（农药学专业论文）液相色谱串联质谱法检测粮谷中三嗪类除草剂的残留量.pdf

华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 摘要 三嗪类除草剂是一类被广泛应用于农业上，来控制杂草生长的除草剂。此类除 草剂的使用为农业带来了巨大的利益，但其过多和不正确的使用也给环境造成潜在 的危害。由于三嗪类除草剂性质稳定，使用后会残留在作物中，通过生物循环进入 人体中，危害人类的身体健康，许多国家和地区对三嚎类除草剂的残留制定了最高 残留限量标准。 液相色谱一质谱联用法是二十世纪八十年代发展起来的一种分析方法，它结合 了高效液相色谱的分离性能高和质谱检测器灵敏度高、应用范围广且能给出分子量 和结构信息的优点，成为一种强有力的分离分析工具，在化学、医药卫生、食品科 学、生命科学和环境科学等领域引起日益广泛的关注和应用。 本文首先以玉米为研究对象对三嗪类除草剂的多残留检测方法进行研究。通过 对提取、分离和净化条件的摸索，结合固相萃取技术建立了液相色谱一质谱法对玉 米中2 6 种三嗪类除草剂残留量的检测方法： 1 方法选取乙腈作为提取溶剂，用o a s i sm c x 固相萃取柱净化，操作简单方 便，节省了有机溶剂和处理时间，简化了样品的前处理过程。 2 通过优化色谱和质谱条件，完成了对2 6 种三嗪类除草剂的分离，基本覆盖 了绝大部分三嗪类除草剂品种。 3 方法采用选择离子扫描模式，以保留时间和监测离子对信号比例定性，外标 法定量。具有高准确度和灵敏度，最低检出限均低于世界各国制定的三嗪类除草剂 最高残留限量标准。在0 0 0 5 0 8g g m l 范围内，2 6 种三嗪类除草剂线性良好，相关 系数为o 9 9 7 8 0 9 9 9 9 ，满足定量分析的要求；在1 0 1 0 0g g k g 浓度范围内，平均添 加回收率在7 3 4 1 0 5 0 之间，相对标准偏差为1 9 9 6 ；方法的检出限为 0 2 5 - 3 0 “g k g 。 4 试验研究了样品基质效应对检测结果的影响，方法采用标准曲线法来去除基 质效应的影响。 本文通过试验验证说明了玉米中三嗪类除草剂残留的检测方法适用范围广泛， 还可同时用于小麦、大麦、大米及大豆样品中三嗪类除草剂的残留检测，适用性强， 容易被采用和推广，具有良好的应用前景。 关键词：三嗪类除草剂；多残留；粮谷；固相萃取；液相色谱一质谱联用；检测 a b s t r a c t 嘣a z i n eh e r b i c i d e sh a v eb e e nw i d e l yu s e dt o c o n t r o lt h eg r o w t ho fw e e d si n a g r i c u l t u r e t h eu s e o ft h et r i a z i n e sh a sb r o u g h tg r e a tb e n e f i t sf o ra g r i c u l t u r e ，b u ti ta l s o r e s u l t si nt h ep o t e n t i a lh a r mt ot h ee n v i r o n m e n ts i m u l t a n e o u s l yd u e t oe x c e s s i v ea n d i n c o r r e c tu s e t r i a z i n eh e r b i c i d e sh a v eac h a r a c t e ro fs t a b i l i t y , w h i c hc a l lr e m a i ni nt h e a - o p sa f t e ru s e d ，t h r o u g ht h eb i o l o g i c a lc y c l et h e yc a ne n t e rt h e h u m a nb o d ya n d e n d a n g e rh u m a nh e a l t h ，m a n yc o u n t r i e sa n dr e g i o n sr e g u l a t e ds t a n d a r d so fm a x i m u m r e s i d u el i m i t so ft r i a z i n eh e r b i c i d e s t h ea n a l y t i c a lm e t h o do fl i q u i dc h r o m a t o g r a p h yt a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y d e v e l o p e df r o mt h ee i g h t i e so ft h et w e n t i e t hc e n t u r y , i tc o m b i n e sh i g hs e p a r a t i o no f h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n dm a n ya d v a n t a g e so fm a s ss p e c t r o m e