（营养与食品卫生学专业论文）食品中磺胺二甲嘧啶残留酶联免疫方法的建立.pdf

天津科技大学 学位论文原创性声明 i i i iii ii i iii i i ii fi i i ii 17 9 7 3 5 3 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究 成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发 表或撰写的成果内容。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：王昆 日期：础年j 月垴日 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科 技大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：互易 日期：咿年3 月留日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口( 请在方框内打“v ) ，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 ， 不保密圈( 请在方框内打“v ”) 。 作者签名：孟铭 7 日期：础年3 月灯日 导师签名： 11 1日期：厶，劳年多月弓f 日 抄久 摘要 磺胺二甲基嘧啶( s m z ) 是一种广泛用于人类和畜禽生产中常用的抗菌药物，主 要用于促进牛，羊，猪，以及家禽的生长。但其对人体有潜在的毒副性作用。为了检 测可食用性动物食品( 猪肉，鸡肉，鸡蛋，鱼肉，牛奶和肝脏) 中磺胺二甲基嘧啶的 残留，本文建立了一种直接对其进行测定的竞争酶联免疫方法。 本文制备了针对磺胺二甲基嘧啶的特异性抗体，建立了完整的针对磺胺二甲基嘧 啶残留的简单快速的酶联免疫分析方法，其灵敏度达到0 5 比g k g 1 。磺胺二甲基嘧啶 在不同基质中的最低检测限比较低，在肝脏中是5 # g k g l ，在其它基质中是2 9 9 k g l ， 均远远低于规定的最高残留限量值，符合国际标准检测要求。样品经过甲醇提取，并 用缓冲液稀释一定倍数后可以直接用该方法进行检测。检测猪肉，鸡肉，鱼肉，鸡蛋 和牛奶可以通过稀释2 0 倍消除基质影响，猪肝稀释5 0 倍可以消除基质影响。通过检 测回收率7 0 1 2 0 ，证明了在食品中检测磺胺二甲基嘧啶残留的简单，有效，快速 的方法的准确性。 采用两种不同方法合成了两种酶标抗原，用来比较同源酶标和异源酶标对e l i s a 检测结果的灵敏度和特异性的影响。结果表明，用异源酶标可以得到更高的灵敏度。 针对磺胺二甲基嘧啶特异性抗体的特异性，对1 4 种磺胺药物进行了检测。s m z 抗体显示出较好的特异性，除与磺胺二甲基嘧啶的结构相差一个甲基的磺胺甲基嘧啶 有1 3 3 的交叉反应外，其余1 3 种均低于0 5 。 针对磺胺二甲基嘧啶兽药残留的传统检测方法是高效液相色谱法0 w l c ) ，以建 立的磺胺二甲基嘧啶高效液相色谱检测方法为标准，对建立的磺胺二甲基嘧啶直接竞 争e u s a 检测方法的准确性进行验证。h p 以) 险测结果与e u s a 检测结果比较显示出了 良好的相关性，线性相关系数大于0 9 。 关键词：磺胺二甲基嘧啶；酶联免疫；基质影响；残留 s u l p h a m e t h a z i n e ( s m z ) i so n ek i n do fs u l p h o n a m i d ew h i c hi sw i d e l yu s e dt ot r e a t b a c t e r i a ld i s e a s e si nh u m a na n dv e t e r i n a r ym e d i c i n ea n dt op r o m o t eg r o w t hi nc a t t l e ，s h e e p ， p i g s a n dp o u l t r y h o w e v e r , i th a sp o t e n t i a lm e n a c et oh u m a nh e a l t h t od e t e r m i n e s u l p h a m e t