（植物营养学专业论文）高等植物氨基酸态氮营养效应研究.pdf

离謦植物氨| l 致志熏效直研究中文擒要 高等植物氨基酸态氮营养效应研究 摘要 本研究在浙江大学有机营养实验室内采用严密的无菌培养技术研究了氨 基酸态氮( 甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸等) 与铵态氮( 硫酸铵) 对水稻、小麦、 大白菜及绿豆等不同科作物的营养效应，甘氨酸态氮和硫酸铵态氮在单施与 不同比例混施条件下对植株总氮的贡献。此外，还用甘氨酸作唯一氮源对拟 州： 南芥全生育期培养试验作了探讨。考占枭如下。 1 l 植物种子组合灭菌方法研究： ( 采用多种消毒剂( 7 0 酒精、1 0 h 2 0 2 、2 次氯酸钠、0 1 h g c l ：等) 对几种作物种子进行组合灭菌。结果表明，灭菌效果与作物种类、种子贮存 时间及不同消毒剂组合等有很大关系。采用7 0 酒精浸l m i n - - 无菌水冲3 次一2 次氯酸钠浸5 m i n 一无菌水冲5 次一o 1 h g c l ：浸5 m i n - - 无菌水冲6 次的组合灭菌程序，可取得较好的灭菌效果；若种子对2 次氯酸钠敏感， 则可用1 0 h ：o ：代替。对于难以灭菌的作物应进行预处理。、l 2 无菌条件下水稻氨基酸态氮及铵态氮营养效应， ( 在高温无菌砂培条件下对无机氮( 硫酸铵，下同) 、有机氮( 甘氨酸，谷氨 酸和赖氨酸) 或缺氮( 对照，下同) 培养的水稻植株干物重、总氮量及根、叶 谷草转氨酶( g o t ) 和谷丙转氨酶( g p t ) 活性作了研究。结果表明，有机、 无机氮均被水稻吸收，且吸收量相当。低浓度( 1 0 i gn 仙，下同) 无机氮或有 机氮培养2 0d 后的水稻总氮量比对照高5 0 以上；无机氮培养的植株干物重 显著低于有机氮培养的，而且也低于对照，袭明植株受n i - h + 毒害。多数有机 氮培养1 5d 的水稻植株根或叶a ) t 或o p t 活性比对照显著升高，且根、叶 h 离等植物，l 基e 志壹口文点【研究中文捌r 要 间有较大差别。无机氮培养的植株根、叶g 町活性是对照2 倍或以上。高浓 度无机氮( 5 0 0m gn l ，下同) 处理6h 后稻株根、叶g p t 活性分别是对照 的2 5 、4 倍，而高浓度甘氨酸，谷氨酸和赖氨酸态氮处理6h 后根、叶g p t 活性分别是对照的5 7 、9 4 、1 9 倍及1 8 、2 3 、1 4 倍。、 3 无菌条件下小麦氨基酸态氮及铵态氮营养效应 ( 铵态氮处理的干物重与对照的相似；除赖氨酸外。甘氨酸、谷氨酸等处 理的则显著大于对照，也显著高于铵态氮处理的。铵态氮处理的单株全氮量 与氨基酸处理的相似，但均显著大于对照。低浓度无机氮长时间培养能显著 提高小麦根g p t 活性，但却使叶片g o t 、g p t 活性显著降低，而高浓度无 机氮处理6 h 后，小麦根、叶g o t 和g p t 活性均不受影响。不同氨基酸对小 麦根、叶中的g o t 活性的影响不同，在低浓度长时间培养条件下，谷氨酸能 显著提高根和叶中的g o t 、g p t 活性，甘氨酸仅能显著提高根、叶g o t 活 性，而赖氨酸仅能显著提高小麦根内的g o t 、g p t 活性而叶的则显著下降： 而在高浓度短时间处理条件下，谷氨酸仅能提高小麦根g p t 活性，甘氨酸仪 能提高小麦叶g o t 、g p t 活性，赖氨酸对根、叶g o t 、g p t 活性影响不大。 在低浓度氨基酸培养的小麦，除甘氨酸处理的根g p t 外，小麦根、叶g o t 和g p t 活性均显著比n h 4 + 的高：而在高浓度氮处理6h 后，除谷氨酸、赖氨 酸处理的根g p t 外，氨基酸处理的根、叶g o t 或g p t 活性比铵态氮处理的 、 低或不变。斗 j 4 无菌条件下大白菜氨基酸态氮及铵态氮营养效应，、 r 。 睛机、无机氮均被大白菜吸收，但吸收量不同。1 0m gn l 无机氮或有机 氮培养4 5d 后，甘氨酸、谷氨酸、铵态氮及赖氨酸培养的植株含氮量分别是 缺氮培养的4 6 、4 0 、3 7 及3 2 倍。甘氨酸培养的植株含氮量比铵态氮培养 的高出2 4 4 ，赖氨酸培养的则低出1 4 6 ，而谷氨酸培养的与铵态氮培养的 相当。铵态氮培养的植株平均单株干物重比氨基酸态氮的高0 8 3 1m g ，其 中与甘氨酸和赖氨酸培养的差异达极显著水平。低浓度铵态氮培养1 4d 后或 纛 j j l ，r 等植物，l | i i 志壹u 蛾研究中文捌r 要 用高浓度浓度铵态氮处理6h 后，大白菜根g p t 活性和根、叶的g o t 和g p t 活性显著高于对照的。与对照比，低浓度谷氨酸处理的根、叶g o t 活性显著 升高，高浓度处理后根的变化不大而叶的则显著升高：高或低浓度甘氨酸或 赖氨酸处理的根、叶g o t 活性均显著升高。除甘氨酸处理的叶g o t 活性外， 低浓度氨基酸处理的大白菜根、叶g o t 活性均显著高于铵态氮的；而高浓度 氨基酸处理后，只有谷氨酸处理的叶、赖氨酸处理的根g o t 活性显著高于铵 态氮处理的。低浓度或高浓度甘氨酸或谷氨酸或赖氨酸培养的大白菜根、叶 g p t 活性显著高于对照。