（分析化学专业论文）苦荞壳中黄酮类化合物提取、纯化与其组分分离、测定.pdf

摘要 苦荞壳中黄酮类化合物提取、纯化 与其组分分离、测定 作者简介：甄云鹏，男，1 9 7 7 年9 月出生，2 0 0 4 年9 月师从于成都理工大学范 必威教授，于2 0 0 7 年6 月获硕士学位。 摘要 本文研究了以苦养壳为原料提取总黄酮的工艺方法，同时对提取的总黄酮进 行了提纯除杂及对其中的主要单体组分进行了分离测定。 ( 1 ) 从苦荞壳中提取总黄酮工艺方法的研究，重点对比研究了超声波和微 波辅助提取法，结果表明微波辅助提取法的效果优于前者。并对其进行了正交实 验设计，对影响提取的主要因素如溶剂种类及浓度、提取时间、温度、p n 、液 固比等进行了研究，得到了优化的提取条件，结果表明，当介质为乙醇时的微波 萃取效果明显优于其他提取方法，黄酮提取率可达2 9 0 以上；与文献方法相比， 提取率明显提高，与超声波法相比时间缩短了一半。 ( 2 ) 对提取液中总黄酮的提纯研究。筛选确定了d 1 0 1 型号大孔吸附树脂 对苦荞壳中总黄酮提取液进行分离除杂纯化，对树脂的吸附和解吸条件进行了详 细的实验研究，d 1 0 1 型号对黄酮有较好的吸附解吸及除杂效果。最大吸附量为 1 3 1m g m l ，解吸率达9 7 7 1 。 ( 3 ) 采用了h p l c m s 联用技术对苦荞壳中总黄酮各种单体进行了分离测 定。h p l c 的实验结果表明，苦荞壳中含有芦丁、槲皮素、杨梅素等黄酮类化合 物，再通过质谱得到了进一步研究。 本文对苦荞壳进行实验研究，其结果为工业上大规模综合开发利用该资源提 供了理论依据，同时，也为苦荞麦的深加工提供有益参考。 关键词：黄酮类化合物、超声波辅助提取、微波辅助提取、大孔吸附树脂、 h p l c m s e x t r a c t i o na n d p u r i f i c a t i o no ft h ef l a v o n ec o m p o u n d s f r o mf a g o p y r u mt a t a r i c u mh u l l s & s e p a r a t t i o na n d d e t e r m i n a t i o no fi t sm a i n m o n o m e r c o m p o n e n t a b s t r a c t i h ea r t i c l es t u d i e dt h em e t h o do ft e c h n i c st h a te x t r a c tt h et o t a lf l a v o n ef r o mt h e f a g o p y r u mt a t a r i c u mh u l l s ，p u r i f i e dt h ee x t r a c t e dt o t a lf l a v o n ea n dd e t e r m i n e dt h e m a i nm o n o m e r sc o m p o n e n ta tt h es a m et i m e ( 1 ) c o n t r a s tt h ee x t r a c t e dm e t h o db yu l t r a s o n i ca n dm i c r o w a v ei nt h er e s e a r c ho f e x t r a c t i n gt h et o t a lf l a v o n ef r o mt h ef a g o p y r u mt a t a r i c u mh u l l s t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ee f f c to fm i c r o w a v ee x t r a c t i o nm e t h o dw a se x c e l l e dt h ef o r m e r a n ds t u d i e d t h em a i nf a c t o r ss u c ha ss o l v e n tk i n d s ，c o n c e n t r a t i o n , e x t r a c t i o nc o u r s e ，t e m p e r a t u r e ， p ha n dr a t i oo fs o l i dt 0l i q u i dt h a ta f f e c te x t r a c t i o nb yo r t h o g o n a l i t ye x p e r i m e n ta n d a c q u i r e dt h eo p t i m i z e de x t r a c t i o nc o n d i t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a t m i c r o w a v e e x t r a c t i o nw i t he t h a n o lw a so b v i o u s l ye x