（生态学专业论文）镉胁迫下东南景天（sedum+alfredii+hance）中差异表达cdna筛选.pdf

中山大学硕士学位论文 镉胁迫下东南景天( & 砌m 口批蹦h a n c e ) 中 差异表达c d n a 筛选 专业：生态学 作者：王胜龙 导师：束文圣教授 摘要 转基因植物修复技术已经成为当前重金属植物修复技术中的一个重要策略。 但由于重金属耐受及富集相关基因资源的缺乏、对植物富集耐受重金属的分子机 制及生理基础还缺乏详细全面的理解，限制了基因工程技术在植物修复上的应 用。本实验从东南景天( 出m 口珈瑚fh a n c e ) 叶片中分离c d 诱导表达的c d n a 片段，拟找出耐受及富集镉相关基因，以期从分子水平上为阐述东南景天耐受或 富集镉的机制提供一定理论依据。 本论文选取锌，镉超富集植物东南景天为研究材料，以1 0 0 mc d c l 2 处理1 2 h 、2 4h 和4 8h 的东南景天叶片混合m r n a 为检测子( t e s t c r ) ，2 0 0 儿m k c l 作 相同时间处理的东南景天叶片混合m r n a 为驱赶子( d r i v e r ) ，采用抑制消减杂 交技术( s u p p r e s s i o ns u b 虹a 吐i v eh y b r i d i z a t i o n ，s s h ) ，以p g e 州。一te a s y 为载体转 化j m l 0 9 细胞构建了c d 胁迫下东南景天中差异表达c d n a 文库。从文库中随机 挑取5 8 个克隆测序后获得2 9 个片段大小为1 3 2 5 8 3b p 的独立c d n a 片段。对 这2 9 个c d n a 片段的序列进行相似性分析发现，其中有7 个c d n a 片段与已报 道的胁迫相关的功能基因相似性较高( 7 9 9 0 ) 。它们分别是与环境胁迫信 号传导相关的s 一受体蛋白激酶基因、l r r 一受体蛋白激酶基因和s h a g g y - 相关的蛋 白激酶基因；与重金属解毒相关的谷胱甘肽s 转移酶基因、醌氧化还原酶基团、 中山大学硕士学位论文 醇脱氢酶基因；及调控转录相关的类基础转录因子。 上述结果表明，东南景天在c d 胁迫下，可能通过受体蛋白激酶及s h a g g y - 相关的蛋白激酶传导胁迫信号，经转录因子调控相关基因表达，而谷胱甘肽转移 酶、醌氧化还原酶及醇脱氢酶可能在东南景天耐受c d 胁迫中发挥作用。 关键词：东南景天，镉胁迫，抑制消减杂交 m 主些查堂堡主堂垡堡皇 一 s c r e e n i n go fd i f f e r e n t i a u ye x p r e s s e dg e n e s i ns p d 髓m 口勿m h a n c er e l a t e dt oc d 2 + s t r e s s w a n gs h e n g l o n g m a j o r ：e c o l o g y s u p e r v i s o r ： p r o f s h uw e n s h e n g a b s t r a c t c u r r e n t l y t h eg e n ee n g i n r i i l g t 1 1 a tc l o n et h ci m t a lr e s i s t a l l c e r e l a t e do r a c c u m u h t i o n r e l a t e dg 锄e si n t op l a m sl l a sa h a d yb e c o m eo n eo ft h e 脚s ti i n p o r t a m s 仃砒c g i e sf o rp h y t o r e m e d i a t i o n h o w e v e r ，t h el a c k i l l go f g e n er e s o u r c e sr e l a t e dh e a v y m e t a lr e s i s t a n c eo ra c c u 瑚u l a t i o na n dt h ep o o rh o w l e d g ea b o u tt h em e c h a n i s m so f r c s i s t a n c eo ra c c 呲u l a t i o nt o h e a v ym e t a li np l a n tr e s t r i c ti t s 印p l i c a t i o ni n p h ”o r e m e d i a t i o n i nt h i se x p e r i i n e m ，w ei s o h t e dt h cg e n e sr e h t e dt oc + s t r e s s 丘d mt h ek a v e so f 曲幽肌口批硪fh a n c e ，协o r d e rt of m do u tt h eg e n e sr e l a t e dt oc d r e s i s t 锄c eo ra c c u m u l a t i o n ，a n dg i v es o m ee v i d e n c e sf o re l u