（生态学专业论文）蚯蚓（eisenia+fetida）生态免疫系统研究Ⅰ——体壁屏障系统及协同防御机理.pdf

摘要 本研究以动物免疫学、生态学、生物化学为指导思想，以蚯蚓的生态免疫系统为主线，探讨 了赤子爱胜蚓的体壁屏障系统( 包括皮肤的物理排除作用和随体表粘液分泌排除) 和协同防御作 用在其免疫系统中的作用。论文主要分为以下几个部分： 第部分，分析了角质层和表皮在蚯蚓抗菌生态免疫系统中的作用。结果表明：蚯蚓的体壁 主要是通过以下途径来抗细菌的侵袭：一是通过角质层的变化( 如上胶层突起的增厚、上角层游 离面中微绒毛的变长等) 直接抵抗微生物的入侵；二是增加表皮中大颗粒粘液细胞和网状细胞的 分泌功能，分泌出大量含有粘多糖蛋白液体复合物的粘液，在蚯蚓体表对细菌进行稀释或者起到 直接杀菌的作用；三是通过增加小颗粒蛋白细胞的分泌作用，在蚯蚓的表皮中分泌出更多的抵抗 疾病的中性粘多糖，从而抵抗进入蚯蚓体表内的细菌。 第二部分，探讨了体表粘液在蚯蚓抗菌生态免疫系统中的作用。结果表明：( i ) 蚯蚓的体表 粘液具有抑菌作用，当浓度为0 2 9 m l 时对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为1 2 2 厘米；其次为大 肠杆菌，扣菌圈直径为1 1 3 厘米，对绿脓杆菌的抑菌作用最差，仅为0 9 8 厘米，诱导后蚯蚓体表 粘液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用显著增加，差异极显著( p o 叭) ，但对绿脓杆菌 的抑菌作用没有显著增加。( 2 ) 经过s e p h a d e xg 7 5 ，g - - 5 0 ，g 2 5 三步层析从蚯蚓的体表粘液 中分离到抗菌肽粗品e s p ，再经过反相高效液相色谱纯化后，得到了一种全新的蚯蚓抗菌肽e s p l 。其是由1 6 种氨基酸的5 0 个残基组成，其中丝氨酸( s e r ) 残基最多，为1 0 个。经基质辅助 激光解吸离子化( m a l d i ) 和飞行时间质谱仅( t t o f m s ) 相结合的方法测得e s p i 的分子量为 5 8 1 4 3 2 。e s p l 对大肠杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的屉低抑菌浓度分别为：6 2 5 m g m l ， 1 2 5 m g m l ；5 0 m g m l 。( 3 ) 从蚯蚓的体表粘液中分离出具有抗菌活力和溶菌活力的凝集素粗品， 含糖量为1 6 6 - t - 0 1 6 ，并且在细菌诱导后凝集素的含穗量显著提高，为3 7 5 4 - 0 1 3 ，对大肠杆 菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活力增强。 第三部分，探讨了脂肪及脂肪酸在蚯蚓抗菌生态免疫系统中的作用，结果表明：蚯蚓脂肪的 抑菌作用具有选择性，对大肠杆菌的抑菌作用最强，抑菌圈直径为1 3 2 厘米；其次为绿脓杆菌， 抑菌圈直径为o 9 7 厘米，但是对金黄色葡萄球菌没有抑菌作用：大肠杆菌诱导后，蚯蚓脂肪对绿 脓杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用增强，但是对大肠杆菌的抑制作用减弱。由此可见，蚯蚓的 脂肪代谢在蚯蚓的生态免疫过程中发挥着重要作用。 第四部分，探讨了多糖在蚯蚓抗菌生态免疫系统中的作用，从蚯蚓的体壁中分离出具有广谱 抗菌活性的粘多糖，并通过高效液相色谱一一质谱联用仪分析，得出纯化出的两种粘多糖都是由 5 个分子组成，其中保留时间为5 3 分钟的糖的分子量为5 3 4 ，通过质谱图的解谱，可以推断这种 糖的组成为：o l u ( 葡萄糖) - x y l ( 术糖) 一g l u ( 葡萄糖) x y l ( 木糖) 而保留时间为6 分钟的糖 的分子量为4 5 2 ，组成可能是g l u ( 葡萄糖) r h a ( 鼠李糖) r h a ( 鼠李糖)或r h a ( 鼠李糖) - - g l u ( 葡萄糖) 一r h a ( 鼠李糖) 。保留时间为6 7 分钟的分离峰，糖的分子量为6 7 8 ，组成为 g l u ( 葡萄糖) 一g l u ( 葡萄糖) - - g l u ( 葡萄糖) - - x y l ( 木糖) - - x y l ( 木糖) ，另外两种化合物 为未知化合物。 第五部分，探讨了体腔液中不同组分的抗菌蛋白在蚯蚓抗菌生态免疫系统中的协同作用。结 中国农业大学博士学位论文 摘要 果表明：分子量在4 0 0 0 1 0 0 0 时，对大肠杆菌的抗菌活力最强，分子量大于1 0 0 0 0 时，对绿脓杆 菌的抗菌活力最强，在1 0 0 0 0 - - 4 0 0 0 时，对金黄色葡萄球菌的抑菌活力最强，而分子量小于1 0 0 0 时，对三种细菌都有抑菌活力。而分子鼍在1 0 0 0 0 4 0 0 0 溶菌活力最强，并且分子量在4 0 0 0 一1 0 0 0 时，都没有溶菌活力。 第六部分，分析表明在蚯蚓的体壁屏障系统中，组织间，物理排除和随分泌排除之间以及抗 菌物质问都具有协同作用。体表粘液和体腔液中的抗菌蛋白之间、凝集素之间及凝集素中的糖和 蛋白之间在抗菌过程中也都具有协同作用。 