h a z i n e ( s m z ) r e s i d u e si ne d i b l ea n i m a lf o o d s0 i gm u s c l e ，c h i c k e nm u s c l e ，e g g , f i s h ，m i l ka n dl i v e 0 ，ac o m p e t i t i v ed i r e c te n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) m e t h o dw a se s t a b l i s h e d t h ea n t i - s m za n t i b o d yp r o d u c e di nt h i sp r o j e c tw a ss p e c i f i cf o rs m z , a n dt h e na n a n t i b o d y b a s e ds i m p l e ，r a p i d a n dc o n v e n i e n td i r e c t c o m p e t i t i v ee n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a yw a sd e v e l o p e d t h es e n s i t i v i t yo ft h em e t h o dw a sh i g h ，a n dt h el i m i t o fd e t e c t i o nf o rd e t e r m i n a t i o no fs m zr e s i d u e si nd i f f e r e n tm a t r i xw a sf a rb e l o wt h e m a x i m u mr e s i d u el e v e l s ( r l s ) ，w h i c hw a s5 肛gk s 1i nf i v e r 2 gk s 1i no t h e rf i v e s a m p l e s s ot h em e t h o dc o u l ds a t i s f yt h ei n t e r n a t i o n a ls t a n d a r d i z a t i o nd e t e c t i o nd e m a n d a f t e rl i q u i de x t r a c t i o n 谢t hm e t h a n o l ，s a m p l ee x t r a c t sd i l u t e d 谢t hb u f f e rw e r ea n a l y z e db y d i r e c tc o m p e t i t i v ee n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a yd i r e c t l y m a t r i xe f f e c t sc o u l db e a v o i d e dw h e na1 ：2 0 d i l u t i o no fp o r k , c h i c k e n ，e g g , f i s ha n dm i l ks a m p l e sa n da1 ：5 0 d i l u t i o no ff i v e rs a m p l e sw i t hs e l e c t e db u f f e r as i m p l ea n de f f i c i e n te x t r a c t i o nm e t h o df o r t h er a p i dd e t e c t i o no fs i v i zr e s i d u e si nf o o d sw a sd e v e l o p e dw i t hr e c o v e r i e sb e t w e e n 7 0 一1 2 0 t oc o m p a r et h ee f f e c to fh o m o l o g o u sa s s a ya n dh e t e r o l o g o u sa