c e l l e dt h a na n yo t h e rt e c h n i q u e t h e e x t r a c t i o nr a t i oo ff l a v o n er e a c h e do v e r2 9 0 c o m p a r e dt ot h el i t e r a t u r em e t h o d t h e e x t r a c t i o nr a t i oi n c r e a s e do b v i o u s l y c o m p a r e dt ot h eu l t r a s o n i cm e t h o d ，t h et i m eo f e x t r a c t i o ns h o r t e n e dah a l f ( 2 ) i nt h ep u r i f i c a t i o nr e s e a r c ho ft o t a lf l a v o n ef r o mt h ee x t r a c t i o nl i q u i d ，w e f i l t r a t e da n da s c e r t a i n e dt h em a c r o p o r o u sr e s i n s - d 1 0 1t os e p a r a t ea n dp u r i f yt h et o t a l f l a v o n ef r o mt h e f a g o p y r u mt a t a r i c u m h u l l sa n ds t u d i e dt h ea d s o r p t i o na n d d e s o r p t i o nc o n d i t i o no ft h em a c r o p o r o u s t h er e s u l t ss h o w e dt h a td 1 0 1 h a db e t t e r a d s o r p t i o n d e s o r p t i o na n dp u r i f i c a t i o ne f f e c t m a x i m a la d s o r p t i o nc a p a c i t ) ，i s 1 3 1 m g m la n dd e s o r p t i o nr a t i oi s9 7 7 1 ( 3 ) s e p a r a t e da n dd e t e r m i n e dt h e d i f f e r e n tm o n o m e ro ft o t a lf l a v o n ef r o m f a g o p y r u m t a t a r i c u mh u l l s b y h p l c m s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t f a g o p y r u m t a t a r i c u mh u l l sc o n t a i n e dt h ef l a v o n ec o m p o u n d ss u c ha sr u t i n , q u e r c e t i n , m y r i c e t i n e t ca n da f f i r m e db ym s 1 1 1 ea r t i c l es t u d i e dt h ef a g o p y r u mt a t a r i c u mh u l l s t h ec o n c l u s i o nw o u l dp r o v i d e t h e o r e t i c a lb a s i sf o rt h ei n d u s t r yt oe m p o l d e ra n du t i l i z et h er e s o u r e 圮c o s m i c a l l ya n d a tt h e $ a l n et i m ew o u l dp r o v i d eb e n e f i c i a lr e f e r e n c et om a n u f a c t u r ef a g o p y r u m t a t a r i c u mh u l l s k e y w o r d s ：f l a v o n ec o m p o u n d s ；u l t r a s o n i c - a s s i s t e de x t r a c t i o n ；m i c r o w a v e a s s i s t e d e x t r a c t i o n ；m a c r o p o r o u sr e s i n s ；h p l c - m s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得成都理工大学或其他教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 ，o 签名：吼油够 勿口7 年j 月，日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盛整理王盍堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权盛壑堡王太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 够， 扪 ， ，卜 年 ，玩7 ，嘞1 暨 ， 第一章引言 第一章引言 1 1 研究意义 黄酮类化合物是一类广泛存在于植物体内的天然色素，这类化合物具有抗菌、 抗病毒、抗过敏、抑制癌细胞等多种药理活性，对治疗癌症、心血管等疾病有重 要意义。