（发育生物学专业论文）小鼠早期胚胎发育过程中细胞凋亡及凋亡基因表达的检测.pdf

独仓4声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 f 壅；如丛直墓丝益要壁型童塑曲：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名_ 参廒 日期：p f 缉钼，自 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名参该 日期：扣年卵侑 导师签名：留易彩吼。年杉闩 ， 摘要： 早期胚胎发育过程当中伴随着大量的发育异常的细胞，尤其在体外培养过程中更为普遍。 细胞凋亡是体细胞中清除发育异常细胞的重要途径之一，研究表明，早期胚胎当中异常细胞 的清除也是通过细胞凋亡的途径实现的。着床前胚胎当中凋亡现象普遍存在，即使是形态正 常的胚胎当中也存在凋亡细胞，而细胞凋亡的发生是凋亡基因的表达的直接结果。胚胎细胞 大比率的凋亡对胚胎的生长是不利的，为了提高体外培养胚胎的存活能力，人们通过改变培 养条件，添加生长因子来抑制胚胎细胞的凋亡。 各种生长因子影响胚胎发育能力的研究已有大量的报道，但这些研究大多停留于各时期 胚胎发育率的数据统计，而对各种生长因子对胚胎作用的分子机制没有做进一步的深入研究。 尤其对早期胚胎发育过程当中生长因子与凋亡基因表达变化之间的关系研究的更少。对早期 胚胎发育过程中凋亡基因表达变化的研究对于揭示早期胚胎发育机制有重要的意义。 本实验采用彗星电泳、改进后的胚胎r n a 提取方案结合巢式r t - p c r 、免疫化学染色的 方法，对小鼠体内早期胚胎在发育过程中的细胞凋亡情况及凋亡基因b c l 2 家族的表达情况 进行了研究。同时检测了i g f 1 在体外培养条件下对小鼠胚胎细胞凋亡及凋亡基因b c l 2 家 族( b a x 、b c l 2 、b a k 、b c l x 1 ) 表达的影响，初步揭示了i g f 1 可能通过调节b c l 2 家族基 因的表达，抑制细胞凋亡的发生，提高了小鼠胚胎的质量和胚胎的发育率。这对于揭示早期 胚胎发育机制机理以及获得更多的优质胚胎有重要的意义。 实验结果表明： 1 在国内同类研究中率先使用彗星电泳的方法检测早期胚胎当中的凋亡现象。彗星电 泳结果表明早期胚胎发育过程中广泛存在凋亡，不同发育时期的形态正常的胚胎当 中存在凋亡细胞。 2 采用改进的胚胎细胞总r n a 提取方案，应用少量胚胎提取总r n a ，使用巢式p c r 的方法检测到b c l 2 家族当中4 个基因( b a x 、b c l 2 、b a k 、b c l x 1 ) 在小鼠胚胎发育 的早期表达，且表达情况随发育时期的不同而变化。 3 体外无血清培养条件下，凋亡胚胎比率上升，并且b a x 基因在桑椹胚期表达量上升， 而b c l - 2 基因的表达量降低。 4 1 0 0 n g m li g f 1 能够促进小鼠胚胎的生长，提高各时期胚胎发育比率及囊胚发育率， 降低凋亡胚胎比率。 5 在同类研究中首次直接证明，i g f 1 对小鼠早期胚胎发育过程中b c l 2 家族b c l 一2 及 b c l x l 基因的表达有明显的影响。1 0 0 n g m li g f - 1 能够上调桑椹胚期b c l 一2 基因的表 达以及桑椹胚期和囊胚期b c l x l 的表达量；对促凋亡基因b a x 及b a k 在小鼠早期胚 胎当中的表达没有明显的影响。 关键词细胞凋亡：早期胚胎：b c l 2 家族：i g f 1 a b s t r a c t a p o p t o s i sa n de x p r e s s i o no fa p o p t o s i sg e n e sd u r i n gm o u s ee a r l y e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t d u r i n gt h ep r e i m p l a n t a t i o ne m b r y od e v e l o p m e n t ，w ec a l lf i n dm a n ya b n o r m a lc e l l se s p e c i a l l y i nt h ep r o c e s so fi nv i t r oc u l t u r e a p o p t o s i si sa ni m p o r t a n tw a yt oe l i m i n a t ee x c e p t i o n a lc e l l si n t i s s u e m a n yr e s e a r c hs h o wt h a ta p o p t o s i sa l s ow o r ki np r e i m p l a n t a t i o ne m b r y o a p o p t o s i si s p r e v a l e n ti np r e i m p l a n t a t i o ne