（法医学专业论文）小鼠皮肤切创愈合过程中caspase抑制剂对caspase活性的影响和对细胞凋亡抑制作用的研究.pdf

英文缩略语 1 4 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 论文作者签名：i l 型：日期：丝2 2 ：! j o 训 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印，缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 、织删 中文论著摘要 小鼠皮肤切创愈合过程中c a s p a s e 抑制剂对c a s p a s e 活性的影响和对细胞凋亡抑制作用的研究 刖舌 皮肤切创愈合过程是机体保持组织完整性而产生的一个连续而复杂的过程， 大致分为三个阶段，即炎症期、增生期和组织重建期，有多种细胞因子和炎症细 胞参与。研究表明，皮肤损伤愈合过程中保持细胞数量的平衡是通过程序性细胞 死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ) ，即细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 这一机制完成的“1 我们的前期研究认为c a s p a s e 家族成员可能参与皮肤损伤愈合过程中多型核细 胞、单核细胞、成纤维细胞这三种细胞的凋亡，并且c a s p a s e 家族成员有望成为 用于皮肤损伤时间推断的指标问。而且在皮肤切创愈合过程中c a s p a s e 的表达、 激活情况对参与损伤愈合中细胞凋亡的影响和对组织愈合的影响尚未见报道，也 未见关于在体研究参与皮肤损伤愈合过程中细胞凋亡机制的研究报道。 q v d o p h ( q u i n o l y l v a l y l o - m c t h y l a s p a r t y l 一 - 2 ，6 - d i f l u o r o p h e n o x y l r r , e t h y l k e t o n e ) 是一种优于z v a d r i n k 和b o c d r i n k 的广谱抑制剂。本实验在切创的动 物模型体内应用c a s p a s e 广谱抑制剂q - v d - 0 p h ，抑制c a s p a s e 级联的激活，从而 抑制c a s p a s e 活性，并且应用免疫组织化学染色技术、比色法、w e s t e r nb l o t t i n g 和盯一p c r 技术等方法检测各组小鼠皮肤切创愈合过程中c a s p a s e - 3 ，- 6 ，- 7 蛋白 的表达、激活情况和m r n a 的表达情况，从而阐述皮肤损伤愈合过程中细胞凋亡的 机制和凋亡细胞的信号转导途径。 实验材料和方法 1 健康成年清洁级昆明系小鼠1 6 2 只，体质量3 0 士2 9 ，随机分为3 组：实验 组( q - v d o p t t 组) 、对照1 组( d m s o 组) 、对照2 组( n a c i 组) 。每组小鼠又分成 o h 、6 h 、1 2 h 、l d 、3 d 、5 d 、7 d 、l o d 、1 4 d 时间段，每时间段6 只小鼠。实验切 口前3 0 m i n 小鼠腹腔注射相应液体，乙醚气体吸入麻醉，背部剪毛处理，常规手 术消毒，在背部中央做一纵行长1 5 a m 皮肤全层切口，深达筋膜。每2 4 h 重复给 药一次。分别于伤后不同时间将小鼠脱颈椎处死，取伤口处1 0 c r u x l 5 c m 皮肤组 织。部分固定后石蜡包埋，5pm 厚度连续切片。部分所取皮肤组织用冷生理盐水 清洗后置于液氮内速冻，一7 0 保存备用于蛋白印迹分析和活性测定分析，部分用 i o d e p c 水冲洗后用t r i z o l 提取m r n a ，用于r t - p c r 分析。 2 常规h e 染色。 3 免疫组织化学染色( s p 法) ： 4 w e s t e r nb l o t t i n g 分析； 5 c a s p a s e 一3 ，一6 活性测定； 6 r t p c r ； 7 图像分析与统计学处理 应用o l y m p u sb x5 1 显微照相摄像系统( 日本) 、计算机显微图像分析系统( m e t a m o r p h d d l o b x 5 1 ) ，4 0 0 倍下，在损伤区及损伤周边区随机选1 0 个视野，计数包 括多型核细胞、单核细胞、成纤维细胞在内的细胞总数和阳性细胞数。计算阳性 细胞百分率，在s p s s l l 0f o rw i n d o w s 软件进行统计学方差分析。 w e s t e r nb l o t t i n g 和r t p c r 分析结果应用f l u o c h e mv 2 o s k 件( 美国阿尔法公 司，电泳凝胶图像工作站) 分析，作灰度扫描分析测定扩增条带灰度值，用内参照 b a c t i n 修正比较各组表达水平的差异。结果采用方差分析。 实验结果 第一部分：小鼠皮肤切创愈合过程中应用c a s p a s e 抑制剂后皮肤 损伤愈合过程的病理形态学变化 q - v d 加p h 实验组愈合过程较对照组快。q - v d - o p h 组伤后6 h 出现多型核细胞 浸润，1 2 h 内可见大量浸润的炎细胞，1 d 可见多型核细胞数量减少，3 d 单个核细 胞堆积，成纤维细胞增生。