s s a yo nt h ee l i s a s e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t y , t w oe n z y m ec o n j u g a t e sw e r es y n t h e s i z e d t h er e s u l ti n d i c a t e d t h a th e t e r o l o g o u sf o r m a ts h o w e dh i g h e rs e n s i t i v i t y t h es p e c i f i c i t yo ft h ea n t i b o d yf o rs m zw a sd e t e r m i n e db yt e s t i n g1 4k i n d so f s u l p h o n a m i d e s i ng e n e r a l ，t h ed e v e l o p e di m m u n o a s s a yi sh i g h l ys p e c i f i cf o rs m z a l l t e s t e ds u l p h o n a m i d e ss h o w e dl o wc r o s s - r e a c t i v i t y ( 0 5 ) e x c e p ts u l p h a m e r a z i n e ( s m r ) ， w h i c ho fc h e m i c a ls t r u c t u r ei so n em e t h y ll e s st h a ns m z , s h o w i n gc r o s s - r e a c t i v i 哆o f 1 3 3 t r a d i t i o n a la n a l y t i c a lm e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fs m zi ne d i b l ef o o d sw e r e h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y i nm yp r o j e c t , a 肿l cm e t h o dw a sa l s o d e v e l o p e df o rt h ev a l i d a t i o no ft h ed e v e l o p e de l i s am e t h o d s a m p l ee x t r a c t sw e r e a n a l y z e db ye l i s aa n dh p l c , a n dr e s u l t so b t a i n e db yt w om e t h o d sc o r r e l a t e dw e l l ，t h e c o r r e l a t i o nw a sg r e a t e rt h a n0 9 k e yw o r d s ：s u l p h a m e r a z i n e ，e l i s a , m a t r i xe f f e c t ，r e s i d u e s 目录 1 前言：“”1 1 1 兽药及其对食品安全的影响1 1 1 1 兽药和兽药残留“1 1 1 2 兽药残留与食品安全“2 1 2 磺胺类药物概述“3 1 2 1 磺胺类药物的性质和作用3 1 3 动物源性食品中磺胺的残留及其检测“7 1 3 1 动物源性食品中出现磺胺残留的原因”7 1 3 2 现有检测分析方法方法概述8 1 3 3 高效液相色谱( h p l c ) 法概述9 1 4 酶联免疫检测技术研究进展1 1 1 4 1 基本原理”1 2 1 4 2 技术环节”1 2 1 4 3e l i s a 方法的选择1 3 1 5 本文研究对象及其主要内容1 4 1 5 1 磺胺二甲基嘧啶简介1 4 1 5 2 磺胺二甲基嘧啶常用检测方法1 4 1 5 3 本文研究内容1 5 2 材料与方法 2 1 实验材料1 6 2 1 1 试剂与药品1 6 2 1 2 实验仪器与材料1 7 2 1 3 待测样品：”1 7 2 1 4 实验动物1 7 2 1 5 常用酶及其底物1 7 2 1 6 常用溶液的配制1 8 2 2 实验方法1 8 2 2 1 人工抗原和包被抗原的合成1 8 2 2 2 酶标抗原的制备1 9 2 2 3 样品前处理2 0 2 2 ：4 抗体的制备与纯化i 一2 1 2 2 5 抗血清效价的测定2 3 。 