本研究为一探索性研究，其创新之处为：首次证明了体表粘液在蚯蚓抗菌生态免疫系统中的 作用，并从体表粘液中发现了一种新的抗菌肽e s p 1 。同时验证了脂肪、多糖在蚯蚓抗菌免疫中 的作用。 关键词：蚯蚓，抗菌屏障，协同作用，蚯蚓粘多糖，蚯蚓脂肪 l l a b s t r a c t t h ee f f e c t so fa n t i b i o t i cb a r r i e r ( p h y s i c a la n dm u c i l a g i n o u se l i m i n a t i o n ) a n dj o i n tp r e v e n t i o ni n t h ea n t i b a c t e r i a li m m u n i t ys y s t e mo fe i s e n i a 拍t i d aw e r ea n a l y z e di nt h i ss t u d yb ya p p l y i n ga n i m a l i m m u n o l o g y , e c o l o g ya n db i o c h e m i s n _ y t h em a i nr e s u l t so f t h i ss t u d yw e r ea st h ef o l l o w i n g s t h ef i r s tp a r to ft h i ss t u d yr e s e a r c h e dt h ei n f l u e n c eo fb a c t e r i u mi n d u c e m e n to nt h eu l r a s i r u c t u r e i n t e g u m e n t a r ys y s t e mi ne i s e n i af e t i d a ，a n t i b a c t e r i a lf u n c t i o no fb o d yw a l lw a sc o n d u c t e db yt h e f o l l o w i n gw a y ：m i c r o o r g a n i s mw a sd i r e c t l yr e s i s t e dt h r o u g ht h ec h a n g eo fc u t i c l e ，s u c ha si n c r a s s a t i o n o fu p c u t i c l ep r o t u b e r a n c ea n di n c r e a s i n gl e n g t ho fm i c r o f l o c c u si nt h e u p c u t i c l ed i s s o c i a t i o n s u r f a c e ；e x u d a t i o nf u n c t i o no fl a r g eg r a n u l a ro r t h o c h r o m a t i cm u c o u sc e l l sa n dr e t i c u l a t i o nm u c o u s c e l l si nt h ee p i d e r m i sc o u l db ee n h a n c e dw h e nt h ee i s e n i a f e t i d aw a si n d u c e db yec o l im o r e o v e r ，t h e m u c u st h a tc o n t a i n e d c o m p o u n ds u b s t a n c eo fm u c o p o l y s a e c h a r i d ea n dp r o t e i nc o u l d m a k et h e b a c t e r i c i d a lf u n c t i o no rd i l u t e t h em i c r o o r g a n i s mo nt h es u r f a c eo fe a r t h w o r m ，w h i c hc o u l dp r o t e c t e a r t h w o r mf r o mi n v a s i o no fm i c r o o r g a n i s m ；t h ec o n t e n to fn e u t r a lm u c o p o l y s a c c h a r i d eo fa n t i b a c t e r i a l f u n c t i o nc o u l db ei n c r e a s e da c c o r d i n gw i t ht h ee x u d a t i o ni n c r e m e n to fs m a l lg r a n u l a rp r o t e i n a c e o u s c e l l si nt h ee p i d e r m i s ，w h i c hc o u l dr e s i s tb