（外科学专业论文）lrp16在子宫内膜癌中的表达及临床意义.pdf

厂一_ 剐螋 l r p l6 在子宫内膜癌中的表达及临床意义 摘要 目的：探讨l r p l 6 在子宫内膜癌中的表达与临床病理间的关系， 及l r p l 6 与e c a d h e r i n 在子宫内膜癌中的关联。方法：随机采集临 床2 6 例子宫内膜癌组织及1 0 例正常子宫内膜组织。( 1 ) 采用逆转录 聚合链式反应方法( r t p c r ) 测量l r p l 6 m r n a 在子宫内膜癌组织和正 常内膜组织中的表达；( 2 ) 采用免疫组织化学s p 法检测l r p l 6 蛋白 和e c a d h e r i n 在子宫内膜癌组织中的表达。结果：( 1 ) 在2 6 例子宫 内膜癌组织中l r p l 6 m r n a 呈阳性表达者2 1 例，其阳性表达率为 8 3 3 3 ，表达水平o 8 2 o 2 1 ：1 0 例正常组织中l r p l 6 m r n a 呈阳性表达 者3 例，阳性表达率为3 0 ，表达水平o 4 7 o 1 8 ，两者差异有统计学意 义( p = o 0 1 2 ，p o 0 5 ) ( 2 ) l i u l 6 核阳性表达率为6 1 5 4 ( 1 6 2 6 ) ，浆阳性 表达率9 6 1 5 ( 2 5 2 6 ) 。e r a 阴性患者中l i 冲1 6 核阳性率为8 5 5 6 ， e r a 阳性患者中核阳性率为5 2 6 5 。两者差异具有显著性( p o 0 5 ) 结论：子宫内膜癌中 l r p l 6 m r n a 表达明显高于正常内膜组织( p o 0 5 ) 关键词：l r p l 6 ，e c a d h e r i n ；子宫内膜癌；m r n a ；免疫组织化 学：r t p c r 。 t h ee x p r e s s i o na n dc l i n i c a ls i g n i f i c a n c eo fl r p l 6 i n e n d o m e t r i a ic a n c e r a b s t r a c t ：o b j e c t i v e ：7 r oe x p l o r em er e l a t i o n s h i po fe x p r e s s i o no f l r p16 a n dc i i n i c o p a t h o l o g i cf e a t u r e sa n di n v e s t g a t et h ec o r r e l a t i o nb e t w e e n e x p r e s s i o no fl r p l6a n de - c a d h e r i ni ne n d o m e t r i ac a n c e r m e t h o d s ：2 6 e n d o m e t r i a lc a n c e rt i s s u e sa n dlon o m a le n d o m e t r i at i s s u e sw e r e c o l l e c t e dr a n d o m l y t h ee x p r e s s i o n so fl r p 16 n 1 r n aw e r ee x a m i n e db y r e v e r s et r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n( r r - p c r ) i n2 62 6 e n d o m e t r i a lc a n c e ra n d10n o m a le n d o m e t r i u m ， t h ee x p r e s s i o no f l i t p16a n de c a d h e r i nw e r ee x a m i n e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t 叫i nt h e 2 6e n d o m e t r i a lc a n c e rt i s s u e s r e s u l t s ： ( 1 ) t h e p o s i t i v e r a t e so f l r p l 6 m r n aw e r e8 3 3 3 i ne n d o m e t r i a lc a n c e ra n d3 0 i nn o r n l a l e n d o m e t r i u mr e s p e c t i v e l y ，t h el e v e lo fl r p 16 m r n aw e r eo 8 2 士0 21i n e n d o m e t r i a lc a n c e ra n do 4 7 士o 18i nn o m a le n d o m e t “u mr e s p e c t i v e l y ； t h ed i f 瓷r e n c ew a ss i g n i n c a n t ( p o 0 5 ) c o n c l u s i o n s ：p o s i t i v er a t eo f l r pl6 i ne n d o m e t r i a l c a n c e rw a s h i 曲e r t h a ni nn o m a l e n d o m e t r i u m ，l i 心16e x p r e s s i o ni nt h ec ”o p l a s mm a y b ec o r r e l a t e dw i t h g o o dp r o g n o s i s ，l r p 16e x p r e s s i o ni nt h en u c l e u sm a yb ec o r r e l a t e dw i t h b a dp r o g n o s i st h e r e w a sn o s i g n i f i c a n t l y d i f e r e n c eb e 似e e n l r p 16 e x p r e s s i o na n de - c a d h e r i ne x p r e s s i o ni ne n d o m e t r i a l c a n c e r k e y w o r d s ：l i 之p l6 ，e c a d h e r i n ，e n d o m e t r i a l ，c a n c e b l u 卜p c r ，i m m u n o h i s t o c h e m i s t 叫 擎一雌 球共 病例 长期 要集 内膜 容易 参与 子宫内膜癌的发生与发展印1 。目前研究较多的，与雌激素关系紧密的 基因l i 冲1 6 是从健康成人外周血淋巴细胞中克隆的一个人类基因，通 过n c b i 提供的s a g e ( s e r i a la n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n ) 数据库 对该基因进行系列表达分析，显示该基因在人类多种肿瘤细胞中的表 达量均明显高于其正常组织，提示l r p l 6 与人类多数肿瘤的发生发展 相关，且可能受到雌二醇的调控。7 1 。近年对其进行了大量的研究， 结果表明l r p l 6 基因是e r 信号通路上的应答基因，雌激素能刺激l r p l 6 的表达。在l r p l 6 基因对雌激素依赖性乳腺癌研究中发现，较低浓度 的雌二醇即可明显增加e r a 阳性的乳腺癌m c f 7 细胞l i 冲1 6 m r n a 的表达水平，而雌二醇在e r a 阴性的c o s 7 细胞中对l i 冲1 6 m r n a 的 表达无调节作用，构建l r p l 6 启动子控制的荧光素酶报告子并与一系 列核受体共转染c o s 一7 细胞，结果发现l r p l 6 主要受e r a 的调控，提示 4 雌激素通过激活雌激素受体上调乳腺癌m c f 7 细胞中l r p l 6 基因 m r n a 水平皿 。 钙粘蛋白是粘附分子家族中的一员，钙依赖性细胞间粘着是细胞 膜正常形态的形成和维持所必需的，而肿瘤细胞间粘着明显少于非肿 瘤细胞间，故细胞间粘连可能在肿瘤的发生、浸润、转移方面有着重 要意义。上皮细胞钙粘蛋白( e c a d h e r i n ) 是经典的钙粘蛋白，由c d h l 基因编码，定位于染色体1 6 q 2 2 1 ，是最早认定的抑制侵袭基因之一， 其表达下调或缺失被证明促进肿瘤的侵袭和转移，研究证实c d h l 基凶在弥散性胃癌，小叶性乳癌和子宫内膜癌中均有突变，可能在基 因水平下调e c a d h e r i n 的表达从而增强其侵袭转移能力口嵋3 。霄，一。粤 另一研究应用w e s t e r n 印迹方法，检测了l r p l 6 对乳腺癌转移相关 分子m m p 一2 ，删p 一9 ，c i m 4 和e 一钙黏着蛋白表达的影响，结果在l r p l 6 抑制的m c f 一7 细胞中只有e 一钙黏着蛋白表达上调，提示l r p l 6 通过调节 e 一钙黏着蛋白表达影响肿瘤的侵袭转移凹1 。由此推测在雌激素依赖性r 肿瘤子宫内膜癌的发病中，l r p l 6 基因也起了非常重要的作用。孟元 光等发现雌激素通过激活雌激素受体上调子宫内膜癌i s h i k a w 细胞中 l i 冲1 6 基因m r n a 水平，其高表达能下调e 钙粘着素的表达，从而增 加癌细胞的侵袭能力n0 i ，但尚未在组织中得到证实。 本研究选择我院子宫内膜癌组织为研究对象，用半定量i 讯p c r 法检测正常内膜组织及内膜癌组织中l r p l 6 删 a 表达差异，并用 免疫组化方法检测子宫内膜癌中l i 冲1 6 、e c a d h e r i n 的表达，并研究 其相关性，以及l r p l 6 与雌激素受体、组织学分级，临床期别之间 的关系，研究l r p l 6 在子宫内膜癌发病中可能的作用，为子宫内膜 癌发病机制提供理论基础。 材料与方法 1 实验材料 1 1 子宫内膜癌组织 来源于2 0 0 9 年3 月至2 0 1 0 年3 月在泸州医学院附属医院妇科 经宫内膜组织病理学确诊并行手术治疗的患者共2 6 例，平均年龄5 4 5 岁。