高浓度氨基酸处理的根g p t 活性显著高于铵态氮处 理的，叶的仅是谷氨酸处理的显著高于铵态氮处理的。这些结果表明，不同 浓度、不同氨基酸可能通过不同部位的g o t 和g p t 催化同化的能力不同。点 5 无菌条件下绿豆氨基酸态氮及铵态氮营养效应j ( 有机、无机氮均被绿豆植株吸收，铵态氮和氨基酸态氮培养的植株总氮 量极显著大于缺氮培养的：除甘氨酸外，氨基酸培养的植株含氮量显著大于 硫酸铵培养的。甘氨酸及谷氨酸态氮培养3 0d 的植株干物重均显著高于铵态 氮培养的高，表明甘氨酸和谷氨酸比铵态氮更适合绿豆的生长。与对照相比， 低浓度( 1 0 r a g n l ) 铵态氮培养1 5d 后，根、叶g o t 活性显著下降，而高 浓度( 5 0 0m gn l ) 的铵态氮处理缺氮植株6h 后，根的g o t 酶活性保持不 变，叶的却极显著下降：而低浓度氨基酸培养韵植株根、叶g o t 活性均显著 下降。而且高浓度氨基酸处理6h 后，根、叶g o t 活性均不升高，甚至显著 下降。这表明，不同氨基酸及其不同浓度可能通过绿豆幼苗不同部位的g o t 催化同化能力不同。供给低或高浓度铵态氮后，根g p t 活性变化不显著，但 叶的在低浓度培养时显著下降而高浓度处理后则显著升高：而低浓度甘氨酸 培养的植株根、叶g p t 活性变化不显著但高浓度处理6h 后根的不变而叶的 显著升高；低浓度谷氨酸处理的根g p t 活性不变但叶的显著下降，而高浓度 处理后根、叶的均显著升高；低或高浓度赖氨酸处理的根、叶g p t 活性保持 不变，甚至显著下降。与铵处理相比，低浓度氨基酸处理的根g p t 活性变化不 高等植物，l l i 意囊口垃研究中文棚r 要 显著，而叶的除甘氨酸处理的显著升高外，另两个氨基酸处理的均显著下降： 高浓度处理后，甘氨酸处理的根、叶g p t 活性不化不大：谷氨酸处理根、叶 分别显著升高3 5 1 、2 3 6 ；赖氨酸处理根的变化不大但叶的显著下降。这 些表明，不同氨基酸及其不同浓度通过绿豆不同部位g p t 催化同化能力也不 、 同。4 6 有机氮与无机氮对作物总氮的贡献： 甘氨酸态氮和铵态氮以不同比例混合氮源( 甘氨酸氮：铵态氮分别为l ：0 ， 0 7 5 ：0 2 5 ，0 5 ：0 5 ，0 2 5 ：0 7 5 ，o ：l ，0 ：0 ，其中铵态氮用”n 标记) 培养 小麦、大白菜及绿豆等作物，以研究有机氮对植株总氮的贡献。结果表明， 作物能吸收甘氨酸态氮及铵态氮，一种氮源可以影响作物对另外一种氮源的 吸收。当以铵态氮作唯一氮源培养作物的植株含氮量比以甘氨酸态氮作唯一 氮源时的大，这可能是作物长期适应了无机氮环境的结果。当铵态氮和甘氨 酸态氮混合作氮源时，作物对某一种氮源吸收量的大小与其在混合氮源中所 占的比例大小有关。当无机氮源所占的比例高时，作物对无机氮的吸收量就 高，反之。当有机氮所占的比例高时，作物对有机氮的吸收量就高。当甘氨 酸态氮和铵态氮以等比例混合时，小麦、绿豆对铵态氮的吸收量比对甘氨酸 态氮的多。说明当这两种氮源在根际的比例相等时，小麦和绿豆偏爱吸收铵 态氮；但大白菜对两种氮的吸收量相当， 7 无菌条件下拟南芥全生育期培养研究。 ( 用有机、无机氮作唯一氮源培养拟南芥结果表明。拟南芥种子经春化处 理并种在通气良好的培养基中的拟南芥生长较好。在通气不良条件下，无机 氮及有机氮培养的你南芥只开花不结荚，必须同时供给氧气和二氧化碳后拟 南芥才能结荚。试验结果还首次表明，无菌条件下拟南芥以无机氮或有机氮 作唯一氮源培养6 9 天后均能开花，但以有机氮作唯一氮源拟南芥开花比以无 机氮作唯一氮源的开花早，而且以有机氮作唯一氮源的拟南芥能够完成生命 周期即能够开花结荚心 r ，p 簪植r ，l l 蕺态氰效应研究中文捌r 关键词：无菌培养v 种子；消毒剂；组合灭菌? 氨基酸态氨￥铵态氮yg o t ； g p t ；, 5 s 标记；春化：生命周期，水稻；小麦；大白菜；绿豆；拟南芥 l l l t 致谢 在作博士论文期间，自己在学习、试验、完成论文以及生活等各方面都 得到恩师陶勤南教授的悉心指导、关心和帮助，恩师的严谨治学方法使我终 身收益。还特别感谢吴良欢教授为论文的完成提供机会并在试验和撰写论文 过程中提供具体的指导和帮助。在作博士论文期间，还得到了环境与资源学 院研究生科娄建悦老师，核农所的唐世荣老师，环境与资源学院的领导以及 方萍老师的支持和帮助。试验过程中，范稚莲硕士，何勇强博士，高用明博 士，姜东博士，陈锦新硕士等为论文试验提供提供作物种子并提出宝贵意见。 化工部上海化工研究院杜晓宁高级工程师为试验的同位素测定部分提供帮 助。此外，博士论文部分内容还得到徐星萍同学、范崇耿同学的帮助。博士 论文期间，在试验和生活上还得到了梁和博士，莫秀德博士，张冬平博士， 路兴花硕士，刘铭硕士，夏会龙博士。朱维琴博士以及李志刚博士的关心和 帮助。此外，在博士论文期间还得到了广西大学林鉴钢教授，陶春娘副教授， 陈佩琼教授和白厚义教授的关心和帮助。 最后，我特别感谢我的爱人范稚莲硕士对我工作的支持和理解，并给我 提出很好的意见和想法。正因为有这么多老师、同学及领导的关心和帮助， 自己的博士论文才得以完成，在此，我表示由衷的感谢。 