（植物学专业论文）重组植物表达质粒pbith和pbigfp的构建及vcath基因的克隆与表达.pdf

摘要 一、重组植物表达质粒p b i - t h 、p b i - g f p 的构建 本文利用定向克隆、单酶插入等分子生物学技术，分别将绿 色荧光蛋白基因( g f p ) ，及植物甜蛋白( ( t h a u m a t i n ) 基因克隆 至植物表达载体p b i l 2 1 中，成功的构建了重组植物表达质粒 p b i t h 和p b l g p p 。 二、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的组织蛋白酶基因( v c a t h ) 的克隆及原核表达： v c a t h 基因是一种病毒的组织蛋白酶基因，其编码蛋白具有 水解肌动蛋白的蛋白酶活性，可能参与病毒感染后期宿主的组织 液化，本文通过p c r 扩增，从a c m n p v 的基因组中获得v c a t h 基 因，将其克隆至原核表达载体p r s e tb 中，成功的构建了重组原 核表达质粒p r s e t v c a t h 。并在大肠杆菌中进行诱导表达。利用 s d s p a g e 确定了表达产物的分子量并初步研究了表达量与诱导时 间之间的关系。 关键词：绿色荧光蛋白基因甜蛋白基因v - c a t h 基因克隆载 体基因表达报道基因 a b s tr a c t i c o n s t r u c t i o no fr e c o m b i n a n t p l a s m i d sp b l t ha n d p b l g f p b ym o l e c u l a rb i o l o g i c a lm e t h o d s ，t h a u m a t i ng e n ea n dg f p g e n e w e r ec l o n e d i n t o p l a n te x p r e s s i o nv e c t o r p b i 121 r e c o m b i n a f l t p l a s m i d sp b l t ha n dp b i g f pw h i c hc a nb ee x p r e s s e di np l a n tw e r e c o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y 2 c l o n i n g a n d e x p r e s s i o n o fv e a t h g e n e f r o m a u t o g r a p h a e a l i f o r n i c am u i t i c a p s i d n u c l e a r p o l y h e d r o s i sv i r u s t h et t e i n 。o d e d b y 诎啊锄啪g e n ec 锄坶出) i y s 器枷n ，a n d m a yi n v o l v e di nt h el i q u e f a c t i o no fh o s td u r i n gl a t e ri n f e c t i o n t h ev c a t hg e n ew a s a m p l i f i e db yp c rf r o ma c m n p v g e n o m ea n dc l o n e d i n t o e x p r e s s i o n v e c t o r p r s e t - b t h e nt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d p r s e t v c a t bw a sc o n s t r u c t e da n de x p r e s s e di ne c o l i t h em o l e c u l a r w e i g h t o f e x p r e s s e dp r o t e i n w a sd e f i n e d b ys d s p a g e t h e o o l a t i o n s h i p b e t w e e n e x p r e s s e d a m o u n ta n d i n d u c i n g t i m ew a s d i s c u s s e d k e y w o r d s ：g f p g e n e t h a u m a t i n g e n e v c a t hg e n e c l o n ev e c t o r g e n ee x p r e s s i o n r e p o r tg e n e 本文缩略语 b p ：碱基对 e d t a ：乙二胺四乙酸二钠 k b ：千碱基对 s d s ：十二烷基磺酸钠 t r is ：三羟甲基氨基甲烷 a p ：氨苄青霉素 k m ： 硫酸卡那霉素 x g al ：5 - 溴一4 一氯一3 一t 引哚一b d 一半 乳糖苷 i p t g ：异丙基硫代一b d 一半乳糖苷 p r s e t ：质粒p r s e