m b r y o s ；e v e nt h ee m b r y oi sm o r p h o l o g i c a ln o r m a l a p o p t o s i si st h e r e s u l to fa p o p t o s i sg e n e se x p r e s s i o n t h el a r g er a t i oo fa p o p t o s i si ne m b r y om a yi n f l u e n c et h e e m b r y o sl i v a b i l i t y , i no r d e rt oi m p r o v et h el i v a b i l i t yo fe m b r y o s ，w h i c hc u l t u r e di nv i t r o ，m a n y r e s e a r c h e r st r yt oi n h i b i ta p o p t o s i si ne m b r y o sb yc h a n g i n gt h ec u l t u r ee n v i r o n m e n t ，s u c ha s a d d i t i o n a lg r o w t hf a c t o r s t h e r ea r em a n yr e p o r t sa b o u tg r o w t hf a c t o r sc a ni n f l u e n c et h ed e v e l o p m e n to fe m b r y o ，b u t m o s to ft h e mf o c u so nt h es t a t i s t i c so ft h er a t i oo ff e t a t i o n ，t h ei n v e s t i g a t i o no nt h em e c h a n i s mo f h o wt h e s ef a c t o r sw o r ka r er a r e t h e r ei sg r e a tm e a n i n gt oe x p l o r et h em e c h a n i s mo fe a r l ye m b r y o d e v e l o p m e n tb yi n v e s t i g a t et h ea p o p t o s i sg e n ee x p r e s sc h a n g ed u r i n gp r e i m p l a n t a t i o ne m b r y o d e v e l o p m e n t w eu s et h ec o m e ta s s a y , a m e l i o r a t i v ep r o j e c to ng e t t i n gt o t a lr n af r o me m b r y o sc o m b i n et h e n e s t e dr t - p c r ，i m m u n o c h e m i s t r y , t oa n a l y s i sa p o p t o s i sa n dt h ec h a n g eo fb c l 一2f a m i l yg e n e s e x p r e s s i o n b a s e do nt h e s e ，w ee x a m i n et h ei n f l u e n c eo fi g f 一1 o na p o p t o s i sa n dt h ec h a n g eo f b c l 2f a m i l yg e n e s ( b a x 、b c l 2 、b a k 、b c l - x 1 ) e x p r e s s i o ni nv i t r ot oi n v e s t i g a t et h em o l e c u l a r m e c h a n i s mo f i g f 1i n f l u e n c et h ed e v e l o p m e n to f p r e i m p l a n t a t i o ne m b r y o s t h er e s u l t sa sf o l l o w e d ： 1 a m o n gt h e i n t e r n a ls t u d i e sw et a k et h el e a do fu s i n gt h ec o m e ta s s a yt oe x a m i n e a p o p t o s i si np r e i m p l a n t a t i o ne m b r y od e v e l o p m e n t t h er e s u l t s h o w st h a ta p o p t o s i si s p r e v a l e n ti np r e i m p