莫良玉 二零零一辛巨月于浙江大学华家池校l g 前t 前言 自从1 8 4 0 年德国化学家李比希( l i e b i g ) 创立植物的矿质营养学说以来。 人们就很重视化肥的施用，化肥每年的施用量逐渐增加，使世界的农作物产 量成倍增加。然而，由于长期大量施用化学肥料，目前已引起严重的环境问 题。土壤退化严重，耕地肥力也逐年下降，土壤养分平衡被破坏，引起农业 生产成本增加。地下水、江河和湖泊不同程度地受到化肥的污染，化肥含有 多种有毒重金属，过多施用还会引起农产品的污染，氮肥还会引起蔬菜叶硝 酸盐含量增加，影响人体健康。而且，化肥工业本身也对环境造成很大的污 染。由于化肥存在种种弊端，人们开始重视生态农业，重视有机肥的施用。 有机肥来源广泛，作物秸秆、农副产品加工废弃物、动物产品加工废弃物、 人畜排泄物以及城市生活垃圾等等均可为农业系统提供充足的有机肥。作物 施用有机肥后，不仅产量提高，而且产品的品质也提高，但是，迄今人们对 有机肥的作物营养机理仍来十分了解。有机肥在土壤中可被土壤微生物降解 产生大量的有机营养成分，如氨基酸等，这些有机营养成分对作物的营养效 果如何仍未清楚。吴良欢和陶勤南( 2 0 0 0 ) 发现，水稻在无菌条件下不仅可 以吸收甘氨酸态氮，而且甘氨酸对水稻的营养效应优于铵态氮。但是，农业 生产中的其他的农作物能否吸收有机态氮，有机态氮对这些农作物的营养效 果如何，植物能否以有机氮作唯一氮源完成生命周期等方面仍未了解。故本 文主要研究不同科植物能否直接利用氨基酸态氮，对不同氨基酸的吸收是否 相同，有机氮和无机氮是否相互影响，以及不同氨基酸对不同植物的叶、根 中转氨酶活性影响等，以探索氨基酸对植物生理特性影响的规律性。另外还 探讨以有机氮作唯一氮源能否完成生命周期。通过完成这些试验，可以扩充 植物矿质营养学说的内涵，为有机肥料的研制和应用提供一些理论依据，为 治理环境污染提供一些理论指导。 前 i t 有机氮很容易被微生物降解，因而有机营养实验必须在严密的无菌条件 下进行才能得到确切的结果。我们于9 0 年代建起了植物有机营养实验室，这 就保证了试验可在严密的无菌条件下进行进入实验室的空气经过滤孔直径 为0 5i l 的过滤膜过滤3 次变为无菌空气，该无菌空气垂直流到方形植培台 上，植培台上有光源，室内的温度由大功率的冷暖空调器调节。试验培养植 物就放在植培台上培养，菌检表明，植培台上检测不到微生物存在。有机营 养试验整个过程要做到植物培养基质无菌，空气无菌，采用无菌苗以及植物 培养液中不存在将氨基酸脱氨的脱氨基酶，只有这样才可能表明植物只能直 接吸收有机氮。正由于有了这个有机营养实验室，才使得我们有条件从事植 物有机营养研究工作。 2 第一部分文h 囊述 第一部分文献综述 氮是自然界中分布最广的元素之一。在地球的地壳岩石和沉积物中含有 很大一部分以固定态存在，另外还有很大部分则分布在大气层中。大气层 中分子态氦的含量为3 8 1 0 “吨。而岩石豳中的氮含量为1 8 1 0 “吨。土壤 中的氮仅占在岩石圈氮很小的一部分，而土壤氮中能被植物直接吸收的氮仅 占很小的比例。氮在大气圈、土壤圈和生物圈之间循环很快。氮对植物的生 长非常重要，植物体含氮量在2 4 之间，植物体内的许多重要化合物均含 有氮，如蛋白质、核酸、氨基酸、叶绿素、色素以及一些生长激素等等。在 许多农业生态系统中，氮素通常是植物生长的限制因子，施用氮肥对提高农 业作物产量有很大作用。但是，氮肥的不合理施用不仅对作物的品质和产量 造成不良的影响，而且还引起环境退化。因而氮素的施用以及植物对氮素的 吸收代谢研究日益受到重视( m e n g e l 和k i r k b y , 1 9 8 2r 孙羲，9 9 1 ；朱兆良， 和文启孝，1 9 9 2 ) 。下面对近年来在植物吸收和同化氮素方面的研究进展作一 综述。 1 高等植物同化铵的g s g o g a t 循环 植物体内的n h 4 + 有多种来源，一部分来自根细胞质膜上转运子吸收的 n h 4 + 与n 0 3 ( c h r i s p e e l s 等，1 9 9 9 ：f r o m m e r 等，1 9 9 4 ：c r e n 和h i m l ，1 9 9 9 ) ， 其中n 0 3 可由体内细胞质硝酸还原酶( n r ；e c i 6 6 1 ) 还原为n 0 2 。，再由质 体( p l 嬲t i d ) 中的亚硝酸还原酶( n i r ；e c i 7 7 1 ) 将进入质体的n 0 2 还原为 n h 4 + ，一部分来自光呼吸、根瘤菌固氮作用、氨基酸代谢等代谢途径( c r e n 和 h i r e l ，1 9 9 9 ) 。过去认为谷氨酸脱氢酶( g d h ；e c l 4 1 2 ) 是同化n h + 的主要 酶，因为该酶在植物体内广泛分布，可催化下列反应： 卜谷氨酸+ h 2 0 + n a d ( p ) o 一酮戊二酸+ n h 3 + n a d h 2 第一部分文捌罐拳逮 后来研究表明，o d h 对n h 3 的亲和力低( k m 7 0 r a m ) ( l e a ，1 9 9 2 ) ， 只有当体内n h ，浓度较高，该酶才起作用，但通常情况下细胞中n h 3 浓度较 低。