（营养与食品卫生学专业论文）teb4基因在内质网应激中的作用.pdf

缩写词表 缩写词表 缩写词英文 a c r a c r y l a m i d e a m p a p s b p b s a c d n a d dh 2 0 d e p c d m s o d n a 心t p d t t e c o l i e l e 2 e 3 e d l a e r e r a d g a p d h i p t g l b m m l v m r n a o d a m p i c i l l i n a m m o n i u mp c r s u l f a t e b a s ep a i r ( s ) b o v i n es e r u ma l b u m i n c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d o i l b l ed i s t i l l e dw a t e r d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e d i m e t h y ls u l f o x i d e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e d i t h i o t h r e i t o l e s e h e r i c h i ac o l i u b i q u i t i n - a c t i v a t i n ge n z y m el u b i q u i t i n c o n j u g a t i n ge n z y m e u b i q u i t i n - p r o t e i nl i g a s e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m e r - a s s o c i a t e dd e g r a d a t i o n g l y c e r a l d e h y d e3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e i s o p r o p y l - b - - d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e l l l r i a b e r t a n im e d i u m m o l o n e yr o u t i n el e u k e m i a v i r u s m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d o p t i c a ld e n s i t y 中文 丙烯酰胺 氨苄青霉素 过硫酸铵 碱基( 对) 牛血清白蛋白 互补d n a 双蒸水 焦碳酸二乙酯 二甲基亚砜 脱氧核糖核苷酸 脱氧核苷三磷酸 二硫苏糖醇 大肠埃希菌 泛素激活酶 泛素交联酶 泛素蛋白连接酶 乙二胺四乙酸 内质网 e r 相关降解 3 磷酸甘油脱氢酶 异丙基硫代半乳酸糖苷 l b 培养基 莫氏鼠白血病病毒 信使核糖核酸 光密度值 缩写词表 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p dp a r k i n s o n sd i s e a s e p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l p i p e s p i p e r a z i n e - n ，n - b i s ( 2 一e t h a n e s u l f o n i ca c i d ) p m s f p h e n y l m e t h y l s u l p h o n y l f l u o r i d e r i n g r e a l l yi n t e r e s t i n gn e wg e n e r n ar i b o n u c l e i ca c i d r t - p c rr e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r s e c h a i nr e a c t i o n s d s y n t h e t i cd r o p o u t s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e t b e t r i s b o f i ca c i d ( b u f f e r ) t b s tt r i sb u f f e r e ds f l i n ec o n t a i n i n gt w e e n2 0 t e m e d n ，n ，n