t r ys u c h 铺 h i g h - s e n s i t i v i t y , w i d er a n g eo fu s ea n ds u p p l yo ft h em o l e c u l a rw e i g h ta n d s t r u c t u r e i n f o n n a t i o no fm o l e c u l e t h em e t h o dh a sb e c o m eap o w e r f u lt o o lf o rs e p a r a t i o na n d a n a l y s i si nc h e m i s t r y , m e d i c i n ea n dp u b l i c h e a l t h ， f o o ds c i e n c e ，l i f es c i e n c ea n d e i l 访r o n m e n t a ls c i e l l c ea n do t h e ra r e a s ， a n di th a sa r i s e dw i d e s p r e a dc o n c e r na n d a p p l i c a t i o n s i nt h ep a p e r , t a r g e t e do fm a i z ew er e s e a r c h e d am e t h o df o rd e t e c t i n gt h e m u l t i r e s i d u eo ft r i a z i n eh e r b i c i d e s t h r o u g hg r o p i n gt h e c o n d i t i o n so fe x t r a c t i o n s e p a r a t i o n a n dp u r i f i c a t i o n ，a n dc o m b i n i n gt h et e c h n o l o g yo fs o l i d p h a s ee x t r a c t i o nw e e s t a b l i s h e dam e l o dt od e t e c tt h er e s i d u e so f2 6t r i a z i n eh e r b i c i d e si nm a i z eb yl i q u i d c h r o m a t o g r a p h yt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ： 1 t h em e m o ds e l e c t e da c e t o n i t r i l e a st h ee x t r a c t i o ns o l v e n ta n do a s i sm c x c a r t r i d g ef o rp u r i f i c a t i o n i tw a ss i m p l ea n dc o n v e n i e n tt oo p e r a t e ，s a v e dt h ea m o u n to f o r g a n i cs o l v e n t sa n dp r o c e s s i n gt i m e ，a n ds i m p l i f i e dt h ep r o c e s so f s a m p l ep r e t r e a t m e n t 2 b yo p t i m i z i n gt h ec o n d i t i o n so fc h r o m a t o g r a p h ya n dm a s ss p e c t r o m e t r y , w e s e p a r a t e d2 6t r i a z i n eh e r b i c i d e sw h i c hb a s i c a l l yc o v e r e dt h em a j o r i t y v a r i e t i e so ft r i a z i n e h e r b i c i d e s 3 t h em e t l l o du s e ds e l e c t e di o ns c a nm o d e ，a n dm a d eu s eo f r e t e n t i o nt i m ea n dt h e s i g n a lp r o p o r t i o no fm o n i t o r i n gi o n - p a i rf o rq u a l i t a t i v ea n a l y s i s ，a n de x t e r n a ls t a n d a r d m e t h o df o rq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s i th a dh i g ha c c u r a c ya n ds e n s i t i v i t y , a n dt h em i n i m u m d e t e c