c i d a t i n gt h eu n d e r l y i n g m e c h a n i s m si m r o l v e di l lc dr e s i s t a l l c eo r h y p e r a c c u m u l a t i o ni n 口沁讲f t h ez 1 1 c dh y p e r a c c u r n u l a t o rs 帕讲fc o l l e c t e d 丘o ma no l dp b z nm 协m go f z h c j i a n gp r o v i n c ew a su s e di i l t h i se x p e r i m e n t u s i i l gs u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v e b y b r i d i 龃t i o n ( s s h ) t e c l l n i q u e ，t h ed i 髓r e n c eo f t h em i x e dl n i a b e t w e e nt h ek a v e s o f s 口撇锄h 姐c ew h i c h 粤删血q u a r t e ro f h o a 9 1 a n dw i t h1 0 0h mc d c l 2f o r1 2 h o u r s ，2 4h o u r sa n d4 8h o u r s ( t e s t e r ) a n d1 e a v e so f s 面制hw h i c hg m w nmq u a r t e r o fh o a g l a i l dw i n l2 0 0 肛mk c lf o rc o r r e s p o n d i n gt i m e s ( d r i v e r ) w e r ec o n 驴a r e d t h e m i x t u r eo fs u b t r a c t e dd n a 劬g m e n f sw e r ec 1 0 n e di n t op g e m 一te a s yc a r r i e ra n d t r a i l s f o r 玎di n t oec o l is t r a i nj m l 0 9t oe s t a b l i s ht h ed i f r c r e m i a l l ye x p r e s s e dc d n a 生坐查堂堡堂堡丝兰 l i b r a r yi n & 伊硝fr e l a t e dt oc d 2 + s t r e s s f i r y e i g h cc 1 0 n e sw e r es e l e c t e dr a n d o l l l l ya n ds e q u e n c e d t h er e s u l ts h o w e d t h c yb e l o n g e dt o2 9d i 彘r e n tc 1 0 n e s ，t h el e n g t ho f w h i c h w a sa b o u t1 3 2 5 8 3b p t h e 2 9 丘a g m e m sw c f es e a r c l e dh o m o l o g i c a l l y 证g e n b a i ) k ，a n d7c l o n e so ft h e mw e r e h i g hh o m o l o g yw i t hn m c t i o ng c n c sr e l a t e dt os 仃e s s 3c l o n e so fw h i c ha s s o c i a t e d w 记hs i g n a lc o n d u c t i o nr e l a t e dt os t r e s so fc j f c u m s t a n c ef o ri n s t a n c es r e c e p t o r k i 衄s e 1 j k ep r o t e j n ，s b a g g y - r e l a t e dp r o t e i nk i n a s e 卸dl r rr c c c p t o r l i k ek i t l a s eg e n e s ； 3c l o n e sa s s o c i a t e dw i t hd e t o x i f i c a t i o na _ b o u th e a v e m e t a ll i k e g k t a t h i o n c s t 啪s 断a s e ，q u i n o n eo x i d o r e d u c t a s ea n da l c o h o ld e h y d r o g c n a s eg e n e s ；0 n ec l o n e a s s o c i a t e dw i t ht m 璐c r i p t i o nr e g u l a t i o n ： b t f 3 - h k e 圩a 璐c 啷t i o n 蠡虻t o r t h c s ef