在国外，近年来对黄酮类化合物的研究开发虽然十分活跃，但在国内 保健食品生产中开发较多的只有银杏黄酮、山楂黄酮、茶叶黄酮等“1 ；目前，国 内提取芦丁的原料主要是槐花，其资源稀少，不能充分满足市场需要，因此，寻 找其它资源便成为人们十分关注的问题。 荞麦起源于中国，神农书记载，公元前五世纪，荞麦已是栽培的八谷之一。 目前，养麦在世界上分布很广，但主要集中在北半球。养麦有两个栽培品种，一 是1 7 9 1 年定名的f a g o p y r u m t a t a r i c u m ( i i n n ) g a e n c h ( 鞑靼荞麦) ，二是1 7 9 4 年 定名的f a g o p y r u me s c u l e n t u mm o e n c h ( 普通莽麦) 。2 0 世纪8 0 年代，中国科学 家将鞑靼荞麦冠名为苦荞，普通养麦冠名甜养。“。 苦养麦属双子叶蓼科( p o l y g o n a c e a e ) 养麦属( f a g o p y r u m e s c u l e n t u m ) 植物，俗 称苦莽，又名三角麦，也称作野荞麦，学名鞑靼荞麦( f t a r t a r i c u m ) ，是一种药食 两用植物。苦荞在我国境内自然野生的历史已有两千余年之久。苦荞麦耐旱、耐 寒、耐酸、耐脊，生长期短( 九十到一百天左右) ，在我国四川凉山、云贵、晋、冀 高原等处均有分布，年产约一亿公斤“。 目前，实验室研究的用于提取黄酮类化合物的原料有银杏叶、槐花米、芹菜、 柑橘、葛根、荷叶、蜂胶、生姜、花生壳等。”。苦荞营养丰富，蛋白含量达儿一1 5 ， 包括人体必需的8 种氨基酸，含有9 种脂肪酸类物质，其中8 0 是不饱和脂肪酸， 是非常有利于中老年人的食品，且苦荞含有黄酮、硒、镁等有益于人体的物质。”“。 苦荞因生长条件限制，大都分布在我国西部贫困的高寒山区和少数民族居住 地区，全世界每年消耗大量的苦荞，苦荞的茎、叶、根、花、籽粒、壳中均含有 黄酮类化合物“”，而国外早在4 0 年代就把苦养作为黄酮的重要提取原料删。在 荞麦加工中，苦荞壳是产量最大的一种副产品，因而，苦荞壳有望成为一种廉价 的提取原料，用苦养壳提取黄酮类化合物不但能提高产品附加值，而且能带动贫 困地区的经济发展，有利于国家的西部大开发战略。 综上所述：采用合适的提取技术和分离去杂方法对苦养壳中的芦丁、槲皮素 和杨梅素的提取分离具有重要的意义。本文主要通过微波辅助提取和大孔吸附树 脂分离去杂等方法得到总黄酮的提取、分离工艺，对综合开发该资源提供了一定 的参考价值。 成都理e 人学硕士学位论文 1 2 研究现状 1 2 1 苦养壳中的黄酮组分 苦养麦的花、叶、茎、籽粒、壳中均含有一定量的黄酮类化合物，其中花中 的黄酮类化合物含有最高，平均值为7 4 ：叶中含量次之，平均值为5 3 ；茎中 的含量较低，平均值为1 0 。据唐宇、赵刚对2 8 个苦养品种籽粒黄酮含量的测定， 其中含量最高为2 9 1 ，最低的为1 0 7 ”1 ；另外也有报道苦荞壳中黄酮类化合物 是其中籽粒中黄酮含量的3 4 倍嘲1 。 苦养壳中含有的黄酮类有芦丁、槲皮素、杜刺碱、异杜荆碱等。苦荞壳中富 含芦丁，占总黄酮的7 0 一9 0 。 1 2 2 黄酮类化合物的基本结构和分类 黄酮类化合物主要指基本母核为2 一苯基色原酮( 见图1 1 ) 的一系列化合物 ”1 。天然黄酮类化合物母核上常有- - o h 、一0 c h 3 等取代基，由于这些助色团的存 在使该类化合物多显黄色，而且结构中具有碱性氧原子，所以过去也曾把黄酮类 化合物称作黄碱素类化合物。 目前黄酮类化合物是泛指两个芳环( a 和b ) ，通过三碳链连结而成的一系列 化合物”，其基本骨架具有g ( a ) 一c 。( c ) 一c 。( b ) ( 见图1 2 ) 的特点。根据中央 三碳链的氧化程度，b 环在环c 上的连接位雹以及三碳链是否构成环状等特点，将 黄酮类化合物进行归类( 表1 1 ) 。 7 6 3 图 12 一苯基色原酮( 黄酮) f i g u r e1 12 - p h e a y ! - , c h r o m o t l e ( f l a v o n e ) 2 7 6 5 4 图1 2c r c r c 。 f i g u r e1 2c 6 - c 6 - c 6 4 5 尹。 