t i o n1 i m i t sw e r el o w e rt h a nt h es t a n d a r d sf o rm a x i m u m l i m i t e dr e s i d u e so ft r i a z i n e s r e g u l a t e db yd e v e l o p e dc o u n t r i e s i nt h ew o r l d a tt h er a n g eo fo 0 0 5 0 8i t g m lr a n g e ，2 6 t r i a z i n eh e r b i c i d e sh a dg o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i pa n dc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sw e r ei nt h e i i i 液相色谱串联质谱法检测粮谷中三嗪类除草剂的残留量 r a n g eo fo 9 9 7 8 0 9 9 9 9 ，w h i c hm e tt h er e q u i r e m e n t so fq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s i nt h e c o n c e n t r a t i o nr a n g eo f10 - 10 0p g k g ，t h ea v e r a g er e c o v e r i e sw e r ea m o n gi n7 3 4 1 0 5 o ，a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n sw e r ef r o m1 9 t o9 6 t h el i m i t so f d e t e c t i o nr a n g e df r o mo 2 5l x g k gt o3 0p g k g 4 t h ee x p e r i m e n ts t u d i e dt h ee f f e c t so fs a m p l em a t r i xe f f e c t so nt h er e s u l t so f d e t e r m i n a t i o n t h em e t h o du s e ds t a n d a r dc u r v et or e m o v et h ee f f e c t so fm a t r i xe f f e c t s t h r o u g ht h ee x p e r i m e n tt h ep a p e rs h o w e dt h em e t h o do fd e t e c t i n gt h er e s i d u e so f t r i a z i n eh e r b i c i d e si nm a i z eh a daw i d er a n g eo fu s e ，i tc o u l db ea l s ou s e df o rd e t e c t i n g t h er e s i d u e so ft r i a z i n eh e r b i c i d e si nw h e a t , b a r l e y , r i c ea n ds o y b e a r l i th a das t r o n g a p p l i c a b i l i t ya n dg o o da p p l i c a t i o np r o s p e c t s ，a n dc a l lb ee a s i l ya d o p t e da n ds p r e a d e d k e y w o r d s ：t r i a z i n eh e r b i c i d e s ；m u l t i - - r e s i d u e ；c e r e a lg r a i n s ；s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ； l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ；d e t e c t i o n 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 吵 如需保密，解密时间 年月日 是否保密 、夕 一蚴：凄膏移 帆1 m 学位论文使用授权书 黼鲐毒季兮名：一 蛳期：加7 年6 肌日 蛳飙呷年舌月，o 日 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 第一章绪论 1 选题意义和相关背景 1 1 选题意义 除草剂是人类生产和生活中必不可少的生产资料。2 0 世纪4 0 年代起，人类进 入有机化学除草剂时代，几十年来，除草剂被广泛应用于几乎所有的农作物田中。 正是由于除草剂的使用，人类在与杂草危害的斗争中取得了巨大成就，不仅节省了 大量繁重的除草体力劳动和机械除草作业，更重要的是使农作物达到了高产，减少 了巨额的因草害造成的农产品产量和质量的损失，挽回了极其可观的社会经济效益。 