（预防兽医学专业论文）莱克多巴胺单克隆抗体的研制及其elisa检测方法的建立.pdf

扬州大学硕士学位论文 符号说t t , q ( a b b r e v i a t i o n s ) a n t i b o d y a n t i g 锄 b o v i n es e n i ma l b u m i n c o n c e n t r a t i o n c l e n b u t e r o l d u l b e c c o sm o d i f i c a t i o no f e a g l e sm i n i m u m d i m c t h y ls u l f o x i d e n z y m ：一l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y f e t a lc a l f s e l u n l f o o da n dd r u ga d m i n i s t r a t i o n g a sc h r o m a t o g r a p h y g a sc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m 武t h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e h y p o x a n t h i n e ，a m i n o p t e r i na n dt h y m i d i n e h y p o x a n t h i n ea n dt h y m i d i n e h i 曲p e r f o r m a n c ef i q u i dc h r o m a t o g r a p h y l m m u n o g l o b u l i ng l m m u n o g l o b u l i nm h a l f o f m a x i m a li n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o n m o n o c l o n a la n t i b o d y m i l l i m o l e i i t e r m i l l i g r a m m i n u t c m i l l i l i t e r m o l e i r c r 抗体 抗原 牛血清白蛋白 浓度 盐酸克伦特罗 d m 匣m 培养基 二甲基亚砜 酶联免疫吸附试验 胎牛血清 ( 美1 3 1 ) 食品药物管理局 气相色谱 气相色谱质谱仪 辣根过氧化物酶 h a t 培养基 h t 培养基 高效液相色谱 免疫球蛋白g 免疫球蛋白m 5 0 阻断作用浓度 单克隆抗体 毫摩尔，升 毫克 分钟 毫升 摩尔，升 6 怂 他卧 c 乱 一 一 l 兰 默 一 哪 啪 盯 够 w 一 嘴蓦 耐 一 里墨三一茎塞兰里塑兰塞堕垫堡箜堕型墨基坠! 璺垒焦塑直堕箜塞皇 三 n a n e g n u n o p t i c a ld e n s i t y o r t h o - p h e n y l e n ed i a m i n e o v a l b u m i n p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n ew i t ht w e e n p o l y e t h y l e n eg l y c o l h y d r o g e ni o nc o n c e n t r a t i o n r o t m i o np e rm i n u t e r a c t o p a m i n e m i c r o g r a m m i c m l i t e r b a r b i t a lb u f f e r e ds a l i n e 纳克 光密度值 邻苯二胺 鸡卵清白蛋白 磷酸盐缓冲液生理盐水 磷酸盐吐温缓冲溶液 聚乙二醇 氢离子浓度 转，分 莱克多巴胺 微克 微升 巴比妥缓冲液 唱 帆 哪 嗍 l 童 m 舭 腭 m | 耋 塑壅：苎壅兰里坚! 堡堡堕堡堕些型些些兰兰! 璺垒堕塑万法塑堡垦! 莱克多巴胺单克隆抗体的研制 及其e l i s a 检测方法的建立 研究宅：阳露 导师：吴艳涛教授 刘秀梵教授 中文摘要 莱克多巴胺( r a c t o p a m i n e ，r a c ) 是一种b2 肾上腺素能兴奋剂，因具有营养 再分配、促进蛋白质合成，增加动物酮体瘦肉率，提高饲料转化率的作用，可能 被非法作为饲料添加剂用于畜产品的生产。但其残留对人类健康存在潜在的危害， 被禁止或限定在畜产品生产中使用。本研究旨在制各特异性针对莱克多巴胺的单 克隆抗体，并建屯竞争酶联免疫吸附法( c e l i s a ) 用于r a c 的残留检测。 将阳离子化乍血清i ，了蛋白( c b s a ) 和半抗原r a e 进行偶联，经紫外光谱扫描 确定偶联成功，测定偶联物的蛋白浓度为o 7 0m g m l 。