i i l d i n g ss u g g c s tt h a t r e c 印t o r _ l i k e k i n a s ea 1 1 d s h a g g y r e l a t e dp r o t e i n k 妇s em a yt r a 璐m i t 也es i g n a lr c l a t e dt oc 矛+ s 仃e s s ，m e nr e g u l a t e dt h ee x p r e s s i o no f c o r r e h t i v eg c n e sb yb t f 3 一l i k et r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，a n dg h n a m i o n cs t r a 【l s f e r a s e ， q u i n o n eo x i d o r e d u c t a s ea n da l c o b 0 1d e h y d r o g e n a s em a yp i a ya ni 1 1 】p o r t a n tr o l ci n r e s i s t i n gc + s t r e s si n 的硪f k e yw o r d s ：蚴删d 犯西fh 柚c e ，c d 2 + s 仃e s s ，s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n v 中山大学硕士学位论文 本研究受 国家“8 6 3 项目( n o 2 0 0 1 a a 6 4 5 0 1 0 3 ) 霍英东青年基金优选资助项目州o 9 4 0 2 2 ) a c k n o 、l e d g e m e n t s 资助 t h ep r e s e n tr e s e a r c hi sf i n a n c e db y 8 6 3 g r a n t ( n o 2 0 0 1 a a 6 4 5 0 1 0 3 ) a n dh u o y i n g d o n gf u n d a n d a w a r df b r y o u n gf a c u l t y m e m b e r se x c e l l e n t s u p p o r t e dp r o j e c t s ( n o 9 4 0 2 2 ) 中山大学硕士学位论文 b p c p l t c d n a d e p c d n a m 町t p d t t e t b r e d t a i p t g l b b m e p c r p o d r n a s d s s s h t a e u x g a l b a s e p a i r c a t a l a s e 缩略词表 碱基对 过氧化氢酶 c o i 印l e m e n t a r yd n a补脱氧核糖核酸 d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e焦炭酸二乙酯 d e o x y r i b o n u c k i ca c i d脱氧核糖核酸 d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e d i t h i o t h r e i t o l 脱氧核苷三磷酸 二硫苏糖醇 e t h d i u mb r o 商d e 溴化乙锭 e t h y k n ed i a m h l et e t m c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 i s o p r o p y l - p d t h i o g a l a c t o s i d e丙基一b d 硫代半乳糖苷 u b r i ab r o 也 p - m e r c 印t o e t h 觚o l p 0 1 y m e r a s ec h a i l lr e a c t i o n p e r o x i d a s e r i b o n u c l e i ca c i d l b 培养基 b 一巯基乙醇 聚合酶链式反应 过氧化物酶 核糖核酸 s o d i u md o d e c y ls i l l f a t e 十二烷基磺酸钠 s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d j z a t i o n 抑制消减杂交 t r i s a c e t i ce l e c t r o p h o r e s i s 乙酸电泳缓冲液 m i t 酶活力单位 5 一b r o t n 0 4 c h i o r o 一3 一i n d o l y l b d g a i a c t o p y m n o s i d e 5 一溴一4 一氯一3 一吲哚d 半乳糖苷 中山大学硕士学位论文 前言 c d 是毒性最强豹重金属之一。作为一种痕量重金属元素，c d 在未污染土壤 中主要来源于其成土的母质，一般情况下其含量范围为0 o l 0 1 7 坦k g ( 王云和 魏复盛，1 9 9 5 ) 。