如在日本，在未使用除草剂时每亩( 折算) 需除草工时为3 3 0 小时，而使用除草剂 后仅为2 8 8 小时，并且可大大节约能源和机械费用等；在菲律宾，使用除草剂使水 稻增产5 0 ；在我国，1 9 9 9 年化学除草面积已近6 7 0 0 万公顷，按每亩挽回粮食3 0 斤计算，可挽回1 5 0 0 万吨( 3 0 0 亿斤) 粮食，可供数千万人的口粮，还可节省十数 亿个劳动力( 张一宾和张怿，2 0 0 7 ；李孙荣，2 0 0 3 ) 。 除草剂的广泛使用，在为人类和社会的发展做出巨大贡献的同时，其负面影响 也日益显露出来。除草剂及一些除草剂的代谢产物和降解产物不仅污染农作物本身， 还对农作物的生长环境如土壤、自然水体等产生污染。当这些有害物质进入食品并 被人摄取后，由于这些物质降解和排泄缓慢而逐渐积累最终导致人体急性或慢性中 毒，严重危害人体健康。 三嗪类除草剂是一类应用范围广，使用时间长的除草剂，在农业中发挥着重要 作用，但同时也对环境造成了不良影响，通过生物循环危害人类身体健康，其残留 问题引起了世界各国的广泛关注与重视，并制定了最高残留限量标准。 目前国内外对三嗪类除草剂残留的检测方法主要有气相色谱法( g c ) 、气相色 谱一质谱联用法( g c m s ) 和液相色谱法( l c ) ，少数运用液相色谱串联质谱法， 检测样品主要是环境样品和蔬菜水果样品。对粮谷样品的检测路线多为：溶剂提取一 液一液分配一固相萃取净化一检测四个步骤。这些方法操作复杂，耗费大量有机溶 剂且检测周期较长。在运用气相色谱检测时有的还要用多毛细管柱，多检测器测定， 或者大体积进样，增加了检测成本和检测效率，同时大体积进样还会造成系统的污 染，缩短仪器寿命。在采用色谱与选择性检测器分析时，不可避免会遇到以下问题： 第一，由于色谱的分辨能力有限，当样品中组分过多时，色谱很难将所有的组分分 液相色谱串联质谱法检测粮谷中三嗪类除草剂的残留量 离；第二，对相邻的色谱峰，当它们的保留时间相差很少时，仅凭保留时间对组分 定性是不准确的；第三，分析样品时，基质对样品的干扰用选择性检测器很难排除。 g c m s 联用技术具有高分离度、高分析速度和高灵敏度并可提供待测物质的分子量 和结构信息，定性、定量功能优于色谱法，但是，g c m s 应用范围有限，这是因为 g c m s 分析时，样品必须气化，因而难以用于极性、热不稳定和大分子化合物的测 定。而液相色谱一质谱法( l c m s ) 充分利用了高效液相色谱分离能力高、分离范 围广和质谱定性专属性强、灵敏度高、检测快速的特点，并结合了质谱能提供分子 量和结构信息、抗干扰能力强的优点，成为一种强有力的分离分析工具，可以在较 短的时间内对痕量的多种组分一次性的进行分离和鉴定，可以利用选择离子监测 ( s 蹦) 或提取离子色谱图( e s i ) 进行准确定量，最适合复杂基质中的痕量残留物 检测。 此外，对三嗪类除草剂的残留检测多为单项目检测或少数几种物质的检测，多 项目检测方法较少，尽管国家标准建立了l c m s 对几百种农药残留量进行同步检测 的方法，但是该方法只能进行初筛，对三嗪类物质的针对性不强，有些物质回收率 偏低。因此，建立一种针对性强、操作简单、成本较低、应用范围广的多残留检测 方法势在必行。 1 2 三嗪类除草剂的概况 三嗪类除草剂又叫三氮苯类，分为均三氮苯类和非均三氮苯类，是早在2 0 世纪 5 0 年代就推出的传统除草剂之一。1 9 5 2 年加斯特( a g a s t ) 等人首先发现了可乐津 ( c h l o r a z i n e ) 的除草活性，1 9 5 6 年发现西玛津的优异杀草活性，并由瑞士嘉基 ( g e i g y ) 公司开发生产，从而以三嗪为骨架的化合物逐步引起了人们的关注( 陈冠 荣等，1 9 9 1 ：赵善欢，1 9 9 9 ) 。三嗪类除草剂可以在玉米、高梁、棉花、甘蔗及其他 作物地中选择性除草，在非农用地中也有很高的除草价值，在世界范围内被广泛应 用。 1 2 1 三嗪类除草剂的结构与性质 1 2 1 1 基本结构 三嗪类除草剂属于氮杂环衍生物，目前开发出的这类药剂大多数是均三氮苯类。 均三氮苯的基本化学结构是一个六元环，环中的三个碳和三个氮对称排列( 见图 1 - 1 ) 。 按环上碳原子上r l 取代基的不同，可以分为“津”、“净”和“通”三个系统，即取 代基为氯原子( - c 1 ) 称为“津”，甲硫基( - s c h 3 ) 称为“净”，甲氧基( - o c h 3 ) 称为 2 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 “通”( 赵善欢，1 9 9 9 ) 。目前三嗪类除草剂共有3 6 个品 种，农业中比较常用的有莠去津、扑草净、特丁通、西 玛津、扑灭津、扑灭通、特丁津、莠灭净等，此外，环 嗪酮、嗪草酮和苯嗪草酮也是常见的三种三嗪类除草剂。 本实验涉及的三嗪类除草剂名称见表1 1 。 