以此偶联物r a c c b s a 作为 免疫原，与试剂盒自带佐剂乳化后免疫6 周龄雌性b a l b e 小鼠，每次免疫间隔2 周，待血清抗体效价明显升高后加强免疫，3 天后取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞 s p 2 o a g 一1 4 进行融合。同时用混合酸酐法将r a e 与鸡卵清白蛋白( o v a ) 偶联。 以偶联产物r a e o v a 作为包被抗原，经日j 接e l i s a 试验筛选出阳性细胞株，再用 有限稀释法进行多次亚克隆，获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命 名为5 d 2 和6 8 3 。经亚类签定其免疫球蛋白亚类均为i g m ，单抗腹水的间接e l i s a 效价分别为2 x 1 0 和l 1 0 5 。该细胞株经体外培养、传代、冻存和复苏后抗体性质 稳定。特异性鉴定结果显示，单抗与r a c 的类似物盐酸克伦特罗及两种偶联载体 均不发生交叉反应。采辟jc e l i s a 试验鉴定单抗的敏感性，6 8 3 的i c s o 为o o l n g m l ， 5 d 2 的i c s o 为0 1 n g m l 。说明单克隆抗体具有较好的亲和性。 将e l i s a 检测条件进行了优化，得到的最佳反应条件为：包被时间3 7 作用 3 h ，封闭条件为3 7 作用3 h ，封闭液选用1 明胶。用方阵滴定法确定最适包被 堑丛盔兰堡主兰垡丝苎 ! 抗原稀释倍数为l ：1 6 0 0 ，单抗的最适稀释倍数为1 ：8 0 0 0 ，采用c e l i s a 方法建立 检测r a c 的标准曲线，在0 i n g m l 1 0 0 n g m l 范围内呈线性相关，回归方程为y - - - 0 4 0 5 2 x + 0 0 1 1 1 ，相关系数r 2 = o 9 8 1 5 。用e e l i s a 法检测r a c 有着良好的应用 前景，但是试剂盒的组成元件和条件还需要进一步探索，最佳反应条件还需要进 一步优化。 关键词：莱克多巴胺；单克隆抗体；竞争酶联免疫测定法 懵1 露：幕屯# ：2 版甲屯降抗f 奉的研制 乏儿e l i s a 榆测方法的建证 d e v e l o p m e n t o fae l i s af o rd e t e c t i o no f r a c t o p a m i n e b a s e do nm o n o c l o n a la n t i b o d i e s m s c a n d i d a t e ：l u y a n g s u p e r v i s o r ：p r o f y a n t a ow u p r o f x i u f a nl i u a b s t r a c t r a e t o p a m i n ei so n eo ft h eb2 - a d r e n e r g i ca g o n i s t s t h ei l l e g a lu s eo fr a c t o p a m i n e i nl i v e s t o c k p r o d u c t i o n h a sl e dt o s y m p t o m so f f o o dp o i s o n i n g a f t e rh u m a n c o n s u m p t i o no fm e a tp r o d u c t s s o ，t h eu s eo fr a c t o p a m i n ew a sb a n n e do rl i m i t e da s g r o w t hp r o m o t e r si nl i v e s t o c k o u rr e s e a r c ha i m e dt op r e p a r em o n o c l o n a la n t i b o d i e s a g a i n s tr a e t o p a m i n ef o re s t a b l i s h m e n tt h ee e l i s am e t h o df o rd e t e c t i o n i nt h i ss t u d y h a p t e nr a cw a sl i n k e dw i t han e wc a r r i e r - c a t i o n i s e db o v i n es e r u m a l b u m i n ，a n dt h es y n t h e s i z e da n t i g e nw a si d e n t i f i e db yu l t r a v i o l e tr a d i a t i o n t h e c o n s i s t e n c eo ft h el i n k e da n t i g e ni s0 7 0 m g m 1 t h es p l e e nc e l l so fb a l b em i c e i m m u n i z e db yr a c c b s aw e r ef u s e dw i t hs p 2 0 a 争1 4m y e l o m ac e l l su s i n