因此，该酶对植物体内n h 3 同化的重要作用受到怀疑，目前一般认为g d h 主要起解除氨毒作用( m e l o o l i v e i r a ，1 9 9 6 ) 。1 9 7 4 年l e a 和m i f l i n 发现一条 新的n h 4 + 同化有效途径，植物体内9 5 以上n h 4 + 通过该途径同化( l e a ，1 9 9 2 ； l e a 和m i f l i n ，1 9 9 9 ) 。n h 4 + 进入该途径首先由谷氨酰胺合成酶( g l u t a m i n e s y n t h e t a s e ，g s ) 催化合成谷氨酰胺；然后由谷氨酸合成酶( g l u t a m a t e a - o x o g l u t a r a t ea m i n o t r a n s f e r a s e ，g o g a t ) 将谷氨酰胺和口一酮戊二酸转变为2 个分子谷氨酸，其中一个分子谷氨酸可作为g s 的底物，另一个谷氨酸可用 于合成蛋白质、核酸等含氮化合物。在同化n h 4 + 时，g s 和g o g a t 是同时 起作用的，因而该途径被称为g s ，g o g a t 循环( 见图1 1 ) 。g d h 可对 g s g o g a t 循环起辅助作用( r e f o u v e l e t 和d a g u i n ，1 9 9 9 ；q u 町i 和m a d u ， 1 9 9 6 ) 。当植物发芽、衰老以及种子形成时，o d h 可催化谷氨酸脱氨，使n h 3 进入g s g o g a t 循环而得以再利用。 在g s g o g a t 循环中，g s 催化下列反应： l - - 谷氨酸+ a 1 p 小m 3 l - - 谷氨酰胺+ a d p + p i + h 2 0 n a d h 图1 1 高等植物体内同化氮的g s g o g a t 循环 g s - - 谷氨酰胺合成酶：g o g a t - - 谷氨酸合成酶。 】亨一部分文献i 述 g s 对n i - 1 3 有高的亲和力( 1 ：。：0 0 1 , 4 1 m m ) ，能迅速将体内的n i - 1 3 同化 为氨基酸，防止n h 3 积累中毒。 目前在高等植物中发现有两种类型的g o g a t ，一种是以n a d h 为还原 剂( n a d h - g o g a t ；e c l 4 1 1 3 ) ，另一种是以f d 作为还原剂 ( f d g o g a t ；e c l 4 7 i ) ，它们催化下列反应： q 一酮戊二酸+ l - - 谷氨酸+ n a d h 2 - 2l 谷氨酸+ n a d + q 一酮戊二酸+ l 一谷氨酸+ f d ( 还原型) - 2l 谷氨酸+ f d ( 氧化型) 植物的叶、根、根瘤、子叶等器官均发现g s g o g a t 循环酶系存在。用 g s 抑制剂m s o ( l - m e t h i o n i n e s - s u l p h o x i m i n e ) 、p p t ( p h o s p h i n o t h r i c i n ) 等处理植 物组织时可引起组织内n h 3 浓度上升，而用g o g a t 抑制剂 a z a s e r i n e ( o - d i a z 0 8 c e t y l s e r i n e ，重氮乙酰丝氨酸) 、d o n ( 6 - d i a z o 5 o x o n o r l e u c i n e ；重氮酮基正亮氨酸) 等时则可阻碍n h s 同化，同时组织中谷氨酰胺含 量也提高：用5 n 一甘氨酸供给c 3 植物叶片发现谷氨酰胺先被博n 标记，然 后才是谷氨酸被标记；缺失g s 的大麦突变体在空气中生长时叶片中n h 3 浓 度很高，与用g s 抑制剂m s o 、p p t 处理相同，这是因为光呼吸释放出的n i - 1 3 未被g s 同化；用峙n i - h + + m s o 供给缺失叶绿体0 s 小麦未发现有带1 5 n 标 记的氨基酸；目前已发现有缺失g o g a t 的拟南芥、大麦、碗豆突变体，这 些突变体在空气中生长时叶中谷氨酰胺迅速累积，氨基酸合成减少；缺失叶 绿体g s 和f d - - g o g a t 的双突变体大麦在高c 0 2 浓度条件下( 光呼吸被抑 制) 可以生长，一旦暴露于空气中生长即受严重抑制，同时c 0 2 同化速率下 降，叶中n i - 1 3 浓度升高( l e a ，1 9 9 2 ) 。所有这些均表明，植物体内存在 g s g o g a t 循环，并且是同化n h 4 + 的主要途径。 o s o o g a t 循环在同化氨时需不断补充碳架，以满足植物生长对n 的需 求，碳架主要来自a 一酮戊二酸，因而该酸是连接c 、n 代谢的关键点。通 常认为是由细胞质型异柠檬酸脱氢酶( n a d p - d h ) 催化异柠檬酸脱氢产生 ( c h e n ，1 9 9 8 ) ，线粒体三羧酸循环形成的柠檬酸通过载体进入细胞质后，由 细胞质乌头酸酶将其变为异柠檬酸，然后由该酶将异柠檬酸变为a 一酮戊二 ，亨一部分文献蟓篷 酸提供g s g o g a t 循环碳架；线粒体三羧酸循环中的异柠檬酸脱氢酶能催化 异柠檬酸变为a 一酮戊酸，因而也可能由线粒体n a d i d h 催化提供。