5 d 肉芽组织增生明显。7 d 可见大量的单个核细胞和长 梭形细胞并可见大量的管腔样结构。伤后l o d 肉芽组织增生明显，1 4 d 形成增生 性瘢痕。 第二部分：小鼠皮肤切创愈合过程中c a s p a s e 抑制剂对 2 c a s p a s e - 3 ，- 6 ，- 7 表达影响的免疫组织化学研究 对照组中c a s p a s e 一3 ，- 6 ，一7 阳性表达主要存在于多型核细胞、单个核细胞和 成纤维细胞中( 细胞种类主要根据形态来区分) ，并且各时间段相邻两组 c a s p a s e 一3 ，一6 ，一7 阳性细胞率存在显著性差别( p 0 o r ) ，q - - v d - o p h 组还可见肉 芽组织内堆积的成纤维细胞大部分表达c a s p a s e - 3 3 日性，阳性细胞率直至1 4 d 达到 最高峰。而此时却很少表达c a s p a s e 一6 ，- 7 。实验组阳性细胞率与对照组存在显著 性差别( p 0 0 1 ) 。 第三部分：小鼠皮肤切创愈合过程中c a s p a s e 抑制剂对c a s p a s e - 3 一6 ，一7 表达及其剪切影响的蛋白印迹分析 对照组c a s p a s e 一3 ，一6 ，一7 的表达存在时间规律性。q - v d - o p h 组随损伤时间 延长，c a s p a s e 一3 前体表达逐渐增多，直至1 4 d 达高峰，但实验组未检出c a s p a s e 一3 的活化片段；c a s p a s e 一6 ，一7 前体表达趋势同对照组，但杂交强度明显降低，而 且只在l d - 7 d 组检出少量活化片段。与对照组存在显著性差异。 第四部分：小鼠皮肤切创愈合过程中o a s p a s e 抑制剂对 c a s p a s e - 3 一6 剪切及其活性变化的研究 对照组c a s p a s e 一3 活性倍数增值在1 2 h 和l o d 分别达高峰，q - v d - o p h 组对 c a s p a s e 一3 的活性完全抑制。对照组c a s p a s e - 6 活性倍数增值在3 d 达高峰， q - v d - o p h 部分抑制了c a s p a s e 一6 的活性，与对照组各时间段相比均有显著性差异。 第五部分：小鼠皮肤切创愈合过程中c a s p a s e 抑制剂对c a s p a s e - 3 ， 一6 ，7m r n a 表达水平影响的研究 对各组各时间段样本进行r t - p c r 实验并进行相对灰度测定分析，发现对照组 c a s p a s e 一3 ，一6 ，一7 m r n a 的表达存在时间规律性。q - v d - o p h 组随损伤时间延长， c a s p a s e 一3 m r n a 表达逐渐增多，直至1 4 d 达高峰；c a s p a s e - 6 ，- 7 m r n a 表达趋势同 对照组，但杂交强度明显降低。表明q - v d - o p h 可以影响c a s p a s e 一3 ，一6 ，- 7a r n a 的 合成。 讨论 近年的研究表明，c a s p a s e 是负责执行凋亡细胞中特异性酶切的关键蛋白酶， c a s p a s e 蛋白酶家族是一类细胞凋亡调节因子家族，当受到一定的信号刺激后通过 蛋白酶级联反应顺序激活，在细胞凋亡过程中起关键作用。结合近年来的研究结 果，提示c a s p a s e - 3 ，一6 ，- 7 极有可能是皮肤损伤愈合过程中诱导中性粒细胞、单 核细胞、成纤维细胞凋亡的最终执行因子。为进一步阐述c a s p a s e 家族成员在皮肤 损伤愈合过程中执行细胞凋亡的作用，应用c a s p a s e 抑制剂人为抑制其剪切和激 活，观察皮肤损伤愈合过程的变化和细胞凋亡的情况。 q - v d o p h 作为新型的c a s p a s e 广谱抑制剂，通过抑制上游的启动型c a s p a s e 而 发挥抑制细胞凋亡的作用。本实验以前期动物实验为基础，通过在体应用q v d _ o p h 研究皮肤损伤愈合过程中细胞的凋亡机制，探讨o - v d - o p h 对c a s p a s e - 3 ，- 6 ，- 7 的抑制情况和对细胞凋亡的影响。 本实验的研究发现正常对照皮肤中检, h c a s p a s e 一3 前体的表达，表明 c a s a p s e 一3 可能参与表皮基底层角朊细胞( k e r o t i n o c y t e ) 的凋亡，并参与皮肤稳 态的维持。而且还检出c a s p a s e - 6 的活性裂解片断，说明c a s p a s e - 6 在正常皮肤中 发挥维持稳态和执行皮肤新陈代谢相关的细胞凋亡的作用。 一、皮肤损伤愈合过程中中性粒细胞凋亡的机制 皮肤损伤愈合的早期，c a s p a s e - 3 、一6 、一7 被激活，尤其是在中性粒细胞浸润 的高峰时相内c a s p a s e 一3 的活性最高，说明在中性粒细胞的凋亡过程中c a s p a s e 一3 的激活发挥主要的作用。应用q - v d - 0 p h 后，c a s p a s e - 3 的激活被抑制，但中性粒细 胞仍旧不发生堆积。说明其自发性凋亡还存在非c a s p a s e - 3 途径，存在其他代偿性 途径发挥执行细胞凋亡的作用。 