2 2 6 直接竞争酶联免疫法建立磺胺二甲基嘧啶标准曲线2 3 2 2 7 标液稀释剂的优化2 4 2 2 8 特异性实验2 4 2 2 9 酶标抗原稳定性实验2 4 2 2 1 0 直接竞争e l i s a 检测方法性能指标的评价2 4 2 2 1 1 高效液相色谱分析方法2 5 3 结果与讨论2 8 3 1 磺胺二甲基嘧啶半抗原的设计与合成2 8 3 1 1 产物的验证2 8 3 1 2 产物的分离提纯2 9 3 2 人工免疫原的制备3 l 3 3 抗体制备”3 1 3 3 1 抗血清效价与结合力的变化3 1 3 3 2 抗体的纯化”3 2 3 4 实验条件的优化”3 3 3 4 1 同源酶标抗原浓度的优化”3 3 3 4 2 异源酶标抗原浓度优化3 4 3 4 3 同源及异源酶标直接竞争反应3 4 3 4 4 两种酶标抗原对检测结果的影响3 5 3 4 5 抗体特异性3 6 3 4 6e l i s a 试剂工作浓度的优化3 8 3 4 7 标液稀释剂优化实验3 9 3 5 标准曲线的建立“4 1 3 6 酶标稳定性试验4 2 3 7 样品基质影响及消除4 2 3 8 磺胺二甲基嘧啶直接竞争e l i s a 检测方法性能指标的评价4 8 3 8 1 检测i 辊4 8 3 8 2 精密度一4 8 3 8 3 准确度4 9 3 9 磺胺二甲基嘧啶高效液相色谱检测方法5 0 3 9 1 高效液相色谱检测磺胺二甲基嘧啶k 5 0 3 9 2 建立高效液相色谱检测磺胺二甲基嘧啶在食品中的残留5 1 3 9 3 磺胺二甲基嘧啶直接竞争e l i s a 检测结果与仪器分析结果的一致性5 4 4 结论5 5 5 展望 6 参考文献 7 论文发表情况 8 致谢 i i i 5 6 5 7 6 3 6 4 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 兽药及其对食品安全的影响 1 1 1 兽药和兽药残留 随着人们膳食结构的不断改善，肉、蛋、乳、水产品等动物性食品所占的比例在 不断增加。为了满足人类对动物性产品不断增长的需要，大幅度、快速地提高动物性 食品的产量。大量的、种类繁多的兽药被应用于畜禽生产的许多环节。因而在动物性 食品中造成了不同程度的兽药残留，伴随而来的是对公众健康和环境的潜在危害。兽 药残留不仅直接对人体产生急慢性毒性作用，引起细菌耐药性的增加，还通过环境和 食物链的作用间接对人体健康造成潜在危害，对此，世界各国已经开始注意到这个问 题的严重性，并认为兽药残留将是今后食品安全性问题中的重要问题之一【1 2 1 。 在刚过去的三十年中，兽药在动物身上应用的管理程序得到了充分的加强。尽管 兽药的应用有助于增加食品的供应，但是诸如在食品中的药物残留的出现等的消极的 结果不能被忽视。随着兽药使用的增加，消费者食用到这些兽药的可能性也增加了。 各个国家都规定了食品中被认可的药物最高残留限量，只要食品中兽药的残留低于允 许的最高残留限量，那么就可以认为被检测的样品对人类使用是安全的【3 4 】。然而，一 些消费者购买的食品中含有的药物残留却远远高于现有的检出限。 对于消费者来说，食品中出现兽药残留对健康是件危险的事情。首先，某些药物 的致癌性被广泛的质疑。其次，某些微生物长期的与这些药物作用将会增加其抗药性。 兽药是用来预防、治疗和诊断动物疾病的化学物质，同时还可起到促进动物生长、 繁殖和提高生产性能的作用。兽药残留就是对食品动物用药后，在动物体内经过生物 运转( 即吸收、分布、排出) 和生物转化，以兽药原形及其代谢产物在动物的细胞、 组织或器官内蓄积或储存的现象【5 6 1 。 造成动物性食品兽药残留的原因主要有：所使用药物的种类、剂量及时间的不同。 不同种类药物的理化性质是各不相同的，而且药物经生物转化后的代谢产物也极为复 杂，因而动物组织中的药物残留组分也各不相同。对人体而言，游离的原药及其代谢 物在动物性食品药物残留中最为重要，是造成药物残留的重要原因之一。