手术切除后立即取病灶处组织，置于液氮罐中保存。 1 1 正常子宫内膜组织 来源于同期子宫全切除术标本共1 0 例，术前术后病理学证实无 恶性病变存在，平均年龄5 1 4 岁。术后立即取宫内膜组织，并置于 液氮罐中保存。 上述组织经泸州医学院附属医院病理科进行病理学检查结果如 下：l o 例正常宫内膜组织未见病变；2 6 例内膜癌组织病理诊断为高 分化腺癌1o 例，中分化腺癌1 0 例，低分化腺癌6 例，其中e r ( + ) 患 者1 9 例，e r ( 一) 患者7 例；根据2 0 0 9 f i g o 子富内膜癌手术病理分期 i 期1 9 例，i i 期3 例，i i i 期3 例，期1 例。 2 主要实验试剂 2 1r t p c r 试齐0 2 1 1r n a 提取试剂 总r n a 提取试剂盒( 离心柱型) ( t i a n g e n 公司) ；氯仿、无水乙 醇均为国产分析纯市售试剂；d e p c 水( 大连宝生物公司) 2 1 2 逆转录试剂及p c r 试剂 逆转录及p c r 试剂盒购自成都博瑞克生物技术有限公司；引物 由上海生工生物公司合成： 2 1 3 电泳试剂 t b e 液( 上海生工生物公司) ；1 0 0 b pd n al a d d e r ( t i a n g e n 公 司) 等。 2 2免疫组织化学试剂 一抗：兔抗人多克隆l r p l 6 抗体，鼠抗人单克隆e c a d h e r i n 抗体； 二抗：辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体( 北京中山金桥公 司) ；s p 一9 0 0 通用型s p 试剂盒( 武汉博士德生物工程有限公司) 等。 2 3 其它试剂为国产分析纯市售试剂。 3 实验仪器 3 1r t p c r 主要仪器 主要实验仪器包括：s w 二l j i f 超净工作台( 苏州安泰空气技术 有限公司) ；高速低温离心机( 美国科俊) ；m a x i m a s c 型超纯水 仪( 英国e e g ad e m o n 公司) ；a e l 一2 0 0 电子天平( 中国湘仪天平仪 器厂) ；d y y 8 c 型电泳仪( 北京六一仪器厂) ；定量p c r 仪i c y c l e r ( 美国b 1 0 r a d 公司) ；f o r m a 一8 6 cu l tf r e e z e r ( 美国t h e r m o e l e c t r o n 公司) ；8 5 7 1 超低温冰箱( 美国f o m a 公司) ；倒置显微 镜及图像分析系统( 日本o l y m p u s ) ；蛋白质核酸测量仪n d l o o ( 基 因公司) ；凝胶成像及分析系统l a s 3 0 0 ( 日本f u j i f i l m ) 等。 3 2 免疫组织化学主要仪器 主要仪器包括：医用冰箱( 中国容声) ；o l y m p u sb x 一5 0 光学显 微镜( 日本o l y m p u s ) ；d h g 一9 0 7 0 电热恒温鼓风干燥机( 上海益恒实 验仪器公司) ；p h s 一3 c 型酸度计( 成都方舟科技开发公司) ；l e i c a r m 一2 0 3 5 型切片机( 德国l e i c a ) ；c d 一6 多媒体图像分析系统( 中国) 。 3 3 分析数据库及软件 g e n b a n k 核酸数据库，n c b ib l a s t n 分析软件，s c i o ni m a g e 分析软件( s c i o n 公司) ，o l i 9 0 5 0 引物设计软件，p d q u e s t2 d 分 r 析软件( b i o r a d 公司) ，q u a n t i t yo n e 分析软件，e x c e l 和s p s s1 5 o f o rw i n d o w s 数据分析软件。 4 实验方法 4 1实验标本组织的获取和处理 4 1 1r t p c r 标本的获取和处理 手术切除病变子宫后立即在无菌操作下取病变处约 1 o 1 o 1 0 c m 3 体积组织置于无菌冻存管内，立即置于液氮罐中保 存。 子宫全切除患者，子宫切除后立即在无菌操作下取宫内膜组织体 积约1 o 1 o o 5 c m 3 置于无菌冻存管内，立即置于液氮罐中保存。 4 1 2 免疫组织化学标本的处理 上述组织送泸州医学院附属医院病理科常规进行术后病理学检 查，在此进行常规石蜡包埋并切片保存。 4 2r t p c r 实验方法 4 2 1 总r n a 提取 ( 1 ) 将组织块剪碎后加入盛有1 m 1 t r i z 0 1 试剂的e p 管中，进行 匀浆破碎细胞处理，置e p 管于冰上片刻； ( 2 ) 匀浆样品在1 5 3 0 。