二、 皮肤损伤愈合过程中单核细胞凋亡的机制 免疫组织化学染色结果表明对照组中浸润和增生的单个核细胞中有 c a s p a s e 一3 ，一6 ，一7 的表达，c a s p a s e - 3 ，一6 ，一7 的激活在单个核细胞的凋亡过程中发 挥重要作用。o v i ) - o p h 抑$ ! j c a s p a s e - 8 。啕，一1 2 的活性，并且抑制了c a s p a s e 一3 ，一6 ， 一7 的活化。由于在q v d - o p h 组内，单个核细胞浸润和增生的高峰时相内c a s p a s e 一3 的激活完全被抑制，但可检出c a s p a s e 一6 ，一7 的活性片段，说明c a s p a s e - 6 ，一7 激活 不单纯由上游因子c a s p a s e - 8 ，一9 ，一1 2 刺激激活，或者我们使用的抑制剂浓度并 未完全抑制c a s p a s e 家族成员的活性，而且在单核细胞的凋亡过程中c a s p a s e - 6 ，- 7 可能不起主要作用。 三、c a s p a s e - 3 ，一6 ，一7 在成纤维细胞凋亡和增生性瘢痕形成过 程中的作用 c a s p a s e - 3 的激活在晚期肉芽组织向瘢痕组织转化过程中发挥主要作用。 c a s p a s e 一6 ，- 7 亦参与成纤维细胞的凋亡。应用c a s p a s e 抑制剂后，c a s p a s e 一3 激活 片段完全被抑制，引起成纤维细胞大量堆积。o - v d - o p h 组内在l o d 和1 4 d 时间段上 c a s p a s e 一6 ，- 7 的激活被抑制进一步说明t c a s p a s e - 6 ，一7 的激活在成纤维细胞的 凋亡和增生性瘢痕的形成过程中发挥重要的作用。 四、 c a s p a s e - 3 ，一6 ，- 7 在皮肤损伤愈合时间推断上的应用 皮肤损伤愈合过程中c a s p a s e 一3 ，一6 ，一7 的阳性细胞率、w e s t e r nb l o t t i n g 和c a s p a s e 一3 ，一6 以及r t p e r 结果表明c a s p a s e 一3 ，一6 ，- 7 基因和蛋白的表达水平 上存在时间规律性，进一步证实t c a s p a s e 一3 ，一6 ，一7 在皮肤损伤时间推断上的应 用价值。 五、d m s o 对皮肤损伤愈合的影响及对c a s p a s e 活性的影响 d m s o 可以较低程度地抑制c a s p a s e 一3 ，一6 ，一7 前体的表达和激活，其中对 c a s p a s e 一3 的抑制作用较弱，而对c a s p a s e - 6 的抑制作用相对较强。 结论 1 皮肤切创愈合过程中应用q _ v d - - o p h 后造成皮肤的异常愈合，形成增生性瘢痕； 2 皮肤切创愈合过程中，q - v d o p h 抑制单核细胞和成纤维细胞的凋亡过程，导致 该类细胞的堆积，但并未影响浸润的多型核细胞数目的减少； 3 皮肤切创愈合过程中q - v d o p h 抑制c a s p a s e 一3 的激活，增加t c a s p a s e 一3 基因与 前体的表达； 4 皮肤切创愈合过程中q - 、，d o p h 抑$ | j c a s p a s e 一6 ，一7 基因和前体的表达与激活； 5 皮肤切创愈合过程中组织中浸润的中性粒细胞的凋亡可能与c a s p a s e 一3 的激活 相关，当其激活被抑制时，可能出现其他代偿性途径执行细胞凋亡； 6 c a s p a s e - 3 的激活可能是执行皮肤切创愈合过程中组织中单个核细胞、成纤维细 胞凋亡的关键因子；c a s p a s e 一6 ，一7 激活不单纯由上游因子刺激激活，并且 c a s p a s e 一6 ，一7 可能不是执行单核细胞和成纤维细胞凋亡的关键因子； 7 d m s o 可以较低程度的抑$ 0 c a s p a s e - 3 ，- 6 ，- 7 的表达和激活。其中对c a s p a s e - 3 的抑制作用较弱，对c a s p a s e - 6 的抑制作用较强。 关键词 皮肤；损伤愈合；c a s p a s e 一3 ；c a s p a s e - 6 ：c a s p a s e - 7 ；c a s p a s e 抑制剂； q - v d o p h ；免疫组织化学；r t p c r ；w e s t e r nb l o t t i n g ；活性测定；成纤维细胞； 单核细胞；多型核细胞；增生性瘢痕 6 英文论著摘要 c a s p a s ei n h i b i t o rp r e v e n t st h ei n c r e a s ei n c a s p a s e 一3 ，一6 ，- 7a c t i v i t ya n da p o p t o s i sd u r i n gi n c i s e d s k i nw o u n d h e a l i n gi nm i c e i n t r o d u c t i o i ti sw e l le s t a b l i s h e dt h a ts k i nw o u n d h e a l i n gc a nb et e m p o r a l l yd i v i d e di n t ot h r e