动物的品种、 生长期的不同。研究表明，药物在畜禽体内的消除规律是不一样的【7 1 。人为因素所造 成的兽药残留。此类残留大都是由用药错误造成的，其原因主要有：滥用兽药，如用 药剂量、给药途径、用药部位和用药动物的种类等不符合用药规定，这些因素有可能 延长药物残留在体内的时间，从而需要增加休药的天数；在休药期结束前屠宰动物； 突击使用兽药，以逃避宰前检查：以未经批准的药物作为添加剂饲喂动物；动物饲料 在加工和运输过程中被兽药污染【叭o 】。 目前，国际上将兽药残留分为7 类，即：抗生素类、驱肠虫药类、生长促进剂类、 抗原虫药类、灭锥虫药类、镇静剂类和b 肾上腺素能受体阻断剂。常见的兽药残留主 要有下面几类：抗生素类药物，主要用于防治动物的传染性疾病，如氯霉素、四环素、 1 前言 土霉素、青霉素等。抗菌消炎类药物，如磺胺类药物( 磺胺嘧啶、磺胺脒、磺胺甲基 异恶唑等) 和硝基呋喃类药物( 呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等) 。抗寄生虫药， 主要用于驱虫或杀虫，如左旋咪唑、苯并咪唑、克球酚、吡喹酮等。激素类药物，主 要用于提高动物的繁殖和生产性能，如己烯雌粉、孕酮、睾酮、雌二醇等l l 。 在过去，在销售的牛奶、肉制品等动物源性食品中抽样检测出了磺胺类药剂的残 留。据报道，一项由美国食品及药物管理局进行的全国性调查显示有4 5 的牛奶采样 中包含可检出计量的磺胺二甲基嘧啶【捌。而另一项在全加拿大十个城市完成的3 0 份 采样调查中，检测出两个样品中的磺胺二甲基嘧啶的残留水平在1 1 4 和5 2 n g m l p 3 1 。 早在1 9 8 8 年，美国国家毒物中心( n i 四己) 的报告显示磺胺二甲基嘧啶可能是致 癌物之一，自此以后对于已经出现的磺胺二甲嘧啶以及其它磺胺类药物在牛奶和其它 食品中的残留被广泛的关注【1 4 l 。i 。 1 1 2 兽药残留与食品安全 近2 0 年来，随着我国畜牧业的繁荣和发展，兽药( 包括药物添加剂) 的使用日益广 泛，在降低发病率与死亡率、促生长、提高饲料利用率和改善产品品质方面起到十分 显著的作用，已成为现代畜牧业不可缺少的物质基础。目前绝大多数食品动物在生长、 生产过程中至少长期使用l 2 种兽药或药物添加剂。但是，兽药的使用无疑会导致兽 药及其代谢产物在动物体内的滞留或蓄积，并以残留的方式进入人体及生态系统。兽 药残留问题不仅涉及到广大人民群众的生命安全与健康，还涉及到生产经营企业的经 济利益和国家经济的发展l l h l 7 j 。 食用含有兽药残留的动物性食品后，一般对人不表现急性毒理作用。但如果长时 间摄入低剂量兽药残留的动物性食品，则可造成兽药残留在人体内蓄积，引起各种组 织器官发生病变，甚至癌变。兽药残留对人体的危害主要表现在以下几个方面。毒性 损害：人长期摄入含兽药残留的动物性食品后，可造成药物蓄积，当达到一定浓度后， 就会对人体产生毒性作用。过敏反应：过敏反应是一种急性反应，一些人食用因药物 残留污染的食物后会出现这种反应。导致病原菌产生耐药性：经常食用低剂量药物残 留的食品可使细菌产生耐药性。动物在经常反复摄入某一种抗菌药物后，体内将有一 部分敏感菌株逐渐产生耐药性，成为耐药菌株。这些耐药菌株可通过动物性食品进入 人体，当人产生这些耐药菌株引起的感染性疾病时，就会给临床治疗带来一定的困难， 甚至延误正常的治疗过程。“三致”作用：某些兽药残留长期或大剂量被人体摄入后， 可产生致畸、致癌、致突变作用。激素样作用：摄入激素类药物，可能干扰人的激素 功能，影响生育能力，导致儿童的性早熟等。破坏微生物平衡，导致二重感染。在正 常条件下，人体消化道内的微生态环境中存在着多种微生物，个体菌落之间维持着共 生状态的平衡。长期使用广谱抗生素，敏感菌受到抑制，而不敏感菌趁机在体内繁殖 生长，形成新的感染，即“二次污染”。 1 1 1 1 抗生素类药物 有关资料显示，青霉素、链霉素，以及极少数在人医临床上使用的新生霉素、竹 桃霉素似乎更容易产生过敏反应。过敏反应有多种多样，轻者可出现瘙痒、红疹、头 2 天津科技大学硕士学位论文 痛等症状，重者可引起休克甚至危及生命。流行病学和实验资料表明，低至5 - 1 0 单 位( 0 0 0 3 - - - , 0 0 0 6 m g k g 组织) 的青霉素在敏感个体足以产生过敏反应【。 