gp e g 4 0 0 0 r a e - o v a ，a st h ec o a t i n ga n t i g e n ，w a ss y n t h e s i z e db ym i x e da c i da n h y d r i d em e t h o d i n d i r e c te n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) w a su s e dt os c r e g l lh y b r i d o m a c e l l sa n dl i m i t e dd i l u t i o nm e t h o dw a sp e r f o r m e dt os u b c l o n ct h ep o s i t i v ec l o n e s t w o c e l ll i n e s ，5 d 2a n d6 8 3 ，w h i c hs e c r e t em o n o c l o n a la n t i b o d i e sa g a i n s tr a c t o p a m i n e s t a b l yw e r eo b t a i n e db yt h et e c h n o l o g yo f h y b f i d o m a b o t ho f t h e mw e r ei g ms u b t y p e s t h ee l i s a t i t e r so f a s c i t e sf l u i d sw e r e2 x 1 0 5 a n d1 1 0 5 t h es e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t y w a si d e n t i f i e db ya c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o ne n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( c e l i s a ) t h ei c 5 0o f6 8 3w a so 0 1 n g m l ，a n dt h ei c s oo f5 d 2w a so 1 n g m 1 t h e m c a b sh a v en oc r o s s - r e a c t i v i t yt o w a r d sc l e n b u t e r o la n dt w oc a r r i e r s t h er e s u l t s 扬州大学硕士学位论文 t h e s et w oc e l ll i n e sw e l eg o o dm a t e r i a lt os e tu pd e t e c t i n gm e t h o do f r a c t o p a m i n e a ni n d i r e c tc o m p e t i t i v ee l i s am o d ew a sf o u n d e db a s eo nt h em o n o c l o n a l a n t i b o d y t h eb e s tc o n d i t i o no f c o a t i n gi s3 7 cr e a c t3 h a n dt h e nb l o c ki ti n3 7 ( 2f o r3 h t h e b e s t c o n c e n t r a t i o n o f c o a t i n g a n t i g e n w a sl ：1 6 0 0 ，t h e o p t i o n a lw o r k i n g d i l u t i o n o f m c a bw a s1 ：8 0 0 0 t h el i n e a r d e t e c t i n gr a n g e o fc a l i b r a t i o nc u r v e st od e t e c t r a c t o p a m i n e w a s o 1 n g m l 1 0 0 n g m 1 t h e f o r m u l aw a sy = - 0 4 0 5 2 x + 0 0 1 1 1 9 2 = 0 9 8 1 5 c e l i s aw a sav e r yp r o m i s i n gm e t h o df o rr a cd e t e c t i o n t h ev a r i o u s f a c t o r sa n dc o n d i t i o n sf o re l i s ak i t sw e r et ob ee x p l o r e d ，a n dt h eo p t i m a lr e a c t i o n c o n d i t i o n sn e e dt ob ed e t e r m i n e di nf u r t h e rr e s e a r c l l k e yw o r d s ：r a c ；m o n o c l o n a la n t i b o d y ；c e l i s a 扬州人学颤卜学位论义 8 文献综述 l 兽药残留现状 近年来，全球食品安全问题已经成为媒体和公众普遍关注的首要问题，引起 了全世界的高度关注。