a c t e r i ai n v a d i n gi n t ot h ee p i d e r m i so f e a r t h w o r m t h es e c o n dp a r to ft h i ss t u d yr e s e a r c h e dt h ef u n c t i o no fs k i ns e c r e t i o n si nt h ea n t i b a c t e r i a l i m m u n i t ye c o s y s t e mo fe i s e n i af o e t i d a i tw a ss h o w n ：t h ea n t i b a c t e r i a lf u n c t i o no fe a r t h w o r ms k i n s e c r e t i o n st os t a p h y l o c o c c u sa u g e u sw a st h eb e s t dt h ed i a m e t e ro fb a c t e r i o s t a s i sc i r c l ew a s1 2 2 c e n t i m e t e r t h o s et oe s c h e r i c k d ac o l ia n dp s e u d o m o n a sa e r u g i n o s aw e r e1 1 3c e n t i m e t e ra n do 9 8 c e n t i m e t e rr e s p e c t i v e l y a f t e rt h ee a r t h w o r mw a si n d u c e db ye s c h e r i c h i ac o l i , t h eb a c t e r i o s t a s i s i n f l u e n c eo fe a r t h w o r ms k i ns e c r e t i o n st oe s c h e r i c h i ac o l ia n ds t a p h y l o c o c c u so l t r e u sw e r ei n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y ( p 1 0 0 0 0d ) w e r et h eb e s t t o p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a a l lt h ep r o t e i n s ( 1 0 0 0d ) h a dt h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e st o 丘c h e r i c h i a c o l i ， s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa n dp s e u d o m o n a sa e r u g i n o s am o r e o v e r , t h ep r o t e i n s ( 4 0 0 0d 一1 0 0 0d 1h a dn o b a c t e r i o l y t i ca c t i v i t i e s ，b u tt h eb a c t e r i o l y t i ca c t i v i t i e so f t h ep r o t e i n s ( 1 0 0 0 0d - - 4 0 0 0d ) w e r et h eb e s t i tc o u l db ec o n c l u d e dt h a tt h e r ew e r es o m ec o o p e r a t i o na m o n gd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h tp r o t e i n si nt h e a n t i b a c t e r i a li m m u n i t ys y s t e mo f e i s e n i a f e a d a i nt h ea n t i b i o t i cb a r r i e rs y s t e mo fe a r t h w o r m ，t h ej o i n tp r e v e n t i o nc o u l d b ef o u n di nt h e t i s s u es y s t e m ，t h es y s t e mb e t w e e np h y s i c a le l i m i n a t i o na n dm u c i l a g i n o u se l i m i n a t i o na n dt h e a n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c es y s t e m a n dt h ej o i n tp r e