c 放置5 分钟： ( 3 ) 4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心5 分钟，将上清液移至新的无r n a s e 的离心管中： ( 4 ) 加入o 2 m l 氯仿，盖好瓶盖，猛烈振荡1 5 秒，室温放置3 分钟； ( 5 ) 4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，取上层水相至新的无r n a s e 的离心管中： ( 6 ) 加入o 5 倍体积无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一 重一 起转入吸附柱c r 3 中，4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 秒钟，弃掉收集管中 废液； ( 7 ) 加入5 0 0u1 去蛋白液r d ，4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 秒，弃废 液；加入5 0 0u1 去蛋白液r d ，4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 秒，弃废液； ( 8 ) 加入7 0 0ul 漂洗液r w ，室温静置2 分钟，4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 秒，弃废液； ( 9 ) 加入5 0 0ul 漂洗液r w ，室温静置2 分钟，4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 秒，弃废液； ( 1 0 ) 将吸附柱放入收集管中，4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心2 分钟，去 除残余液； ( 1 1 ) 将吸附柱c r 3 转入新的离心管中，加入4 0u1 r n a s e f r e e d d h 2 0 ，室温放置2 分钟，4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心2 分钟。 将提取的细胞总r n a 置于7 0 超低温冰箱中保存待用。 4 2 2逆转录c d n a ( 1 ) 按逆转录试剂盒说明在冰上配制逆转录反应液( 见表1 ) 表l ：逆转录反应液的组成 t a b l e1 ：s o l u t i o n sf o rr e v e r s e n a n s c r i p t i o nr e a c t i o n 试剂使用量 r e v e r r i r aa c e 5 r t b u f r d n t pm i x t u r e ( e a c hl0 m m ) s u p e r - i u r t - e n h a n c e o l i g o ( d t ) l8 ( 5 0 p m o l 儿) t o t a ir n a r n a s e f r e e h 2 0 1 0 此 4 o 止 2 0 儿 o 5 儿 o 5 皿 1 o 皿 x 儿 ( 1 l - x ) 此 如表1 所示，该逆转录反应体系总体积为2 0ul ，根据提取的 总r n a 的浓度来计算其需要量( 表中用x 表示) ，2 0ul 的反应体系 可最大使用1 u g 的t o t a lr n a 。 ( 2 ) 逆转录条件如下： 厂3 0 。c 1 0 觚n i5 0 3 0 m i n ( 逆转录反应) 1 c y c l e l 9 9 5 m i n ( 逆转录酶的失活反应) l 5 5 m i n ( 3 ) p c r ：选取g a p d h r 为参照物进行相对定量p c r 。 引物设计： 在g e n b a n k 核酸数据库查到目的基因与参照基因序列， o l i 9 0 5 o 软件设计引物，并经n c b ib l a s t n 分析软件验证，符合引 物要求后送上海生工生物公司合成。各基因序列如下( 见表2 ) 。 表2 ：目的基冈和参照基因的引物序列 t a b l e2 ：p r i m e rs e q u e n c eo ft a 唱e tg e n e sa n dr e f e r e n c eg e n e g e n en a m e p r i m e r s t 。( c ) p r o d u c ts i z e p r j m e r - r 5 - t a c c t g a g c a g t c 您g a c - 3 5 7 3 0 1 8 b p l r p l 6 p r i m e 卜f 5 - g a t g t c c t c g t c c t t c t c 一3 5 7 3 1 8 b p p r i m e 卜r 5 - a t gc t gg c gc t ga g tt c gt c - 3 6 1 9 2 0 b p g a p d h p r i m e 卜f 5 一g g tc a tg a g t c ct t cg a t a - 3 6 0 0 7 2 2 b p 其中p r i m e r - r 为上游引物，p r i m e r f 为下游引物，tm 决定着 p c r 反应中退火温度的设定，产物片段长度位于1 5 3 0 b p 之间，符合 引物设计要求。 