在我国，随着人民生活水平的提高，越r 柬越多的人开始关 注食品安全的问题同时，我国加入w t o 后，随之而来的频繁的对外贸易，也使 得国内生产业对国际的一些食品卫生标准引起高度的重视。对于兽医工作者来说 兽药残留是一个需要引起高度重视的问题。f a o w h o 联合组织的兽药残留立法委 员会把兽药残留定义为：兽药残留是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体 化合物及或其代谢物，以及与兽药有关的杂质的残留。所以兽药残留既包括原药， 也包括药物在动物体内的代谢产物。另外，药物或其代谢物与内源大分子共价结 合产物称为结合残留。动物组织中存在共价化合物( 结合残留) 则表明药物对靶 动物具有潜在的毒性作用。目酊，主要残留兽药有激素类、抗生素类、磺胺类、 呋喃类、抗球虫药和驱虫药。 在畜牧业现代化、集约化和规模化，产中，静药( 包括兽药添加剂) 因其在 降低动物发病率、提高饲利利用率、促生长和改善产品品质方面起到十分显著的 作用，使用极为普遍，已经成为重要的生产要素，但是，使用不当或在利益的驱 使下，滥用兽药的现象也普遍存在，导致畜产品中的兽药残留严重的现象时有发 生，已经成为对公众健康的潜在威胁，同时也影响动物性食品的国际贸易。我国 虽己制定“动物性食品中浮药线留最高限量”标准，但滥用和超标使用兽药，尤 其是抗菌药物的现象十分严重。t 9 9 5 、1 9 9 6 年，欧盟兽医委员会派员对我国进行 了考察和评估，认为我国的兽医卫乍状况达不到欧盟的要求，于是做出了从1 9 9 6 年8 月1 日起。禁止从我酎进口禽肉的决定。1 9 9 7 ，1 9 9 8 年欧盟又派员来华考察， 结果仍达不到其要求。目前，我国肉蛋奶的出口形式仍相当严峻。 2 兽药残留对公共卫生及环境的危害【1 4 】 兽药残留的毒性作用主要表现在：急性中毒、过敏反应和变态反应、三致作 用( 致畸、致突变、致癌) 、对胃肠道菌群的影响等方面。动物用药以后，药物以 堕墨! 茎塞兰曼堕兰塞堕堕箜塑垦型堡基塾! 坠堡型查垄箜壅塞! 原形或代谢物的形式随粪、尿等排泄物排除，残留于环境中。随着世界各国环保 意识的增强，人们越来越关注兽药在环境中的蓄积、转移、转化和对各种生物及 人类健康的影响，并在国际上形成了一个新的研究热点。绝大多数兽药排入环境 以后，仍然具有活性，会对土壤微生物、水生生物及昆虫等造成影响。 3 国内外对兽药残留的监控情况【5 j 为了有效控制药物的残留，除了在畜牧生产实践中规范用药，还必须同时建 立药物残留监控体系，制定有关违规出发手段，完善有关的体制。世界各国政府， 尤其是西方发达国家出台了关于兽药添加剂使用的更严格的限制措施，美国及欧 盟各成员国已经开始实施国家残留计划监控( t h e n a t i o n a l r e s i d u e p r o g r a m ) ，定期 向社会公布市场检测结果。同时一些发达国家已经在畜产品生长过程中推行g m p ( g o o dm a n u f a c t u r i n gp r a c t i c e ，良好规范) 或h a c c p ( h a z a r da n a l y s i s & c r i t i c a l c o n t r o lp o i n t ，危害分析与关键控制点) 规范管理和监控措施，以防止生产、加工 和流通各生产环境可能带来的食物污染，真正保证食品安全。 我国兽药残留的研究工作起步较晚，自从我国加入w t o 以后，国外对于我国 出口的食品提出了更高的要求，而我国出口肉制品常因兽药残留等问题而受阻， 造成了巨大的经济损失。同时，随着人民生活水平的提高，动物源性食品的安全 和卫生问题便引起了普遍的关注。国家有关部门在兽药残留监控方面做了大量的 工作，包括制定各种监控兽药残留的法规，制订动物源性食品中兽药最高残留 限量标准，开始建立兽药残留监控体系，改进了残留分析方法和技术，发展了快 速、准确和灵敏度高的质量检测手段。 41 32 一肾上腺素受体激动剂概述 82 肾上腺素受体激动剂( 简称1 32 激动剂，b2 - a d r e n e r g i ca g o n i s t ) 是能与 细胞膜上受体结合，直接产生各种生理效应( 如增加心率等) 的天然儿茶酚胺的 人工衍生物，由于其具有苯乙醇胺结构母核，故又称为苯乙醇胺类化合物。其作 用机理类似于肾上腺素( e p i n e p h r i n e ) 和去甲肾上腺素( n o r e p i n e p h r i n e ) 。 1 32 激动剂主要由三个活性基团组成：b 羟基、芳香环和脂肪氨基。常用的 扬州人学颀 学位论文 i o b2 - 激动剂主要有两类：双苯烷胺类和苯乙醇胺类。目i j ，国内外最常用的b2 激动 剂主要有克伦特罗( c l e n b u t o r o l 俗称“瘦肉精”) 、沙丁胺醇( s a l b u t a m 0 1 ) 莱克多 巴胺( r a c t o p a m i n ) 。 