但由于大气沉降、采矿、冶炼、工业废物排放、污灌、施用污 泥及磷肥等自然及人为因素的影响，加快了c d 进入土壤的速度，而c d 在土壤中 又具有稳定、易积累和不易消除的特点，因此土壤环境中的c d 具有长期积累和 富集的趋势。随着环境中c d 污染范围的扩大和强度的增加，被生物有机体吸收 富集的量也相应增大，既可以直接对植物造成不同程度的生理伤害甚者致死，又 可以随着食物链的逐级放大作用使食物链的高级消费者动物和人类受到危 害。六十年代，在日本发生的第二公害病骨痛病，便是由于食用被c d 废水 污染的土壤生产的“镉米”所致( 江行玉和赵可夫，2 0 0 1 ) 。我国约有1 万多公 顷农地受到重金属c d 的污染，每年生产的镉米高达5 万吨以上，因污染而损失的 粮食约1 2 0 0 万吨，严重影响了我国的粮食生产和食品安全( 陈怀满，1 9 9 6 ) 。正 是由于c d 污染的范围广和危害性大的特点，土壤c d 污染的治理问题长期以来都 是世界关注的焦点问题。 在众多土壤重金属污染修复技术中，植物修复方法以安全、廉价、修复彻底 的特点成为研究和开发的热点。但其自身仍存在着许多不足：超富集植物通常生 物量低、生长缓慢、本地种缺乏、适应能力差并且通常一种植物只富集一种重金 属。这些缺点成了植物修复技术推广应用的瓶颈。而解决这一问题的有效途径就 是研究重金属对植物的毒害机制及植物耐受、富集重金属的机理，利用基因工程 的手段获得相关基因，进而提高植物对重金属的耐受富集能力、改良其生长特性。 1 1c d 污染对植物产生毒害的机制 环境中的c d 除了直接改变生态环境的物质形态及结构组成而对环境造成破 坏外，更是对生物体的生理功能造成损伤，其毒害机制主要有如下几个方面： 中山大学硕士学位论文 1 1 1c d 与d n a 损伤、癌基因表达 近2 0 年来，国内外科学家关于c d 对机体健康的影响展开了广泛的研究。研 究表明，c d 具有致癌、致畸和致突变作用( d e g r a e v e ，1 9 8 1 ) 。1 9 9 3 年国际癌症 研究机构( i a r c ) 明确指出，c d 是人类和实验动物肺癌的肯定致癌物，且已被 i a r c 归类为第一类致癌物。有关c d 的致癌作用，近年来在分子水平上展开了广 泛的研究，涉及到d n a 损伤、基因调节和细胞信号传导、细胞凋亡等方面。 b e y e r s m a n n 和h e c h t e n b e r g 的研究表明，c 荫引起d n a 损伤、使d n a 单链断裂， c d 还能影响哺乳动物基因调节和细胞信号传导( b e y e r s m 锄na n dh e c h t e n b e r g ， 1 9 9 7 ) ；c d 也能诱导多个细胞系的凋亡( h a b e e b u 等，1 9 9 8 ) 。h a s s o u n 和s t 0 1 1 s ( 1 9 9 6 ) 在研究c d 对巨噬细胞的毒性实验中也发现c d 引起了d 1 町a 单链断裂。任 何d n a 损伤，只要修复无误，突变就不会发生，如果修复错误或没有修复，即 可导致损伤，发生突变。 因此在任何指定的时间范围内观察到的d n a 损伤程度 是e l n a 损伤与d n a 修复之间相互平衡的结果，在c d 的作用下，d n a 损伤的明显 增强，是由于c d 既诱导了d n a 损伤，同时又损害了d n a 修复系统( h a n 而g ， 1 9 9 4 ) 。c d 对d n a 修复系统的损伤是因为其抑制d n a 聚合酶b 的活性，减少d n a 合成，而且d n a 聚合酶在碱基配对中的高保真性也因c d 而下降( h a n w i g 等， 1 9 9 6 ) 。余日安等( 2 0 0 1 ) 应甩n o r t h e m 斑点杂交方法研究氯化镉对大鼠肝细胞 原癌基因c 岛s 、c j u n 表达的影响，发现c d 通过造成氧化应激，引起d n a 损伤，增 加细胞内钙浓度，并激活蛋白激酶c ，使c f o s 、c j u n 等表达增加，产生肿瘤反应。 杨居荣等( 1 9 9 5 b ) 以玉米、大豆等为实验材料，用镉处理后提取d n a 。发现所 提取d n a 量比对照少5 0 左右。目前，这方面的研究都是以人类和动物为对象， 以植物为实验材料的报道很少，但d n a 的复制及修复机理在动植物中的致性， 也决定了c d 会对植物d n a 造成损伤的可能。 1 1 2 对光合作用的抑制 c d 是光合作用的一种有效抑制剂，在影响到光合之前，c d 首先影响光合色 素，使叶绿素总含量和叶绿素“b 比值都下降，叶绿素含量和光合强度随c d 浓度 增加而下降( 李元等，1 9 9 2 ；陈国祥等，1 9 9 9 ) 。例如，c d 污染后番茄的叶绿素 a 和叶绿素b 含量均随c d 浓度增大而减少，a b 值随c d 浓度增大而增大，表明c d 对 2 中山大学硕士学位论文 番茄叶绿素b 的影响比对叶绿素a 的影响大( g i l 等，1 9 9 5 ) 。一般说来，重金属对 类胡萝h 素的影响比叶绿素小，但明显降低高等植物叶绿素类胡萝h 素比值， 并抑制p s i i 及光合磷酸化。有报道，c d 对p s 的抑制，可能是通过锰蛋白影响 光解系统造成的( p r a s a d ，1 9 9 5 ) 。