e p h a s e s ，t h ee a r l ya c u t ee x u d a t i v ep h a s e ，f i b r o - p r o l i f e r a t i v ep h a s ea n dt i s s u er e m o d e l m g p h a s e ，w h i c hi n v o l v e di nd i f f e r e n tk i n d so fc y t o k i n e sa n di n f l a m m a t o r yc e l l si n c l u d i n g p o l y m o r p h o n u c l e a rc e l l s ( p m n s ) ，m o n o n u c l e a rc e l l s ( m n c s ) ，f i b r o b l a s t i cc e u s ( f b c s ) t h en u m b e ro fi n f l a m m a t o r yc e l l si n c r e a s e ss i g n i f i c a n t l yd u r i n ge a r l ya c u t ee x u d a t i v e p h a s ea n df i b r o - p r o l i f e r a t i v ep h a s e ，b u t d e c r e a s e s s i g n i f i c a n t l yd u r i n g t i s s u e r e m o d e l i n gp h a s e r e c e n ts t u d i e sh a v es u g g e s t e dt h a ta p o p t o s i so o c l l l 8a n dp l a y sa p i v o t a lr o l ei na c h i e v i n gt h ed e c r e a s ei nc e l l u l a r i t yd u r i n gs k i nw o u n dh e a l i n g o u r p r c v i o u ss t u d i e ss u g g e s t e dt h a tc 硒p a s ep r o t e a s e sp a r t i c i p a t ei nt h ep r o c e s so fc e l l a p o p t o s i si n c l u d i n gp m n s ，m n c s ，f b c sb yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n dt h er a t i oo f p o s i t i v ec e l l si st i m e d e p e n d e n tw h i c hp r o “d e st h ep o s s i b i l i t yo fs k i nw o u n da g e e s t i m a t i o nb yc 船p 鹤e 一3 ，- 6 ，一7i ni n c i s e ds k i nw o u n dh e a l i n gi nm i c e i na d d i t i o n , i ti s s t i hu n k l o w nt h a tt h em e c h a n i s mo fc e l la p o p t o s i sd u r i n gi n c i s e ds k i nw o u n dh e a l i n g a n dt h er e l a t i o m h i pb e c w e e na p o p t o s i sa n dt h ee x p r e s s i o na n da c t i v a t i o no fc a s p 越e e x e c u t o rs u c ha sc 船p a s u - 3 , - 6 ，一7 q v d o p h ( q u i n o l y l v a l y l 0 - m e t h y l 髂p a r t y l 一 - 2 ，6 m i f l u o r o p h e n o x y l - i t , e t h y l k e t o n e ) i sab r o a ds p e c t r u mc 船p a s ei n h i b i t o rw i t hp o t e n ta n t i a p o p t o t i cp r o p e r t i e sw h i c h i sb e t t e rt h a no t h e rc a s p a s ei n h i b i t o rs u c ha sz v a d r i n ka n db o e d - f r a kd u et oi t s i m p r o v e m e n t si np o t e n c y , s t a b i l i t ya n dt o x i c i t y i nt h i ss t u d y , t h ee x p r e s s i o n sa n d a c t i v a t i