v e n t i o nc o u l db ea l s of o u n di nt h ea n t i b a c t e r i a l p r o t e i ns y s t e m ，t h ea g g l u t i n i ns y s t e ma n dt h es y s t e mb e t w e e np o l y s a c c h a r i d e sa n dp r o t e i ni nt h e a g g l u t i n i no fs k i ns l i m ea n dc o e l o m i ef l u i d t h e r ew e r et h r e ei n n o v a t i o n si nt h i ss t u d y ：t h ef u n c t i o no fs k i n s e c r e t i o n si nt h ea n t i b a c t e r i a l i m m u n i t ys y s t e mo f e i s e n i a f e t i d aw a sf i r s t l yc o n f i r m e d ；an e wa n t i b a c t e r i a lp e p t i d e ( e s p - 1 ) f r o ms k i n s e c r e t i o n sw a si s o l a t e da n dp u r i f i e d ；t h ei m m u n i t yf i m c t i o no fe a r t h w o r mf a ta n dp o l y s a c c h a r i d e sw e r e a l s of o u n di nt h i ss t u d y k e y w o r d ：e i s e n i af e t i d a ；a n t i b i o t i cb a r r i e r ；j o i n tp r e v e n t i o n ；e a r t h w o r mp o l y s a c c h a r i d e s ； e a r t h w o r mf a t 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同_ t 作的同志对本研究所儆的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名 互本 时间： 2 。o o s 年g 月即日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 委埠 巧郦媳 时间： 矽j 年f 月e 1 时间： 多年占月撕捆 第一章免疫生态系统观及蚯蚓抗菌免疫的研究进展 1 免疫的生态系统观 生物进化从最原始的生命形式到人类出现和繁衍经历了漫长的岁月。在进化的过程中除了要 获得足够的食物和战胜强敌外，还要与各种病原体作斗争，这样就发展了一套防御系统。在亿万 年的生存斗争中，这一套防御系统从最简单的吞噬异体的形式发展到比较高级的、多样化的免疫 系统；从非特异性免疫发展到特异性免疫；从细胞免疫发展到体液免疫。在高等脊椎动物中，非特 异性免疫和特异性免疫，细胞免疫和体液免疫彼此协同互相补充形成一套比较完善的防御网。 1 1 免疫系统的系统发生和个体发生 1 1 1 免疫系统的系统发生 机体抵御外源性物质的侵入和自我修复机制存在于无脊椎动物门的各种生物上，这些机制都 属于天然免疫。只有在脊椎动物身上才能找到区分外源性抗原并具有特异性防御的机制。脊椎动 物的各种细胞能对引起感染性疾病的微生物起聚集和杀灭作用，这些反应细胞类似子吞噬细胞， 在无体腔动物中称为阿米巴样细胞，在软体动物和节肢动物中称为血细胞，在环节动物中称为体 腔细胞，在被囊动物中称为血液白细胞。无脊椎动物不含有抗原特异性淋巴细胞，也不产生免疫 球蛋白或补体蛋白。然而，它们含有大量可与微生物结合并使其溶解的可溶性分子。这些分子包 括能与微生物细胞壁上糖水化台物结合并凝集和溶解微生物的溶菌酶。某些无脊椎动物的吞噬细 胞能分泌类似于脊椎动物的巨噬细胞所分泌的细胞因子。这样，无脊椎动物的防御系统是由类似 于高等动物天然免疫效应机制的细胞和分子介导的。许多研究表明，无脊椎动物能对外源性的组 织移植或同种异体移植产生排斥反应。如果用机械的方法使两群不同的海绵( 多孔动物) 共生， 1 2 周后它们便会坏死，而来源于同一群海绵就能融合并能继续生长。环节动物门的蚯蚓和棘皮 动物门的海星也能排斥其它物种的移植物。这些捧斥反应主要是吞噬细胞样细胞介导的。而脊椎 动物对移植物排斥的不同处是，具有对移植组织有特异性的记忆。这些表明，即使是无脊椎动物 也表达细胞表面分子，以区分自我和非我，这些分子可能是脊椎动物组织相容性分子的前身“1 。 免疫性是在长期进化过程中逐步发生和完善起来的。对外源物质的识别似乎是真核生物的普 遍特性。这种特性在进化上可能与吞噬细胞作用有同样古老的起源。随着多细胞动物的出现和胚 层的分化，细胞表面的专一识别在形体的建造和维持中起着重要的作用口j 。在种系发生上，原始 的免疫反应能力( 免疫识别和排斥) 在腔肠动物已经有初步的表现。