n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e 田mt r a n s m e m b r a n e s t r i s - ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e x g a l 5 - b r o m o - - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l b d g a l a c t o p y r a n o s i d e i i i 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚合酶链反应 帕金森氏病 聚乙二醇 哌嗪一n ，n 一双( 2 一乙 磺酸) 苯甲基磺酰氟 真正感兴趣新基因 核糖核酸 逆转录聚合酶链反应 s d 培养基 十二烷基硫酸钠 t r i s 硼酸电泳缓冲液 t r i s 洗膜缓冲液 n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 跨膜结构 三( 羟甲基) 氨基甲烷 5 溴一4 一氯一3 一吲哚一 d d 一半乳糖苷酶 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 签名： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规 定，同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和 电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影 印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目 录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权 按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子 版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分 或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 年月日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 年月 e t年 月 日 第 部 分 t e b 4 基 因 在 内 质 网 应 激 巾 - 的 作 用 摘要 摘要 目的：利用已有的t e b 4 截短体基因重组质粒和t e b 4 的r n a 干扰重组质 粒转染入胚肾2 9 3 细胞，建立t e b 4 过表达及其r n a 干扰细胞模型。毒素诱 导细胞模型发生内质网应激，检测细胞内质网应激相关基因( c h o p 、g r p 7 8 、 g r p 9 4 ) 表达的变化。探讨某些毒素诱导内质网应激时，t e b 4 截短体基因对内 质网应激相关因子m r n a 和蛋白水平表达的影响，及其在细胞应激中的作用。 方法：l 、用脂质体转染法将t e b 4 截短体重组质粒( p e g f p t e b 4 ) 和t e b 4 的r n a 干扰片段重组质粒( p s u p e r - e g f p r n a i ) 分别瞬时转染人胚肾2 9 3 细 胞，建立相应的t e b 4 截短体过表达细胞模型和t e b 4 干扰细胞模型。以分别转 染p e g f p - n 2 和p s u p e r e g f p 质粒的2 9 3 细胞为对照组。2 、实时荧光定量p c r ( r t p c r ) 、w e s t e r nb l o t 法检测各组细胞模型中t e b 4 的表达，以确定细胞模 型是否制备成功。3 、转染4 8 小时后，分别以鱼藤酮、衣霉素和a1 32 5 3 5 蛋白诱 导各组细胞模型发生内质网应激，在毒素作用不同时间收获细胞，r t p c r 、 w e s t e r nb l o t 法测定内质网应激相关因子c h o p 、g r p 7 8 和g r p 9 4 在不同细胞模 型组中的表达，探讨t e b 4 在内质网应激中的作用。 结果：l 、r t p c r 、w e s t e r nb l o t 法分别检测到e g f p t e b 4 过表达细胞模型 组中t e b 4 的m r n a 水平的表达量是其对照组p e g f p - n 2 的2 0 2 倍，蛋白水平 的表达量是其对照组p e g f p n 2 的1 1 3 倍；相对于对照组p s u p e r - e g f p ， e g f p i 埘灿干扰细胞模型组中t e b 4 的m r n a 水平及蛋白水平的抑制率分别 是6 2 9 6 和6 0 8 2 。表明细胞模型建立成功。