但杨丹慧等( 1 9 9 0 ) 发现，c d 2 + 处理菠菜后叶 绿体类囊体膜中光系统i i 捕光叶绿素蛋白质复合物l h ci i 的部分寡聚体解聚成 单体，且l h c i i 的总量也减少了。而u c i i 在光能吸收、传递以及激发能在两个 光系统间的分配和调节方面起着重要作用，因此部分l h ci i 解聚和总量减少必然 导致由l h ci i 捕获并向光系统i i 中心传递的能量减少。a t a l 等( 1 9 9 1 ) 还发现， c d 2 + 处理后的叶绿体电子传递活性比放氧活性更快下降，这意味着p s1 i 氧化侧不 是c d ”的唯一作用部位，在p si i 与p si 之间的电子传递链上还存在对c d 2 + 敏感的 部位。木豆( 归”驸蝴l - ) 营养生长阶段用2 0m mc d 2 + 处理，一天后c 0 2 交 换率即被抑制8 7 ，气孑l 导度和蒸腾作用率也相应降低。c d 使木豆c 0 2 交换率降 低并不是菜单一因素作用的结果，而是因其对气孔导度、叶绿素含量和光合作用 器官功髓的综合影响引起的( s h c o r a n 等，1 9 9 0 ) 。c d 使叶绿素含量降低很可能是 由于c d 在叶片局部累积过多，与叶绿体中蛋白质上的巯基( s h ) 结合或取代其 中的f e ”、z n 2 + 、m 9 2 + 等，从而破坏了叶绿体的结构和功能活性( 孙赛初等，1 9 8 5 ) 。 c d 使叶绿素酶活性增强导致叶绿素分解加快，导致叶绿素含量降低( n a g 等， 1 9 8 1 ) 。电子显微镜观察发现c d 使叶绿体的亚显微结构发生改变，叶绿体膜系 统受破坏，使得植物捕光能力大为降低，从而影响到光合作用等一系列功能的正 常进行( 彭鸣等，1 9 9 1 ) 。b a s z y n s k i 等在1 9 8 0 年的报道中指出，c d 对光系统i 的电子传递有抑制作用，对光系统i i 并无影响；1 9 8 9 年杨丹慧等人研究结果则表 明，c d 对光系统i 和光系统i i 均有影响，但对后者的影响更显著。她们的研究 还发现，c d 引起光系统i 捕光叶绿素蛋白质复合物部分解聚和总量减少。捕光 叶绿素蛋白质复合物在光能吸收、传递以及激发能在两个光系统间的分配和调节 方面起着重要作用，这种复合物的解聚和总量的减少必然影响光系统的正常发 挥，导致光合强度降低。但c d 对光系统i 的作用机理尚需要深入探讨。 1 1 3 对气孔功能的影响 c d 处理可使植物气孔阻力增加，是由于c d 可直接影响保卫细胞中离子和水 3 中山大学硕士学位论文 分的迁移。c d 对气孔功能的影响因浓度和处理时间的不同表现为以下几种情况 ( p r a s a d ，1 9 9 5 ) ：低浓度( 1 5 州) 和短时间( 7 2h 以下) c d 胁追下光合作 用增强、蔗糖浓度增大、渗透势降低、膨压增大，引起气孔开放根生长受到抑制， 但对叶片无毒害作用 较高浓度( 5 5 0u m ) 和较长时间( 3 周) c d 胁迫，根生 长被强烈抑制且叶片中c d 大量积累。由于根尖细胞退化，水分吸收和运输机制 遭到破坏，水势降低，细胞分裂素从根尖外运，a b a 水平提高，从而引起气孔关 闭。叶片表现出中毒和衰老的症状，如乙烯含量增加，细胞分裂素、多胺减少， 代谢遭到破坏，气孔控制丧失等。 1 1 4 对酶活性的影响 c d 通过对细胞膜的伤害，破坏细胞内酶及代谢作用的原有区域性，还可能 直接取代某些酶中与酶活性相关的微量元素或与酶中半胱氨酸残基键结合而使 酶结构受至n 破坏( 杨居荣等，1 9 9 5 c ) ，有关的酶活性也必然受到影响。孙光闻 等( 2 0 0 4 ) 用不同浓度的c d 处理白菜，发现当c d 浓度达到1 0 吲l 植株生长被显 著抑制，叶绿素含量减少；而c d 浓度是1m 班时过氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢 酶( c a = r ) 及抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 的活性显著增加；c d 为l om 虮时叶 片s o d 、c a t 、a p x 及p o d 活性显著降低，脱氢抗坏血酸还原酶( d r ) 和谷胱 甘肽还原酶( g r ) 活性却显著增加。 植物受c d 污染后s o d 、p o d 和c a t 活性会发生相应变化，但依品种及抗性的 不同而有所差别。例如，用c d 处理烟苗，p o d 活性提高( 李元等，1 9 9 2 ) ，用 1 0 8 0m j 矿l c d c l 2 溶液处理旱萝h 幼苗，虽然幼苗的生长受抑制，但p o d 活性无 变化。杨居荣等( 1 9 9 5 b ) 用c d 分别处理小麦、玉米、黄瓜和大豆，结果显示 耐性强的小麦的s o d 、p o d 和c a t 活性升高，雨耐性弱的大豆中的3 种酶活性均 降低，说明s o d 、p o d 和c a t 在植物抗c d 胁迫中起一定的作用。酶活性的变化趋 势还与c d 处理的浓度有关：当十壤c d 含量小于2 2 3m 舭g 时，桑树的p o d 、s o d 活性无睨显变化或有所增加；但当c d 含量超过2 2 3i n g m g 时s o d 活性则降低。