页 婶 第一章引言 表1 - 1 黄酮类化合物的结构 t a b l e 1 - lc h e m i c a ls l l u c b r r e so f f l a v o n o i d s 黄酮类化合物( f l a v o n o i d ) 基本结构 查耳酮( c h a l c o n e s ) 二氢奁耳酮( d i h y d r o c h a l c o n e s ) 橙酮( a u r o n e s1 黄酮( f l a v o n e s ) 黄酮醇( f l a v o n o l s ) 二氢黄酮醇( d i h y d r o f l a v o n o l s ) 黄烷酮( f l a v a n o n e s ) 黄烷醇( f l a v a n o l s ) 黄烷二醇( f l a v a n d i 0 1 ) 花青素，花色素( a n t h o c y a n i d i n l 异黄酮( i s o f l a v o n o i d s ) 二黄酮( b i f l a v o n o i 原花色素( p r o a n t h o c y a n i d i n s ) 喵 3 成都理i ：人学硕十学伉论文 1 2 3 黄酮类化合物的性质 1 2 3 1 黄酮类化合物的溶解性 黄酮类化合物的结构及存在状态使溶解度有显著差异。一般游离苷元难溶或 不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中。其中黄 酮、黄酮醇、查耳酮是平面型分子，因分子堆砌较紧密，分子间引力较大，故更 难溶于水，而二氢黄酮及二氢黄酮醇等，因系非平面型，故排列不紧密，分子间 引力降低，有利于水分子进入，因而对水的溶解度稍大。多数苷类因以离子形式 存在，具有盐的通性，故亲水性较强，偏向于较大的水溶性。黄酮类分子中具有 的羟基可提高在水中的溶解度。由于它们多数都具有酚羟基，因此纯的苷或苷元 都较易溶于碱性有机溶剂毗啶、二甲基甲酰胺等。羟基经甲基化后，则增加在有 机溶剂中的溶解度。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，但难溶 或不溶于苯、氯仿等有机溶剂，糖链越长，则水中溶解度越大。 1 2 3 2 黄酮类化合物的特征反应 各类黄酮化合物与镁粉盐酸、锌粉盐酸、钠汞齐盐酸、硼氢化钠、五氯化 锑、乙酸镁、三氯化铝、氢氧化钠等试剂产生特征颜色。黄酮类的颜色反应多与 分子中的酚羟基及y 毗哺酮环有关。在早期的研究工作中，常以这些特征颜色反 应定性地判断黄酮类化合物的存在和类别。黄酮类化合物的显色反应如表1 2 所 示。 表1 2 各类黄酮类化合物的显色反应 t a b l e1 2 t h ec o l o r i n gr e a c t i o n o f f l a v o n o i d s 注：。表示有荧光 4 第章引言 1 2 3 3 黄酮类化合物的生物活性 ( i ) 黄酮类化合物在心脑血管系统的作用 ( i i ) 黄酮类化合物的抗癌作用 ( i i i ) 黄酮类化合物对神经、内分泌、免疫系统的作用 ( i v ) 黄酮类化合物对消化呼吸系统的作用 1 2 4 总黄酮提取工艺的研究进展 1 2 4 1 溶剂提取法 溶剂提取法包括热水提取法、醇提法和碱性水或碱性稀醇提取法。热水仅限 于提取黄酮甙类，在提取过程中要考虑加水量、浸泡时间、煎煮时间及煎煮次数 等因素。此工艺成本低，安全，适合于工业化大生产。 醇提法与醇的浓度有极大关系，高浓度的乙醇( 如9 0 9 5 ) 适宜于提取黄 酮甙元，6 0 左右浓度的乙醇适宜于提取黄酮甙类。 由于黄酮类成分大多具有酚羟基，因此可用碱性水( 如碳酸钠、氢氧化钠、氢 氧化钙水溶液) 或碱性稀醇( 如5 0 的乙醇) 浸出，浸出液经酸化后析出黄酮类化合 物。 1 2 4 2 超滤法 控制超滤膜孔径大小能有效除去煎液中大分子物质，选用适宜孔径的超滤膜 是提高产品收率和质量的关键。超滤技术的主要特点是分离过程无相变化，耗能 低，分离率高。 1 2 4 3 超声提取法 超声波提取( t h eu l t r a s o u n d a s s i s t e de x t r a c t i o n ) 是近年来应用于中药有效成分 提取分离中的一种手段。原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分溶出， 另外超声波次级效应，如机械震动乳化、扩散、击碎、化学效应等，也能加速提 取成分的扩散、释放并与溶剂充分混合而利于提取。超声波提取法最大的优点是 提取时间短、温度较低、收率高，并且可以为中药大规模生产的提取分离提供合 理化生产工艺、流程及参数i 川。 超声波提取法在中药有效成分提取中的应用已经显示出明显的优势，超声波 技术在中药有效成分提取的不同阶段产生不同作用，这一点对提取方法落后、生 产周期长的中药大规模生产，在提供更科学的工艺条件方面有推广的价值。但超 5 成都理1 ：大学硕+ 学位论文 声波作用的时间和强度需要一系列实验来确定，超声波发生器工作噪声比较大， 需注意防护，工业应用有一定困难。而且在大规模提取时效率不高，故常作为一 种强化或辅助手段。 1 2 4 4 微波提取法 ( 1 ) 微波性质及其微波萃取研究进展 1 9 9 2 年1 0 月在荷兰的布鲁克伦召开了首届微波化学大会。