p c r 扩增： 在逆转录后生成的c d n a 中分别加入l r p l 6 或g a p d h 引物， 同时进行p c r 扩增，对扩增产物进行对比分析。( p c r 扩增体系组 成见表3 ；实验分组情况见表4 ) 表3 ：p c r 扩增体系的组成 t a b l e3 ：s o l u t i o n sf o rp o l y m e f 觞ec h a i nr e a c t i o n 试剂 使用量 c d n a p r i m e r - r p r i m e r f 2 t a qp c rm 觚t e r m i ) ( r n 鼬ef r e e h 2 0 x l 1 0 肛l 1 0 肛i l o p i 8 - x 山 t 0 t a l 、，o l u m 2 0 i 注：p c r 反应系的配制，其中x 的量一般不超过总体系的1 0 。 表4 ：p c r 实验分组情况 t a b l “：d e p a n m e n t so fp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n c d n a 来源加入引物 退火温度 正常宫内 参照组c d n ag a p d h 引物5 6 。c 膜组织组 实验组c d n al r p l 6 引物5 7 。c 子宫内膜 参照组c d n ag a p d h 引物 5 6 。c 癌组织组 实验组c d n al r p l 6 引物 5 7 。c p c r 反应体系： 步骤1 ： 1 c y c l e 9 4 5 m i n 步骤2 ： f 9 4 5 0 s 2 8 c y c t5 6 嚣4 兰s 步骤3 ： 1 c y c l e 7 2 1 0 m i n 取6 止p c r 产物进行2 琼脂糖凝胶电泳( o 5 u m le b 染 1 2 色) 鉴定扩增的p c r 产物，并通过凝胶成像及分析系统对电泳图片 进行拍照及分析。 4 2 3 相对定量的分析方法的建立 在假设目的基因与参照基因的扩增效率一致的前提下，可以用 相对定量方法来比较其在实验组和对照组的差异。分析所拍摄的电泳 图片中分离的各特异扩增条带的原始吸光度( 彳) 值，计算l i 冲1 6 与 g a p d h 的彳值比值，从而得出各组织中l i 冲1 6 m r n a 的相对表达水 平。 4 2 4 图像处理及统计分析 2 琼脂糖凝胶电泳图像采用q u a n t i t yo n e 分析软件定量分析。 实验数据用e x c e l 统计，并用s p s s l 5 of o rw i n d o w s 软件包进行统 计分析，配对均数比较用p a i r e d s a m p l e st 检验，p o 0 5 为差异有统 计学意义。 4 3免疫组织化学实验方法 4 3 1 石蜡切片 所有标本均经1 0 甲醛固定，常规石蜡包埋，选择典型病灶( 或 正常宫内膜组织) 石蜡块以4 岬厚度连续切片3 张，分别进行 l r pl6 ，e c a d h e r i n 抗体免疫组化染色、h e 染色及备用。 4 3 2 免疫组化染色： 采用免疫组织化学中链霉素抗生物素蛋白一过氧化物酶法 ( s t r e p t a v i d i n p e r o x i d a s e ，s p ) 染色。 ( 1 ) 组织切片在6 0 恒温箱里烤片2 h ，取出后立即置于二甲苯中 脱蜡，行梯度乙醇脱苯、水化。( 二甲苯1 1o m i n _ 二甲苯 i i l o m i n _ 1 0 0 乙醇5 m i n _ 9 5 乙醇5 m i n _ 7 5 乙醇5 m i n ) ( 2 ) p b s ( p h 7 4 ) 冲洗3 次，每次5 m i n ( 3 ) 每张切片滴加3 过氧化氢甲醇溶液1 滴，室温孵育3 0 m i n 以 阻断内源性过氧化物酶活性，p b s 冲洗3 次，每次5 m i n ( 4 ) 切片浸泡于柠檬酸缓冲液中( p h 6 o ) ，置微波炉中加热使温度 保持于9 2 1 0 0 ，持续5 m i n 2 次以修复抗原，室温冷却后p b s 冲洗 3 次，每次5 m i n ( 5 ) 滴加正常非免疫性动物血清1 滴，室温孵育3 0 m i n 以封闭非特 异性抗原，甩去多余液体，不冲洗 ( 6 ) 滴加一抗1 滴，4 过夜后p b s 冲洗3 次，每次5 m i n ( 7 ) 滴加生物素标记的第二抗体1 滴，3 7 孵育1 h ，p b s 冲洗3 次，每次5 m i n ( 8 ) 滴加链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶溶液l 滴，3 7 孵育l h ， p b s 冲洗3 次，每次5 m i n ( 9 ) 滴加新鲜配置的d a b 溶液1 滴，显微镜下观察3 1 0 m i n ( 1 0 )自来水冲洗，苏木素复染1 5 m i n ，5 盐酸酒精分化1 m i n ，自 来水冲洗返蓝，上行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显 微镜下观察。