l a n t a t i o ne m b r y o s ，a p o p t o s i se x i s t si ng o o dm o d a l i t ye m b r y o so f d i f f e r e n ts t a g e s 2 u s i n gt h en e s t e dp c rt oe x a m i n ef o u rg e n e so f t h eb c l - 2f a m i l y , w eu s e dt h ea m e l i o r a t i v e p r o j e c tt oi s o l a t et o t a lr n af r o me m b r y oc e l l s i nt h i sp r o j e c t ，t h eq u a n t i t yo fe m b r y oi s s m a l l w ef o u n df o u ro ft h eb c l - 2f a m i l yg e n e sp r e v a l e n te x p r e s s i o nd u r i n gt h ee a r l y e m b r y od e v e l o p m e n t ，a n dc h a n g ew i t ht h ed i f f e r e n ts t a g e s 3 t h ei nv i t r os y s t e mw i t h o u ts e r u mu p g r a d e st h er a t i oo fa p o p t o s i si ne m b r y o d u r i n gt h e s t a g eo f m o r u l a , b a xe x p r e s su p g r a d e ，w h i l eb c l 2d e c r e a s e 4 w ef o u n dt h a t1 0 0 n g m li g f 1c a ni m p r o v et h ee m b r y od e v e l o p m e n ta n dt h er a t i oo f b l a s t o c y s t ，d e c r e a s ea p o p t o s i s 3 5 a m o n gt h er e s e a r c hi nc o m m o n ，w ef i r s td i r e c t l yp r o v e dt h a ti g f - 1c a l li n f l u e n c et h e e x p r e s s i o no fb c l - 2 ，b c l - x l ，w h i c ha r em e m b e r so fb c l - 2f a m i l y , d u r i n gp r e i m p l a n t a t i o n e m b r y od e v e l o p m e n t 1 0 0 n g m li g f 1c a nu p g r a d et h ee x p r e s s i o no f b c l - 2i nm o r u l aa n d b c l - x li nm o r u l aa n db l a s t o c y s t ；b u th a sn oo b v i o u se f f e c t so nb a xa n db a k k e yw o r d s ：a p o p t o s i s ；p r e i m p l a n t a t i o ne m b r y o ；b c l - 2f a m i l i e s ：i g f 1 g r a d u a t e ：l i w e i s p e c i a l i t y ：d e v e l o p m e n tb i o l o g ys c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o f y a ny u n q i n 4 1 引言： 1 1 哺乳动物早期胚胎发育过程中的细胞凋亡的生物学意义 在哺乳动物中，大约有3 0 7 0 的胚胎在发育过程中夭折，其中绝大部分发生在胚 胎发育的早期。早期胚胎死亡的原因很多，与遗传与环境因素关系密切。在哺乳动物早 期胚胎发育的过程中，在胚胎发育的任何一个阶段都能够发现包含凋亡细胞的胚胎 f b y m e 等，1 9 9 9 ) 。 细胞凋亡是生物体在发育过程中为了维持自身正常的生长发育需要对发育异常的细 胞及多余细胞的清除过程之一。在许多组织当中都检测到了细胞凋亡的发生，在着床前 早期胚胎的发育过程当中也能够检测到( j a l ( o b ，2 0 0 3 ) 。通过对核酸的染色可以在这些胚 胎当中发现染色体的凝集，通过a n n e x i nv 染色的方法可以检测到胚胎细胞膜表面磷酯 酰丝氨酸的明显变化( r 1 e v y 。1 9 9 8 ) ，这些现象都是细胞发生凋亡时的明显特征。