这一规模盛大具 有历史意义的会议的召开，标志着微波化学这一新的交叉科学的诞生。 微波是频率大约在3 0 0 m h z - 3 0 0 g h z ，即波长在1 0 0 c m - l m m 范围内的电磁 波，它位于电磁波谱( 光波) 和无线电波之间。微波是一个十分特殊的电磁波段，其 性能近似太阳光的性质，波速与光速相同，都为3 1 0 8 m s ，波长为1 2 2 4 c m ，振 荡频率为2 4 5 亿次s 。 微波作为一种电磁波，具有电磁波的诸如反射、透射、干涉、衍射、偏振以 及伴随电磁波进行能量传输等特性，这就决定了微波的产生、传输、放大、辐射 等都不同于普通的无线电和交流电。在一般的条件下，微波可方便地穿透某些材 料，如玻璃、陶瓷、某些塑料( 如聚四氟乙烯) 等。微波也可以被一些介质材料，如 水、碳、橡胶、食品、木材和湿纸等吸收而产生热，因此，微波作为一种能源在 家用、工业、科研和其他许多领域获得广泛的应用。 微波具有以下的一些特性：( 1 ) 直线性：象可见光一样沿直线传播；( 2 ) 反射特 性：遇到某些物体( 如金属) 就反射，类似镜子反射光波；( 3 ) 吸收特性：微波在类 似水等极性介质中间传播时，大量的微波能很容易被吸收而变成热能，因此可以 对液体进行加热，而化学分析所涉及的样品处理大多在液相进行，因此微波技术 可以得到充分应用并大大加快化学反应速度；( 4 ) 穿透性：微波可以穿透玻璃、陶 瓷、聚乙烯、纸等绝缘物体，这些物质介质损耗小，分散系数低，微波在此中间 传播时，只有少量的微波能被吸收，因此能量损耗很少。但介质热传导通常导致 反应器具温度升高；( 5 ) 辐射特性：微波频率很高，辐射效应非常明显，如果微波 在普通导线上传输时，伴随着能量不断向周围辐射，微波将很快衰减，所以微波 对传输元件有特殊要求。 微波萃取，亦称微波辅助萃取是指主要应用微波的热效应对样品及其有机溶 剂进行加热，将待测组分从样品基体中提取出来的一种方法。 1 9 8 6 年，g a n z l e r i 7 | 等首次发表了用微波进行溶剂萃取。文中探索了从土壤、 种子、食物以及饲料中提取各类化合物，他们用微波加热样品及溶剂3 0 秒后，将 容器浸入冰浴冷却2 5 分钟，然后再进行微波加热，如此重复5 次，以得到最 佳萃取率。 6 第一章引言 自1 9 9 7 年至今，国外有关微波萃取的研究报道快速递增。不仅在方法上有 了一定的突破，在研究领域上也扩展到环境、食品、生物医药、天然植物、石油 化工和矿物等各个方面。但是从已报到的文献可以看出，国内有关微波萃取的领 域大多还应用于食品和环境分析上，近两年来有关天然植物的微波萃取的文献报 道逐渐增多。众所周知，我国盛产中药，作为一种天然植物，中药有着特殊的地 位。微波萃取法的兴起正为中药有效成分的提取提供了很好的手段。微波萃取技 术是一种新兴的萃取技术，虽然起步只有短短几年时间，理论上还有待于深一步 地研究，但已有的研究成果已足以显示其种种优越性。王立娟”1 等利用微波辅助 碱溶酸沉从槐米中提取芦丁的最佳工艺条件。粗产品的得率为2 2 4 ，纯度为 6 1 1 。龚盛昭“微波场协同提取芦丁的研究，得到了微波场协同提取芦丁的最 佳工艺条件：m ( 水) m ( 槐米) = 1 6 ，时间1 0m i n ，微波功率2 9 6w 提取2 次。过滤， 滤液用( h c l ) = 10 9 6 的盐酸调p h = 2 3 ，加入表面活性剂t w e e n 2 0 促进芦丁析出， 静置3 0m i n 使沉淀完全。分离出沉淀，水洗滤饼干燥后即得芦丁粗产品，产率约 为1 7 1 ，( 芦丁) = 9 4 1 。 ( 2 ) 微波萃取的原理 微波萃取实际上主要是微波对萃取溶剂及样品的加热作用，它能够穿透萃取 溶剂和物料使整个系统更加均匀地加热：从微观上讲，微波所产生的电磁场加速 样品向萃取溶剂界面的扩散速率。微波萃取的机理可从两方面考虑：一方面，微 波所产生的电磁场加速被萃取部分成分向萃取溶剂界面扩散速率，用水作溶剂时， 在微波场下，水分子高速转动成为激发态，这是一种高能量不稳定状态，或者水 分子气化，加强萃取组分的驱动力；或者水分子本身释放能量回到基态，所释放 的能量传递给其他物质分子，加速其热运动，缩短萃取组分的分子由样品内部扩 散到萃取溶剂界面的时间，从而使萃取速率提高数倍，同时还降低了萃取温度， 最大限度保证萃取的质量。 另一方面，微波能是一种由离子迁移和偶极子转动引起分子运动的非离子化 辐射能。当它作用于分子上时，促进了分子的转动运动，分子若此时具有一定的 极性，便在微波电磁场作用下产生瞬时极化，并以2 4 5 亿次秒的速度做极性变 换运动，从而产生键的振动、撕裂和粒子之间的相互摩擦、碰撞，促进分子活性 部分( 极性部分) 更好地接触和反应，同时迅速生成大量的热能。由于吸收微波能， 细胞内部温度迅速上升，使其细胞内部压力超过细胞壁膨胀承受能力，细胞破裂。 细胞内有效成分自由流出，在较短的时间内萃取介质被捕获并溶解。 ( 3 ) 微波萃取的特点 微波加热是直接穿透容器，容器中的溶剂与样品吸收微波直接升温，以达到 加热的效果，具有加热速度快、加热均匀、无温度梯度、无滞后效应等特点，样 品与溶剂在很短得时间内便可以升温到很高的温度，它比常规加热法一般要快 7 成都理1 ：人学硕十学何论文 1 0 - 1 0 0 倍。 