在高等无脊椎动物( 环节动 物、棘皮动物) 中已经证实存在类似于脊椎动物的细胞免疫性，表现为对异体移植物专一的排斥 能力和免疫记忆。细胞免疫和体液免疫( 抗体) 结合起来的免疫防御机制是在脊椎动物中，随着 淋巴样系统结构和功能的复杂化，丽逐步进化出来的 4 1 ( 图1 1 ) 。到哺乳动物才出现免疫系统的 各种成分，而且在演变过程中特异性日益增强( 见表卜一1 ) 。这些特异性免疫应答的主要特征， 如特异性、记忆性、区分自我和非我，以及自我调节的能力已出现在较低的脊椎动物中，在较高 三旦查兰燮主兰垒丝苎一 第一章免疫生态系统观及蚯蚓抗菌免疫的研究进展 等的动物中还有对多种抗原识别的能力。 细胞表面 化的白卜颗粒白血警，淋巴球和 受体 。 血球 t 淋巴球b 淋巴球 l 细胞或物种1 免疫识别和i 原始的细胞免1 细胞免疫和体；复杂的免疫调节，各 专一的聚集 免疫不适应 疫和免疫记忆 液免疫的结合 类和亚类免疫球蛋白 i! ； 审审 植物、原生 腔肠动物，环节动物，棘皮从高等鱼类到 动物、海绵海鞘 动物，原始鱼类鸟类、哺乳类 图1 1免疫应答发生的主要阶段( h i l d e m a n n ，1 9 7 4 ) f i gl 1 t h ed i f f e r e n tp h a s eo f i m m u n er e s p o n s e i n t h ea n i m a lp h y l o g e n y ( h i l d e m a n n ，1 9 7 4 ) 表1 1在种系发生上，免疫系统的各种成分 t a b l ei 1 t h ed i f f e r e n tc o m p o n e n to f i m m u n i t ys y s t e mi nt h ea n i m a lp h y l o g e n y 缩写：n k 自然杀伤代号：+ 存在：一缺乏 在原索动物如海鞘中就已经出现了类似淋巴球的细胞，并表现专一的对异体移植物的排斥能 力。现存脊椎动物的最原始种类圆口类( 如八日鳗) 开始出现原始的淋巴样系统( 构造非常简单 的胸腺和脾脏) ，同时在不同程度上表现出脊椎动物免疫反应能力的各种特征。除了专一的细胞 免疫和免疫记忆外，圆口类还表现出一定程度的体液免疫能力，能对少数抗原起反应，产生类似 i g m 的抗体。在软骨鱼类淋巴样的系统的发育程度更高，出现了真正的胸腺和脾脏，体液免疫和 细胞免疫能力都有提高。随着浆细胞的出现，高等软骨鱼和软骨硬鳞鱼的抗体合成进一步加强。 在高等硬骨鱼开始出现和i g m 不同类型的免疫球蛋白。两栖类已出现原始的淋巴结以及t 和b 2 细胞功能的初步分化，两栖动物如非洲蟾蜍属，则出现两种抗体。各种t 细胞功能，如对有丝分 裂原的增生反应，m l c 反应、移植物抗寄生反应，t 和b 细胞协同效应等都有不同程度的出现。 在原始的爬行类中枢淋巴样组织( 如扁桃腺) 有明显的发育1 5 3 0 在高等爬行类还出现p a y 日淋巴 细胞团。鸟类出现法氏囊，t 和b 细胞的功能分化更趋完善。哺乳类免疫系统在结构和功能上都 得到最高度的发展( 见表l - - 2 ) 吼 表1 2 脊椎动物免疫系统各项特征的出现 t a b l e1 - 2 t h ec h a r a c t e r i s t i co f i m m u n es y s t e mi n t h ev e r t e b r a t e 被囊类代表脊索动物中的原索动物亚门。其他动物分属脊椎动物各纲( m a r c h a l o n i s ，1 9 7 7 ) i 1 2 免疫系统的个体发生 免疫反应在个体发育中也是逐步建立起来的，先出现细胞免疫，然后再出现体液免疫。这反 应了免疫系统的发育和进化的进化过程，同时也大体反映了系统发生的进程。更有意义的是免疫 系统在发育中有阶段性现象，而低等脊椎动物个体发育也有阶段性( 变态) 现象( 典型的幼体与 成体差异较大，有时会被误认为不同的物种) ，而且两种阶段在现象上有明确的可比性”。 个体免疫细胞发育有着明显的阶段性口1 ，一般由干细胞来的原淋巴细胞经前淋巴细胞、幼 稚淋巴细胞，最后成为成熟免疫细胞并离开初级( 中枢) 免疫器官，分布到机体有关组织器官。 此发育过程和具有调控机制尚未完全明了，但已了解到原淋巴细胞到成熟免疫细胞，通常至少需 要经历两次选择，首先为正选择( p o s i t i v es e l e c t i o n ) ，淋巴细胞进行由个体信号诱导的增殖，如 3 前t 细胞的存活与增殖需要个体主要组织相容性复合物( m i - i c ) 分子的诱导，否则通常被淘汰； 另一次为负选择( n e g a t i v es e l e c t i o n ) ，幼稚淋巴细胞由个体抗原诱导程序性自灭或灭活，剩余的 才演化为可与非己抗原反应的免疫细胞。t 细胞在中枢免疫器官( 胸腺) 内的发育，可以看作是个 体发育全程分阶段平行跟踪过程，t 细胞随个体发育阶段的不断推进而变化【”1 。 在高等脊椎动物胚胎发育过程中，一般认为淋巴样系统的干细胞来源于卵黄囊。这些细胞随 着血流散播到初级淋巴器官，在鸟类为胸腺和法氏囊，哺乳类为胸腺和胎儿肝脏( 继之为骨髓) 。 