r ： r l 图1 - 1 三嗪的基本结构 f i g 1 - 1t h e b a s i cs t r u c t u r eo ft h et r i a z i n e s 表1 - 1 三嗪类除草剂的名称和分子式 t a b l e1 1n a m e sa n dm o l e c u l a rf o r m u l a so ft r i a z i n eh e r b i c i d e s 1 2 1 2 主要性质 三嗪类除草剂纯品为白色结晶，水溶性较低，在水中的溶解度，通常是“通”类 “净”类 “津”类。大部分物质性质稳定。 3 液相色谱串联质谱法检测粮谷中三嗪类除草剂的残留量 三嗪类除草剂属于选择性输导型土壤处理剂，在土壤中有较强的吸附性，通常 在土壤中不会过度淋溶，因此，对有些敏感作物也能利用土壤位差，达到安全施药 的目的。该类物质在土壤中的淋溶性，主要受土壤胶体粒子吸附力的影响，与药剂 本身的水溶性关系不大。“净”类( 如扑草净) 和“通”类( 如扑灭通) 的吸附受土壤 质地( 黏土含量) 的影响较大，而“津”类( 如西玛津、莠去津和扑灭津) 则与土壤 有机质含量高度相关。多数三嗪类除草剂在土壤中有较长的持效期。通常“通”类的 持效期长于“净”类和“津”类( 赵善欢，1 9 9 9 ) 。 1 2 2 三嗪类除草剂的作用机理 除草剂的作用机理比较复杂，许多除草剂的作用机理至今尚未十分清楚，这是 因为它们的作用不仅受防治对象影响，同时还受环境条件的干扰。许多除草剂的杀 草作用并不限于某一因素，有时是几种因素同时发生，形成一个多种复杂的过程。 无论触杀型或是内吸传导型除草剂，当被植物吸收后，必须对植物的正常生理生化 过程进行某种干扰作用，才能把植物杀死。除草剂对植物干扰、破坏的作用机理可 以归纳为以下几个主要方面( 赵善欢，1 9 9 9 ) ： ( 1 ) 抑制光合作用： 绿色植物是靠光合作用来获得的养分，光合作用是植物体内各种生理生化活动 的物质基础，是植物特有的生理机制。除草剂通过抑制光合电子传递或拦截传递到 氧化型辅酶i i ( n a d p + ) 的电子，从而抑制植物的光合作用，达到除草的目的。 ( 2 ) 干扰呼吸作用和能量代谢： 呼吸作用是碳水化合物等基质通过糖酵解和三羧酸循环的一系列酶的催化而进 行的有机酸氧化过程，并通过氧化磷酸化反应将产生的能量转变为三磷酸腺苷 ( a t p ) ，以供生命活动的需要。植物在除草剂的作用下，体内贮存的能量a t p 不断 用于植物生长、生化反应和养分的吸收和运转，变成二磷酸腺苷( a d p ) ，随着a d p 浓度的增加，加速植物的呼吸作用。另外，呼吸所释放出的能量，不能用于a d p 的 氧化磷酸化，因而，中断了a t p 的形成，使植物体中a t p 的浓度降低，其结果是呼 吸作用成为一种无用的消耗，造成植物能量的亏缺，使植物体内各种生理生化过程 无法进行，从而导致植物死亡。 ( 3 ) 干扰植物的激素平衡： 激素是调节植物生长、发育、开花和结果不可缺少的物质，在植物的不同组织 中都有适当的含量。激素类型的除草剂可以破坏植物生长的平衡，当低浓度时对植 物有刺激作用，高浓度则产生抑制作用。 4 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 ( 4 ) 抑制细胞分裂、伸长和分化： 除草剂对植物的抑制作用往往表现于植物形态的变化，如出现畸形或不正常的 生长发育等，其原因是除草剂抑制了细胞分裂、伸长和分化。 ( 5 ) 抑制植物的生物合成，如抑制色素、氨基酸、核酸和蛋白质的合成等，从而影 响植物的生长与发育，造成植物死亡。 植物的生长发育是植物体内许多生理生化过程协调统一的表现，当除草剂干扰 了其中某一环节时，就会使植物的生理生化过程失去平衡，从而导致植物的生长发 育受到抑制或死亡。 三嗪类除草剂属于选择性输导型土壤处理剂，易经植物根部吸收并随蒸腾流向 上转移至地上部分。它是一类植物光合作用的强烈抑制剂( 张一宾，2 0 0 6 ) ，通过光 合系统i i 以d l 蛋白为作用靶标，抑制光合作用中的电子传递从而抑制植物的光合作 用来达到除草的目的。 1 2 3 三嗪类除草剂的危害 三嗪类除草剂在高剂量时为灭生性除草剂，用于工业区、道路旁等非农用地除 草，低剂量时则作为选择性除草剂。这类除草剂的广泛使用，产生了一些危害生物 和环境的严重副作用，如可以使人类及生物的内分泌系统发生紊乱等。目前已研究 证明三嗪类化合物为内分泌干扰物质( i r e n ae ta l ，2 0 0 6 ；r o b e r t ，2 0 0 3 ) 。1 9 9 7 年世 界自然基金会( w w f ) 提出的环境荷尔蒙物质中( 齐文启等，2 0 0 0 ) ，莠去津和嗪 草酮位列其中。美国国家环保局( e p a ) 的风险评估( u sd e p a r t m e n to fh e a l t ha n d h u m a ns e r v i c e s ，2 0 0 3 ) 报告指出：莠去津对濒危鱼类、水生无脊椎动物以及陆生和 水生植物造成危害，尤其是对蛙类有性别逆转作用；西玛津对血液循环系统有危害 作用，长期暴露在有莠去津、西玛津等残留的环境里，人和动物的各项免疫系统都 会收到影响，可能导致“三致”危害及再生繁殖困难。而日本报道的有关环境荷尔蒙 物质中，除莠去津和西玛津外，西草净也包括在内。此外，有相关报道称三嗪类化 合物还可以引起人类癌症及先天性缺陷( i r e n ae ta l ，2 0 0 6 ；b i c h o ne ta l ，2 0 0 6 ：z h o u q i n g x i a n ge ta l ，2 0 0 6 ) 。