许多研 究表明，细胞凋亡是早期胚胎清除由于自身或外界不良环境影响产生的不良细胞的主要 途径之一。 在早期胚胎发育的各个时期当中，尤其是囊胚中能够检测到明显的凋亡信号。即使 是在并未表现出碎裂等凋亡的明显特征，而且形态上仍然正常的胚胎中也能够检测到凋 亡信号。现在的胚胎移植所采用的胚胎通常优先选用符合形态学检测标准的优质胚胎， 但实验证实，一部符合形态学标准的优质胚胎当中也包含相当比例的凋亡细胞。在一般 的体细胞实验结果表明，细胞凋亡存在不可逆性，一旦细胞内部的凋亡机制启动，尽管 细胞的形态依然正常，最终还是不能摆脱凋亡的命运。含有大比率凋亡细胞的胚胎的发 育能力必然要受到影响，含有大量凋亡细胞的胚胎的移植成功率将会大大的降低。 胚胎细胞的凋亡比率与胚胎发育能力之问的关系现在还不清楚，凋亡诱发因素与细 胞凋亡之间具体的信号通路还在研究当中。现在的研究着重于从改变体外胚胎培养条件 入手，抑制体外培养过程中凋亡的发生、提高胚胎的发育能力以及提高移植的成功率。 现在的研究表明，多种生长因子都能够对胚胎的细胞凋亡进行调节，尽管这些生长 因子影响胚胎发育能力及胚胎细胞凋亡比率的实验已有大量报道，但人们对这些生长因 子在早期胚胎发育过程中作用的分子机制研究的还很少，尤其对受体、配体所介导的凋 亡通路知之甚少( k a w a m u r a ，2 0 0 1 ) 。对早期胚胎细胞凋亡机理的研究对于揭示早期胚 胎发育的机制，提高优质胚胎产量有很大的意义。 1 2 早期胚胎凋亡的影响因素 1 2 1 体内发育胚胎的凋亡情况 在早期胚胎发育的过程当普遍存在着凋亡现象，即使在正常的体内发育的胚胎当中 也存在凋亡的细胞( s t r a s z e w s k i ，2 0 0 5 ) 。在体内获取的各时期的胚胎中发现，各时期胚 胎当中都包含凋亡细胞核。超过5 0 的小鼠的囊胚中包含有凋亡细胞，在内细胞团中尤 其明显( m i s h r a , 2 0 0 5 ) 。这说明生物体通过凋亡这一途径对早期胚胎的发育过程加以调 控，清除发育过程中染色体畸形以及发育异常的胚胎细胞。 1 2 2 体外培养胚胎凋亡的影响因素 在畜牧业生产和人类辅助生育技术当中，胚胎的体外培养作为一种常规手段被广泛 使用。研究发现，体外培养胚胎的细胞凋亡比率明显高于体内发育胚胎。影响胚胎细胞 凋亡比率的因素很多，其中体外培养的环境对胚胎细胞的凋亡有重要的影响。体外培养 过程对胚胎的发育能力影响很大，胚胎获取以及胚胎培养的实际操作过程都可能对胚胎 的发育能力及胚胎细胞的凋亡产生影响。 1 2 2 1 超数排卵对胚胎质量的影响 不管是在畜牧生产还是在人类辅助生殖治疗过程，要保证成功率的关键就要获得足 够数目的优质胚胎，而要达到这一目的就需要使用外源激素刺激卵巢一次排除多个卵母 细胞。这一过程使用激素刺激改变了卵巢的正常生理状态，很可能对卵母细胞的发育能 力造成影响，进而影响胚胎的发育能力( a n d r e a ，1 9 9 8 、w i n g ，2 0 0 0 、b o e l h a u v e ，2 0 0 5 ) 。 胚胎早期发育所需要的部分m r n a 及蛋白依赖于卵母细胞的积累，由于激素刺激而过早 排出的卵母细胞内m r n a 及蛋白水平必然要受到影响( g e o r g e ，2 0 0 4 ) 。已经发现人类 正常生理周期排除的卵子与超数排卵获得的卵子在基因及蛋白水平存在差异( a n d r e u ， 2 0 0 0 ) 。对于超数排卵对胚胎发育的影响目前还没有系统的研究。有报道表明，超排激 素的使用可能导致卵巢的过度刺激以及卵母细胞染色体的畸形( s t a l l o c k ，2 0 0 3 ) ，但使 用激素刺激对胚胎发育能力及对胚胎凋亡的影响目前还没有系统的研究。 1 2 2 _ 2 体外发育环境对胚胎的影晌 体外培养条件能够对胚胎的发育产生影响，不适宜的培养条件能够诱发胚胎细胞的 凋亡( b d s o n ，1 9 9 7 、l o n e r g a n ，2 0 0 3 ) 。即使是在不同的培养液中，胚胎细胞的凋亡比率也 6 有较大的差别( d i a s e n 2 0 0 1 ) 。培养在m 1 6 培养液中的小鼠囊胚细胞凋亡比率为3 2 4 ， 而同期培养在k s o m 中的小鼠囊胚细胞凋亡比率为2 0 3 ( m a r z i e l ，2 0 0 2 ) 。通过对牛 早期胚胎体内及体外发育过程中基因表达情况的检测发现，体外培养胚胎不仅在形态上 与体内胚胎存在差别而且在蛋白表达上也有明显的不同( a u g u s t i n 2 0 0 3 、l o n e r g a n ， 2 0 0 3 ) 。另外在体内发育过程中胚胎发育的内环境受母体的调节，不存在剧烈的环境变 化；而在体外发育过程中，胚胎在转移过程中的低温刺激( y u a n ，2 0 0 3 、b o d z i o c h ，2 0 0 5 ) ， 培养过程中的温度( p a u l a ，2 0 0 2 ) ，p h ( p a u l a ，2 0 0 4 ) 变化的刺激以及环境中放射线及辐 射( m i k i o ，2 0 0 1 ) 的影响都能够影响胚胎的发育。