由于氯霉素具有极好的抗菌作用和药物代谢动力学特征而被广泛用于动物生产。 但是，其对畜禽的不良反应是对造血系统有毒性，使血小板、血细胞减少，形成视神 经炎。其残留的潜在危害是对骨髓造血机能有抑制作用。由于它具有引起人类血液中 毒的副作用，可引起人的粒细胞缺乏病、再生障碍性贫血和溶血性贫血。 人长期食用残留链霉素的动物性食品可引起眩晕和耳聋。摄入含有氯霉素残留的 食品可产生再生障碍性贫血等。更为严重的是，还可导致“三致”( 致癌、致畸、致突 变) ，四环素、链霉素等和多数激素均有潜在性的致癌作用【1 9 】。 1 1 1 2 抗菌消炎类药物 磺胺药物可引起泌尿系统损害，特别是在体内形成的乙酰化磺胺在酸性尿中溶解 度很低，可在肾小管、肾盂、输尿管等处析出结晶，损害肾脏。 喹诺酮类( q n s ) 和氟喹诺酮类药物( f q s ) 是近2 0 年来迅速发展起来的一类抗 菌药。喹诺酮类药物，因疗效较差有被淘汰的趋势。近年来氟喹诺酮类药物发展很快， 已有近2 0 个品种投入市场，其中近1 0 个用于畜禽和水产养殖，例如环丙沙星、氟甲 喹已大量用作兽药。近几年又在研究将恩诺沙星、二氟沙星、达诺沙星、沙拉沙星、 培氟沙星等，用在抗动物细菌病和抗动物支原体病中。因这类药物具有广谱、高效、 人畜通用等特点，愈来愈受到养殖业的重视，正在以较快的速度和较大的份额占据养 殖业的抗感染药物的市场，据推测，氟喹诺酮类药物将会成为2 1 世纪畜禽、水产养 殖中抗感染药物的主要品种。喹诺酮类中个别品种有致突变作用。 使用违禁药品，我国农业部颁布的l ：允许作饲料药物添加剂的兽药品种及使用规 定明确规定，禁止向饲料中添加b 一兴奋剂、镇静剂、激素等药物。b 一兴奋剂如盐 酸克伦特罗俗称“瘦肉精”，能提高畜禽的饲料转化率和增加瘦肉率，但在畜禽体内代 谢慢、存留时间长，其中以肝、肺含量最高。人摄入后极易中毒，重症者还会出现头 痛、恶心、呕吐、心慌、气短等症状闭丑j 。 1 2 磺胺类药物概述 1 2 1 磺胺类药物的性质和作用 1 2 1 1 磺胺类药物简介 作为一种抗菌药，磺胺类合成抗菌药是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的抑制核酸 合成广泛使用的预防性和刺激动物生长的抗菌药，其主要作用是通过抑制细菌繁殖达 到抗菌的目的，而不是直接杀灭细菌。磺胺类药物是人工合成的应用最早的化学药品， 具有抗菌谱广、抗球虫和价廉易得、化学性质稳定等特点，特别是高效、长效、广谱 的磺胺药和增效剂合成以来，使磺胺类药兽医临床上应用仅次于抗生素。在食源性动 物的饲养中用于预防和治疗食源性动物疾病，通常用于家禽以预防球虫病、霍乱和感 染性鼻炎、在水产品养殖过程中用于控制疔疮和肠败血症等。磺胺类药物还被用于促 生长作用的饲料添加剂，以提高动物得抗病能力，提高产量1 2 2 矧。然而不正确的使用 这些抗生素会导致在食用动物产品残留，这些残留物对身体有不良影响，具有显著的 3 1 前言 毒性副作用，引起过敏反应，如：引起排尿和造血紊乱等副反应，导致食入者再生障 碍性贫血，影响人的泌尿系统功能，引起结晶尿、血尿、尿痛、尿少等症状f 2 4 岱】。磺 胺二甲嘧啶还可能使小鼠致癌。食用含磺胺类药物残留的动物食品：牛奶能导致过敏 机体发生过敏反应，破坏机体正常菌群生态平衡。其中磺胺二甲嘧啶超标的动物性食品 损害人类的健康，如可能引起甲状腺癌，影响人体核酸的合成，产生一定的耐药性，对磺 胺二甲嘧啶过敏的人会导致心悸、气短等不良反应。蜂蜜中磺胺及其代谢产物的残留 可能引起过敏体质消费者产生过敏反应，并产生细菌耐药，对健康造成危害。随着抗 生素的发展。磺胺类药物的临床应用逐渐减少【孙2 9 1 。目前中国、欧盟、美国、日本等均 将磺胺类药物列为动物饲养过程中限制使用的药物1 9 7 4 年瑞士禁止使用磺胺类抗生 素预防和治疗蜜蜂幼虫芽孢杆菌感染。我国农业部早在1 9 9 7 年就颁布了动物性食品中 兽药最高残留量及作为药物饲料添加剂的使用范围的有关规定，欧盟将磺胺类药物列 为必须严格监控的药物，并制定了动物食品中磺胺的最大残留量限量为0 1 m g k g ，我国 鲜、冻禽产品国家标准( ( g b l 6 8 6 9 ) 2 0 0 0 ) 规定磺胺二甲嘧啶：0 1 m g k g 。