但细 胞质中的n a d p - i d h 不是限制g s g o g a t 循环碳架的关键步骤。还有另外 的碳架补偿途径( k r u s e ，1 9 9 8 ) 。这表明g s g o g a t 循环的碳架可有多种来 源( p a r k 和k a h n ，1 9 9 9 ：l a n c i e n ，1 9 9 9 ：l a n c i e n 等，1 9 9 9 ) 。 了解了植物的g s g o g a t 之后，我们就可以利用各种手段( 如利用分子 生物学方法) 来提高植物对氮的利用效率。用转基因方法将松树的g s 基因 导入白杨基因组中，获得了含有松树g s 基因活性的白杨，转基因白杨的g s 活性比不转基因的高，而且叶绿素含量也高，树生长2 个月的株高比不转基 因的高出7 6 ，而生长6 个月以后转基因白杨树高也比不转基因的高出2 1 ( g a l l a r d o 等，1 9 9 9 ) 。转基因烟叶中的g s 2 活性比正常株的高出2 倍后，植 株生长量高出正常株的2 0 3 0 ( 以鲜重计) ( m i g g e 等，2 0 0 0 ) 。最近发现， 在植物衰老过程中，叶中铵的同化部位叶绿体逐渐向叶肉细胞质转移 ( b r u g i e r e 等，2 0 0 0 ) 。因此，当我们要改良作物时，要从多方面考虑问题， 才能获得预期的目的。 2 植物氨基酸营养研究进展 李比希创立植物的矿质营养学说以来，人们一直认为植物只能吸收无机 态氮而不能吸收有机态氮，施入土壤中的有机态氦必须由土壤中的微生物矿 化为无机态氮后植物才能吸收，因而矿质养分受到重视。对植物吸收和同化 n h , + 、n o ：方面已有较深入的了解，在根细胞质膜上发现有吸收n h 。+ 、n 魄的高 亲和性和低亲和性转运子( t r a n s p o r t e r ) 存在，编码这些转运子的基因已 被克隆并进行了描述( f r o m m e r 等，1 9 9 4 ；d o d d e m a 和t e l k a m p ，1 9 7 9 ；g l a s s 等，1 9 9 2 ； k l e i n e r ，1 9 8 1 ) 。然而，随着研究手段的改进和研究的深入，有越来越多的证 据表明植物也能吸收有机态氮。w o l f 在1 8 6 8 就发现黑麦在以酪氨酸作唯一 氮源时生长良好；之后陆续发现其它一些植物也能吸收氮基酸态氮( m c k ， 1 9 6 2 ) 。进入九十年代后，植物有机氮营养研究逐渐增多。水稻在淹水条件下 6 第一部分文崩l 述 能吸收分子态尿素，而早稻则几乎没有吸收分子态尿素，这是由于在淹水条 件下脲酶活性受抑制，尿素受酶降解少( p u l f o r d 和t a b a t a b a i ，1 9 8 8 s e f e e n a 等( 1 9 9 9 ) 。近年来，在植物直接吸收氨基酸态氮方面有重大进展，下面对 近年来在生理生化和分予生物学方面的进展综述如下。 2 1 嗜氨基酸植物 2 1 1 北极及北方地带土壤中氨基酸含量 北半球北极及北方地带常年低温，分布着大量的沼泽、湿地，微生物活 性低，有机质矿化缓慢，土壤氮养分含量低，其主要来自降雨、微生物固氮、 周围分水岭和地下水。据估计每年每平方米通过降雨和微生物固氮进入北极 土壤中的氮为3 0 2 5 0m g ( j o n a s s o n 和s h a v e r ，1 9 9 9 ) 。土壤无机养分含量低， 如北极苔原土壤无机氮仅0 5 1 0m gn k g ，由有机氮矿化而来的无机氮 仅能满足植物需氮量的一半左右，而微生物体养分含量高，使得能为植物吸 收的无机氮养分更少；土壤有机氮含量可达2 8m gn k g ，在白毛羊胡子 草( e r o p h o r u mv a g i n a t m ) 和苔草( c a r e xa q u a t i l i s ) 生长的湿地中。氨基酸 浓度常高出无机氮的好几倍( j o n a s s o n 和s h a v e r 。1 9 9 9 ：k i e l l a n d ，1 9 9 4 ：c h a p i n ， 1 9 9 3 ) 。北方森林土壤的氨基酸氮含量约为1 0k g h a ，而无机氮为0 3k g h a 。 左右，表明氨基酸是森林的重要氮源( n a s h o l m 等，1 9 9 8 ) 。因而氨基酸对于 生长在北极、北方的植物非常重要。 2 1 2 北极苔原嗜氨基酸植物 生长在北极、北方的植物常具有高效的养分再利用能力，表显为一方面 叶片寿命较长养分在体内停留时间也较长。植株养分吸收及损失减少，另 一方面，这些植物常能直接吸收氨基酸等有机态氮，以补偿土壤无机氮的不 足( j o n a s s o n 和s h a v e r ，1 9 9 9 ) 。 