2 、衣霉素诱导的内质网应激中， 2 4 小时和4 8 小时，t e b 4 干扰组中g r p 7 8 、g r p 9 4 的m r n a 和蛋白水平都明 显高于t e b 4 过表达组( p o 0 l ，p 0 0 1 ) ；各组间c h o p 的表达无论是m r n a 水平还是蛋白水平都没有显著差异。a 1 32 5 3 5 蛋白诱导内质网应激作用4 小时， t e b 4 干扰组中c h o p 的m r n a 和蛋白水平都明显高于t e b 4 过表达组( p 0 0 5 ，p o 0 5 ) ；而2 4 小时后，c h o p 的m r n a 和蛋白水平表达量很低，各组 之间没有显著差异。作用2 4 小时后，t e b 4 干扰组中g r p 7 8 的m r n a 和蛋白 水平都明显高于t e b 4 过表达组( p 0 0 1 ，p 0 0 5 ) 。在鱼藤酮诱导细胞后未检测 出基因明显表达变化。 摘要 结论：在衣霉素和a 1 32 5 - 3 5 蛋白诱导2 9 3 细胞发生内质网应激中，t e b 4 截 短体缓解了应激引起的c h o p 、g r p 9 4 和g r p 7 8 基因的表达上调。 关键词：t e b 4 ，内质网应激，实时荧光定量p c r ，w e s t e r nb l o t ，2 9 3 细胞 2 a b s t r a c t a b s t r a c t o b j e c t i v ew i t ht h ep e r s e v e r a t e do v e r - e x p r e s s i n ga n di n t e f e f i n gt e b 4f r a c t i o n m o d e l s ，t ou n d e r s t a n dt h ee f f e c to ft e b 4f r a c t i o no ns o m ee r - r e l a t e dg e n e ( c h o p ， g r p 7 8 ，g r p 9 4 ) o nt h ec o n d i t i o no fe n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ( e r ) s t r e s si nt h eh u m a n e m b r y ok i d n e y2 9 3c e l l s m e t h o d s ( 1 ) t h e s er e c o m b i n a n t i o n sp e g f p - t e b 4a n dp s u p e r - e g f p - r n a iw e r e t r a n s f e c t e di n t o2 9 3c e l l su s i n gl i p o f e c t a r n i n e ，w i t hp l a s m i d sp s u p e r - e g f pa n d p e g f p - n 2a sc o n t r 0 1 ( 2 ) a l lo ft h e c e l lg r o u p sw e r ee x p o s e dt or o t e n o n e ， t u n i c a m y c i no ra 1 3 2 5 - 3 5r e s p e c t i v e l yt o i n d u c ee rs t r e s s t h ee x p r e s s i o no fe r s t r e 辎- r e l a t e dg e n e ss u c ha sc h o p , g r p 7 8a n dg r p 9 4w a st e s t e db yr t - p c ra n d w e s t e r nb l o t r e s u l t s ( 1 ) t e b 4f r a c t i o ng e n ew a sc h e c k e dt o b ee x p r e s s i n gh i g h l yi n o v e r - e x p r e s s i n gg r o u pe g f p - t e b 4c e l l s ；a n d t ob ek n o c k e dd o w ng r e a t l yi n i n t e r f e r i n gg r o u po fe g f p - r n a ic e l l s t h ec e l lm o d o l sw e r es u c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d ( 2 ) e x p o s u r eo fa l lt h ec e l lg r o u p st ot u n i c a m y c i nr e s u l t e