在体内环境中，各种生睦因予的水平 是受到母体调：常的其浓度随着胚胎发育的过程而改变( v e r h a g e ，1 9 9 7 ) 。虽然人们已经 在早期胚胎发育的体内环境当中检测到了许多生长因子，但生长因子在早期胚胎发育过 程中的变化情况现在还不十分清楚( a n d r e o s ，1 9 9 8 ) 。各种生长因子在早期胚胎发育过程中 的作_ l j i ! 上及作用的具体机制还需要做进一步的研究。 1 3 生长因子在早期胚胎发育过程中的作用 早期胚胎发育过程当中胚胎受到多种生长网子的协同作用，其中有生睁窿进因子也 有生陆抑制因子( b e h r , 2 0 0 5 ) 。在对早期胚胎的研究中发现，一些在体内发育阻滞的胚 胎在体外培养条件下能够重新启动发育过程。这说明体外发育环境可能稀释或排除了体 内发育过程中阻碍发育的因囊从而促进了胚胎发育进程( s o p h i e ，2 0 0 0 ) 。 在早期_ i 匝胎发育过程中起作用的生长因子的来源可以分为两类一类是由生殖道上 皮细胞分泌通过旁分泌途径起作用或通过血液循环经内分泌途径释放到胚胎发育环境 中：另一种则是由胚胎自身分泌的，通过自分泌途径来调节胚胎的发育。研究发现培养 在较小的培养滴中的胚胎以及在个培养滴中培养多个胚胎，能够提高胚胎的发育能力 ( s o p h i e ，2 0 0 0 ) 。这说明胚胎能够自身台成生长刨子( co n e i l l ，】9 9 8 ) 。同时外源生长因 子也在早期胚胎发育的过程中起着重要的作用，并直接与胚胎细胞的存活与否有密切的 关系。在许多培养系统当中，外源生| 丈因子的缺火都被作为一种诱发凋亡发生的手段被 使用( j o h n ，2 0 0 0 、r i z o s ，2 0 0 3 ) 。 不同生长因子作用于胚胎细胞的途径不同，多种生长因子是通过细胞膜表面的受体 来发挥功能的。在早期胚胎细胞膜表面已经发现了多个生长因子家族的受体或配体- 如 胰岛索样生长园子家族( i g f s ) 、表皮生长因子( c u ix s ，2 0 0 3 ) 、肿瘤坏死因子、白介素 等( d a n i e l ，1 9 9 7 、h a r d y , 2 0 0 2 ) 。这些生长因子的受体或配体表达的强弱及活性随着胚胎所 处时期的不同而变化，说明在某一时期早期胚胎可以对这些生艮因子做出反应 ( l i u ，2 0 0 5 ) 。在早期胚胎当中能够检测到胰岛素受体，但检测不到胚胎自身产生的胰岛 素蛋白及m r n a 。这说明在胚胎发育的过程中，外源胰岛索通过旁分泌途径调节胚胎的 生长发育。加入外源的生长因子比如t g fa ( d a n i e l ，1 9 9 8 ) 和i g f - l 能够明显的促进 着床前胚胎的发育，增加内细胞团细胞的数目以及提高囊胚发育率，明显的减少人囊胚 细胞的捅亡比例( b y r e n 2 0 0 2 ) 。在t g fa 缺陷型小鼠的胚胎中发现囊胚内细胞团数目 明显减少而且凋亡比率明显升高( b r i s o n ，1 9 9 7 ) 。其它的生长园子也对胚胎的生长起不 垄i ! 圣彗蠢差翼兰璧老茎塞篓耋 同的调节作臻。但它们在聪黯细胞当申的信学通路至今还没有摘清。虽然在体缨臆实验 中已经得到了一些结果，但在不同的组织当中同一种因子的作用效果及通路可能完全不 同( d e w e y 。1 9 9 5 ) 在早期胚胎细胞当中生长因子的作用通路是否与体细胞相同遥有铸 避一步抟研究。 1 3 1 胰岛素样生长因子家族( i g f s ) 及其在胚胎早期发育过程 中的作用 在影嫡早期胚齄发育的众多生长强子当中，胰岛豢祥生长强子是a 们醑究较罩翡一 共生长困予在体外培养实验中作为一种重要的添加成分被广泛使用。对于i g f 1 作用机 制的研究一直是a 们关注的热点。 i g f s 是一类络构上类能干胰岛索原的多欣，主要包括i g f - 1 和 g f - 2 两类，他们分 别为包台7 0 和6 7 个氨基酸的单链多肽。i g f 1 中有7 0 的序列与i g f 2 相同，5 0 的 痔到与臃薅素相辎。i g f s 在体纲麓中翁作翔主簧逢透过细胞表囊翦摸受体介导避籽匏。 i g f 1 和i g f 2 各有其特异性的受体。胰岛素受体也能丹导1 g f s 的作用，但不同癸型的 受俸对各种不同分子结台能力差异较大i g f * 1 受体( i g f - i r 结台 g f - i 豹能力蔗胰 岛素受体的1 0 0 倍。在着珠前囊坯缃艟膜表掰能检测到i g f 1 r 的表达，这说明在i 瑾船 发育过程中i g f - 1 可能通过受体介导来调节胚胎的发育。 在虫液孛i g f - i 及i g f 2 通常与拔称为i g f b p s 驰蛋白塞藏结台。这一家族毡耩六 个相对分子质量约为3 0 k d a 的蛋白，依次为i g f b p 1 i g f b p - 6 他们对i g f s 分子有很强 纳吸附作用。其结合自力强于细胞膜表亟的i g f s 受体。