因此，三嗪类除草剂对人类、动物和水生生物的危害是不 容忽视的。 1 2 4 世界各国的限量要求 三嗪类化合物性质稳定，使用后能够长期残存于作物和环境中，造成环境污染， 威胁人类健康，其残留问题引起了世界各国政府和有关国际组织的高度重视。世界 5 液相色谱串联质谱法检测粮谷中三嗪类除草剂的残留量 卫生组织和联合国粮农组织等国际组织均制定了各种食品中三嗪类除草剂残留的最 高限量；许多国家、地区和区域性国际组织也结合本国或本地区的实际情况制定了 植物性食品中三嗪类除草剂残留最高限量规定。以下( 表1 2 ) 分别列出了一些农业 大国和我国主要贸易伙伴对三嗪类除草剂最高残留限量的标准( 林维宣，2 0 0 2 ) 。 表1 - 2 各国规定的三嗪类除草剂在农产品中的最高残留限量 t a b l e1 - 2m a x i m u mr e s i d u el i m i t so ft r i a z i n eh e r b i c i d e s i nf a r mp r o d u c t sr e g u l a t e db ys o m ec o u n t r i e s 除草剂 ( m 眺g 限量- z 戋m 叽) 农产品国家或组织 西玛津 莠去津 嗪草酮 扑草净 特丁津 特丁净 0 2 5 o 5 o 1 o 0 5 0 1 玉米、苹果、苜蓿等 甜玉米、仁果 玉米、水果 芦笋 玉米、甘蔗 玉米、草莓 豆类、油籽 玉米、水果、蔬菜 菠萝、玉米 玉米 玉米笋 饲料小麦 饲料玉米 玉米、大米及其他谷物 玉米 大豆 向日葵、饲料豆荚等 所有植物性食品 马铃薯 小麦、大麦 玉米、豌豆、马铃薯等 马铃薯、蔬菜 玉米、大米、大豆、大麦 玉米、棉花籽 蔬菜、水果 粮谷、鲜菜豆等 大麦、小麦、燕麦等 玉米、高粱 所有植物性食品 小麦、玉米、高粱 玉米、豌豆、马铃薯 加拿大 法国 美国 德国 中国 加拿大 欧盟 法国 美国 德国 德国 美国 美国 日本 美国 美国、日本 加拿大 德国 加拿大 美国、日本 加拿大 俄罗斯 德国 美国 德国 德国 加拿大 美国 德国 美国 加拿大 草净津0 0 5 玉米、高粱、棉籽 美国 6 m 啷叭 幡吣m 5 俗! 耋 叭 ”哪叭 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 1 2 5 三嗪类除草剂的市场现状 从2 0 世纪7 0 年代起，全球除草剂的使用量逐年上升。1 9 6 0 年，除草剂在三大 类农药中仅占2 0 ，位居第三，1 9 7 0 年上升到3 5 ，位居第二，从1 9 8 0 年起，除 草剂市场超过了杀虫剂，首次登上了三大类农药的榜首，占4 1 以上，并一直独占 熬头，独领风骚二十余年。2 0 0 6 年农药市场销售额高达3 0 0 亿美元，其中除草剂为 1 5 0 亿美元左右，占5 0 ，年增长率1 2 。因为种植结构和其他因素的影响，世界 各国除草剂用量差异较大( 王焕民，2 0 0 3 ) ，发达国家如美国，除草剂在农药产品中 所占的比例较大，约为5 0 ，而我国除草剂仅占2 0 。随着我国农业现代化和集约 化生产的发展以及农业劳动力的社会转移，我国除草剂的需求正在迅速增加。目前 全国农田化学除草面积已达o 5 3 亿l l i i l 2 ，较1 9 8 0 年增加了1 0 多倍( 梁丽娜等，2 0 0 5 ) 。 除草剂产业发展迅速。 我国是三嗪类除草剂生产和使用大国，2 0 0 3 年三嗪类除草剂的销售额为7 1 9 亿 美元，占整个农药市场的2 7 ，占除草剂市场的5 4 ( 赖惠春等，2 0 0 6 ) 。随着科 技进步，除草剂残留在环境中的毒害作用逐渐被人们意识到，并引起广泛地重视， 特别是三嗪类除草剂，由于其用量大，在环境中残留时间长，造成严重的污染。此 外，由于磺酰脲类等新型除草剂的迅速发展，三嗪类除草剂的市场份额日益下落。 尽管如此，三嗪类除草剂仍在各大类除草剂中位居第五，仅次于氨基酸类、磺酰脲 类、酰胺类和芳氧苯氧丙酸类除草剂( 张一宾，2 0 0 6 ) 。 7 液相色谱串联质谱法检测粮谷中三嗪类除草剂的残留量 1 3 农药残留分析的检测方法 食品中的农药残留分析通常需经过样品制备、纯化富集、分离检测和综合分析 等步骤，而高效快速的样品前处理方法和高灵敏度、高选择性的检测技术已成为目 前研究的重点。以下分别对样品前处理方法和检测技术进行概述。 1 3 1 前处理技术 样品前处理方法就是对样品中的预测组分进行分离、富集( 浓缩) 、纯化或衍生 化等处理，将采集的样品转化为适合于各种色谱分析测定的形态。随着科学技术的 发展，需要分析检测的样品种类越来越多，预测组分的含量越来越低，这就对样品 前处理方法提出了新的挑战。样品制备技术随着分离科学的发展而发展，从使用经 典的溶剂萃取、蒸馏等方法到现在普遍使用的固相萃取、固相微萃取技术，新近出 现的免疫萃取、超临界流体萃取、微波萃取、分子印迹萃取等技术，样品前处理技 术取得很大进展。 1 - 3 1 1 液一液萃取技术 液一液萃取( l i q u i d 1 i q u i de x t r a c t i o n ，l l e ) 是一种传统的农药残留分析前处理 方法，常用于样品中被测物质与基质的分离，在不相溶的两种液体或相之间通过分 配对样品进行分离而达到被测物质纯化和消除干扰物质的目的。