di nas i g n i f i c a n ti n c r e a s eo f g r p 7 8a n dg r p 9 4 t h e yw e r eu p r e g u l a t e dm o r es i g n i f i c a n t l yi ni n t e r f e r i n gg r o u p t h a ni no v e r - e x p r e s s i n gg r o u pa f t e r2 4a n d4 8h o u r s ( p o 0 1 ；p 0 0 1 ) c h o pw a s d i s c r e a s e dg r a d u a l l ya n dc a nn o tf o u n da n yd i f f e r e n c ea f t e r4 8h o u r s t h ee x p r e s s i o n o fg e n ec h o pw a su p r e g u l a t e da f t e ra f l 2 5 3 5i n d u c e de rs t r e s si ni n t e r f e r i n gg r o u p t h a ni no v e r - e x p r e s s i n gg r o u pa f t e r4h o u r s ( p o 0 5 ) t h ee x p r e s s i o no fg e n eg r p 7 8 w a su p r e g u l a t e da f t e ra f l 2 5 - 3 5i n d u c e de rs t r e s s2 4h o u r si ni n t e r f e r i n gg r o u pt h a ni n o v e r - e x p r e s s i n gg r o u p ( p 09 8 ( 图46 ) ，实验准确性达到标准。 o o o o 富；ol目q赫 第4 章结果 闰4 6 蛋白测定标准曲线 44 2w e s t e r nb i o t 检测t e b 4 蛋白表达情况 一抗用t e b 4 抗体( m a r l m a r c h 6 ) 检测过表达组细胞模型和干扰组细胞 模型中t e b 4 蛋白表达情况( 图4 7 ) 。以t e b 4 p a c t i n 的表达量比值( 图48 ) 显示：e g f p - t e b 4 过表达组细胞模型中t e b 4 蛋白表达量是其对照组e g f p - n 2 的1 1 3 倍；而相对于对照组p s u p e r - e g f p ，e g f p - r n a i 干扰组细胞模型中t e b 4 的蛋白抑制率是6 0 2 8 。确定了e ( 3 f p t e b 4 过表达组细胞模型中t e b 4 基因 过表达和r n a i 干扰组细胞模型中t e b 4 的干扰效果，可以进行下面的实验。 t e b 4 j j 一 a c t i n 矗_ 一一 目47w e s t e r nb l o t 检测t e 8 4 的蛋白含量 e g f p - t e b 42 ：e g f p - n 2 3 ：e g f p - r n a i 4 ：p s u p e r - e g f p 曲l2 i 1 io 8 ￥06 ；0 4 冒o2 “”一”“9 ”5 6 ”“1 9 鬻 图4 82 9 3 细胞中t e b 4 4 a c t i n 的蛋白表达量比值( i s ) 呻 o 第4 章结果 45 衣霉素诱导的内质网应激 451r t - p c r 法检测衣霉素诱导细胞内质网应激时各组细胞c h o p 、o r p 7 $ 、 g r p 9 4 基因的表达 选择2 1 1 9 m l 的衣霉素分别作用于过表达组细胞模型和干扰组细胞模型2 4 小 时和4 8 小时，荧光定量p c r 检测c h o p 、o r p 7 8 、g r p 9 4 基因的m r n a 表达。 结果显示：在作用2 4 和4 8 小时后，干扰组细胞模型中g r p 7 8 、g r p 9 4 基因的 表达明显高于其对照组( p 0 0 5 ) ，且极明显高于过表达组细胞模型( p 0 0 1 ) ； 过表达组细胞模型中g r p 7 $ 、g r p 9 4 基因的表达明显低于其对照组( p o 0 5 ) ， 有显著性差异( 图4 9 - 4 1 0 ) ；过表达组细胞模型中c h o p 基因的表达明显低于 其对照组( 删0 5 ) ，且极明显低于干扰组细胞模型( p o 0 1 ) ，有显著性差异 ( 图4 1 1 ) 。 | ；| 缸巨 i o 8 厂1hi ”“ 跨址址簪蚓i 山叫 第4 章结果 菖 1 譬0 9 l 一 品 0 t l 麓 器 0 4 图4 1 ic h o p 基田在表霉索作崩2 4 小时和4 8 小时后的m r n a 表达餐( i s ) ( p 0 0 5v sc o n t r 0 6 # # p 0 叭v s t e b 4 ) 4 52w e s t e r nb l o t 方法检测衣霉素诱导细胞内质网应激时各组细胞c h o p 、 g r p 7 8 、g r p 9 4 基因的表达 选择终浓度为2 1 t g m l 的衣霉素作用过表达组细胞模型和干扰组细胞模型2 4 小时和4 8 小时，检测c h o p 、g r f t 8 、g r p 9 4 基因蛋白水平的表达( 图4 1 2 ) 。 结果显示，在作用2 4 小时后，过表达组细胞模型中g r p 7 $ 基因的表达明显低于 其对照细胞( p o 叭) ，干扰组细胞模型中g r p 7 8 、c h o p 基因的表达明显高于 过表达组细胞模型( p 锄0 1 ) 有极显著性差异：4 8 小时后过表达组细胞模型中 g r p 7 8 、g r p 9 4 基因的表达明显低于其对照细胞( 咖0 5 ) ，干扰组细胞模型中 g r p 7 8 、g r p 9 4 基因的表达明显高于过表达组细胞模型( p 00 5 ) ，有显著性差 异( 图4 1 3 图4 1 5 ) 。 c h o p c t i n 一一h 2 4 h 4 5 h 图4 1 2w e s t e r n b l o t 检蔫表霉素作用后的g r p 7 9 、g r p 9 4 和c h o p 蛋白含量 i ：e g f p o t e b 42 ：e g f p - n 23 ：e g f p - r n a i 4 ip s u p e - e g f p 第4 章结果 | | ；| 缸圉 善“4 。 举0 3 圉 孔z 2e ：l 2 fhl 吲ml 川一l l 出一 ( i s ) ) ( i ，) 圈4 1 sc h o p 基因在衣霉素作用2 4 小时和4 8 小时后的蛋白表达量( i s ) ( # 0 5v s t e b 4 ) 46a b - 3 5 蛋白诱导的内质网应激 第4 章结果 瓣肌护 鞭“圉 塑!至堕墨 图4 1 8o r p 9 4 基因在a b 2 5 郴作用4 小时和2 4 小时后的m r n a 表达董( i g ) ( # p 0 0 5 v s t e b 4 ) 462w e s t e r n - b l o t 检测a b 2 蛋白诱导细胞内质嗣应激时各组细胞c h o p 、 g r p 7 8 、g r p 9 4 基因的表达 a 赴”s 蛋白经3 t c2 4 小时预处理后，以2 0i i m 的终浓度分别作用于过表 达组细胞模型和干扰组细胞模型4 小时和2 4 小时，检测c h o p 、g r p 7 8 、g r p 9 4 基因的蛋白表达情况( 图4 1 9 ) 。结果显示：作用4 小时后，过表达组细胞模型 中c h o p 基因的表达明显低于其对照组( p 00 5 ) ，干扰组细胞模型中c h o p 基 因的表达明显高于其对照组( p ( 0 0 5 ) 和过表达组细胞模型( p o0 1 ) 有显著 性差异( 图4 2 6 ) ；在作用2 4 小时后，过表达组细胞模型中g r p 7 8 基因的表达 明显低于其对照组( p 00 5 ) ，干扰组细胞模型中o r p 7 8 基因的表达明显高于其 对照组( p 蛊。一棚恂霹鲁罂 第4 章结果 弘s 霞f 警圈 骖趾尉 瓤岫圉 i | | ；| 0 8 圉 ( i 。) ( i 。) 图4 2 2o r p 9 4 基因在a 赴5 d 5 作用4 小时和2 4 小时后的蛋白表达量( i s ) 第4 章结果 47 鱼藤酮诱导的内质网应激 471r t - p c r 法检测鱼藤酮诱导细胞内质同应激时各组细胞c h o p 、g r p t 8 、 g r p 9 4 基因的表达 选择终浓度为0 6 “m 的鱼藤酮作用于过表达组细胞模型和干扰组细胞模型 1 2 小时和2 4 小时，检测c h o p 、g r p 7 8 、g k p 9 4 基因的m r n a 表达量。结果 显示，作用2 4 小时后，干扰组细胞模型中c h o p 和g r f 7 8 基因的表达明显高 于过表达组细胞模型( 删0 5 ) ，有显著性差异( 图42 5 - 42 6 ) ，g r p 9 4 基因的表 达未受影响( 图42 4 ) 。 蘸目 蘸岫庐 图4 2 4g r p 7 8 基冈在鱼藤酮作用1 2 小时和2 4 小时后的n l r n a 表达量( i s ) ( # d 哪0 5v s t e b 4 ) 第4 章结果 图4 2 5c h o p 基因在鱼藤酮作用1 2 小时和2 4 小时扁的m r n a 表达量( i s ) ( # p 00 5 ”t e b 4 ) 47 2 w e s t e r n b l o t 检测鱼藤酮诱导细胞内质网应激时各组细胞c h o p 、g r p 7 8 、 g r p 9 4 基因的表达 选择终浓度为0 6p m 的鱼藤酮作用于过表达组细胞模型和干扰组细胞模型 1 2 小时和2 4 小时，检测c h o p 、g r p 7 9 、g r p 9 4 基因的蛋白表达量( 图42 6 ) 。 