当 c d 含量达1 4 5m g 瓜g 时，p o d 活性也明显下降( 陈朝明等，1 9 9 6 ) 。总之，c d 污 染可引起s o d 、p o d 和c a r 活性下降，但耐性植物在一定的c d 浓度范围内，3 种 酶的活性得以维持或提高，超过这个范围，它们的活性仍要下降，但下降的幅度 4 中山大学硕士学位论文 要比耐性弱的植物小( 杨居荣等，1 9 9 5 c ) 。 由此，对于耐性植物，酶的活性似 乎存在一个阈值，说明s o d 、p o d 和c a t 对膜系统的保护作用是有一定限度的。 此外，c d 对上述几种酶的同工酶谱也产生影响，但也有不同的情况。例如受c d 污染后玉米、西葫根内p o d 同工酶谱的带数减少且颜色深浅改变，而蔬菜幼苗却 增加一条新酶带，同时生长受抑制( 刘海亮等，1 9 9 1 ) 。 c d 还会抑制固氮酶、根系脱氢酶的活性。近几年的研究显示，c d 对淀粉酶、 脱氧核酸酶( d n a s e ) 、核糖核酸酶、硝酸还原酶、蛋白酶、多酚氧化酶、抗坏 血酸过氧化酶、乳酸脱氢酶等也有抑制作用( 段昌群和王焕校，1 9 9 8 ：罗立新等， 1 9 9 8 a ，1 9 9 8 b ) ，以上结果表明，c d 对氮代谢、呼吸作用、碳水化合物代谢和核 酸代谢等均有阻碍作用，但目前在这些方面的研究还较少，上述酶受抑制机理仍 有待深入研究。 1 1 5 对水分耐性的影响 通常c d 降低植物对水分胁迫的耐性，在相对水分含量和叶片水势较高时膨 压已丧失ac d 降低细胞壁弹性，这可能是造成水分胁迫耐性降低的主要原因。 c d 处理的植物也表现出蒸腾速率降低和气孔阻力增加。例如c d 显著降低向日葵 ( 胁，出n 西淞硎h “螂l i l l n ) 的蒸腾速率和相对水分含量，单位叶面积上气孔数量 增加而气孔面积减小( k a s t 删等，1 9 9 2 ) 。c d 影响蒸腾作用除通过改变气孔孔径 外，主要是通过影响水分吸收来实现的。据报道，c d 诱导木质部细胞壁退化， 而这种退化减少了水分的运输。由于水分运输的减少，加之水分吸收减少( 主要 由于根生长减少) ，从而引起c d 处理植株的萎蔫( p m s a d ，1 9 9 5 ) 。 1 2 植物对c d 的耐受及富集机理 如前面所述，c d 是毒性最强的重金属之一，进入植物体后会对造成一系列 生理生化毒害。但现在发现多种植物在含有高浓度c d 的环境中可以正常生长， 显示出极强的c d 毒耐性，其中部分物种还表现出对c d 超积累的特性。这些现象 说明植物自身具有对c d 耐受和富集的机制。这一机理已经成为当前植物逆境生 理研究的热点领域( 杨居荣和黄翌，1 9 9 4 ；段昌群和王焕校，1 9 9 5 ) 。尤其是近 5 中山大学硕士学位论文 几年，随着分子生物学等现代技术手段的引入，对忍耐机制的研究已经获得了 定进展，而对富集机制的研究则进展不大。 1 2 。1 对c d 毒性的耐受机制 c d 对植物的伤害是多方面的，相应地植物采取多方面的策略来抵抗或减弱 c d 胁迫的程度，如固定化、区域化及合成植物螯合肽、金属硫蛋白、应激蛋白、 应激乙烯等，概括分为三个方面：产生具有损伤修复功能的酶类及蛋白质；限制 c d 在体内所处的空间位置；形成能与c d 结合的物质，降低或消除c d 的生物有效 性。分述如下： ( 1 1限制c d 在体内所处的空间位置 c d 进入植物体的第一步是进入根系，而进入根系的c d 首先被根部细胞壁及 碳水化合物固定而束缚于果胶位点，限制c d 向植物体功能部位进一步转移而造 成广泛伤害，这是抗c d 胁迫的第一道屏障( 杨居荣和黄翌，1 9 9 4 ) 。c d 主要集 中在根部可能与c d 迸入根的皮层细胞后和根内蛋白质、多糖类、核糖类、核酸 等化合成为稳定的大分子络合物或不溶性有机大分子而沉积下来有关( 王焕校， 1 9 9 0 ) 。n i s h i z o n o 等在1 9 8 7 年报道，禾秆蹄盖蕨( 4 卿一“m 即勋s ，研) 的根所 吸收的重金属中有7 0 9 0 累集在根尖细胞壁上，这种沉积阻止了c d 进入原生 质，减轻其对植物的毒害( n i s h i z o n 0 等，1 9 8 7 ) 。对于普通植物及耐c d 植物来 说，c d 在植物体内的分布一般是根 茎 叶 籽实，但c d 富集植物的茎叶部所 含c d 浓度比根部c d 浓度大，这不但说明根部细胞壁的c d 固定作用不是普遍机制， 更说明超富集植物具有转运c d 和在茎叶部固定c d 的机制。例如芥菜将c d 超量富 集于叶片表皮毛中，使其含量比叶片组织高4 3 倍，消除c d 对叶肉细胞的直接伤 害( b h r n c y 等，1 9 8 6 ) 。杨居荣等( 1 9 9 3 ) 的研究结果表明，c d 在黄瓜、菠菜 中的可溶成分所占比例较大，为4 5 6 9 ，沉积于细胞壁的成分占2 5 2 1 o 也证明了c d 在根部及细胞壁沉淀并不是一个普遍起主导作用的区室化位点。液 泡也是一个区室化部位，例如，c d 通过根部进入植物体内部后，被植物屏蔽在 液泡内。在这一过程中液泡膜上的重金属离子氢离子反向转运蛋白( a t i p o r t o r ) 和依赖于a t p 的质子泵起着主要作用。