第一，瞬间产生高温，萃取时间短。 第二，加热均匀。 第三，微波加热具有选择性，可通过选择适当的溶剂提高萃取效率。 第四，伴随着生物效应。 1 2 4 5 超临界流体萃取法 超临界流体( s u p e r c r i t i e a lf l u i d ，简称s c f ) 一般用临界温度和临界压力的形式 来定义。s c f 不同于一般的气体，也有别于一般的液体，它兼有气体和液体的双 重特性，扩散系数大，粘度小，渗透性好，与液体溶剂相比，可以快速完成传导， 达到平衡，实现快速分离。 超l 临界流体萃取( s u p e r c r i t i e a lf l u i de x t r a c t i o n ，简称s f e 或s c f e ) 的原理是利 用超l 临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解 能力的影响而进行的1 4 0 l 。 世界上最早把超临界萃取技术大规模应用于工业化生产的是德国。1 9 7 8 年德 国建立工厂用于咖啡豆中咖啡因的脱除1 4 1 , 4 2 i 。c c h 是常用的超临界流体，超临界 c 0 2 作为萃取剂，具有诸多优点：c 0 2 的临界温度为3 1 0 6 ，临界压力为 7 1 4 m p a ，超临界状态易于实现；安全无毒，且萃取分离一次完成，无溶剂残留； 是惰性气体，操作安全，价廉易得；萃取可以在室温附近的温和条件下进行，对 易挥发组分或生理活性物质破坏很小，适于天然活性成份的萃取；溶剂和溶质分 离方便，只需改变温度和压力就可以实现溶质和溶剂的分离，操作简便1 4 “。郭 月英1 4 4 i 用超临界c 0 2 萃取苦养壳黄酮，由正交试验结果知，最大萃取率为 o 2 0 1 ；得较优组合为：萃取时间4 h 、萃取温度3 5 、固液比1 ：1 0 、萃取压力 2 5 m p a 。李守君”等用超临界萃取养麦中芦丁最佳工艺条件的研究：萃取时自j 为 1 0 0 m i n ；萃取温度为3 5 ；萃取压力为3 5 m p a 。在最佳条件下的萃取率为8 0 左 右。 1 2 5 黄酮类化合物的分离、纯化方法进展 1 2 5 1 铅盐沉淀法 在中药的乙醇或甲醇提取液中加入饱和的中性乙酸铅水溶液，可使具有邻二 酚羟基或羧基的黄酮类化合物沉淀析出；如果中药的乙醇或甲醇提取液中所含的 黄酮类化合物不具有上述结构，则加中性乙酸铅发生的沉淀为杂质，过滤除去， 再向滤液中加碱式乙酸铅，可使其它黄酮类化合物沉淀析出。 8 第一章引言 滤取黄酮类化合物的铅盐沉淀，悬浮于乙醇中，通入h 2 s 进行复分解，滤除 硫化铅沉淀，滤液中可得黄酮类化合物。由于初生态的硫化铅沉淀具有较高的吸 附性，故多不用h 2 s 脱铅，而用硫酸盐或磷酸盐，或用阳离子交换树脂脱铅。 1 2 5 2 柱层析法 分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚酰胺及纤维粉等。此外， 也有用氧化铝、氧化镁及硅藻土的。 1 2 5 3 高效毛细管电泳法( h p c e l 近几十年来发展很快的高效毛细管电泳( g p c e ) 是一种高效分离技术，它具 有高效、快速、进样体积小、溶剂消耗少和抗污染能力强等特点。它以高压产生 的强电场为驱动力，以小内径的石英为分离通道，依据各组分之间电泳淌度或分 配系数大的差异实现分离。最近几年用于黄酮类物质的分析较多的是毛细管区带 电泳( c e c ) 和胶束电动毛细管色谱( m e c c ) 。 1 2 5 4 高效液相色谱法( h p l c l h p l c 法具有分离效果好，准确性好，分析速度快及仪器自动化程度高等特 点。尤其适合于挥发性低、热稳定性差、分子量大及离子型化合物的分析，已广 泛用于天然产物的分析。黄酮类化合物的h p l c 分析通常用反相c 1 8 色谱柱， 由于黄酮分子中存在酚羟基，流动相中加入少量的酸可以改变峰型。近年来，已 经有很多人用高效液相色谱法来对黄酮类化合物进行分离分析。 1 2 6 黄酮类化合物的定量测定和结构鉴定方法研究进展 1 2 6 1 利用分光光度法进行总黄酮的含量测定 在含有黄酮类化合物的溶液中加入某种金属离子，这样母核中某些位置上的 h ( 如3 、5 位上) 为羟基所取代时常能与金属离子形成络合物，如黄酮( i i ) 、黄酮 醇( i i i ) 。此外，在b 环上任何有相邻的两个羟基存在时同样也会产生络合作用。 这些金属离子有a 1 3 叫翩、z f 4 + i j 5 i 、t i 4 + i 蚓等。但由于3 + 便宜易得。所以是最常 使用的诊断试剂。黄酮类化合物与金属离子形成的络合物一般为黄色或橙色。因 此也就存在着当用诊断试剂并控制适当条件时，用可见分光光度法，通过 l a m b e r t - b e e r 定律的数学运算测定出黄酮类化合物含量的可能。 实践证明，采用分光光度法测定黄酮类化合物含量重复性好、准确、简便、 9 成都理l ：大学硕十学能论文 易掌握、不需复杂的仪器设备，所需试剂也便宜易得。因此，选用此法作为药品 生产中质量检测是行之有效的。 