结果显示，c h o p 、g r p 7 8 和g r p 9 4 基因的表达均未受影响( 图4 2 7 42 9 ) 。 g 即叫 g p p 7 8 图4 2 6w e s t e r n b l o t 检测鱼藤酮作用后的c h o p 、g r p 9 4 和g r p 7 8 蛋白古量 i ：e g f p - t e i m2 ：e g f p - n 23 ：e g f p - r n a i 4 ：p s u p e r - e g f p l i l d 1 o 0 0 0 0 0 一mihx29型鞋霉 第4 章结果 幽42 7 图4 2 8 要 蠹岫皿圉 刨42 9c h o p 基因在鱼藤酮作j j1 2 小时和2 4 小时后的蛋白表达量( i s ) 第5 章讨论 第5 章讨论 神经退行性疾病是老年人常见病，主要有多巴胺能神经元退化造成的帕金森 病和胆碱能神经元退化引起的阿尔茨海默病。错误折叠蛋白沉积是许多神经退行 性疾病的共同特征，神经细胞内错误折叠蛋白的聚集影响了神经信号传递及轴突 运输，并激活了与细胞死亡等有关的细胞内的信号通路。本课题旨在研究t e b 4 截短体蛋白的表达变化对神经细胞的影响，从一个全新的侧面探讨神经退行性疾 病的相关发病机制，为其进一步研究提供依据。 泛素连接酶e 3 是泛素化反应中起关键作用的酶1 2 2 1 。所有的e 3 都具有高度 的底物特异性。蛋白质翻译后特定的修饰经常作为其相应泛素连接酶e 3 识别的 标志。环指结构为e 2 和底物提供居留位点从而使e 2 催化泛素转移到底物上田】。 许多含有c 3 h c 4 的环指结构的蛋白已经发现具有e 3 连接酶活性，包括酵母 d o a l 0 和人m a r c h 蛋白。t e b 4 也属于m a r c h 蛋白，游离的t e b 4 环指结构 在体外可催化泛素k 4 8 ( 4 8 位点赖氨酸) 特异的反应，并涉及泛素交联酶u b c 6 和u b c 7 。 一些神经退行性疾病与泛素蛋白酶体参与的相关蛋白的水解有关，其中包括 内质网相关蛋白的降解。内质网是真核细胞中蛋白质翻译合成和细胞内钙离子的 储存场所，对细胞应激反应起调节作用。内质网内未折叠蛋白的堆积，钙离子失 稳等多种因素可触发内质网应激的发生，通过非折叠蛋白应答能够促进蛋白质的 正常折叠或降解异常折叠的蛋白质。h a s s i n k ，g e e 等人曾用1 0 p g m l 衣霉素分别 处理细胞4 小时和8 小时，从而抑制内质网内糖蛋白的正常折叠。实验结果显示， d o a l 0 和h r d l d e r 3 的表达量有显著差异。在酵母中，d o a l 0 和h r d l d e r 3 是已 经确定的两种e 3 连接酶，d o a l 0 的缺失导致内质网未折叠蛋白堆积引起轻微的 应激反应，若同时缺失d o a l 0 和h r d l ，应激反应将会进一步恶化。这些表明， d o a l 0 是酵母e r 应激和降解途径中的重要成分。 基于帕金森病易感性模型，我们从p d 脑黑质( s n ) 获得单一的含路易小体 ( l b ) 的和不含l b 的多巴胺( d a ) 能神经元并进行r n a 指纹图表达谱的分析【1 8 1 ， 发现t e b 4 截短体片段在p d 脑黑质区不含l b 的d a 能神经元表达高于含l b 的相 应细胞。t e b 4 是一个比较新的基因，已经确定它具有e 3 连接酶活性，与d o a l 0 高度同源。 为什么t e b 4 截短体基因在无路易小体的多巴胺能神经细胞高表达，这种截 第5 章讨论 短体的表达产物已经删除了c 3 h c 4 环指结构域，是否仍然具有泛素连接酶活 性? 是否参与内质网相关应激途径的蛋白降解? 其在神经细胞中有何作用? 与 神经退行性疾病有何关系? 基于神经退行性疾病( s c a 、p d 、h d 、a d 等) 的发病可能具有部分共有 的机制，我们以期通过神经细胞模型探讨t e b 4 截短体在神经元细胞中的作用。 本实验利用实验室成功构建的t e b 4 表达载体和r n a 干扰载体瞬时转染人胚肾 2 9 3 细胞，建立t e b 4 干扰和过表达细胞模型，以鱼藤酮、衣霉素和a d 2 5 3 5 分别 诱导细胞e r 应激，检测e r 应激相关因子的表达，借以推测t e b 4 与e r 相关 应激途径的关系，进一步研究其在神经细胞中的作用。 本实验检测的e r 应激指标g r p 7 8 、g r p 9 4 和c h o p 是内质网应激的 标志性蛋白，很多文献报道上述三种指标与e r 应激密不可分。它们已经成为研 究e r 应激不可或缺的途径之一。 衣霉素是一种蛋白质n 一糖基化作用抑制剂，通过抑制天门冬酰胺连接的多 糖合成过程中g p t ( 乙酰氨基葡萄糖- l - p - 转移酶) 活性来抑制糖蛋白的合成h 们。 