自由c d 2 + 也可能通过c d 2 + 和2h t 反向运输 进入液泡。c d 2 + 进入液泡后，被限制于有限区域，不能在胞质溶胶中进行自由循 6 中山大学硕士学位论文 环，因而液泡固定化在排除c d 毒害方面也起重要作用。 ( 2 )形成能与c d 络合的物质，降低或消除c d 的生物有效性 植物体中形成的可与c d 络合的物质有c d 结合蛋白( c db i n d i n gp m t e i n ， c d b p ) 、植物螯络合素( p b 啤o c h e l a t 洫，p c ) 、金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i l l ， m r ) 、谷胱甘肽( g s h ) 、草酸组氨酸( h i s ) 、柠檬酸盐( c i t r a t e ) 等小分子 物质，它们通过与c d 的结合阻止自由c d 2 + 的循环，避免金属敏感酶变性失活，减 轻c d 对植物的伤害。 二十世纪八十年代初期，许多学者认为c d 能诱导植物形成c d 结合蛋白( c d b i n d i l l gp r o t e i n ) ，并且认为是植物对c d 耐性的主要生理机制( w e i g e la n dj a g e r ， 1 9 8 0 ) ，这种c d b p 分子量从3k d 到3 3k d 不等，氨基酸组成也比较特别，含有较 高的半胱氨酸、谷氨酸或谷酰胺和甘氨酸，而其它种类的氨基酸含量很少或没有 ( 李振国和余叔文，1 9 9 0 ) 。而且部分研究也得出了相关结论，何笃修等( 1 9 9 1 ) 从玉米中提纯获得的结合蛋白，蛋白与c d 的比例为l ：3 ；杨红玉和千焕校( 1 9 8 5 ) 报道c d 结合蛋白能够结合进入细胞的4 0 5 0 的c d ，c d 和c d 结合蛋白复合物 的形成限制了c d 以自由态存在，减轻了c d 对植物的毒害。 1 9 8 5 年开始，以g r i l l 为先导的另外一些学者在植物中分离得到的另一类被称 为植物络合素( p h 舛o c h e l a t i l l ，p c ) 的多肽络合物是一种由半胱氨酸、谷氨酸和 甘氨酸组成的c d 络合多肽，其分子量比较低，一般为2 4k d ，且具有( 而l u c v s ) 。g 1 y ( 舻2 1 1 )的一般化学式( g r i l l 等，1 9 8 5 ；s t e 腩n s 等，1 9 8 6 ) 。p c 的发 现，使人们对c d 结合蛋白的存在及相关的解毒机理产生了怀疑，转而认为p c 的 形成，才是植物解毒的生理机制之一( g m l 等，1 9 8 7 ； c o b b e t t ，2 0 0 0 ) ，而以 前报道的c d 结合蛋白可能是提取过程中的p c 聚合物或由于产物不纯所引起 ( m u l l i g a n 等，1 9 9 9 ) ，而且c d b p 和p c 的氨基酸组成相似，这点也说明c d b p 是 p c 聚合形成的。大量研究表明，p c 介导植物对高浓度c d 2 + 耐受，其原理是c d 2 + 以低毒c d p c 复合物形式进入细胞的液泡内( c l e m e n s 等，1 9 9 9 ) 。若机体缺失p c 则会丧失对镉的耐受功麓，如拟南芥和裂殖酵母p c 缺失突变体对c d 及砷酸根离 子高度敏感。g r i ( 1 9 9 2 ) 的研究结果也表明，p c 能结合十多种高等植物所吸收 的9 0 的c d 。v e r k l e i j 等( 1 9 8 5 ) 也报道，根系所吸收的c d 至少有6 0 被结合生 7 中山大学硕上学位论文 成p c 。迄今，已从蛇木根、烟叶、毛曼陀罗、菜豆、玉米、番茄、甘蓝和小麦 等植物中发现到p c 的存在。但近年来，一些学者对p c 的解毒效果却也产生了怀 疑。有研究表明，耐性作物体内的c d p c 反而比非耐性作物低( 杨居荣等，1 9 9 5 a ) ， 部分原因可能是c d 与功能蛋白相结合，使耐性降低。因此，c d b p 或c d p c 的形成， 也许是某些植物耐c d 的重要机制，但其能力是有限的，植物中可能还存在未被 发现的其它解毒机制。 另一种被认为在植物中发挥耐c d 作用的蛋白类是金属硫蛋白m t ( m e t a u o t h i o n e i l l ，m t ) 。m t 是由核基因编码、低分子量、富含半胱氨酸、能 与金属结合的一类多肽的总称，普遍存在于动物、植物和原核生物中。它与p c 的本质区别在于m t 由基因直接编码，而p c s 是在p c s 合成酶的催化下完成。与p c s 一样，m t 能够通过巯基与金属离子结合，从而降低重金属离子的毒性( v a n 等， 2 0 0 1 ) 。将从重金属耐性植物紫羊茅草( 鼢m 埘6 阳)中克隆到的m t l 的全 长c d n a ，转入到酵母m t 基因缺失突变株中发现，m t l 的表达增加了酵母细胞对 c u 、c d 和p b 的抗性( 王剑虹和麻密，2 0 0 0 ) 。在拟南芥和蚕豆中，m r 主要在毛 状体中表达( f o l e ya n ds i n g h ，1 9 9 4 ) ，而c d 等许多有毒重金属离子也在毛状体 中累积( s a l t 等，1 9 9 5 ) ，暗示m t 和重金属累积有某种联系。