他们在斑液中超稳定i g f s ，姓 及调节1 g f s 在盘液及组织中的分配眈例的作糟( h w a ，1 9 9 9 ) 。i g f b p s 在不同的绒织中 袭达不同的类型，其活性受磷酸化、糖基化、特异性的瑕自水解酶等多种因素的调节。 在众多i g f b p s 家族分子孛i g f b p - i 与胚胎发育的关系较为密切。i g f b p - i 参与予富肉 膜细胞、胎盘膜上的i g f s 受体竞争性的与1 g f s 结合，从而通过对i g f 1 浓度的调控来 调四组织蜘胞的生长( m a r z l e l ，2 0 0 2 ) 。张培养至囊胚的小鼠胚胎的培养液中发现有i g f i i 及i g f b p * i ( t i a n ，2 0 0 2 ) ，这可能怒胚胎自身分泌i g f b p 一1 蛋囱调节生长环境中i g f s 的浓度。 1 3 2i g f 1 在胚胎发育中的作用 在胚胎早期发育过程中，i g f - i 的作用十分明显( a n d r e a ，2 0 0 3 ) 。在正常的艇胎培 养过程中常常添加动物血清。其中包括多种生长因子( m o i l e r ，2 0 0 1 、j i a 2 0 0 1 ) 旭包 括j g f 1 。在噩骀发育过程孛，尤其程蕾寐蘸豹发育j 妻稷输弈管内的i g f 一1 靛浓壤变纯 对胚胎的芷常发育有者十分重要的意义( a v m a k a r e v i c h ，2 0 0 2 ) 。i g f - i 对胚胎发育的影 响主要有弼个方。一是促进细艟分鞋，增加细胞数量i 二是抻制细腿凋亡，促进胚胎 发育。 实验发现，在体外培养的输卵管上皮细胞在孕酮的作用下i g f b p - t 的表达量下调。 虽然没有直接的证据证明这种下调是否能够经由i g f 1 浓度的变化而对胚胎的发育产生 影响。但从多个体外培养实验证明i g f 一1 确实能增进胚胎生长( l i g h t e n ，1 9 9 8 ) ，以及 在早期胚胎存在的子宫及输卵管环境中，羊、猕猴等大的动物中检测到了i g f - 1 蛋白表 达( m a t w e e ，2 0 0 0 ) 。据此，我们推测着床前胚胎生长内环境中的i g f 1 浓度变化与胚 胎发育的质量有关。 在胚胎体外培养的实验中证实，i g f 1 能够在体外培养过程中发挥抗凋亡的功能。 i g f 1 能够提高胚胎的存活率，并使内细胞团细胞数增加，还能明显提高体外培养胚胎 的囊胚发育率。从形态鉴定以及t u n e l 染色对胚胎的碎裂及凋亡情况加以检测，添加 i g f 1 组的胚胎碎裂率及t u n e l 阳性比率都明显下降( s o p h i e ，2 0 0 0 ) 。1 g f 1 能够降低 胚胎的凋亡比率，增加内细胞团的细胞数目( b y m e ，2 0 0 2 ) 。并能够降低胚胎在受到凋 亡诱导物刺激后的凋亡比率，用放射线刺激兔的体外培养胚胎以诱导凋亡，对照组与添 加i g f 1 组差异显著，说明i g f 1 对放射线的不良刺激有挽救的作用( m i k i o ，2 0 0 1 ) 。 i g f 1 能够有效地阻止凋亡的发生及提高囊胚率，胰岛素也有相似的作用，但弱于i g f 1 要达到与i g f l 相同的效果，其浓度要提高l o 倍。 尽管i g f 1 的抗凋亡功能得到了广泛的认同，但它具体在胚胎当中如何发挥功抗凋 亡功能还有待进一步的研究。胰岛素受体的m r n a 在胚胎发育的早期就能够检测到，可 小鼠胚胎八细胞期检测不到i g f 1 受体蛋白。但能够检测到i g f 1 受体m r n a 。这表明 在早期胚胎发育过程中i g f - 1 可能也是通过受体对胚胎的生长起作用，但八细胞前i g f - 1 是否能够调节胚胎的生长发育目前尚不十分清楚( g o r d o n ，2 0 0 1 ) 。 生理浓度的i g f 1 能够促进胚胎的生长，而过高浓度的的i g f 1 则对胚胎的生长起 抑制作用。实验结果表明，6 0 0 nm o l m l 的i g f 1 能够明显的抑制胚胎的存活，高浓度的 i g f 1 使得大量的胚胎不能发育至囊胚。这种现象能够被i g f 1 抗体或结构类似物所缓 解( c h im m ，2 0 0 0 ) 。对于高浓度胰岛索样生长因子的致病机理目前还不是十分明确， 但培养在高胰岛素浓度环境下的细胞表现为胰岛素样生长因子受体表达量的下调。推测 i g f 1 的细胞毒作用可能与靶细胞膜表面的受体丢失有关。 1 4 早期胚胎发育过程中的凋亡基因表达 早期胚胎的发育过程是一个多个基因同时协同作用的复杂过程。但就凋亡现象而言， 现在己经发现许多与细胞凋亡相关的基因在哺乳动物胚胎发育的早期表达( y o k o ，2 0 0 5 、 c u i ，2 0 0 6 ) 。在形态正常的胚胎当中也能检测到这些与凋亡的发生直接相关的分子的 m r n a 及蛋白，这些分子的表达量的变化决定着胚胎的命运。