c h a p i n 等( 1 9 9 3 ) 首先发现无菌根的维管植物喜欢吸收氨基酸，从野外 7 ，f 一部分文罐避 获得的无菌根北极莎草( 白毛羊胡子草) 的根能有效地吸收氨基酸，其吸收氨 基酸的量至少占该植物在野外吸收总氮量的6 傩；水培试验发现以氨基酸作氮 源时吸收的氮和形成的生物量均比以无机氮作氮源时的多，而适应无机氮环 境生长的小麦在以氨基酸作氮源时吸收的氮和形成的生物量均比以无机氮作 氮源时的少近一半。s c h i m e l 和c h a p i n ( 1 9 9 6 ) 研究苔原莎草( t u n d r as e d g e ) 原位( 如s i t v ) 吸收氨基酸时发现，白毛羊胡子草和苔草( c a r e xa q u a t i l i s ) 对氨基酸的吸收速率不低于n 儿+ ；在生长高峰季节供给高浓度氨基酸( 2 5m g n k g 。) ，其吸收速率甚至高于n h , + ，而在生长后期给以低浓度氨基酸( 2 4 鸭 n k g “) ，其吸收速率近似于n h , + 。k i e l l a n d ( 1 9 9 4 ) 发现，生长在北极四个生态 系统即干燥石楠林( d r y h e a t h ) 、草丛苔原( t u s s o c kt u n d r a ) 、灌木苔原( s h r u b t u n d r a ) 和湿草甸( w e tm e a d o w ) 的维管植物也能直接吸收氨基酸，其吸收 氨基酸能力因植物种类而异，吸收的氨基酸态氮可占植物吸收总氮量的1 0 8 2 ；他还发现，植物对氨基酸的吸收能力与氨基酸分子量呈负相关。 2 1 3 菌根对植物吸收有机氮的促进作用 植物可与真菌形成菌根以提高有机氮的吸收能力，具石南菌根植物吸收 有机氮不受无机氮存在的影响，菌根吸收氨基酸后能释放自由氨基酸而被宿 主植物直接吸收( j o n a s s o n 和s h a v e r ，1 9 9 9 ：k i e l l a n d ，1 9 9 4 ；r a a d ，1 9 9 1 ) 。有试 验表明，具有外生菌根的落叶灌木吸收氨基酸速率最高，具石南型( 内生) 菌 根的常绿植物居电。而不具菌根的禾草类( g r a m m o i d s ) 最低( k i e l l a n d 1 9 9 4 ) 。 n a s h o l m 等( 1 9 9 8 ) 发现瑞典北方森林中的欧洲赤松( p l n u s s y l v e s t r y 曲、挪威 云杉( p y c e aa b f e 0 、欧洲越桔( v a c c i n i u mm y r t i l l u s ) 和曲芒发草 ( d e s c h a z p s y af l e x u o s a ) 等植物在野外能吸收有机态氮。他们将带双标记甘 氨酸( u 一：、。 n - g l y c i n e ) 或1 5 n i + 注射到晚期演替的针叶林( 1 a t e s u c c e s s t i o n a lc o n i f e r o u sf o r e s t ) l 的粗腐殖层( m o rl a y e r ) 中，研究有外 生菌根的树木欧洲赤松、挪威云杉，有石南型菌根的矮灌木欧洲越桔以及有 丛枝菌根的曲芒发草在野外吸收氨基酸情况，通过测定根中”c 和1 5 n 百分超 1 第一部分文娃逮 比值明显地表明这些植物能直接吸收氨基酸，6h 后至少有9 1 、6 4 和4 2 的甘氨酸分别被矮灌木、草和树木吸收：此外，还发现施入土中的甘氨酸代 谢迅速，2h 后呼吸释放的3 c 仉速率为7 d 后的1 4 倍。 2 1 - 4 高山地带嗜氨基酸植物 高山( a l p i n e ) 由于海拔高，其气候特点与北极相似，常年低温土壤 有机质通过微生物的矿化作用受抑制，因而土壤有机质含量高，无机氮含量常 常较低；有机氮含量常高于无机氮，因而有机氮对生长在这一地带的植物和 微生物非常重要。高山土壤中氨基酸含量较高，在高山干草甸土壤孔隙水中 氨基酸浓度变幅为1 3 1 5 8um o l l ，甘氨酸为主要成分；在亚高山沼泽地 土壤孔隙水中氨基酸浓度为1 5 2 0i im o l l ，天冬氨酸为主要成分，而在矮 草草原土壤孔隙水中氨基酸浓度为2 5 4 5 l jm o l l ，谷氨酸为主要成分。这 些土壤中的高浓度氨基酸主要来自土壤蛋白酶对土壤蛋白质水解作用及土壤 对相当数量氨基酸的吸附作用( r a a b 等，1 9 9 9 ) 。 r a a b 等( 1 9 9 9 ) 从五个自然生态系统中收集不带菌根的1 3 种莎草植物，其 中3 种为高山莎草、4 种为亚高山莎草、2 种为短草草原莎草、1 种为温带沼 泽莎草，3 种为干燥热带森林莎草，他们用这些莎草进行有机氮( 甘氨酸) 和 无机氮( n 0 3 、n h 。+ ) 吸收研究，结果发现除一种干燥热带森林莎草( g a h n i a g a h n i f o r m i s ) 不能吸收甘氨酸外，其余的均能吸收甘氨酸，而且发现有一种 高山莎草( k o b r e s i am y o s u r o i d s ) 不能吸收n h + ，其对no ，虽能吸收，但对 n o 。一的吸收速率低于对氨基酸的；温带、热带莎草对n h + 和n 0 。这两种无机氮 的吸收速率高于对氨基酸的，这可能是这些莎草适应了无机氮环境的缘故。 