1 2 6 2 利用紫外光谱分析黄酮类化合物的结构 近二十年来对黄酮类化合物的紫外光谱研究较多，各类黄酮的光谱均具有特 征的吸收谱图，当环上具有含氧取代基，如羟基、甲氧基和糖苷等时，其吸收带 的波长与强度变化往往与取代基的数目和位置有关，并有一定的规律性。此外， 这类化合物在甲醇钠或乙醇钠( 或氢氧化钠) 、乙酸钠、三氯化铝、三氯化铝盐酸、 硼酸乙酸钠等试剂作用下，紫外光谱的吸收带改变亦与结构有一定的相关性，这 方面已积累很多数据及规律性，因此紫外光谱对黄酮类化合物结构鉴定有重要的 价值。 1 2 6 3 利用n m r 光谱分析黄酮类化合物的结构 利用1 h n m r 和”c n m r 分析黄酮类化合物结构，简便而快速。多将黄酮类 化合物作成三甲基硅醚衍生物，溶于四氯化碳中进行测定。该衍生物的核磁共振 信号一般发生在9 q ) p p m 之间。 1 2 6 4 利用m s 分析黄酮类化合物的结构 在测定黄酮类化合物的配基和营的结构方面，电子轰击质谱法是一种有效的 方法。特别是在可利用的化合物样品量很少( 即低于l i n g ) 的时候。这种方法成功地 用于各种黄酮化合物的配基。多数黄酮类化合物甙元因分子离子峰( m - 3 较强，往 往成为基峰，故一般无须作成衍生物进行测定，但是当采取气相一质谱( c , - c m s ) 联用手段进行分析时，为了提高样品的挥发度，则须作成甲醚衍生物等。黄酮类 化合物的甙类如不作成衍生物，则其分子离子峰一般难以看到。甚至其全甲基化 及全乙酰化衍生物，也只能给出个低强度的分子离子峰。除了分子离子峰外， 黄酮类化合物甙元也常常生成 m 1 1 + ， m h 】主峰。如为甲基化衍生物，则可以得 至r j m 1 5 + ，【m c h 3 】离子。黄酮类化合物的化学结构有一定的规律性，许多中药 中分离出的黄酮类化合物大多是已知化合物或其衍生物。因此，根据紫外光谱、 核磁共振谱和质谱以及它们的理化常数，一般能顺利地进行鉴定和结构测定，如 果有必要的话，还要通过化学降解或合成方法来阐明结构。 1 0 第一章引言 1 3 研究思路 苦荞壳首先经过烘干、粉碎等前处理过程后，进行提取苦养总黄酮实验，经 过传统提取、辅助提取等方法，比较苦荞总黄酮的提取率和提取条件，优选微波 辅助提取作为重点研究。在大孔吸附树脂纯化去杂过程中，选择多种大孔树脂进 行静态吸附比较，把其中效果理想的d 1 0 1 树脂进行动态吸附实验来选取最优因 素条件。在高效液相色谱分离苦养黄酮实验过程中，选取液相色谱的流动相和色 谱柱最佳分离条件，最后，通过h p l c m s 联用技术鉴别苦荞壳中黄酮化学组分。 整体工艺流程如下： 成都理i ：人学硕+ 学何论文 第二章实验部分 2 1 实验仪器与试剂 2 1 1 实验仪器 k q 5 2 0 0 d b 型数控超声波清洗器：，昆山市超声仪器有限公司( 频率；4 0k h z ) w p 8 0 0t l2 3 k3 微波炉：g a l a n z f r 2 微波萃取罐：四川省分析测试研究所 高效液相色谱：日本岛津( s h i m a d z u 、带光电二极管阵列检测器) 色谱柱：s c i e n h o m e 柱( 4 6 x 2 0 0l n l t l ，5 啪，h a n b o ns c i e n c e & t e c h n o l o g y c o ，l t d ) ；o d s y w g 柱( 1 5 0 4 6 l l l l n ，1 0 1 j a n ，大连伊利特) 质谱：a g i l e n tg 1 9 5 6 a v l a p 一0 1p 手提式真空泵：天津奥特赛恩斯仪器有限公司 2 0 0 1 a 恒温干燥箱：上海试验仪器厂， d z k w - 4 屯子恒温水浴锅： 北京中兴伟业仪器有限公司， 1 0 3 四两装高速中药粉碎机：瑞安市永历制药机械有限公司， 7 2 1 分光光度计：四川仪表九厂 k s - i 康氏振荡器：江苏亿通电子有限公司 s h a c 恒温水浴振荡器：江苏正基仪器有限公司 2 i 2 实验材料及试剂 苦荠壳( 四川省凉山自治州) 芦丁( 纯度9 5 ，上海试剂二厂) 槲皮素( h p l c 用纯度为9 7 3 ，中国药品生物制品检定所) 杨梅素( 纯度9 5 ，f l u k a 公司) 色谱用甲醇( 色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心) 无水乙醇( 分析纯，上海有机化工试剂研究所) 色谱用水( 乐百氏纯净水) n a n 0 2 、a i ( n 0 3 ) 3 、n a o h 、甲醇、磷酸、无水乙醇均为分析纯； n k a 9 、x 一5 树脂( 南开大学化工厂) d i o ! 树脂( 天津市光复精细化工研究所) y w d 0 7 d 树脂( 河北沧州远威化工有限公司) h p d 4 5 0 、h p d 6 0 0 树脂( 河北沧州宝恩化工有限公司) 。 第二章实验部分 2 2 总黄酮提取实验 2 2 1 样品的前处理 苦荞壳放入烘箱中7 0 烘干2 4h ，机器粉碎样品3 0 - 3 0 0 目之间，冷却放 入干燥器用于实验。 