o n sa n dc l e a v a g e so fc a s p a s e 一3 ，- 6 , - 7w e r ed e t e c t e db yi n m a u n o h i s t o c h e m i s t r y , c o l o r i m e t r i cm e a s l l r e m e mo fp r o t e o l y t i ca c t i v i t y , w e s t e r n b l o t t i n ga n dr t - p c r f o l l o w i n gt h ei n t r a p e r i t o n e a li n j c c t i o no fq v d o p hi nt h ei n c i s e ds k i nm i c et o 7 p r e v e n tc a s p a s ec a s c a d e ，w h i c hi sa t t e m p t e dt oi n t e p r e tt h em e c h a n i s mo f a p o p t o s i sa n d t h ep a t h w a y so f a p o p t o t i cs i g n a l i n gt r a n s d u c t i o n m a t e r i a l sa n dm e t h o d s at o t a lo f1 6 2s e v e n - w e e k - o l dm i c e ，e a c hw e i g h t i n g3 0 士2 9 , w e r ed i v i d e d r a n d o m l yi n t ot h i n eg r o u p ，t h eq - v d o p hg r o u p ( o 8 m g k g ) a n dt h ev e h i c l eg r o u p s i n c l u d i n gd m s o ( o 8 m l k g , 5 ) a n dn a c i ( 0 9 ) g r o u p ，a n de a c hg r o u pw a sd i v i e d i n t oo h , 6 1 1 , 1 2 h l d , 3 d , 5 d , 7 d ，1 0 da n d1 4 di n t e r v a l sw i t hs i xm i c ei ne a c ht i m ep o i n t a 1 5 e r a - l o n gi n c i s i o nw 鹤m a d e 、i t hab i s t o u r yi nt h es k i nl a y e ro nt h ec e n t r a ld o r s u m u n d e rs t e r i l et e c h n i q u ea f t e rt h em o u s ew a sa n e s t h e t i z e db yi n h a l i n ga e t h e rf o l l o w e db y i n j e c t i o no fq - v d o p ho rv e h i c l ei n t r a p e d t o n e a l l y3 0 m i n i t u e sl a t e r t h e ne a c hm o u s e w a sf e dw i t hs t e r i l i z e df o o da n dd i s t i l l e dw a t e ri ni n d i v i d u a lc a g et op r e v e n ti n f e c t i o n 。 d i f f e r e n td o s ew a s 一a d m i n i s t r a t e di n t r a p e f i t o n e a u ye v e r y2 4 h t h e1 5 e m x l 0 e r a s p e c i m e n sw e r et a k e nf r o mt h ew o u n d e ds i t e sa f t e rt h em i c ew e r ee x e c u t e db yc e r v i c a l d i s l o c a t i o na to h , 6 h ，1 2 h ，l d ，3 d ，5 d ，7 d ，1 0 da n d1 4 d p o s t w o u n d i n gt op r e p a r ef o r t h es u b s e q u e n t p r o c e d u r e s i n c l u d i n gh es t a i n i i l g i m m u n o h i s t i c h e m i c a ls t a i n i n g ， c o l o r i m e t r i cm e a s u r e m e n to fp r o t e o l y t i ca c t i v i t y , w e s t e r nb l o t t i n ga n de x p r e s s i o no f c a s p a s e sm r n ab