( 以p b s 代替一抗作为空白对照) 4 3 3 阳性结果判断：评分标准参照赵亚力等心4 1 报道的方法 e c a d h e r i n 分布于癌细胞膜上，呈棕黄( 褐) 色。l r p l 6 核内、 胞浆内着色分别记录。每张切片低倍镜下选取典型肿瘤部位，高 倍镜( 放大4 0 0 倍) 下观察并拍摄，计数l o o o 个肿瘤细胞，阳性细 胞数量和着色强度分别记录并进行量化处理，结果判定由病理科 两位老师分别测定并统计 ( 1 ) 着色强度按下列标准评分：无色( 阴性) 0 分，淡棕黄色( 弱阳 1 4 性) 1 分，棕黄色( 阳性) 2 分，棕褐色( 强阳性) 3 分。 ( 2 ) 阳性细胞数量按下列标准评分：无阳性细胞记为o 分， 6 0 为3 分； ( 3 ) 上述两者评分之和，o 一1 分者为( 一) ；2 分为( + ) ；3 4 分为( + + ) ； 5 6 分为( + + + ) 。 4 3 4 统计分析 应用s p s s l 5 o 统计软件处理相关数据，采用x 2 检验，t 检验， w 订c o x o n 等级资料两样本的比较法、s p e a 珈a n 等级相关分析。p o 0 5 为差异有统计学意义。 结果 1 正常子宫内膜组织与子宫内膜癌癌组织l r p l6 m r n a 分析 1 1 细胞总i a 抽提结果 2 6 例子宫内膜癌组织及1 0 例正常子宫内膜组织中所提取总i a 均经蛋白质核酸测量仪测定，a 2 6 0 2 8 0 在1 8 2 o 之间( 见图1 、2 ) ， 符合r n a 提取要求。 图l ：用蛋白质核酸测量仪n d l o o ov3 1 2 测量某正子宫内膜组织样本的总i u 蛆 a d i n e 舔u r i n ga p p 盯a _ t i l s 1 3 6 n g u l ，a 2 6 0 - 1 0 3 4 0 ， 提取要求，可继续后继 图2 ：用蛋白质核酸测量仪n d l 0 0 0v3 1 2 测量某子宫内膜癌组织样本的总砌蛆 f i g2 ：t o t a l 砌、i ao fac a n c c rs 锄p i em e 嬲u r e db y 仙c l e p d 0 t e i na d m e 舔u r i i l g 印p a r a l = u s 由图2 可见：该子宫内膜癌组织总i a 浓度为4 2 3 4 n g u l ，a 2 6 0 _ 1 0 5 8 4 ， a 2 8 俨5 4 7 0 ，a 2 砷陀8 0 1 9 3 ，在1 8 2 0 之间，符合i 斟a 的提取要求。 分别取6 此总r n a 进行1 琼脂糖凝胶电泳检验( o 5 “m le b 染色) ，并在紫外光成像系统下拍照分析。( 见图3 ) 图3 ：总r n a 电泳图片( 1 琼脂糖凝胶，0 5 蚓m l 溴化乙锭染色) f 适3 ：1 a g a r o s eg c le l e c 仃0 p h o r c s i s 伽l po f 触l 心认n o m a la n dc a n c e r 1 7 图3 中，1 泳道为正常子宫内膜组织总i 矾a ，2 泳道为子宫内膜癌组织总 r n a 。两泳道均可见2 8 s 、1 8 s 、5 s 三条亮度递减的条带，且2 8 s ：1 8 s - 2 ：l ，说 明总砌蛆提取完整无降解，可以进行后续实验。 1 2r t _ p c r 结果 1 2 1 p c r 产物电泳情况 分别取6 止p c r 产物经2 琼脂糖凝胶电泳( o 5 蚓m l 溴化乙 锭染色) ，紫外光成像并拍照后，可见产物基因片段位于1 0 0 b p 3 0 0 b p 之间。其中参照基因片段约为2 8 0 b p 左右，目的基因片段约为 1 8 0 b p 一2 0 0 b p ，电泳结果显示扩增出的目的基因片段分子量大小与预 期目的基因片段符合( 见图4 ) 图4 ：p c r 产物电泳图片( 2 琼脂糖凝胶，o 5 峙m l 溴化乙锭染色) f i g4 ：2 a g 踟s eg e le l e 咖p h o 佗s i sm a po f 姆锄枷跚g m 即t a t i e db yp c r 图4 中：m 矾瞄( 1 0 0 b pd n al a d d e r ) 处加入m a d ( e r8 此：其余泳道均加入 p c r 产物6 止。a 、b 、c 、e 为子宫内膜癌组织参照基因条带，分子量约为2 8 0 b p ， a 、b 、c 、e 是子宫内膜癌组织目的基因条带；d 、f 是正常子宫内膜组织参照基因 条带，分子量约为2 8 0 b p ，d 、f 是正常子宫内膜组织目的基因条带示，d 有极弱显 示，f 未显示。 1 8 图4 中凝胶图像经凝胶图像分析软件定量分析后可得到以下数 据( 见表5 ) 。对1 0 例正常子宫内膜组织和2 6 例内膜癌组织进行上 述操作并分析其电泳图像后得出如表6 中的结果。在1 0 例正常宫颈 组织中，参照基因条带均可见，其中3 例可见到l r p l 6 目的基因条 带，阳性表达率为3 0 ，表达水平为o 4 7 o 1 8 ；2 6 例内膜癌组织中， 参照基因条带亦均可见，其中2 1 例出现l r p l 6 目的基因条带，阳性 表达率为8 3 3 3 ，表达水平为o 8 2 o 2 l 。 