在大部分情况下， 一种液相是水溶剂，另一种液相是有机溶剂。可通过选择两种不相溶的液体控制萃 取过程的选择性和分离效率。常用的萃取剂有二氯甲烷、乙酸乙酯等。在水和有机 相中，亲水化合物的亲水性越强，疏水性化合物将进入有机相中的程度就越大。通 常先在有机溶剂中分离出被测物质，由于常用的溶剂具有较高的蒸气压，然后可以 通过蒸发的方法将溶剂除去，以便浓缩这些被测物质。 液一液萃取中非常重要的操作是急速地振荡样品。由于物质剧烈振动，液一液 萃取中乳化现象经常发生，特别是那些含有表面活性剂和脂肪的样品( f o n te ta l ， 1 9 9 3 ) 。发生乳化现象时，可根据乳化的程度采用适当的方法消除乳化，如：加盐； 使用加热一冷却萃取溶剂；通过玻璃棉塞过滤乳化液样品；通过滤纸过滤乳化液样 品；通过离心作用；加进少量的不同的有机溶剂。在液一液萃取中，应该选择在水 中具有低溶解性( 小于1 0 ) 的有机溶剂和萃取后易挥发的、与分析技术匹配的、 具有极性和氢键性质的有机溶剂。这样可以强化有机相中欲测定物质的回收率。 但是传统的液一液萃取不仅费时，而且消耗大量有机溶剂，造成了对操作人员 的危害、对环境的污染。随着农药残留分析技术的提高，样品前处理也向着省时、 8 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 省力、省钱、减少溶剂、减少对环境的污染、微型化和自动化方向发展，如固相萃 取、超临界流体萃取、微波辅助萃取等都取得了很大进步( v e r ae ta l ，1 9 9 6 ) 。 1 3 1 2 固相萃取技术 固相萃取( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 是近年发展起来的一种样品前处理技术， 由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来，主要用于样品的分离、纯化和浓缩。 它利用固体吸附剂吸附通过萃取柱的液体中的目标化合物，使之与样品基体和干扰 化合物分离，然后用洗脱液洗脱或加热解吸，达到分离和富集目标化合物的目的( 王 立等，2 0 0 1 ；s a i k i aa n dk u l s h r e s t h a ，1 9 9 9 ) 。固相萃取技术分正相吸附、反相吸附 和离子交换吸附。正相吸附所用的吸附剂都是极性的，用来萃取极性物质；反相固 相萃取所用的吸附剂通常是非极性的或极性较弱的，所萃取的目标化合物通常是中 等极性到非极性化合物；离子交换固相萃取所用的吸附剂是带有电荷的离子交换树 脂，所萃取的目标化合物是带有电荷的目标化合物。常见的正相萃取柱有：硅胶柱、 氧化铝柱、硅镁柱、石墨化碳黑柱等，反相萃取柱有：c l 。柱、c 8 柱、氰基柱、免 疫亲和柱等，离子交换柱：s c x 柱、s a x 柱、氨基柱等。萃取柱种类的选择依分析 样品的性质而定： 若样品的基质是水溶液 a ：目标分析物更易溶于水相，若带电荷则选择离子交换柱，如阴离子或氨基柱 ( 适于阴离子和酸性化合物) ，阳离子交换柱( 适于阳离子和碱性化合物) ；若为中 性则选择反相柱或强阴( 阳) 离子柱； b ：目标分析物更易溶于有机相，若带电荷则选择离子交换柱或反相柱；若为中 性则选择反相柱。 若样品基质是有机相 a ：若是极性有机相，用水稀释，按水溶液方案进行； b ：若是中等极性到非极性有机相，选择正相柱或将溶剂挥发至干后，再溶于水 或极性溶剂，按水溶液方案进行。 尽管固相萃取的分离模式多种多样，但其操作过程基本类似( 刘俊亭和王文彬， 1 9 9 4 ：张海霞和朱彭龄，2 0 0 0 ) ，可分为四步进行：( 1 ) 活化，除去填料上的杂质， 并使疏水性填料溶剂化；( 2 ) 吸附，使分析物尽量吸附于吸附剂上；( 3 ) 洗涤，以去除 吸附于吸附剂上的杂质；( 4 ) 洗脱，用合适的溶剂尽可能完全的将分析物洗脱下来。 与传统的液一液萃取法相比，固相萃取克服了在液一液处理过程中出现的乳化 现象，萃取过程高效快速、节省溶剂、重现性好、回收率高，而且易于实现自动化。 自从一次性商品化固相萃取柱出现以来，经过近3 0 年的发展，在某些分析领域已经 9 液相色谱串联质谱法检测粮谷中三嗪类除草剂的残留量 取代了传统的液一液萃取技术( 董玉瑛等，1 9 9 9 ；g r e e na n da b r a h a m ，2 0 0 0 ；c h i r o n a n d a l b a ，1 9 9 3 ) 。目前这种技术主要用于生物液体分析( 刘玉春等，2 0 0 6 ；孔莹等， 2 0 0 6 ；陈玲等，2 0 0 6 ；卢彦等，2 0 0 5 ) ，包括血清、血浆中药物分析，食品和动植物 产品中农药、兽药及其它化学污染物残留分析。 1 3 1 3 固相微萃取技术 固相微萃取( s o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n ，s p m e ) 是2 0 世纪8 0 年代末由加拿 大w a t e r l o o 大学p a w l i s z y n 和a r h t u r h e 教授提出的一种简便、快捷、无溶剂的样品 制备与前处理技术。