胸腺和法氏囊都是上皮细胞器官，它们各自能诱导干细胞广泛地增生并分化为t 淋巴细胞和b 细 胞( 哺乳类相当于法氏囊的器官曾有许多争论，目前已有证据表明可能是胎儿肝脏) 。t 细胞和b 细胞在外表形态上没有区别。然而在细胞来源上、功能上和细胞表面特性上却有非常明显的不同。 它们来源于不同的初级淋巴器官；分布在次级器宫( 脾脏、琳巴结、肠淋巴组织等) 的不同部位 ( t 细胞位于淋巴结的副皮质和脾脏之中央小动脉周围区域，即依赖胸腺区) ；介导不同类型的 免疫反应，并且具有不同的表面受体和标记。两类淋巴细胞及其亚群的功能，在免疫系统的分化 和免疫反应中的相互作用以及表面特性目前免疫学仍在热烈研究的问题1 。 1 2 免疫生态系统的组成 由主宰或执行机体免疫功能的器官、组织、细胞、分子和与免疫有关的基因所组成的一个系 统称为免疫系统( i m m u n es y s t e m ) 。免疫系统是机体同体t 匈# 1 - 各种不同因素长期斗争过程中，逐 渐建立和发展起来的，随着生物种系的发生进化而e l 益完善。其本身具有构成开放复杂巨系统 所有条件，是一个开放的复杂巨系统“。免疫系统通过免疫应答反应，执行免疫效应，最终达 到维持自身稳定。免疫系统的组成是层次分明的，它们之间的关系相当复杂( 图1 - - 2 ) 。 免疫器官 中枢器官 外周器官 免疫细胞免疫分子 淋巴细胞 抗原递增细胞 肥大细胞 血小板等 免疫球蛋白 细胞因子 补体 黏附因子等 免疫基因 m h c 等 下续的层次( 子系统) 圈1 2 免疫系统( 陈钰，2 0 0 4 ) f i g 1 - 2t h e i m m u n es y s l e m ( c h c n y u ，2 0 0 4 ) 1 2 1 免疫器官子系统的组成 在免疫器官中，中枢免疫器官包括了胸腺、骨髓和法氏囊，是t 细胞和b 细胞分化发育的场 所。外周免疫器官包括了脾脏、淋巴结、肝脏等，是成熟的淋巴细胞识别外原性物质后发生免疫 4 三呈生兰型圭兰垒笙苎 第一章免疫生态系统观及蚯蚓抗菌免疫的研究进展 反应、产生免疫效应的场所，免疫学称它为免疫应答的场所。而血浆、组织液和淋巴液等则属于 免疫器官的内环境子系统。 i 2 2 免疫细胞子系统的组成 免疫细胞包括以下各个子系统“”： 抗原提呈细胞子系统( a c t 系统) ：由朗罕氏细胞( l c ) ，树突状细胞( d c ) 及单核一巨噬 细胞( m v ) 等组成。 t 淋巴细胞子系统：由t 辅助细胞( t h ) ，t 抑制细胞( t s ) ，t 效应细胞( t e ) ，细胞毒t 细胞或杀伤性t 细胞( t r j c ) ，迟发型超敏反应效应t 细胞( t d ) ，放大t 细胞( 1 a ) 和反t s 细 胞( t c s ) 等t 细胞亚群组成。 b 淋巴细胞子系统；由b 辅助细胞( b h ) ，b 抑制细胞( 风) 等b 细胞亚群组成。 大颗粒淋巴细胞( l g l ) 子系统：由自然杀伤细胞( n k ) ，杀伤细胞( k 细胞) ，裸细胞( n 细胞) ，淋巴因子激活的杀伤细胞( l a k 细胞) ，淋巴因子诱导的细胞毒细胞( l i c c 细胞) 和肿 瘤浸润性淋巴细胞( t i c 细胞等组成) 。此外，还有第4 类淋巴细胞nkt 细胞”】，及t 调节f t r ) 细胞等也受到了免疫学家的关注。 其他免疫细胞子系统：由粒细胞，嗜酸性细胞，嗜碱性细胞或肥大细胞和血小扳等细胞组成。 1 2 3 免疫分子子系统的组成 抗体子系统：包括i g g ，i g n ，i g m ，l 妒，i g d 五种免疫球蛋白。 细胞因子子系统：由白细胞介素系列和各种淋巴因子等组成。 体液因素子系统：由补体，乙型溶索和c 一反应蛋白等组成。 1 2 4 免疫基因子系统 m h c ( 主要组织相容性复合物) 是免疫系统最复杂、最具多态性的体系。主要负责细胞闻相 互识别及提呈抗原，诱导免疫反应( 15 1 。几乎所有的哺乳动物都存在有m h c 基因，传统上，将 m h c 基因分为三类，每类都含有多个基因位点。在这些基因中，有些是直接参与抗原提呈的， 如i 类及i i 类基因，有些为免疫功能相关的基因，包括i i i 类中的补体，t n f - a 、b ，h s p 7 0 以及 新发现的l m p 2 、l m p 7 、及t a p 等，而有些则与免疫功能无关“。 免疫系统大的各个子系统之间存在着普遍联系，从纵向看，则m 胡日胞，t 淋巴细胞和b 淋 巴细胞到靶细胞或抗原形成一条免疫反应主链，表现因果联系、辅助与抑制联系。从横向看，免 疫细胞、细胞因子、组织细胞和内环境各部分之间不仅有结构联系，而且有功能联系，起源联系、 辅助或抑制联系等由质变到量变的错综复杂的网络联系，从而产生免疫应答，发挥免疫防御、免 疫稳定和免疫监视三大功能，最终达到消除抗原的目的。 5 中国农业大学博士学位论文 第一章免疫生态系统观及蚯蚓抗菌免疫的研究进展 1 3 免疫网络和免疫生态平衡 免疫网络学说最早由j e m e 提出，在免疫网络学说的发展过程中不断得到完善和发展”。 