表5 ：电泳条带数据统计分析结果 t a b l e5 ：r e s u l t so f t w o g r o u p se l e c t r o p h o r e s i ss 仃i p s 经s p s s l l 5f o rw i l l d o w s 软件包进行统计分析，采用配对均数比 较p a i r e d s 锄p l e st 检验，p = o 0 1 2 ，p o 0 5 ，内膜癌组织和正常宫内 膜组织中l r p l 6 的m r n a 表达存在统计学差异。 2l i 冲1 6 蛋白在子宫内膜癌中的表达情况 2 6 例子宫内膜癌组织中，l r p l 6 免疫组化阳性表达表现为浅黄色 或棕褐色，主要定位与于胞核或胞浆。在肌层、血管中未见表达( 见 图5 ) 图5 ( a ) ：子宫内膜癌组织中l r p l 6 表达情况( s p 4 0 0 ) f 逸5 ( a ) ：l r p l 6 姐t i b o d yc o 瑚l b i i l i n gs i t e si 1 1 吐l e 印i t l l e l i u mo f e n d o m e 仃i a lc 觚c e r 图5 ( a ) 所指为细胞核内出现棕黄色颗粒的癌细胞 图5 ( b ) ：子宫内膜癌组织中l r p l 6 表达情况( s p 4 0 0 ) f i g5 ( b ) ：l r p16a n t i b o d yc o m b i i l i i l gs i t e si i lt i l e 印i 廿l e l i u mo fe n d 锄e 仃i a lc a n c e r 图5 ( b ) 所指为胞浆内呈棕黄色颗粒的癌细胞 2 0 2 1 子宫内膜癌中l r p l 6 细胞着色水平与e r 的关系 l i 冲1 6 核阳性表达率为6 1 5 4 ( 1 6 2 6 ) ，浆阳性表达率9 6 1 5 ( 2 5 2 6 ) 。e r 阴性患者中l r p l 6 核阳性率为8 5 5 6 ，明显高于e r 阳性患者的5 2 6 5 。( p o 0 5 ) 见表6 。 表6：l r p l 6 在细胞不同部位着色强度与e r a 表达 t a b l e6 ：t h e u p16e x p r e s s i o ni nd i f f e r e n t l o c a t i o n 锄dm ee x p r e s s i o no f e s 仃o g e nr e c 印自叫 70322 + 1 97129 u = 2 u = 0 01 42 6 1 38 2 6 p 0 0 5 ) ( 见表7 ) 表7 ：不同部位l r p l 6 蛋白的表达与临床病理特征 t a b l e 7 ：t h e l r p l 6e x p r e s s i o ni l ld i 毹r e n tl o c a t i o n 锄dt h ec l i l l i cp a t h o i 画刊c h a m c t e r 2 2l r p l 6 蛋白表达与e c a d h e r i n 表达关系 e c a d h e r i n 阳性表达表现为棕黄或棕褐色，表达于细胞膜上，呈 线性分布( 如图6 ) 图6 ( a ) ：子宫内膜癌组织中e c a d h e r m 表达情况( s p 4 0 0 ) ( f i g6 ：e c a d h e 血a n t i b o d yc o m b i n i n gs i t e si l l 廿l e 印i t l l e l i u mo f d o m e n a lc 锄c 砷 图6 所指为细胞膜呈线性棕黄色着色的癌细胞 在2 6 例子宫内膜癌组织中，e c a d h e r i n 有2 例未见染色，弱阳性 表达6 例，中等强度表达9 例，强阳性表达9 例，其在l r p l 6 核表达 及l r p l 6 浆表达中的分布各不相同( 见表8 ) ，根据p e a r m a n 等级相 关分析，在l r p l 6 核表达中，l r p l 6 表达强度与e c a d h e r i n 表达强 度无相关性( 相关系数r = o 1 7 9 ，p o 0 5 ) ，在l r p l 6 浆表达中，l r p l 6 表达强度与e c a d h e r i n 表达强度也无相关性( 相关系数 r = o 0 1 8 ，p o 0 5 ) ( 见表8 ) 表8 ：l r p l 6 在细胞不同部位着色强度与e c a d h e r i n 关系 t a b l e 8 ：t h e l r p16e x p r e s s i o ni nd “诧r e n tl o c a t i o na n dt h ee x p r e s s i o n o fe - c a d h e r i n 讨论 子宫内膜癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，严重威胁女性生命。其 发生机制尚不明确，普遍认为雌激素对正常子宫内膜的刺激以及雌激 素受体的过度表达是导致子宫内膜癌发生与发展的主要因素。