温带莎草吸收氨基酸、n h + 、n 仉一的速率均比高山、亚高山莎草大，也可能是 由于温带莎草生长量大，对氮需求量大的缘故。而生长于高山、亚高山的莎 草吸收甘氨酸的速率大于n h 。+ 、n 盯 生长于北极、高山、亚高山、温带及热带的绝大部分莎草均能吸收有机 氮，具有普遍性，但吸收能力不同，且与环境条件的很大关系生长于北极、 9 ，亨一部分文剖罐t 述 高山、亚高山等地区的植物，在低温、高有机质含量的根际环境中趋向于偏 重吸收有机氮。 2 2 作物对氨基酸的吸收 二十世纪九十年代以来，已在严密的无菌培养试验结果证明作物能吸收 利用如氨基酸等有机n 。在无菌水培条件下，等n 量( 1 0 r a g l ) 有机、无机 n 对水稻的营养效果依次为甘氨酸态n 谷氨酸态n 铵态n ( 吴良欢和陶勤 南，1 9 9 9 ) ；在甘氨酸态n 与铵态n 配施条件下，以吸n 总量为基础计算的 甘氨酸态n 营养贡献率可达5 5 6 6 ( 吴良欢和陶勤南，2 0 0 0 ) 。 作物在田间条件下也能吸收氨基酸态n 。n a s h o l m 等( 2 0 0 0 ) 用梯牧草 ( p h e u m p r a t e n s e ) ，杂种车轴革( t r i f o i i u m h y b r i d u m ) ，红车轴革( 7 ： p r a t e n s e ) 和毛良( r a n u n c u u sa c r i s ) 等作物为材料，用注射方法供给带 双标记的甘氨酸( u - 1 3 c ：1 5 ng l y c i n e ) ，2 1 h 后测定根中的”c 和1 5 n 含量，发现 这四种作物在田间均能吸收分子态甘氨酸，被吸收的甘氨酸中至少有1 9 2 3 以上是以分子态的形式被植物吸收，这暗示有机n 也可能是农业上大田 作物的重要n 源。 2 3 植物对根际氨基酸分泌物的再吸收 植物叶片的光合产物能迅速地从叶片转移到根中，而大多数陆生植物根 能向根际分泌含碳化合物，这样损失的碳可占植物总固碳量的1 4 0 ，而氮 损失可占植物总固氮量的1 0 左右( m e n c h 和m a r t i n ，1 9 9 1 ) 。根分泌物成分 复杂，含有多种含碳化合物，其中糖类、有机酸类和氨基酸类为主要成分( c u r l 和t r u e g l o v e ，1 9 8 6 ：k r a f f c z y ，1 9 8 4 ) 。 已发现植物能再吸收这些分泌物。j o n e s 和d a r r a h ( 1 9 9 4 ) 发现，玉米在无 菌水培时其根被动分泌氨基酸，但又主动吸收被分泌的氨基酸。根细胞质中 氨基酸浓度( 9 5r a r a 0 1 ) 与土壤溶液中氨基酸浓度( 0 0 3r e t 0 0 1 ) 形成较大浓度 差，且氨基酸在根尖处浓度大，远离根尖浓度下降，说明氨基酸主要在根尖 第一部分文献缘遥 处被动分泌，他们推算的分泌速率为o 2 7n m 0 1 c m 1r o o t h 1 。j o n e s 和 d a r r a h ( 1 9 9 3 ) 还报道，无菌水培条件下，每天更换根洗液时发现玉米根分泌 氨基酸速率为4 18 6 16n g m g 1r o o t h 1 ，在静态培养( 不更换根洗液) 根分 泌和再吸收氨基酸达平衡后根洗液中氨基酸浓度很低( 约5 0 i lm 0 1 ) ，而大田 中植物根的氨基酸净分泌率为o 1 4 1 4n g m g 一r o o t h ，这就表明根细 胞质膜上氨基酸转运子对氨基酸有很高亲和力。当用质子门( p r o t o np h o r e ) 抑制剂c c c p ( c a r b o n y lc y a n i d em - c h l o r o p h e n y | h y d r a z o n e ) 加入根洗液 ( m o t - b a t h i n gs o l u t i o n s ) 后可抑制根对氨基酸的吸收，而根分泌氨基酸不受 抑制，使氨基酸在根洗液中积累，另外低温( 5 0 c ) 也可减少根对氨基酸的吸 收而对分泌影响不大，也造成氨基酸在根洗液中累积，这表明根吸收氨基酸 为主动吸收，需有质子梯度推动；根质膜上的氨基酸转运子不受氨基酸诱导， 根对氨基酸的吸收受无机氮存在的影响。无菌条件下玉米吸收甘氨酸、甲硫 氨酸的速率比吸收n 0 3 的大，前者为1 7 4 0ug r a g r o o td w h ，而后 者为1 5 1 6 ug m g r o o td w h 。 在大田条件下，植物根分泌氨基酸主要集中在根表面处，氨基酸在土壤 干燥时扩散距离仅几个um 而且在根尖处微生物数量少，因而利于根对氨基酸 再吸收。g o r d o n 和j a c k s o n ( 2 0 0 0 ) 报道，死根和活根中氮浓度相近，说明 氮不能从老根转移。由于根细胞质氨基酸浓度高，故当根衰老组织死亡降解 后增加根际中氨基酸浓度，也利于根的再吸收。 2 4 植物和微生物对土壤中氨基酸营养的相互竞争 当土壤养分丰富时，植物或者通过根增殖，或者通过改变根的养分吸收 动力学来增加养分的吸收。