h 吨一c a 、。* 一m 伽 o h 钒 。 r a c t o p a m l a c 莱克多巴技 c l a d t c r o l 克伦特罗 h o h 2 c o h 一。k 印。谕c h 3 ) 3 = 。= = 。 o h s a l b u t a m o i 沙丁胺醇 幽lt - 要b2 增动剂代表物的结构式 f i g 1c h e m i c a ls t r u c t u r e so f t h er e p r e s e n t a t i v e b2 - a d r e n e r g i ca g o n i s t s 1 32 一激动剂有着广泛的生理作用，这些药物的作用机理是与组织细胞如血管平 滑肌、支气管平滑肌的b2 受体结合，激活细胞膜上的腺苷酸环化酶，引起细胞一 系列变化，导致气管、支气管平滑肌松弛，骨骼肌收缩，血管平滑肌松弛。过敏 介质释放减少，并增加呼吸道纤毛运动，促进痰液排出。因此，它常被用于支气 管哮喘、支气管痉挛的治疗由于其对子宫平滑肌有较强的松弛作用，也用于产 科疾病的治疗。由f 其对心肌，气管平滑肌和血管平滑肌有上述作用，因此若过 量使用，必将对入和动物的健康产生影响，如心跳加快和呼吸困难等症状。 自上世纪8 0 年代初期以来，人们发现其添加于饲料中可提高胴体瘦肉率和促 堕墨! 茎塞至里壁璺至堕垫箜塑壁塑墨墨型坠塑型查垄塑塞窭旦 进生长，因而作为生长促进剂、营养重分配剂使用；运动员应用此类药物，可以 增加肌肉和肺活量。缩短高强度训练后的恢复期。事实表明，此类药物不易破坏， 长时问使用时，在动物体内易形成残留，通过食物链蓄积于人体内，产生中毒症 状。表现为：心动过速、肌肉震颤、心悸、恶心呕吐、头昏、神经过敏和外周血 管扩张，对于高血压、心脏病患者危险更大，甚至致人死亡。另外，b2 激动剂还 有三致作用，即致癌、致畸、致突变作用。如莱克多巴胺的使用量在2 5 m g k g 以 上时猪的染色体畸变率就会增加，1 32 激动剂还会产生激素样作用和过敏反应。还 具有抑制机体免疫功能的作用。 5 莱克多巴胺残留检测研究进展 莱克多巴胺( r a c t o p a m i n e 缩写r a c ) ，化学名称为：1 ( 4 羟基苯基) 2 “1 甲基一3 - ( 4 - 羟基苯基) 丙氨基 乙醇。共有4 种立体构型，分别r r 、r s 、s r 、 s s 。其中r r 构型最具有生物活性，其他3 种生物活性很小。莱克多巴胺的商品 名为舒喘灵，生产上一般用其盐酸盐。 近年来由于加大了打击非法使用盐酸克伦特罗的力度，属于同一类药物的莱 克多巴胺的非法添加日趋严重，尽管我国政府颁布了各种法令严禁将莱克多巴胺 等b2 一激动剂作为动物促生长剂使用，但是由于经济利益的驱使，违法滥用莱克多 巴胺等b2 - 激动剂的现象仍非常普遍，各类中毒事件时有发生。浙江省2 0 0 4 年猪 尿中莱克多巴胺的阳性检出率 1 0 。同时，2 0 0 0 年美国f d a 核准e l a n c oa n i m a l h e a l t hp r o d u c t s 所制造的莱克多巴胺可用做饲料添加剂，这一规定成为许多非法使 用者的借口。 国内外有许多研究者将莱克多巴胺作为饲料添加剂，分别对猪、牛、火鸡、草 鱼、鼠等动物进行试验，证明其具有营养重分配作用，能改变动物的营养代谢， 降低胴体脂肪，提高瘦肉率，同时使动物增重，提高饲料使用率。但是人类食用 含有该残留的畜产品会引发食物中毒，因此，除了美国批准其可为猪的饲料添加 剂，欧洲，中国禁止使用。但事实上常有非法使用情况的报道 7 - 9 1 。在体育比赛中， 莱克多巴胺可以增强运动员、动物( 如马) 肌肉，提高运动成绩，国际奥委会已 将其列为禁用药物。因此，研究和开发莱克多巴胺的分析技术。对于临床药物代 扬州大学硕士学位论文 1 2 谢研究以及食品安全检测和体育赛事兴奋剂检测都具有重要意义。 目前莱克多巴胺的检测技术主要有色谱技术和免疫分析技术等。色谱技术为经 典技术，主要有高压液相色谱( h p l c ) ，高压液相色谱荧光( h p l c f l d ) ，液相色 谱质谱连用( l c - m s ) ，气相色谱质谱连用( g c - m s ) ，毛细管电泳等方法。这些方法 灵敏准确，但是样品处理烦琐费时，成本高，而且需要有经过专i - j n 练的专业人 员来操作复杂的仪器设备。免疫分析技术具有敏感、特异、快速且一次能检测大 量样品的特点，检测精度达n g 级。用于莱克多巴胺检测的主要有酶免疫技术和免 疫生物传感器技术。另外，近年来有关使用生物芯片技术检测兴奋剂的报道也较 多。 酶联免疫吸附测定法( e l i s a ) 是目前检测此类药物的最普遍的筛选方法，具 有高效、灵敏、便于基层推广等优点。高质量的抗体是此方法的关键试剂，其质 量优劣直接影响检测质量。要得到高质量的抗体，好的抗原至关重要。在各种检 测方法中，e l i s a 方法适合应用于大批样品的检测，而且可以直接采用尿液，血 液样品等进行检测，与h p l c ，g c m s 检测有较高的一致性，而且非常适合或体 动物的检测。