分子生物学和基因1 二程的研究成果表明：免疫细胞之间，各免疫细胞亚群之间，免疫细胞与各种 体渡因子之间，免疫细胞与组织细胞之间均存在着刺激或者抑制、正作用或者副作用关系，并两 两之间构成一个普遍联系的网络结构，其主要包括免疫细胞及亚群间的网络结构，主要组织相容 性复合体( m h c ) 遗传限制网络结构，及神经内分泌系统与免疫系统的网络结构三大网络。免疫 生态系统的有序反应一旦被触动，整个网络结构便按照不同的机制运行，一些正、负反馈环路信 息的不断扩大，迅速遍及整体水平的网络系统，实现适应环境的系统整体功能。 免疫生态系统象其他生态系统一样，具有自我调节作用，即有保持其本身相对平衡的功能。 主要表现在两个方面：( 一) 自挣作用，( 二) 免疫挣作用。前者主要是针对自身体内的生理状态 下，清除少量经常不断产生的衰老和死亡的组织细胞或产物，从而保持机体自身稳定性。免疫净 作用就是指机体清除外来抗原或靶细胞的过程。在特殊性抗原刺激发生前，机体处于一种相对稳 定的状态，抗原的进入打破这种免疫生态平衡，导致特异性的免疫应答，最终消除异物。 从当前国内外对免疫学的研究情况看，正从宏观走向微观，从细胞水平过渡到分子水平甚至 基因水平，并取得一批可喜的成果。下一步如何走? 向我们挑战的是什么? 回答是肯定的，应当 是微观研究返回宏观，并进行分析、回归、综合：具体的讲，使获得的细胞水平、分子水平、基 因水平的成果回归整体即从整体上认识各种免疫分子在机体免疫中的作用。正如第九次国际免 疫学大会主席t a d a 教授提出的，现在“免疫学的研究已经完成一个轮回，如何重返生物学本原， 从整体上理解机体的免疫系统，为人类造福，这是今后免疫学必须研究解决的新课题”“。因 此我们应当从系统整体水平上理解免疫生态系统的特殊结构和功能，运用系统论的基本观点指导 免疫学的研究，从另一个角度考察和思考免疫学的一些基本问题，积极把免疫网络同免疫生态系 统联系起来，采取积极有效的措施维持免疫生态系统的相对平衡，保持机体的稳定性。 2 动物免疫生态学的研究进展 随着免疫学家们对大批的日趋复杂的宿主细胞和许多化学信使( 是在免疫应答期间被置入宿 主环境内) 的发现，一些基本的免疫学现象都可以采用广义的生态学术语来进行描述“”，从而 形成了一个新的边缘学科一免疫生态学，因此免疫生态学并不完全是一个全新的概念，其只是 在生态学的研究过程中应用一些免疫学手段，从而促进免疫学和生态学的共同发展。用免疫生态 学研究方法，研究动物免疫状况的变化及其影响因素，不仅可以从一个侧面了解动物个体对环境 作出的生理反应，而且有助于在种群水平上认识动物对环境的适应性及其进化意义“。因此近 年来，有关免疫生态学的研究逐渐成为免疫学家和生态学家共同探索和讨论的热点问题口“”。2 3 1 2 1 免疫指标的选择 目前认为免疫功能可区分为有2 类：天然免疫( i n n a t ei m m u n i t y ) 和获得性免疫( a d a p t i v e i m m u n i t y ) 口”，前者如皮肤屏障、吞噬作用、炎症反应等；后者则包括两类：以b 细胞作用为主， 6 通过产生抗体来清除抗原的体液免疫；以及以t 细胞作用为主，不产生抗体但同样可以清除抗原 并调节免疫应答的细胞介导免疫。其中天然免疫在几乎所有动物类群中均多少有所表现o ”，而获 得性免疫则仅存于脊椎动物；j e l l , ，天然免疫和获得性免疫在识别、区别机制方面其阃也存在明 显差异口“。天然免疫和获得性免疫的组成及特点见表1 3 【2 。 表1 - - 3 天然免疫和特异性( 获得性) 免疫的特点 t a b l e 卜3t h e c h a r a c t e r i s t i c o f i n n a t e i m m u n i t ya n da d a p t i v e i m m u n i t y 天然免疫 特异性( 获得性) 免疫 皮肤粘膜免疫系统，粘膜分泌的抗体 抗体 淋巴细胞 理化屏障 循环分子 细胞 其他细胞分泌的 可溶性介质 皮肤，桔膜 补体 吞噬细胞( 巨噬细胞、自然杀伤细胞、中细粒细 胞) 巨噬细胞衍生的细胞冈了，如a 和1 3 干扰素，肿 瘤坏死因子( t n f ) 淋巴细胞衔生的细胞因予，如y 干扰素 因此许多指标都可以用来衡量动物的免疫状况，包括免疫学指标，内分泌指标等，但如何在 其中选择出合适的指标，对于是否能l e 确说明问题十分重要。n o r r i s 和e v a n s 总结了生态学研究 中应用的免疫学指标，他们将动物免疫力的测定方法分为两类：一类是监测类技术，如自细胞计数、 血液中异嗜白细胞和淋巴细胞比值、血浆蛋白含量等；另一类是刺激类技术，包括测定体液免疫 应答( 如特异性抗体水平) 和细胞免疫应答( 如促细胞分裂原诱导的淋巴细胞增殖能力) 的技术。但监 测类技术不仅提供了取样时个体的健康水平和免疫能力的某些信息，同时也反映了当时免疫系统 对感染( 如寄生虫) 的具体应答情况，因此用这类技术作为衡量动物免疫能力的手段，其价值值得 商榷。相比之下，刺激类技术的优势在于，研究中的每个个体均暴露于标准抗原刺激下，其免疫 系统的应答可通过标准方法进行定量，故免疫应答强度在个体间的差异状况可反映出个体本身或 实验处理的影响“。 还有的研究者经常采用内分泌指标来辅助评价机体的免疫功能，这是因为作为动物体质状况 的标志之一，免疫功能和神经一内分泌系统间的关系非常密切，它们之间可以通过激素、免疫细 胞产物( 如各种细胞因子) 等彼此传递信息，相互作用”8 2 “”3 。 