施入土壤中的有机质主要通过土壤微生物( 细菌、 真菌) 进行分解土壤中的氮9 0 以上是以有机氮形式存在，这些有机氮的 3 0 5 0 9 6 可以被微生物分解为氨基酸。土壤中氨基酸除来自有机质分解外， 降雨也可以提供氨基酸，因为雨水中自由氨基酸浓度为1 1 5 pm o l l ( m o p p e r 和z i k a ，1 9 8 7 ) 。一般耕作土中自由氨基酸含量为0 3 1 4 7 2m g k 9 1 第一部分文献蟓逑 ( m o n r e a l 和m c g i i i ，1 9 8 5 ) 而o s t l e 等( 1 9 9 9 ) 通过测定土壤氮的自然丰 度( 61 5 n ) 测得草地( g r a s s l a n d ) 和耕作土中氨基酸含量为3 5 0 1 9 8 0m g k g ， 而土壤的全氮含量为90 0 0 - 6 00 0 0m g k g 。植物和微生物吸收氨基酸迅速， 施入土壤的氨基酸半衰期( h a l f - l i f e ) 在1 1 2h 之间，因而植物和土壤中 的微生物竞争吸收氨基酸。j o n e s 和h o d g e ( 1 9 9 9 ) 通过比较植物和微生物对氨 基酸吸收的动力学和简单的根际计算后发现植物和微生物对氨基酸的吸收速 率相似，表明在根际中它们竞争氨基酸强烈。h o d g e 等( 2 0 0 0 ) 报道，植物竞 争氮素养分能力比微生物强，给黑麦草施带哨、“c 双标记有机氮后，植物吸 收1 1 5 4 的氮，而微生物吸收7 1 3 的氮。但短期试验却表明微生物是强 竞争者，有4 0 一7 0 的“n 留在微生物体中( k i e l l a n d ，1 9 9 4 ) 。 2 5 植物细胞吸收和转运氨基酸的机理 2 5 1 植物细胞对氨基酸的主动吸收和转运 植物细胞质膜控制着养分的进出。有实验表明，细胞能通过质膜上的特 异性载体蛋白主动吸收氨基酸。该载体属质子偶合运输蛋白或称质子偶合共 运门，它需要h + 的电化学势梯度推动上向运输( u p h i l lt r a n s p o r t ) ，h + 梯度 由质膜w - a t p a s e 产生。b u s h 和l a n g s t o n u n k e f e r ( 1 9 8 8 ) 首次给纯化的密生 西葫芦( z u c c h i n i ) 纯化质膜囊泡( p u r l l i e dp l a s m am e m b r a n ev e s i c l e s ) 加上质子电化学势描述了高等植物细胞质子偶合氨基酸运输。之后，l i 和b u s h ( 1 9 9 0 ，1 9 9 1 ，1 9 9 2 ) 利用纯化的甜菜叶质膜囊泡研究发现氨基酸运输属电产 生的，由彳p h 和膜电势( 么1 l r ) 驱动，受化学修饰剂d e p c ( d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e ) 抑制，d e p c 主要是修饰转运子的组氨酸残基；他们发现质膜 上至少有四种氨基酸转运子：一种是酸性氨基酸转运子一种是碱性氨基酸转 运子，另两种是中性氨基酸转运子( 分别称为中性系统i 和中性系统i i ) ，虽 然某一转运子对某组氨基酸具专一性，但每一转运子均能对另一组氨基酸表 现出交换专一性。这表明一个转运子可运输多种氨基酸。近年来对蓖麻、拟 南芥质膜的氨基酸转运予研究较多。w e s t o n 等( 1 9 9 4 ，1 9 9 5 ) 及w i l l i a m s 等 1 2 第一p 分文剖h 蓬 ( 1 9 9 2 ) 研究蓖麻( r i c i n u sc o 聊u n i s 厶) 根的纯化质膜囊泡的氨基酸运输 后发现，谷氨酰胺、异亮氨酸、谷氨酸和天冬氨酸跨膜运输由跨膜p h 梯度和 跨膜电势推动，表明这些氨基酸吸收是与质子共运输，而赖氨酸和精氨酸等 碱性氨基酸的运输仅由膜电势( 内膜为负) 驱动，表明碱性氨基酸运输为电 压驱动单向运输( v o l t a g e d r i v e nu n i p o r t ) 。氨基酸吸收竞争实验表明，蓖 麻根质膜上至少有三种载体，两个是对中性氨基酸具高亲和力而对碱性和酸 性氨基酸具低亲和力载体( 其中一个对天冬酰胺不具高亲和力而另一个对异 亮氨酸和缬氨酸不具高亲和力) ，一个是对碱性氨基酸和一些中性氨基酸具高 亲和力而对酸性氨基酸具低亲和力载体。 c h e n 和b u s h ( 1 9 9 7 ) 将拟南芥( a r a b i d o p s i s ) e s tc d n a s 克隆至缺失氨基 酸转运子的酵母中表达，发现拟南芥细胞质膜上有转运赖氨酸和组氨酸专一 性转运子( l h t l ) ，其对赖氨酸和组氨酸的k 值分别是1 7 5 和4 0 01 1m o l 。拟 南芥中还发现有氨基酸转运子a a p i 一5 。h a p l 主要运输带负电荷和中性的氨基 酸，a a p 2 和a a p 4 主要运输脯氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸，a a p 3 和a a p 5 主要运 输精氨酸、赖氨酸等。 此外，盐胁迫也能诱导一些植物产生氨基酸