而h p l c 和g c - m s 方法需要昂贵的仪器，复杂的样品处理程序以及 专门的操作技能，且比较费时，不适合用做大批样品的检测，但其有效性，准确 性和敏感性，使其仍有e l i s a 方法不能取代的优势。目前，进行检测时，一般先 用e l i s a 筛选，再用其他方法对阳性样品进行确认。从而可确保检测结果的可靠 性。 堕墨! 苎塞兰里些兰塞堕垫竺竺竺型墨茎坠! 坠丝翌查堡箜塞兰 坚 研究内容 莱克多巴胺单克隆抗体的研制 及其e l i s a 检测方法的建立 lr l j 吾 莱克多巴胺( r a c ) 是种02 肾上腺素受体激动剂，其作用机理是与组织细 胞如血管平滑肌、支气管平滑肌的p2 受体结合，激活细胞膜上的腺苷酸环化酶， 引起细胞一系列变化，导致气管、支气管、血管平滑肌松弛和骨骼肌收缩。类似 的1 32 - 肾上腺素受体激动剂还有盐酸克伦特罗( 俗称“瘦肉精”) 、沙丁胺醇、异丙 肾上腺素等。自上世纪8 0 年代初期以来，有人将b2 肾上腺素受体激动剂作为生 长促进剂、营养重分配剂添加于动物饲料中，提高胴体瘦肉率和促进生长。但此 类物质不易被破坏，长时间使用后，在动物体内易形成残留，通过食物链蓄积于 人体内，使人产生中毒症状。近年来，由于我国政府加强了对“瘦肉精”的监控 力度，使得“瘦肉精”的同类替代品r a c 的非法使用日趋增多，因此建立r a c 的 检测方法意义重大。本研究将r a c 与载体蛋白偶联作为免疫原，利用杂交瘤技术 研制针对r a c 的单克隆抗体，初步建立竞争e l i s a ( c e l i s a ) 检测r a c 的方法， 为开发r a c 检测试剂创造了条件。 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 实验动物以及细胞系 6 8 周龄的b a l b c 小鼠、i c r 小鼠购自扬州大学比较医学中心，小鼠骨髓瘤 细胞s p 2 0 a g - 1 4 ，为本室保存。 2 1 2 主要试剂 半抗原- 载体偶联试剂盒购自p i e r c e 公司，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠i g g 、 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠i g m 、二甲基亚砜( d m s o ) 、p e g 4 0 0 0 均购自s i g m a 扬州大学硬上学位论交 1 4 公司，胸腺嘧啶核苷( t ) 、l 一谷氨酰胺( l g ) 、6 - 羟基嘌呤( h ) 均购自f l u k a 公司， 氨基喋呤( a ) 、小牛血清均购自g i b i c o 公司，鸡卵清白蛋白( o v a ) 购自 上海华美生物工程有限公司，其他有关化学试剂均为国产分析纯试剂。 2 1 3 主要仪器设备 超纯水仪( m i l l i p o r e ) ，倒置显微镜( 日本n i k o n ) ，紫外分光光度计( e p p c n d o r f ) ， 台式离心机( e p p e n d o r f ) ，台式冷冻离心机( h e r a e u s ) ，高速离心机( 日本日立) ， c 0 2 培养箱( 1 k 彻o ) ，自动e l i s a 检测仪( b i o - t e k ) ，自动高压锅( s a n y o ) ， 隔热式电热恒温培养箱( 杭州博日科技有限公司) ，超净工作台( 苏州净化设备有 限公司) ，电热鼓风干燥箱( 南京实验仪器厂) ，超低温冰箱( 美国r e v c o ) ，移液 器( e p p e n d o r f ) ，磁力搅拌器( 上海沪西分析仪器厂) ，恒温震荡器( 太仓实验设备 厂) 。 2 1 4 器械及器皿 细胞培养板( 9 6 孔、4 8 孔、2 4 孔) ( c o s t a r , n u n c l o n ) ，细胞培养瓶( 江苏江 阴三宝玻璃细胞培养瓶厂) ，9 6 孔酶标板( 深圳金灿华实业有限公司) ，刻度吸管， 刻度瓶，注射器，锥形瓶，试管，滴管，培养皿( 直径1 0 c m ) ，烧杯，离心管， 融合管( 5 0 n d ) ，眼科剪刀，镊子，毛剪，研磨棒，血细胞计数板，液氮罐等。 2 1 5 主要试剂的配制 无抗生索无血清d m e m ：d m e m1 3 4 9 ，超纯水1 0 0 0 m l ，n a h c 0 33 7 9 ，用 i m o l l 的盐酸调节p h 值至7 2 7 4 。 h t 培养基：d m e m1 3 4 9 ，n a h c 0 33 7 9 ，h t 贮存液1 0 m l ，l g 贮存液1 0 m l ， 小牛血清1 7 6 m i ，超纯水1 0 0 0 m l 。 h a t 培养基：1 0 0 m lh t 培养基加a 贮存液l m l 。 a ( 氨基喋呤) 贮存液( 1 0 0x ) ：称取1 7 6 r a g 氨基喋呤溶于9 0 m l 超纯水中，滴 加1 m o l l 的n a o h0 5 m l 助溶，待完全溶解后，加0 5 m ll m o l lh c l 中和，再补 加超纯水到1 0 0 m l ，0 2 2 岫膜过滤除菌，分装于指形管中，- 2 0 c 保存。 