由于糖基化作用对蛋白的折叠和可溶性非常重要，并且多数分泌蛋白是n 一糖基 化蛋白，所以它是目前常用的内质网应激诱导剂，尤其在体外研究中，广泛应用 于对细胞内质网应激反应性细胞凋亡的机理研究、各种致病因素与内质网凋亡途 径之间的关系研究等h 7 1 。 在衣霉素诱导的e r 应激中，我们选择2 4 小时和4 8 小时这两个常用时间段 进行研究。g r p 7 8 和g r p 9 4 基因4 8 小时的m r n a 和蛋白表达量均高于2 4 小时， 并且干扰组细胞模型中g r p 7 8 和g r p 9 4 基因无论m r n a 水平还是蛋白水平的表 达量都明显高于过表达组细胞模型。c h o p 基因4 8 小时的m r n a 和蛋白表达量明 显低于2 4 小时，作用2 4 小时后，干扰组细胞模型中c h o p 无论m r n a 水平还是 蛋白水平的表达量都明显高于过表达组细胞模型；4 8 小时后，c h o p 的表达均 无明显差异。 结果显示，衣霉素诱导的e r 应激中，t e b 4 截短体蛋白影响上诉三种基因 尤其是g r p 7 8 、g r p 9 4 的表达。在应激条件下，未折叠蛋白在内质网腔内积聚， g r p 7 8 b i p 与未折叠蛋白的亲和力高于跨膜蛋白，跨膜蛋白与g r p 7 8 b i p 分离 而被激活，同时引起内质网应激元件基因启动子区域激活【3 引，这些基因包括 g r p 7 8 b i p 、g r p 9 4 和蛋8 - 硫键异构酶( p r o t e i nd i s h l f i d ei s o m e r a s e ，p d i ) 等分 子伴侣蛋白及生长停滞及d n a 损伤基因( g e n ef o rg r o w t ha r r e s ta n dd n a 第5 章讨论 d a m a g e ，c h o p g a d d l 5 3 ) 1 3 9 1 。g r p 9 4 是热休克蛋白9 0 家族的主要成员，抑 制蛋白质翻译，减少蛋白质在内质网腔内的堆积，从而对细胞起保护作用，恢复 蛋白质正确构像。本实验中，随着毒素作用时间增加，e r 应激相关因子g r p 7 8 、 g r p 9 4 的表达量也上调，说明e r 应激压力逐渐增强，而t e b 4 过表达组细胞模 型中g r p 7 8 、g i 冲9 4 的表达量的上调幅度都相对于对照组和干扰组细胞模型明 显减小，m r n a 和蛋白的检测结果很相似。推测过表达的t e b 4 截短体可能早期 通过某些途径调解蛋白降解，减缓了内质网应激压力，从而使g r p 7 8 、g i 冲9 4 表达下调。在作用2 4 小时后，过表达组细胞模型中c h o p 基因m r n a 水平的表 达量上调幅度明显小于其对照组和干扰组。c h o p 基因于4 8 小时表达量很低， 没有发现其表达差异。 ab 一淀粉样蛋白( ab ) 是阿尔茨海默病患者脑中老年斑的主要成分【4 i l ，由淀 粉样前体蛋白经b 一分泌酶途径代谢产生，已有大量研究证明a1 3 具有神经毒性。 a 1 3 2 5 - 3 5 是从其前体蛋t 刍a p p 上酶切下来的小肽，这一过程可在e r 中进行。a p p 也属 i 型跨膜蛋白，在正常细胞中，分子伴侣蛋白b i p 可与a p p 结合，抑制a p 2 5 3 5 的产 生 4 3 】。研究发现a 1 3 2 5 - 3 5 可通过e r 途径介导细胞的e r 应激和凋亡。a p 2 5 - 3 5 - - 个显 著毒性作用是使细胞内钙离子系统紊乱，激发e r 内c a 2 + 向胞浆释放【3 羽，e r 内的 c a 寸耗竭可诱发e r 应激，而进入胞浆的c a 2 + 可激活钙蛋白酶，钙蛋白酶再激活 c a s p a s e - 1 2 i j i 起细胞凋亡。另外，许多分子伴侣蛋白如g p r 7 8 等都是c a 2 + 结合 蛋白【4 5 1 ，e r 内的c a 2 + 耗竭可以影响这些蛋白质的功能进而影响蛋白质的折叠过 程，加重e r 应激，导致细胞损害。 在g p 2 5 3 5 蛋白诱导的内质网应激中，c h o p 基因无论m r n a 水平还是蛋白水 平2 4 小时的表达量均明显低于4 小时的表达量，且作用4 小时后，干扰组细胞 模型中c h o p 基因的m r n a 水平和蛋白水平的表达量明显高于过表达组细胞模 型。g l 心7 8 基因m r n a 水平表达量2 4 小时高于4 小时，而蛋白水平表达量2 4 小 时略低于4 小时；a 艮5 - 3 5 作用2 4 小时后，过表达组细胞模型中g r p 7 8 基因的 m r n a 水平和蛋白水平的表达量明显低于干扰组细胞模型。该毒素对g r p 9 4 基因 的表达的影响不明显。 结果显示，a 陀5 - 3 5 诱导的内质网应激中，t e b 4 截短体蛋白影响c h o p 和 g r p 7 8 基因的表达。