2 2 2 配制芦丁标准溶液 准确称取芦丁标准品o 0 1 5 2g ，用3 0 7 , 醇溶液溶解于5 0m l 容量瓶中。分 别准确吸取芦丁标准溶液0m l 、o 2 5 0m l 、o 5 0 0m l 、1 0 0 0m l 、2 0 0 0m l ，分 别置于1 0 m l 比色管中，依次加入3 m l 3 0 乙醇，o 3 m l 5 n a n 0 2 溶液，摇匀， 静置5r a i n 后加入o 3m l1 0 a 1 ( n 0 3 ) 3 溶液，摇匀，静置6m i n 后加入2m i a n a o h 溶液，摇匀，用3 0 的乙醇溶液稀释至刻度，静止1 0m i n ，以试剂为空白， 用o 5c m 比色皿于5 0 61 1 n l 处测定吸光度值a ，绘制标准曲线图。 得到标准曲线回归方程：y = o 0 1 1 8 x + 0 0 4 6 8 相关系数：r = 0 9 9 9 9 根据标准方程可以推导出x ：y - 0 0 4 6 8 ，x 为物质浓度( 单位为m g ，l ) ，yf 1 1 奠ja 0 0 1 1 8 、。9 。 提取率：墨兰! ! ! ! ! ：! 竺l o o 2 ，2 3 实验步骤 准确称取一定量( 水浸提、乙醇浸提、超声波辅助提取的样品取样量为1g ， 微波辅助提取的样品取样量为4 0 0m g ) 经前处理样品，加入浸提液，按不同方法进 行浸提，浸提液趁热抽滤后，使用浸提液浓度定容到5 0m l 容量瓶中、摇匀，准 确吸取1m e , 置于1 0i i l l 比色管中，接下步骤同标准溶液配制方法。 2 2 4 水浸提取总黄酮正交实验 选取三因素三水平正交试验表( b ( 3 3 ” 堕塑望查兰堡兰堡堡苎 表2 - 1 水浸提取正交实验 t a b l e2 - 1o r t h o g o n a le x p e r i m e n t a ll 9 ( 3 3 ) r e s u l to f w a t e re x t r a c t 实验编号 浸捉温度( )浸提时间( h )液吲比提取率 水提取的最佳条件参数为：温度7 0 * ( 2 ，浸提4h ，液固比为1 0 ：1 ，最高提取 率0 8 6 。 2 2 5 乙醇浸提提取总黄酮正交实验 选取四冈素三水平正交试验表( b ( 3 4 ) ) 表2 - 2 乙醇浸提取正交实验 t a m e2 2o r t h o g o n a le x p e r i m e n t a ll 9 ( 3 4 、r e s u l to f a l c o h o le x t r a c t 实验编号浸提温度乙醇浓度( )浸提时( h )液蚓比 提取率 ( ) 15 0 6 021 0 ：10 6 8 25 0 7 541 5 ：10 8 1 3 5 09 562 0 ：l0 6 0 46 0 6 042 0 ：11 2 2 56 0 7 561 0 ：10 7 7 6 6 09 521 5 ：l0 6 5 7 7 0 6 061 5 ：10 9 2 87 07 5 22 0 ：10 7 8 9 7 09 541 0 ：10 4 4 乙醇提取最佳条件参数为：温度6 0 、乙醇浓度为6 0 、浸提4h 、液固比 2 0 ：1 。最高提取率为1 2 2 。 2 2 6 超声波辅助提取工作频率：4 0k h z 2 2 6 1 溶剂种类比较 1 4 第二章实验部分 表2 - 3 溶剂种类实验比较 t a b l e2 - 3c o m p a r i s o no f d i f f e r e n tk i n d so f s o l v e n t 条件：有机试剂浓度6 0 ；温度3 0 ；时间3 0 m i r ap h = 8 ：液同比2 0 ：1 c o n d i t i o n s ：c o n c e n t r a t i o no f o r g a n i cr c a l 筘n t6 0 3 0 ，3 0m i n , p h = 8 ，r a t i oo f s o l m i o nt os o l i d2 0 ：1 从上表可以看出使用甲醇、乙醇的吸光度和提取率相差不大，但从甲醇和乙 醇的价格、有无毒性和沸点的角度考虑来进行选择有机溶剂。我们选择乙醇作为 有机溶剂来提取。 2 2 6 2 乙醇浓度 表2 - 4 溶剂浓度对提取率影响 t a b l e2 - 4e f f e c to f s o l v e n ts t r e n g t ho ne x t r a c t i o nr a t e 02 04 06 0即1 0 0 乙醇浓度( ) c o n c e n t r a t i o n0 fe t h a n o l 图2 - 1 乙醇浓度对提取率的影响 f i g 2 1e f f e c to f c o n c e n t r a t i o no f e t h a n o io ne x t r a c t i o nr a t e 条件：3 0 ，3 0m i n ，p h = 8 。液固比2 0 ：1 c o n d i t i o n s ：3 0 3 0m i n , p h = 8 r a t i oo f s