在早期胚胎当中已经发现 多个凋亡基因的表达，如在人和大鼠的着床前胚胎中发现f a s f a s l 的表达、在人早期 胚胎中发现b c l 2 家族、i a p 家族、t n f 家族p 5 3 ( k a w a m u r a ，2 0 0 1 、y o k o ，2 0 0 5 ) 以 及与细胞凋亡关系密切的c a s p a s e 家族等( a n d r e a ，2 0 0 3 、l o n e r g a n ，2 0 0 3 ) 。这些家族 基因在早期胚胎发育过程中发挥作应共同调节早期胚胎的发育进程，基因的表达变化与 胚胎发育的过程紧密相连。实际上从胚胎一细胞晚期开始，胚胎的基因就已经开始转录。 此时胚胎的生长情况是受到母源r n a 与合子r n a 共同调节的( j u r i s i c o v a ，1 9 9 8 ) 。 9 东北农业大学理学硕士学位论文 1 4 1 早期胚胎发育过程中的b c l 2 家族基因表达情况 在胚胎发育过程中已经检测到了b c l 2 家族基因的表达，几乎所有的b c l 2 家族成员 都在着床前胚胎当中被检测到( m e t c a l f e ，2 0 0 4 、v a t a n s e v e r ，2 0 0 5 ) 。b c l 2 家族蛋白分为 两类：b a x 等促进凋亡的发生；而b c l 2 等则维持细胞的存活( s a t o ，2 0 0 2 ) 。在形态正 常的人类囊胚中检测到了b c l - 2 的高表达，而在同期碎裂胚胎当中则没有发现( h a r d y ， 1 9 9 9 ) 。b c l - 2 家族蛋白分布于细胞的内膜系统，在线粒体内膜以及核膜上分布尤其丰富。 而细胞的命运取决与细胞线粒体内膜表面b c l 2 家族成员形成的同原及异源二聚体的比 率( s o r e n s o nc m ，2 0 0 4 、j e o n g ，2 0 0 5 ) 。在早期胚胎发育的全过程中都能够检测到b c l 。2 家族的表达，在形态正常的胚胎当中也不例外( x i a n g ，2 0 0 4 ) 。虽然在绝大部分胚胎细 胞当中都检测到了凋亡蛋白，但这并不意味着所有的细胞都要发生凋亡。细胞凋亡是一 个程序化的过程。虽然凋亡的诱发原因多种多样，但都必须通过调节凋亡基因的表达来 激活细胞内部的凋亡通路。一般认为，一旦这一通路被激活，凋亡的发生就将是不可逆 的。在哺乳动物体细胞当中，凋亡的发生最终是由c a s p a s e 家族蛋白家族机联发应完成 的。而c a s p a s e 家族蛋白的激活则是由促凋亡基因与抗凋亡基因之间的相互作用决定的 ( c h im - m ，2 0 0 0 ) ，相关的凋亡基囚表达变化情况才是决定细胞命运的关键。 1 4 2 早期胚胎发育过程中i c 限1 与b c l 2 家族之间的关系 i g f - 1 在体外胚胎培养体系当中是一种经常被添加的生长因子，其促生长抗凋亡的 功能已经被大家认同，但i g f 1 抑制细胞凋亡的作用因细胞的类型、诱导细胞凋亡因素 的不同而表现不同信号通路也不尽相同( d e s a i ，1 9 9 9 ) 。i g f 1 能够在早期胚胎当中发挥 抗凋亡、促进细胞增殖的功能，但它的分子机制目前还不是十分清楚。现有的信号通路 的推测都是体细胞培养所得到的结果的推论。在体细胞及肿瘤细胞当中i g f 1 在多种细 胞当中通过调控b c l 2 家族蛋白的表达水平发挥抗凋亡的作用，通过调节b c l 2 家族个成 员的表达水平以及各个家族成员的磷酸化水平来影响二聚体的形成( s o r e n s o n ，2 0 0 4 ) 。 在肿瘤细胞中，i g f 。1 能够上调b c l 2 的表达水平，维持肿瘤细胞的存活；i g f 1 还能够 下调促凋亡蛋白b a k 的表达并能够介导抗凋亡蛋白b c l x l 的表达从而维持肿瘤细胞生存 的目的( p a r d z a s ，1 9 9 7 ) 。 在患有卵巢囊肿综合症的病人经常发生不孕的现象，经检查发现这些病人体内常能 检测到高浓度的胰岛素水平和高浓度的i g f 1 水平，并且伴随有高胰岛素样生长因子所 引起的i g f b p 1 及i g f b p 3 的表达量的下调。高浓度的i g f 1 对胚胎的生长有抑制作用， 在用生理浓度1 3 nm o l m l 和极高浓度1 3 0 nm o l m 1 分别培养小鼠的胚胎的实验中发现， 高浓度i g f 1 引起的凋亡具有浓度依赖性。用荧光染色的方法发现高浓度i g f 1 引起的 凋亡是由i g f 一1 受体的下调引起的( m a g g i e ，2 0 0 0 a ) 。在b a x 基因缺陷型鼠胚胎的培养 实验中发现，处在高浓度i g f l 培养液中的不表达b a x 的胚胎的凋亡比率要明显低于正 常胚胎。这说明，b a x 在高浓度i g f 1 诱导凋亡的过程中起很重要的作用。 在囊胚时期，胚胎发生一种能量使用来源上的变化。从对丙酮酸的氧化磷酸化转向 1 0 葡萄糖的无氧酵解。这种能量上的转移被认为是为胚胎着床及无氧条件所做的准备，在 这一过程中，葡萄糖的蓄积量大大增加，在内细胞团中尤为明显。处于此阶段的胚胎正 由输卵管向子宫颈迁移，在人的输卵管中检测到胰岛索和i g f 1 浓度的升高。