yr t - p c r , a n dt h er e s u l tw a sc a l c u l a t e df o rr a t i oo fp o s i t i v ec e l l ， c a s p a s ea c t i v i t yf o l di n c r e a s e ，c o m p a r a t i v eg r e yi n t e n s i t ys e p e r a t i v e l yb ys o f t w a r eo f f l u o c h e mv e r s i o n2 0a n da n a l y z e db ys p s s11 0f o rw i n d o w s r e s u l t s p a r tit h ep a t h o l o g i c a l m o r p h o l o g i c a lc h a n g e sa f f e c t e db y c a s p a s eb r o a ds p e c t r u mi n h i b i t o rq - v d o p hd u r i n gi n c i s e ds k i n w o u n d h e a l i n g t h e r ew a sn od i f f e r e n c eb e t w e e nd m s og r o u pa n dn a c lg r o u pi ng r o s s a p p e r a n c e w h i l ei nq - v d - o p hg r o u p ，t h eh e a l i n gp r o g r e s si sf a s t e rt h a nt h ev e h i c l e c o n t r o lg r o u p t h ei n f i l t r a t e dp m n sd u r i n ge a r l ya c u t ee x u d a t i v ep h a s ef r o m6 ht ol d , a n dd e c r e a s e di nn u m b e r , i n3 dp o s t - w o u n d i n g , t h ea c c u m u l a t i o no fm o n o c y t ea n dt h e p r o l i f e r a t i o no ff i b r o b l a s t sw e r ed e t e c t e d , a n dg r a n u l a rt i s s u ew a sf o r m e da t5 dt o7 d p o s t - 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p o s i t i v ec e l l sa c h i e v e dt h ep e a l 【，o nt h ec o n t r a r y , t h ee x p r e s s i o n s o fc 鹤p a s c 6a n d 一7w e r es e l d o md e t e c t e di nt h o s ef i b r o b l a s t s t h e r ew e r es i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e si nt h er a t i o so fc a s p a s e 3 - p o s i t i v ec e l l s b e t w c e r lt h ee x p e r i m e n t a l g r o u p ( q v d o p hg r o u p ) a n d t h ec o n t r o lg r o u p s ( p 0 0 1 ) - p a r t t h ee x p r e s s i o n sa n dc l e a v a g e so fc a s p a s e 一3 ，一6a n d 一7 a f t e ri nv i v od e l i v e r yo fc a s p a s ei n h i b i t o rq - v d o p hd u r i n g i n c i s e ds k i nw o u n dh e a t i n gb yw e s t e r nb l o t t i n g t h ee x p r e s s i o n so fc a s p a s e 一3 6a n d 7i nc o n t r o lg r o u p sw e r et i m e d e p e n d e n t t h r o u g ht h es t a t i s t i c a la n a l y s i so nt h ec o m p a r a t i v eg r e yi n t e n s i t y i nq - v d - o p hg r o u p s ， t h ee x p r e s s i o no fp r o c a s p a s e 一3w a su n - 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