而日本规定为 0 2 0 m g k g ，并且具有逐步严格控制的发展趋势【姗j 。 为了保障我国人民的健康及扩大动物性食品的贸易往来，有必要建立动物性食品 j 冲! 在此基团的基础上与其它官能团组成的物质 s u l f a n i l a mi d e ( s a n ) 性质：呈现白色颗粒或粉末状，无臭，味微苦。微溶于冷水，乙醇和丙酮。 易溶于沸水，甘油，盐酸或苛性碱溶液。不溶于苯，乙醚和氯仿。 h 。 物化性质：白色或淡黄色晶体或结品粉末。无臭。味微苦。在空气中无变化。 4 天津科技大学硕士学位论文 用途：适用于肺炎，丹毒，脑膜炎等病。 ( 3 ) 磺胺二甲基嘧啶 3 0 时，酶的活性应 2 5 0 u m g 。 2 1 5 2 常用底物 辣根过氧化物酶的底物为过氧化物和供氢体。 目前常用的过氧化物有过氧化氢( h 2 0 2 ) 和过氧化氢脲( c h 6 0 3 ) 。过氧化氢 在以往的e l i s a 中常被采用，但配成的底物液很不稳定，只能在用前临时配制，更不 易用于商品化检测试剂盒中。近年来过氧化氢脲被普遍采用，在过氧化氢脲中h 2 0 2 的含量约为3 5 ，配制成的底物液可较长期的保存，因此在本试验中选用过氧化氢脲 配制底物液。 供氢体多用无色的还原型染料，通过反应生成有色的氧化型染料。供氢体的种类 很多，常用的有邻苯二胺( o p d ) 、3 ，3 ，5 ，5 四甲基联苯胺( b ) 、3 ，3 ，5 ，5 四甲基联苯胺硫酸盐( n 仍s ) 、二氨基联苯胺( 惦) 等，可根据实际情况进行选 择，本试验选用t m b 为供氢体。t m b 对光敏感性差，配成的底物液可放置较长时间， 其反应产物为蓝绿色，用硫酸终止后变为金黄色，在4 5 0 n m 波长处有最大光吸收。 2 1 6 常用溶液的配制 ( 1 ) 包被缓冲液( 0 0 5 m o f l 碳酸钠碳酸氢钠缓冲液，p h9 6 ) ：取1 6 9 碳酸钠 及2 9 9 碳酸氢钠，加双蒸水至1 0 0 0 m l ，调p h 至9 6 。 ( 2 ) 封闭液( 1 b s a p b s 溶液) ：l gb s a ，1 p b s1 0 0 m l 。 ( 3 ) 样本稀释液( p b s ，p h 7 4 ) ：n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ：6 8 8 9 , n a h 2 p o , , ：6 9 9 , n a c i ：4 5 舀加双蒸水至1 0 0 0 m l ，调节p h 至7 4 。 ( 4 ) 洗涤液( p b s t ，p h 7 4 ) ：取n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 06 8 8 9 ，n a h 2 p 0 4 ：6 9 8 ，n a c l 4 5 9 ，t w e e n 2 00 5 m l ，加双蒸水至1 0 0 0 m l ，调节p h 至7 4 。 ( 5 ) 底物液( t m b 过氧化氢脲溶液) ： 底物液a ：取无水醋酸钠8 2 9 ，b 一糊精2 5 9 ，过氧化氢脲4 2 8 6 m g ，加双蒸 水至1 0 0 0 m l ，调节p h 至5 0 ，4 c 保存，使用时达室温。 底物液b ：取1 0 0 m g 的t m b 溶于1 0 m l 的d m s o 中，棕色瓶保存。 使用前1 5 m i n 混合：1 4 6 m l a 液+ 0 4 5 m l b 液。 终止液：1 2 5 m o l l 的h 2 s 0 4 溶液。 2 2 实验方法 2 2 1 人工抗原和包被抗原的合成 人工抗原为磺胺二甲基嘧啶和蛋白质的偶联物，本实验用k l h 与s m z 偶联作 为免疫原，用o v a 与s m z 偶联作为包被原。用重氮盐法制备 6 ) 。将 5 7 m g ( 0 2 m o l l ) s m z 溶于4 m l0 5 m o f l 硫酸，置o - 4 冰浴，搅拌下逐滴加入l m l l m o f l 亚硝酸钠，将k l h 和o a 各1 0 0 毫克分别溶于4 m l p h 9 4 混合硼酸一碳酸盐缓 冲溶液中，搅拌下逐滴加入生成的重氮盐溶液4 m l 和l m l ，用l m o l l 氢氧化钠调 p h 8 1 0 ，室温反应1 h ，反应液透析过夜，过s e p h a d e xg 2 5 柱，得纯化的s m z - 蛋白 1 8 天津科技大学硕士学位论文 质偶联物，冻干放存i 踟。 