c h o p 的激活是内质网应激反应的直接结果，也是内质网 应激最早期的参与蛋白之一，在非应激状态下，它的表达水平很低，而在内质网 应激中，其表达量大大增加。有文献报道，c h o p 的过表达导致细胞周期阻滞和 第5 章讨论 细胞凋亡，而c h o p 的缺失可使细胞避免内质网应激诱导的凋亡。c h o p 促进凋 亡的机制包括下调b c l - 2 表达、耗竭谷胱甘肽、促进反应氧族产生等；a t f 6 及 p e r k 活化后能选择性诱导c h o p 表达 4 0 l ，目前认为伴侣蛋白b i p 的上升能够阻 碍细胞发生凋亡，但c h o p 表达上调同时使细胞作好凋亡的准备，当不利因素 持续存在、e r s 过于强烈时，细胞就发生凋亡。在内质网应激中，c h o p 在凋亡 信号通路中处于c a s p a s e l 2 及c a s p a s e 9 的上游，其表达变化也早于c a s p a s e l 2 和 c a s p a s e 9 的激活【42 。c h o p 表达升高是e r 应激的标志。结合前期实验结果与文 献资料，我们把a p 2 5 - 3 5 的作用时间点设定为4 小时和2 4 小时。在a p 2 5 3 5 作用4 小时后c h o p 基因m r n a 和蛋白表达量都大大增加，此时过表达细胞模型中 c h o p 基因m r n a 水平和蛋白水平的表达量相对于过表达对照组和干扰组细胞 模型明显减小。结合前期实验结果，推测2 0 肛m 的a b 2 5 - 3 5 作用2 9 3 细胞4 小时 时，c h o p 表达量达到高峰，并且过表达的t e b 4 截短体蛋白对c h o p 的调解作 用在此时尤其显著。t e b 4 截短体蛋白在此过程中也影响g r p 7 8 基因的表达。当 e r 应激发生后，t e b 4 截短体可能参与某一个或几个途径的蛋白降解，减缓了 e r 应激，使g r p 7 8 表达量上调幅度减小。当用a 1 3 2 5 3 5 蛋白作用2 9 3 细胞时， 与t e b 4 具有相似环指结构的e 3 连接酶p a r k i n ，其过表达基因对e r 应激时 g r p 7 8 基因的上调也有缓解作用1 4 6 。 综合上述结果，t e b 4 截短体蛋白对衣霉素和a 艮5 3 5 引起的细胞损伤可能具 有保护作用，t e b 4 截短体蛋白可能通过缓解细胞e r 应激而进一步发挥保护作 用的，t e b 4 截短体蛋白影响了内质网应激相关基因g r p 7 8 、g r p 9 4 和c h o p 的表达，缓解了内质网应激的压力。但其具体参与的途径还有待进一步研究。 鱼藤酮可诱导多巴胺神经元细胞内泛素化a - s y n u c l e i n 聚集，继而引起细胞 死亡，选择性损伤多巴胺神经元p 5 1 。细胞内异常蛋白的处理、降解过程在一定 程度上依赖于泛素蛋白酶体系统和分子伴侣参与。它可选择性抑制细胞内线粒 体复合酶i ，线粒体功能障碍无疑造成生物能量不足，使u p s 不能正常降解 a s y n u c l e i n 蛋白进而导致细胞内这种异常蛋白的逐渐聚集。研究证实无论是在 大鼠体内还是在体外神经细胞内，鱼藤酮抑制复合物均可导致蛋白质羰基含量增 加，而羰基是氧化应激的标志之一 3 6 1 。鱼藤酮作为呼吸链抑制剂，已广泛用于 建立细胞损伤模型。 鱼藤酮诱导的内质网应激中，c h o p 、g r p 9 4 和g r p 7 8 基因无论m r n a 水 平和蛋白水平的表达量均为1 2 小时高于2 4 小时。仅2 4 小时后过表达组细胞模 3 9 第5 章讨论 型中c h o p 和g r p 7 8 基因的m r n a 表达量明显低于干扰组细胞模型的表达量， c h o p 和g r p 7 8 基因各组问的蛋白水平表达量以及g r p 9 4 基因各组间的m r n a 水平和蛋白水平的表达均未受该毒素的影响。本实验中，鱼藤酮作用下的e r 应 激相关因子的表达差异不显著，可能鱼藤酮作用剂量和浓度略有偏差，没有成功 诱导出应激模型，我们期望下次的实验中继续摸索。 由上述e r 应激结果推测，t e b 4 截短体基因可能具有多巴胺能神经元的保护 作用，而且t e b 4 在p d 同一脑区的差异表达可能与路易小体的形成有关。路易小 体，作为p d 诊断的金标准之一，由异常磷酸化、泛素化蛋白聚集而形成，与e r 应激相关。t e b 4 截短体在多巴胺能神经元的高表达推测可能拮抗缓冲e r 应激， 促进异常蛋白的加工，从而抑制路易小体的形成。t e b 4 截短体在脑中发挥神经 保护功能的具体作用机制，还有待进一步研究。 接下来，本课题还有很多工作要做，对于t e b 4 的研究还在继续，本试验为 进一步研究t e b 4 的功能打下了良好的基础。 第二部分 载体构建 摘要 摘要 目的：分别构建a t p 合酶f o 亚基c 6 亚单位( a t