越来越 多的研究资料证实雌激素通过其下游靶基因导致子宫内膜癌的发生 与发展，大量研究表明l r p l 6 基因是e r 信号通路上的应答基因，其 表达依赖雌激素，可能与多种激素依赖性肿瘤的发生发展相关。 l r p l 6 ( l e u k e m i ar e l a t e dp m t e i n l 6 ) 是从健康成人外周血淋巴 细胞中克隆并首先在国际g e n b a n k 中登陆的一个新的白血病相关性基 因。该基因定位于第1 1 号染色体长臂第1 1 区，基因e d n a 全长9 8 0 b p ， 含1 1 个外显子，编码3 2 5 个氨基酸，表达蛋白分子量约为3 5 k d ，该基 因主要编码一种核因子n 。5 1 。对其基因启动子顺式调控元件分析显 示：该基因启动子是i i 型真核启动子，该区域既有通用启动子活性， 又具有与肿瘤发生，细胞周期调控和急性反应期蛋白有关的顺式调控 元件，包括s p l ，i l 一6 受体，雌激素受体等。通过n c b i 提供的s a g e ( s e r i a la n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n ) 数据库对该基因进行的系 列表达分析，显示该基因在人类多种肿瘤细胞中的表达量均明显高于 其正常组织，提示l r p l 6 与人类多数肿瘤的发生发展相关，且可能受 到雌二醇的调控。近年对其进行了大量的研究，结果表明l r p l 6 基因 是e r 信号通路上的应答基因，雌激素能刺激l r p l 6 的表达。 为证实l r p l 6 基因过度表达与内源性e r a 阳性的子宫内膜癌之间 的关系，孟光远等采用n o n h e mb l o t 方法检测子宫内膜样腺癌 i s h i k a w a 细胞中l l 冲l6 m r n a 表达水平，结果显示：雌二醇刺激 i s h i k a w a 细胞中l i 冲1 6 m 】刚a 表达水平的上调，而在采用雌激素抑制 剂i c l l 8 27 8 0 培养的对照组中，l r p l 6 m r n a 的表达水平显著下调， 为进一步了解e r a 表达水平对l r p l 6 表达的影响，将e r a 载体瞬时转染 i s h i k a w a 细胞后检测细胞中l l 冲1 6 i n a 表达量，结果提示：增加e r a 促使i s h i k a w a 细胞中的l i 冲1 6 上调，且与e r a 呈剂量依赖性。证实 l r p l 6 是一个雌激素反应性靶基因，雌激素能刺激l i 冲1 6 的表达，同 时证明l r p l 6 表达水平可以反映雌激素的活性状态以及雌激素信号 通路的活跃程度。 近期有研究利用t r a j l s w e l l 方法检测l r p l 6 过表达对子宫内膜癌 侵袋生长能力影响，研究发现：l r p l 6 过表达的i s h i k a w a 细胞穿过生 物基底膜的数量比对照细胞增3 0 ( p o 0 5 ) ，表明l r p l 6 基因高表达增 强了子宫内膜癌细胞侵袭转移能力。另有研究资料表明子宫内膜癌侵袭转 移的分子学机制主要涉及m m p 2 ，m 9 ，c d 4 4 以及e c a d h e r i n 的表达下调 【1 3 。1 51 ，为探讨l i 冲1 6 促进i s h i k a w a 细胞侵袭生长可能的分子机制，检 测l r p l 6 对内膜癌转移相关分子删p 一2 ，m m p 一9 ，c i m 4 和e 一钙黏着蛋白 表达的影响，采用w e s t e mb l o t 方法检测到l i 冲1 6 过表达i s h i k a w a 细胞 中e 钙粘着素基因的蛋白水平显著下调【6 】，由此推测l r p l 6 通过下调 e 钙粘着素水平增加其侵袭能力 1 例。为进一步探讨l r p l 6 基因下调 e 钙粘着素的分子途径，通过检测转染有l r p l 6 的e 钙粘着素启动子 荧光素酶活性来判断l r p l 6 对e 钙粘着素基因转录激活的影响【1 6 。7 1 ， 结果提示：l r p l 6 对e 钙粘着素具有剂量依赖性抑制效应，但在去除 雌二醇的环境中这种抑制作用消失，这表明l r p l 6 通过抑制e 钙粘着 素基因的转录激活下调其基因表达，这种抑制作用依赖于雌激素的活 性。将l r p l 6 ，e r a ，e 钙粘着素启动子d n a 导入i s h i k a w a 细胞中，观 察e r 与e 钙粘着素启动子d n a 之间的相互作用关系。结果在没有外 源性l i 冲1 6 表达组中e r a 与e 钙粘着素启动子的结合明显强于有外 源性l i 冲1 6 的细胞，表明l l 冲1 6 抑制e r a 在e 钙粘着素启动子区的招 募。l i 心1 6 依赖e r a 转录上调及对i s h i k a w a 细胞影响机制如图所剥1 引。 子宫内膜癌组织中l r p l 6 蛋白的表达情况及其与e r a 、e c a d h e r i n 之间的调控关系尚不清楚，目前尚无相关报道，为近一步证实l r p l 6 对