我们推测 i g f 1 在一定程度上调节了葡萄糖的转运( m a g g i e ，2 0 0 0 b ) 。而且不论是在高浓度葡萄 糖所诱导的小鼠早期胚胎细胞凋亡实验还是高浓度i g f 1 诱导凋亡发生的实验中都发现 b c l 2 家族蛋白表达的变化( t o r c h i n s k y ，2 0 0 3 ) ，我们推测在这些过程当中b c l 2 家族蛋 白是导致胚胎细胞凋亡的关键因素。 虽然有关i g f 1 能够对影响早期胚胎发育过程中b c l 2 家族基因的表达的直接证据 并不多( c u i ，2 0 0 5 ) ，但胰岛素可以通过影响体细胞中b c l 2 家族蛋白b a x 、b c l x l 的表 达( a u g u s t i n ，2 0 0 3 、y u ，2 0 0 3 ) 。依据从肿瘤细胞当中得到的结论( s o r e n s o n ，2 0 0 4 ) 以及 在早期胚胎发育过程中i g f 1 与b c l 2 家族之间存在的种种联系，我们推测：在早期胚胎 发育过程当中i g f 1 与b c i 2 家族基因表达之间存在着某种联系。 1 5 本研究的目的及意义 随着对早期胚胎发育机理研究的不断深入，以及在动物生产及人类辅助生育技术的 不断进步。对于质量高、形态好、移植后有良好发育前景的胚胎的需求量会不断的提高。 获取卵母细胞进行体外成熟、体外受精、体外培养以提高优质胚胎的获取效率已经成为 趋势。体外培养过程对胚胎的发育产生的影响很多。培养液的不同组分，不同生长因子 的浓度都对胚胎的生长有至关重要的影响。而这些都与早期胚胎发育过程中的基因表达 情况有直接的关系。在体外胚胎培养体系中加入生长因子能够促进胚胎的发育而生长 因子对早期胚胎在分子水平如何发挥作用现在仍了解不多，有些只能够通过在体细胞中 得到的结论来加以推测。对这些因子在早期胚胎发育过程中具体对哪些基因的表达产生 了影响还需要进一步的研究。生长因子作用的时期及作用的浓度都会对早期胚胎的基因 表达产生影响，继而影响早期胚胎的发育。i g f 1 作为一种对早期胚胎细胞凋亡起抑制 作用的生长因子在体外培养过程中被广泛使用，但它与凋亡基因表达变化之间的关系至 今仍不清楚。 本实验主要通过检测各个时期体内发育及体外发育早期胚胎的凋亡情况及b c l 2 家 族基因、蛋白的表达，并加以分析。在此基础上添加i g f 1 ，研究其对早期胚胎凋亡及 凋亡基因表达的影响，揭示其可能的作用机制，以期进一步加深人们对早期胚胎发育机 制的认识，同时也可以为提高哺乳动物优质胚胎产出率、加速动物育种、治疗人类不孕 症等提供一定的理论和实验依据。 东北农业大学理学硕士学位论文 2 材料和方法 2 1 主要器材和试剂 2 1 1 主要器材 电子分析天平( 瑞士m e t t l e r1 d l e d o ) 自动双重纯水蒸馏器( 上海玻璃仪器一厂) 恒温磁力搅拌器( 江苏医疗仪器厂) 酸度计( 瑞士m e t t l e r ) 台式高速离心机( 上海安亭) 生物超净工作台( 苏州净化设备有限公司) c 0 2 培养箱( 美国f o r m a ) 实体显微镜( 国产m o t i c ) 倒置显微镜( 日本o l y m p u s ) 荧光显微镜( 日本0 吖m p u s ) 2 1 2 主要试剂 孕马血清( p r e g n a n t m a r es e r u m g o n a d o t r o p i n ，p m s g ) 购自天津市华孚高新生物技术公司 人绒毛膜促性腺激素( h u m a nc h o r i o n i cg o n a d o t r o p i n ，h c g ) 购白天津市中宝药业有限公司 抗体兔抗鼠抗体均购自s a n t ac r u z 公司 p c r 反应所用药品均购自上海p t o m e g a 公司 其他分子生物学试剂均购自于s j 舯a 或g b c o 公司 2 2 实验动物及处理： 本实验所用小鼠为昆明白品系，6 8 周龄性成熟雌鼠，购自哈尔滨肿瘤医院实验动物中 心。动物饲养于人工控制条件下。室温2 2 光照周期为1 4 d q 对光照( 6 ：0 0 2 0 ：o o ) ，1 0 h 黑暗，可以自由取食、饮水。所用雄鼠均单笼饲养，雌性小鼠集中饲养。 2 2 1 供体鼠超数排卵 实验用雌鼠于下午1 5 ：o o 腹腔注射5i u 孕马血清促性腺激素( p m s g ) 间隔4 8 小时腹腔， 注射5i u 人绒毛膜促性腺激素( h c g ) 进行超数排卵处理。 2 2 3 各阶段胚胎获取： 雌鼠注射h c g 后，立即与雄鼠合笼，第二天早晨检出阴道栓的为已受精小鼠。根据胚胎 发育时程，分别于注射h c g 后4 2 、5 5 、6 6 、8 0 、9 0 h 从雌性小鼠的输卵管及子宫中冲取2 细胞、 4 细胞、8 细胞、桑椹胚、早期囊胚。 2 3 1 胚胎的体外培养 取受精雌鼠，于注射h c g 后4 2 h 从输卵管中冲取2 细胞胚胎，m 2 洗涤几次后每1 0 个2 细胞 胚胎移入2 0ulc z b + 1 0 0 n g m li g f 1 培养滴中