此外，许多生态学研究者往往假定单个指标的测定即可反映机体全面的免疫能力，因此在研 究中只应用了一种方法来对免疫系统的某个组分进行定量测量。然而研究发现，不同免疫成分间 可能存在着权衡机制，因此动物对某个免疫系统组分投入程度会影响到向其他组分投入程度”。 故n o r r i s 和e v a n s 认为，采用单一指标衡量动物免疫能力不够全面，可能导致结论有偏差或结论 错误【”1 。 2 2 种群特征对动物免疫功能的影响 2 2 1 种群密度对动物免疫功能的影响 自从c h r i s t i a n 从生理角度提出种群调节的“应激假说( s t r e s sh y p o l h e s i s ) ”后，动物的免疫能 7 中国农业大学博士学位论文 第一章免疫生态系统观及蚯蚓抗菌免疫的研究进展 力与种群数量动态问的关系就逐渐为人们所关注”。c h r i s t i a n 认为，种群数景上升引起社群压 力上升，刺激中枢神经，并影响到脑下垂体和肾上腺的功能：一方面个体的生长激素分泌减少，生 长和代谢受阻，抵抗疾病和外巽不利环境的能力降低，死亡率上升；另一方面，肾上腺皮质增生 和肾上腺皮质激素分泌增多同样降低了机体的抵抗力；同时，动物的生殖也受到抑制，幼体抵抗 力减退。这样，种群增长在神经一内分泌反馈机制的调节下得到抑制。 尽管研究者普遍认为种群密度可影响动物的免疫功能，但由于实验对象、实验条件和研究方 法等的差异，许多研究的结论并不一致，甚至相反。有的研究发现，单独饲养及低密度饲养可导 致动物脾脏重量和血液中免疫球蛋白g ( i g g ) 水平下降、肿瘤增生、对某些病原体更易感0 3 ”7 3 ”； 另一些研究者则认为集群饲养及高密度饲养可引起动物免疫抑制，如外周血淋巴细胞百分比较 低，对微生物平u 其他抗原特异性免疫水平下降等”6 。 国内在种群密度对动物免疫功能的影响方面，也开展了一部分工作，并取得了一些研究成果， 如李风华等( 2 0 0 3 ) 研究了种群密度对布氏田鼠免疫功能的影响结果发现：( 1 ) 随着密度的升高， 布氏田鼠的体重和雄性睾丸的重量有所降低；( 2 ) 中密度和高密度饲养条件下雌性的免疫水平高于 低密度个体，但密度对雄性个体的免疫状况影响不大；( 3 ) 不同密度饲养条件下布氏田鼠血清中的 皮质醇含量没有显著差异。这些结果表明，和睦稳定的种内关系未必对布氏田鼠造成社群压力， 但密度能够影响布氏田鼠的生长、繁殖和免疫状况，而且这些影响存在着性别差异”。郝玉江 等就种群密度对鱼类的影响机理从神经内分泌学、血液学、免疫学等方面进行了初步探讨口。 2 2 2 社群地位对动物免疫功能的影响 许多研究表明优势个体的免疫水平高于劣势个体，其主要表现为：优势个体具有较重的胸腺、 n k 细胞活力高、促细胞分裂原诱导的淋巴细胞增殖应答较强，i g g 水平更高；而劣势个体则表 现出相反的结果，并且更易被病原体感染，发病率和死亡率均高于优势个体忡 4 “。也有的研究认 为，社群地位可能仅在动物遇到急性压力时暂时影响其免疫水平”“。m c g l o n e 等在研究运输压力 对猪的影响时发现，优势个体受到压力时比从属个体及中间地位个体表现出更强的n k 细胞活力， 而未受压力的对照组的社群地位与其体内n k 细胞活力无关”“。 此外，也有部分研究得出了不同的结果。c u n n i c k 等通过给动物注射破伤风疫苗来衡量不同 等级序位的猕猴产生抗体的能力，结果发现从属个体比优势个体产生了更多的i g g ”。b a m a r d 等发现高等级序位的雄性小家鼠( m u s m u s c u l u s ) 在集群时，其血液中睾酮和皮质酮含量增加，而 i g g 含量比低等级个体下降更为显著，容易受病原体感染，并且感染后恢复较慢，表明高等级个 体的免疫力在集群后比低等级个体受到了更强的抑制“。这些抑制可能与体内雄性激素水平有 关，因为等级地位高的个体血液中睾酮含量较商，而睾酮具有免疫抑制作用【4 “”】。 2 2 3 性别对动物免疫功能的影响 不同性别的动物具有不同的免疫水平，雌性个体的免疫水平通常高于同种类的雄性个体，比 雄性个体具有更强的细胞介导免疫和体液免疫功能4 “5 “。对人与动物的研究发现，雌性比雄性具 有更高的血浆i g g 、i g m 、i g a 等多种免疫球蛋白含量【5 l5 2 + 5 3 5 4 1 , 对抗原产生的免疫应答更强n 中国农业大学博士学位论文 第一章免疫生态系统观及蚯蚓抗菌免疫的研究进展 雌性和雄性对疾病的易感性也有所差异。雄性由于免疫e 目力相对较弱，比较容易受到寄生虫和微 生物的侵害“”，如未去势的雄性驯鹿比雌性和去势雄性更容易受到寄生牛蝇的侵扰嘟1 。和雄 性相比，雌性更不易被诱导产生免疫耐受性，相反易产生自身免疫性抗体应答，因此更容易患上 自身免疫性疾病【4 “”j 。 s a i n o 等( 2 0 0 0 ) 用去除法研究了鼠类( c l e t h r i o n o m y s g l a r e o l u s ) 的种群密度，性别和个体免疫 水平的关系，发现密度改变并未影响到雄鼠的免疫能力：而在非繁殖季节，雌性个体的免疫应答 强度随密度降低而下降”。此外，通常认为雌性的免疫水平高于雄性，