豌豆( p 捃 ls 口咖所) 1 型m t 基因p s m t a 在e z 冲表达，其产物可结合c d 2 + ( t o m m e y 等，1 9 9 1 ) 。有 人把来自不同主体的m r 基因，包括鼠m t i 、人类m t n 、人类m t i i 及中国仓鼠 m r i i ，转入j ! c 0 妇船缸6 伽“m ( 烟草属) 中，结果发现其对c d 的忍耐性都出现不 同程度的提高，最高提高了2 0 倍( p a l l 等，1 9 9 3 ；莫华等，1 9 9 6 ) 。 ( 3 )产生具有损伤修复功能的酶或蛋白质 c d 对植物生理生长的直接胁迫是破坏植物膜系统( s c h u t z e n d u b e l 等，2 0 0 1 ) ， 积累活性氧类物质( a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，a o s ) ，如超氧化物( s u p e m x i d e ) ， 过氧化物( p e r o x i d e ) 等自由基，对植物造成一系列氧化破坏作用。而植物也具 有一系列抗氧化酶抵抗c d 的氧化胁迫，如超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化物 酶( p o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、抗坏血酸过氧化物酶( a s c o f b a t ed e r o x 试a s e ) 以及非酶的抗氧化物，如胱氨酸、硫醇类、谷胱甘肽和抗坏血酸( a s a ) 等( 张 承东等，2 0 0 1 ) 。 b 中山犬学硕士学位论文 在植物体内，s o d 使超氧化物还原为过氧化物，后者被c a t 还原为水和氧气 从而清除c d 胁迫下产生的活性氧类物质，抵抗c d 的氧化胁迫( 罗立新等，1 9 9 8 a ， b ：王宏镔等，2 0 0 2 ) 。从超富集植物rc 韶妇删s 和非超富集植物烟草根部的 s o d 、c a t 以及谷胱甘肽等的含量中也发现，前者s o d 活性比后者高2 倍，比c a t 活性高3 0 0 倍以上，比谷胱甘肽高4 倍。当这两种植物同时接触高浓度c d 时，前 者体内的h 2 0 2 浓度没有明显变化，而后者体内的h 2 0 2 较对照植株( 不接触c d ) 的高5 倍( p e r s a i l s 等，1 9 9 9 ) ，这一现象也进一步说明抗氧化物酶在植物耐受c d 毒方面起到相当重要作用。抗氧化酶在植物耐受重金属方面起重要作用的更直 接证据是重金属可使某些植物的抗氧化酶活性增强，如木本植物勋，打口啪d p 砂妇 能超富集c u 、n i 和p b ，当土壤中c u 、n i 或p b 的浓度达到1 0 0 0 0m g l 时，该植物 体内的过氧化物酶活性增强2 倍以上，s o d 活性提高3 倍左右( a l i 等，2 0 0 3 ) 。 抗坏血酸过氧化物酶( a s p ) 和谷胱甘肽还原酶( g r ) 均为植物细胞内清 除h 2 0 2 的重要酶类，而缸a 和g s h 则是植物体内有效抗氧化剂。它们的含量和活 性变化与植物防御活性氧自由基伤害的能力水平相关。g s h 既能抵抗氧化剂对巯 基( s h ) 的破坏，保护细胞膜中含s h 的蛋白质和酶不被氧化，还与a 一生育酚 协调作用，清除细胞中积累的氧自由基。并且g s h 与c d “有较高亲和力，在植物 合成大量p c 前，g s h 作为主要防御体系发挥作用，与c d 螯合，减轻其毒害作用。 w u 等( 2 0 0 3 ) 的实验也对本观点给出了很好的例证：o 5u mc d 2 + 处理大麦5d ， g s h 的含量出现短时间增加，但随着c d 处理延长( 1 0d ) ，其含量反而显著下降。 分析g s h 短时间增加可能是植物对胁迫的一种适应性反应，即在低浓度c d 胁迫 时，植物体内通过自身调节，诱发了抗氧化剂g s h 的合成，以限制脂质过氧化， 增强抗逆性。c d 胁迫时间延长导致大麦幼苗g s h 含量的急剧下降，这可能是大 量g s h 用于c d 解毒，如g s h 作为p c 合成的底物，或作为抗氧化剂清除生物体内 活性氧自由基而生成g s s g ，从而表现为含量下降。对抗坏血酸( a s a ) 等自由 基清除剂研究发现，舡a 通过促进c u 、f e 等微量元素运输，提高地上部c u 、f e 等微量元素含量，避免c d 毒害带来的营养元素缺乏症( 、ua n dz h a n g ，2 0 0 2 ) ； 赵博生和莫华( 1 9 9 7 ) 以大蒜为实验材料，在其根尖生长受不同浓度的c d 毒害 后，再以抗坏血酸和铁盐进行处理，具有一定解毒效应，抗坏血酸可能通过清除 自由基，恢复膜、酶、d n a 的功能，导致蛋白质合成增加，并产生新的抗性蛋 9 中山大学硕士学位论文 白，从而起到解毒作用( 赵博生和莫华，1 9 9 7 ) 。例如在c d 胁迫溶液中加入a s a 对c d 毒害大麦幼苗的生长具有一定的缓解效应，a s a 的存在也增加了麦类作物干 物质积累，但c ( 恸迫加重时