其原理( 马继平等，2 0 0 2 ) 是在一根极细的纤维上涂上不同极 性的吸附剂，相当于气相色谱固定液，做成探针，将探针插入液体或处于顶空状态， 经一定的平衡时间，探针吸附了一定量的被测组分。将探针直接插入气相色谱进样 口，在高温下，被测组分被解吸附，直接被气相色谱检测。 影响固相微萃取效率和精确性的因素( r s m e s ha n dr a v i ，2 0 0 1 ) 包括：纤维表 面固定相的类型、样品量、容器体积、萃取时间、是否使用无机盐及其使用量、p h 值、衍生化等，还可采用加热、磁力转子搅拌、高速匀浆和超声波等方法改变萃取 速度。 与许多经典样品前处理方法相比，固相微萃取技术不但简便、省时、省力、无 需溶剂，特别适于分析挥发性与非挥发性物质，而且其选择性和灵敏度可以通过纤 维头表面的固定相类型、厚度、基质种类和样品加热或冷却处理等因素的改变而改 变。目前在农药残留分析方面固相微萃取的应用已经相当成功( 胡弘鲲和谢家理， 2 0 0 0 ；廖华勇和徐碧珠，2 0 0 2 ) 。 1 3 1 4 超临界流体萃取技术 超临界流体萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，s f e ) 是利用超临界流体作为萃 取溶剂的一种萃取技术，2 0 世纪7 0 年代开始用于工业生产中有机化合物的萃取， 8 0 年代后才用于分析领域。它既可以成为单独的样品i j 处理技术，也可以与气相色 谱仪组成一个完整的分析系统。所谓超临界流体是指在临界温度( t c ) 和临界压力 ( p c ) 以上，以流体形式存在的物质，这种物质同时具有液体高密度和气体低粘度 的双重特性。流体处于临界状态时，其密度随温度和压力的改变而发生明显的变化， 而溶质在超临界流体中的溶解度随流体密度的增大而增大。超临界流体萃取正是利 用这种性质，在较高压力下，将溶质溶解于流体中，然后降低流体溶液的压力或升 高流体溶液的温度，使溶解于其中的溶质因密度下降溶解度降低而析出，从而实现 特定溶质的萃取( 杨立荣等，2 0 0 4 ) 。 1 0 华中农业大学2 0 0 9 届硕七学位论文 目前最常用的超临界流体为液态二氧化碳( 杨立荣等，2 0 0 4 ) 。它具有传质速度 快、萃取效率高、无毒、经济、操作简便、选择性好等优于传统溶剂萃取法的特点， 但是由于超临界流体萃取需要一定的特殊设备，对设备材料和工艺要求均较高，因 此，目前它的广泛应用受到了限制( 戴建昌等，2 0 0 2 ) 。 1 3 1 5 微波辅助萃取技术 微波辅助萃取( m i c r o w a v ea s s i s t e de x t r a c t i o n ，m a e ) 是指利用微波来强化溶剂 萃取效率，即对样品进行微波加热，利用极性分子可以迅速吸收微波能量的特性来 加热一些具有极性的溶剂，达到萃取样品中目标化合物和分离杂质的目的。微波加 热是透入物料内部的能量被物料吸收转换成热能对物料加热，形成独特的物料受热 方式，整个物料被加热，无温度梯度，即微波加热具有均匀性的优点。微波辅助萃 取还具有快速、高效、节省溶剂、环境友好等优点( 杨云等，2 0 0 4 ) ，是一种易于自 动控制的新型样品制备技术。 微波辅助萃取中溶剂的选择非常重要，直接影响到萃取效果( 骆健美等，2 0 0 1 ) 。 由于非极性溶剂介电常数小，对微波透明或部分透明无法进行萃取分离。因此在微 波萃取时，要求溶剂必须具有一定的极性，对待测组分有较强的溶解能力，对后续 测定的干扰较少。此外还应考虑溶剂沸点因素。常用的萃取剂有：甲醇、乙醇、丙 酮、乙酸、甲苯、二氯乙烷、乙腈等有机溶剂。用苯、正己烷等非极性溶剂萃取时 必须加入一定比例的极性有机溶剂。 微波辅助萃取一般用于固体试样，不适用于水样中农药残留的样品前处理。 1 3 1 6 凝胶渗透色谱技术 凝胶渗透色谱( g e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ，g p c ) 是根据被分离物质分子 量的不同，通过具有分子筛性质的固定相( 凝胶) ，达到逐个渗透分离的目的。凝胶 渗透色谱法最初主要用来分离蛋白质，但随着适用于非水溶剂分离的凝胶类型的增 加，发展了应用于农药残留净化的凝胶渗透技术。 凝胶渗透色谱基于体积排除的分离机理，不仅可用来分离和测定小分子物质， 而且还可以分析具有相同化学性质但分子体积不同的高分子同系物。与吸附柱色谱 等净化技术相比，凝胶渗透色谱具有净化容量大、可重复使用、适用范围广等优点， 同时，使用自动化装置后还具有净化时间短、简便、准确等优点( 韦军，2 0 0 5 ) ，但 由于仪器过于昂贵，而且耗费大量溶剂，国外研究较多，国内实验室还没有普及。 1 3 1 7 免疫亲和色谱技术 免疫亲和色谱( i m m u n o a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ，i a c ) 是一种将免疫反应与色 谱分析方法相结合的分析方法，是基于免疫反应的基本原理，利用色谱的差速迁移 液相色谱串联质谱法检测粮谷中三嗪类除草剂的残留量 理论，实现样品分离的一种分离净化方法。分析时把抗体固定在适当的载体上，样 品中待测组分与固定相上的抗体发生抗原一抗体结合反应而被保留在柱上，然后用 适当溶剂