2 2 2 酶标抗原的制备 本实验采取两种不同合成方法所制备的酶标抗原同时进行检测，比较不同结构的 半抗原制备的酶标抗原对检测结果的影响。 2 2 2 1 酶标抗原i 酶标抗原i 采用琥珀酸酐与s m z 反应生成带有羧基( - c o o h ) 的s m z 衍生物， 然后将其用偶联剂碳化二亚胺( e d c ) 与辣根过氧化物酶( h r p ) 相联，具体方法如 下： ( 1 ) 准确称取s m z0 2 r e t o o l ( 5 6 m g ) ，加入4 m l ( o 2 r e t o o l ，2 0 m g ) 琥珀酸酐 无水吡啶溶液中，室温搅拌反应2 2 h 。反应完成后氮气吹干，合成带有羧基的衍生物， 用液相质谱联用仪鉴定结果后，过硅胶柱分离纯化。 ( 2 ) 在l m l d m f 中溶解o 0 2 5 m m o l ( 9 4 5 r a g ) 纯化后的半抗原和e d c0 0 5 r e t o o l ( 9 3 m g ) 。 ( 3 ) 溶解1 0 r a gh r p 到2 m l 1 3 0 m m o l 的n a h c 0 3 溶液中( p h 8 1 ) 。 ( 4 ) 在混合轮上混合4 6 h ，然后加入4 7 m ge d c ，4 1 2 混合。 ( 5 ) 用p b s 透析除盐终止反应。 2 2 2 2 酶标抗原 ( 1 ) 称取1 0 m gs m z 溶解于l m l d m s o 溶液中。 ( 2 ) 称取8 r a gd s s 溶解于o 4 m l d m s o 溶液中。 ( 3 ) 将( 1 ) 逐滴加入到( 2 ) 内，边加边混匀，加完后放在混匀器s h a k e r 上缓 慢混匀3 0 m i n 。 ， ( 4 ) 称取1 0 r a gh r p 溶解于1 0 m m o l l 的p b s 溶液中。之后取9 3 1 i il 的( 3 ) 溶液逐滴加入h r p p b s 中，边加边混匀。将其放于混匀器s h a k e r 上反应2 h 。 ( 5 ) 用p b s 透析除盐终止反应。 2 2 2 3 合成产物结果分析 酶标抗原i 中羧基衍生物的合成需要进行结果分析，将旋蒸后的固体取少量溶解 于反应溶剂中，选择适当的展开剂进行薄层色谱分析，使固体组分有所分离，便于进 行定性分析。同时取微量合成产物溶解于0 5m l 左右的色谱醇甲醇中，进行液质检 测定性。 2 2 2 4 合成产物的分离纯化 合成得到的粗产品除目标产物外，还含有一定量的未反应原料及副反应产物，需 要进一步提纯。本实验粗产品的分离纯化采用硅胶柱层析法。柱层析硅胶选用优质硅 胶精细制备而成，主要成分为s i 0 2 n h 2 0 ，不溶于水无机酸和其它有机溶剂，溶于h f 和苛性碱溶液，在空气中能吸潮，具备对不同物质吸附保留时间上差异，从而达到各 种物质的分离和提纯。 具体方法为： ( 1 ) 选择适当的展开剂。一般可选用和薄层色谱分析一致的展开剂进行硅胶柱 层析。 1 9 2 材料与方法 ( 2 ) 将展开剂注入层析柱的二分之一处，将适量棉花塞入层析柱底部，将0 5 c m 左右的二氧化硅铺在棉花上，截面尽量平整。 ( 3 ) 称取6 0g 硅胶，溶于适量展开剂中，搅拌均匀，微波超声3 0 r a i n 脱气。 ( 4 ) 将超声好的硅胶注入层析柱中，打开柱子底部的活塞，使硅胶沉淀。回收 滴下的展开剂。 ( 5 ) 制样。将粗产品用适量反应溶剂溶解，加入1g 硅胶进行旋蒸。 ( 6 ) 上样。将制好的样品加入沉淀后的硅胶柱中，在样品上加入0 5 c m 左右的 二氧化硅，截面尽量平整 ( 7 ) 轻轻注入适量展开剂，开始层析。 ( 8 ) 在收集过程中进行薄层层析监测，收集适当组分进行液质检测j 对所需组 分进行旋蒸，产物密封保存。 2 2 3 样品前处理 2 2 3 i 样品预处理 ( 1 ) 猪肉、鸡肉、鳕鱼、猪肝这种肉类组织样品需将其切碎。 ( 2 ) 鸡蛋需将蛋清与蛋黄混匀。 ( 3 ) 牛奶类样品可直接称取。 2 2 3 2 样品提取 ， ( 1 ) 猪肉、鸡肉、鳕鱼：称取5g (