ：6 8 3 - 6 9 3 1 5 n i k a sgd e v e l i o g l uo i l , t o n e rj p , e ta 1 e n d o m e t r i a lp i n o p o d e si n d i c a t ea s n f li nt h ew i n d o wo fr e c e p t i v i t yi nf 汴c y c l e s h u mr e p r o d ，1 9 9 9 ，i 郇) ： 7 8 7 。7 9 2 1 6 m e y e rw rn o v o t n yd b ，f r i t zm _ e ta 1 e f f e c to f e x o g e n o u s0 1 1e n d o m e t r i a l m a t u r a t i o ni no o c y t ed o n o r s f e r t i ls t e r i l ，1 9 9 9 ，7 1 f 1 ) ：1 0 9 1 1 4 1 7 e a z i e dgs t o r e n gr t h ei m p a c to fo v a r i a ns t i m u l a t i o no ni m p l a n t a t i o na n d f e t a ld e v e l o p m e n t i n m i c e h u m r e p m d ，2 0 0 1 ，1 6 ( 2 ) ：2 2 1 2 2 5 鼹e ：小鼠赶捧霹j 睦 驻皓柱蓖谴裁的研究研究生：李培枢文释第t9 砸 西m 大学幅赤医学2 0 0 2 级辫士研究生妇产科专业学位论文 指导教却：彭芝兰颧投、季尚为教授 第二部分 内膜l if 表达与小鼠超排胚胎的着床 前言 前面的研究表明超排卵会影响胚胎的质量、降低胚胎的着床率。但胚胎 着床率低也可能与内膜的容受性相关。作为子宫内膜容受性的标志物之一的 自血病抑雉4 因子( 1 e u k 朗n i al r , 虹b i t o r yf a c t o r , l i f ) 水平可以部分反映子宫内 膜的容受性【1 。本研究通过对受体小鼠胚胎移植时子宫内膜中的l f 蛋白及 m r n a 表达水平的检测，来分析超排周期胚胎移植组和自然周期胚胎移植组 两组受体鼠容受性的一致性，反映超排卵对胚胎质量及其着床的影响。 材料与方法 研究对象 昆明纯种性成熟小鼠，通过四川大学成都市武侯区华西实验动物供应站 ( 四川大学华西校区) 购于成都中医药大学实验动物中心( 动物合格证号： 川实动管质第1 i 号) 。雌性总数1 2 0 只，6 8 周龄，体重2 5 3 0 克；雄性总数 2 0 只，8 1 0 周龄，体重3 0 3 5 克。雌鼠每笼4 6 只群养：雄性每笼1 只单独 饲养。饲养条件为自由摄食、饮水，1 2 小时光照，环境温度1 8 - 2 2 。c ，相对 湿度6 0 - 8 0 。 主要试剂 1 l i f 抗体( 一抗) 为兔抗鼠亲和纯化抗体( o 2 m l 份) ，产品编号： b a l 2 3 9 ，购于武汉博士德生物工程有限公司。 2 免疫组织化学染色( s p s a b c 法) 试剂盒( s t r c p t a v i d i np e r o x i d a s ek i t ， 跫r 小鼠趣持两鞠驻酷靛黄辔能的砩巍磷究生：李培畦盘件第20 蓖 四圳太学悔密医学2 0 0 2 蔽博士研究生虹产科专业学位论交 指导教稀：劳芝兰彀授、李皂趋墼堡 s pk i t ) ，产品编号：s a l 0 2 2 ，购于武汉博士德生物工程有限公司，包括： 5 b s a 封闭液( 非免疫正常兔血清) 1 2 m l ，用于组织切片的封闭；二抗为 山羊抗兔i g g 亲和纯化抗体1 2 m l ，已标记长臂生物素：s a b c a p l 2 m l ，链 酶亲和素一碱性磷酸酶等。 3 l 1 f 原位杂交检测试剂盒，产品编号：m k l 4 0 3 ，购于武汉博士德生 物工程有限公司。为针对l e u k e m i ai n h i b i t o r yf a c t o rf l n 。) 的寡聚核苷酸探针， 已经地高辛标记。由于采用多相寡聚核苷酸探针和高敏感标记技术，并配合 使用敏感性加强型的原位检测方法，具有敏感性特别强，背景清晰，结果准 确可靠的优点。可以检测出常规福尔马林固定、石蜡包埋标本的l i f 之m r