h t ( 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷) 贮存液( 1 0 0 x ) ：称取1 3 6 i m g 次黄嘌呤和 阳露；莱克多巴胺单克隆抗体的研制及其e l i s a 检测方法的建立 3 8 8 m g 胸腺嘧啶核苷，加超纯水定容至1 0 0 m l ，置4 5 5 0 c 水浴中溶解，0 2 2 p l n 膜过滤除菌，分装于指形管中，- 2 0 保存。 l g ( l - 谷氨酰胺) 贮存液( 1 0 0 ) ：称取2 9 2 9l - 谷氨酰胺，溶于1 0 0 m l 超纯 水中，0 2 2 i n n 膜过滤除菌，分装于指形管中，- 2 0 保存。 2 2 方法 2 2 1r a c 一蛋白质偶联物的制备 2 2 1 1r a c o v a 的制备 采用混合酸酐法将r a c 和o v a 偶联。称取r a c 3 4 m g 加入到1 0 m g 丁二酸酐( 含 2 m l 毗啶) 中。室温下搅拌过夜，置于通风橱中将吡啶蒸发完全。此反应产物为 r a c 一半丁二酸酐。将其溶于2 m ld m f ( n ，n 二甲基甲酰胺) 和2 m ll ，4 一二氧六 环混合物中，再加2 6 2 山的三正丁胺。将此混合物在冰浴中搅拌1 0 m i n 。然后再加 氯甲酸异丁酯1 5 m ，室温下反应，搅拌1 h 。此混合物逐滴加入预先冷冻的蛋白溶 液( 1 0 0 m go v a 溶解于0 i m 硼酸钠p h8 5 ) 置于室温，反应过夜，最终在p b s 中透析7 2 h 以上。 2 2 1 2r a c c b s a 的制备 采用p i e r c e 公司的半抗原- 抗体偶联试剂盒制备。根据试剂盒说明书的步骤进 行：首先将盒中的c b s a 溶于2 0 0 t t l 超纯水，将r a c 溶解于2 0 0 肛i 连接缓冲液中。 接着将蛋白溶液和半抗原溶液混合，加入5 0 u l 连接剂。置于5 6 c 金属浴中反应2 4 h 。 然后用纯化缓冲液平衡柱子，弃去洗脱物，把载体半抗原混合物过柱，以纯化缓 冲液洗脱，用干净的指形管收集洗脱物，0 s m l 管。测定收集的偶联物的o d 2 。 2 2 1 3 偶联物鉴定以及浓度测定 将1 0 0 mr a c - o v a 偶联物溶于5 m lp b s 中，浓度约为0 4r a g m l ；2 5m go v a 溶于5 m lp b s 中，浓度约为0 5m g m l ：i m gr a c 用p b s 配成0 2m g m l 。上述溶液 在2 2 0 n m 3 0 0 n m 之间进行紫外扫描，得出各物质的特征波长值以及各物质在r a c 特征波长处的o d 值，以计算偶联比。根据公式( 蛋白质浓度= 1 4 5 0 d 2 s o 一0 7 4 0 d 2 6 0 ) 扬州大学硕士学位论文 计算偶联物浓度。 2 2 1 4 偶联比计算 配制一定浓度的r a e 、载体蛋白，分别测定他们的最大吸收峰处k m a x 的波长 下紫外吸收光谱，测定吸收a 值，根据e = a c l ( 其中为某一物质的克分子消 光系数，a 为某一物质在一定浓度下的紫外线吸收峰值，c 为克分子浓度，l 为石 英皿厚度，l = l e m ) ，计算各自的摩尔吸光系数( 8 ) ，由下列公式计算偶联比：半 抗原与载体的结合比= ( 镕柏- 8 蕾体) e 半姐。 2 2 2r a c 单克隆抗体的制备 2 2 2 1 动物免疫 将获得的r a e e b s a 计算蛋白质浓度，以每只小鼠t 0 0 r t g 的免疫剂量用试剂盒 配套佐剂进行乳化( 抗原：佐剂习：1 ) 。取6 8 周龄的b a l b c 小鼠，皮下以及足 垫等部位进行免疫。每次免疫间隔两周，一共免疫4 次。每次免疫后一周，用眼 眶采血法取少量小鼠血，离心制得血清以后，用间接e l i s a 法检测血清抗体效价， 选择效价最高的小鼠进行细胞融会，融合前三天腹腔注射稀释的r a e c b s a 进行加 强免疫( 不加佐剂) 。 2 2 2 2 测定小鼠血清效价 在免疫四次后，从小鼠的眼眶采血o 1 m l ，4 c 放置3 h ，5 0 0 0 r p m 离心5m i n ， 收集血清，用间接e l i s a 法测定血清效价 ( 1 ) 包被抗原：用包被缓冲液将检测抗原r a c o v a 作适当稀释，每孔加入1 0 0 r t l ， 4 c 过夜，用p b s t 洗涤三次之后，拍干。 ( 2 ) 封闭：每孔加入1 5 0 t t l 封闭液，4 c 过夜，用p b s t 洗涤三次，拍干。 ( 3 ) 加入待测血清样品：将血清样品用血清稀释液倍比稀释后，顺序加样，每 孔1 0 0 p 1 ，3 7 c 作用1 5 h ，洗涤三次，拍干。 ( 4 ) 加入酶标二抗：用血清稀释液将酶标羊抗鼠i g o 及i g m 稀释6 0 0 0 倍，每孔 加入5 0 m ，置3 7 ( 2 作用l h ，洗涤三次，拍干。 ( 5 ) 加显色液：配置新鲜的显色液1 0 m l ，每孔加入5 0 m ，3 7 c 作用1 0 1 5 r a i n 。 用露：莱克多巴胺单克隆抗体的研制及其e l i s a 检测方法的建立_ 旦 ( 6 ) 加终止液：每孔加入2 m 硫酸5 0 m 。 ( 7 ) 结果判定：测定o d 4 帅值，以空白孔调零，以没有免疫的阴性b a l b c 小鼠 血清作为阴性血清。若待测孔的o d 值超过0 1 且大于阴性对照孔的2 1 倍，判定 为阳性，以判定值对应的血清稀释倍数为血清的效价。然后根据实验数据挑选效 价高的小鼠进行融合实验。 2 2 2 3 细胞融合 2 2 2 3 1 骨髓瘤细胞的准备 选择生长状态良好的细胞，浑圆透亮，大小均一，边缘清晰，排列整齐，呈 半致密分布，弃上清，用无抗无血清d m e m 洗涤一遍，再用1 0 m l 无抗无血清d m e m 用弯头滴管将骨髓瘤细胞s p 2 o 轻轻吹下。混匀后取o 1 m l 细胞加入0 9 m lo 4 台 盼蓝染液，用血球计数板计数。 2 2 2 3 2 脾脏淋巴细胞的制备 取最后一次加强免疫后3 天的小鼠，眼眶采血后分离阳性血清，通过颈脱位 将小鼠处死，用7 5 酒精浸泡5m i n 消毒体表，在超净台中，以无菌手术将脾脏取 出，用基础培养基洗涤脾脏，以除去附着的结缔组织。然后将脾脏移入新的基础 培养基中，放在微孔滤网上，用研磨棒轻轻的研磨。待脾脏全部被磨碎，细胞进 入培养基中，用吸管轻轻吹打数次以制成单细胞悬液，作活细胞记数( 方法同骨 髓瘤细胞) 。 2 2 2 3 3 饲养细胞的制备 采集时先致死小鼠，消毒体表，以无菌手术掀开腹部皮肤，暴露腹膜，然后 用注射器和2 0 号针头将l o m l 预冷的基础培养基打入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并 用注射器吹打几次。抽出针头，将吸出的饲养细胞悬液移入预冷的干净盐水瓶中 备用。 2 2 2 3 4 细胞融合 ( 1 ) 将脾细胞l x l 0 8 和骨髓瘤细胞3 1 0 7 悬浮液加入5 0 r a l 的离心管中，脾脏细 扬州大学颂士学位论文 l s 胞和骨髓瘤细胞的比例约为3 ：l ，1 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，将上清尽量吸干净。 ( 2 ) 将融合管置于掌上，然后用掌底轻击管底，使沉淀细胞松散均匀，将此融 合管移入4 0 水浴中预热。 ( 3 ) 用l m l 吸管将预热的p e g 慢慢滴如到融合管中的细胞沉淀上，边加边轻轻 搅拌，在4 5 6 0 s 将l n d p e g 加完。 ( 4 ) 在9 0 s 内将2 0 3 0 r a l 基础培养基滴加到融合管中，3 7 c 静置1 0 m i n 。 ( 5 ) 以1 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃去上清，加入5 - 1 0 m lh a t 培养基，用吸管轻轻 吹吸数次，使大的细胞团块分散，加h a t 培养基至8 0 1 0 0 m l ，分装于9 6 孔细胞 培养板，每孔两到三滴，然后将培养板置3 7 ，6 c 0 2 培养箱中培养。 ( 6 ) 5 天后用新鲜h a t 培养基换出培养孔中一半的培养基。 ( 7 ) 1 0 天后h t 培养基换出h a t 培养基。 ( 8 ) 每天观察杂交瘤细胞的生长情况，待其分布至孔底面积1 1 0 以上时，吸出 上清液傲抗体检测。 2 2 - 3 采用间接e l i s a 法筛选阳性克隆 2 2 3 1 包被抗原的稀释度和血清的工作浓度的确定 以融合前采的小鼠血清作为筛选时的阳性对照，非免疫小鼠的血清作为阴性 对照，同时设立空白调零孔。将检测抗原( r a c o v a ) 用包被缓冲液做系列稀释， 每一列为一个稀释度，包被酶标板，l o o “! 孔，4 反应过夜，用p b s t 洗涤三次， 每次5 r a i n ，洗后于吸水纸上拍干：加入封闭液1 5 0 1 x l ，孔，4 1 2 反应过夜之后同前洗 涤三次，洗后于吸水纸上拍干；加入梯度稀释的阳性血清l o o m ，孔，3 7 1 2 反应1 5 h ， p b s t 洗涤三遍后拍干；加入6 0 0 0 倍稀释的酶标羊抗鼠l g g 及i g m ，每孔5 0 p 吼， 3 7 反应1 h ，用p b s t 洗涤三次拍干。加入新鲜配制的o p d 底物显色液5 0 1 1 蚜l ， 3 7 c 反应1 0 - 1 5 r a i n ；以2 m 硫酸终止反应，5 0 孔。测定孔内的o d 4 9 0 值。 2 2 3 2 间接e l i s a 实验 确定好了检测抗原的包被浓度之后，用碳酸盐缓冲液稀释抗原r a t - o v a ，l o o m ，孔加入酶标板中，4 c 反应过夜，用p b s t 洗涤三次，每次5 m i n ，洗后于吸水纸 堕壁：茎塞至里墼苎塞堕堕堕堕堡型墨整型坠堡塑查堡塑塞皇竖 上拍干；加入封闭液1 5 0 叫孔，4 反应过夜之后同前洗涤三次，拍干后- 2 0 ( 2 保存。 融合后，待细胞长到培养孔面积的1 1 0 以上时，采用间接e l i s a 方法进行检 测。吸取待检孔上清1 0 0 1 t l 加入上述的酶标板中，3 7 c 水浴反应1 5 h 后同前洗涤， 拍于。加入6 0 0 0 倍稀释的羊抗鼠l g g + i g m - h r p ，5 0 9 l ，孔，3 7 c 水浴反应1