tb p b l u c ：质粒p b t u e s c r i p ts k ( 一) p g e m ：质粒p g e m t z f ( + ) t h ：甜蛋白基因t h a u m a t i n g f p ： 绿色荧光蛋白基因( g r e e n f l u o r e s c e n tp r o t c i n ) v - c a t h ：病毒组织蛋白酶基因 ( y ir o c a t h e p s i n ) a c m n p v ：苗蓿银纹夜蛾核型多角体 病毒( a u t o g r a p h a c a li f o m i c al l l u l t i c a p s i d n u c l e a rp 0 1 y h e d r o si s v i r u s ) p b i ：植物表达载体p b l l 2 1 ， 前言 一、转基因植物研究现状： 进入8 0 年代以来，生物技术发展越来越快，随着p c r 技术， i ) n a 重组技术的成熟，分子生物学已经渗透到动物、植物、微生 物等各个领域。植物组织培养、目的基因的分离，及载体的构建 和基因转导技术的发展及完善，使将有用的目的基因转入到植物 细胞中，并再生出转基因植株已变成现实。转基因植物在提高作 物产量，增强抗性等各方面的应用已初见成效，有些领域已取得 突破性进展。这些成就大致可分属下述两个方面： ( 1 ) 改艮作物品质： 粮食的营养价值在很大程度上取决于其贮藏蛋白的氨基酸成 份，而这些蛋白质都是由特定的种子蛋白基因编码的。因此许多 研究者对一些氨基酸含量较高的种子蛋白基因进行克隆并将其转 入一些禾谷类作物中以获得营养价值更高的新物种，或者是将已 有的基因经过碱基突变改造后导入植物指导合成极限氨基酸含量 高的蛋白质，以提高转基因植物种子贮藏蛋白的营养价值【l 。5 】。目 前，部分豆科植物和谷类作物的贮藏蛋白如：麦醇溶蛋白基因、 玉米醇溶蛋白基因和伴大豆球蛋白基因等已被克隆，有关表达调 控的研究也在不断深入【6 】。另外，运用转基因的方法在延长果实 的贮存期，提高农作物的光合效率和固氮效率，以及增强植物抗 虫、抗除草剂及抗逆境的品质等各个方面都取得了显著的成就【7 14 1 。到目前为止，已有番茄、水稻、棉花等十多种转基因植物已 经或将要进入市场。 ( 2 ) 利用转基因植物生产药用蛋白： 传统的药用蛋白的提取方法大多采用从动物的特定器官和组 织中提取。由于这些活性物质在动物细胞中含量甚微，所以提取 过程复杂，产量低，价格昂贵，而且远远满足不了社会的需要。 随着基因工程技术的发展，人们开始采用微生物发酵的方法表达 一些药用蛋白。然而这种方法也仍然存有许多不足之处：首先微 生物多为原核生物，无法完成蛋白质的后期加工；其次利用微生 物生产药物可能会带来有害副产品；再者利用微生物发酵需要大 规模的发酵设备和较高的生产技术。而植物为真核生物，并且植 物的栽培已有数百年的经验，可大面积广泛种植，因此若能利用 植物生产药用蛋白则可从根本上克服上述弊端。随着植物基因i f - 程技术的发展，人们开始把药用蛋白的生产从微生物转向植物， 利用转基因植物生产药用蛋白并已取得初步成效。目前有些国家 已经利用转基因烟草成功的表达了神经肽、二氢吡啶羧酸合酶、 血清白蛋白、白细胞介素等数种药用蛋白咐日。随着植物表达载体 的逐步完善，药用蛋白纯化方法的逐步成熟，及使表达产物达到 医用纯度和卫生标准等方面问题的解决，利用转基因植物定量、 定位的表达药用蛋白将不再遥远【1 ”。 二、植物甜蛋白基因( t h a u m a ti n ) ： 自从七十年代以来，人们在多种植物中发现并分离了多种甜 蛋白如：从西非一种灌木( t h a u m a t o c o c c u sd a n i e l l i i ) 果实的 胶质假种皮中分离出的甜蛋白( t h a u m a t i n ) ；从中药马槟榔 ( c a p p a r i s m a m a i k i l e v l ) 成熟种子中分离的马槟榔甜蛋白 ( m a b i l i n ) 【1 踟；从p e n t a d i p l a n d r ab r a z z e a n a 中分离的一种被 称作b r a z z e i n 的热稳定甜蛋白【1 引，及另外一种从c u r c u li g o l a t i f o l i a 的果实中提取出来的具有味调节功能的仙茅甜蛋白 ( c 1 1 f c h l i n ) i 1 引。对于这些高甜度且不含糖的新型甜味剂的研究 正不断发展，其中对t h a u m a t i n 的研究最为广泛和深入。早在八 十年代就已经有了商品化的天然纯化的t h a u m a t i n ，其商品名为 t a l i n 。t h a u m a t i n 做为一种甜物质、软饮料的增味剂及动物的饲 料添加剂在欧洲和日本占有一定的市场。事实上在目前所发现的 甜蛋白中仅有t h a u m a t i n 已做为一种低热量的甜物质和增味剂进 入市场“9 】。开拓t h a u m a t i n 商品市场的同时，人们对t h a u m a t i n 的结构等其它生物学性质也有了相当广泛的研究 2 0 1 。并且许多国 家都在积极探索用基因工程方法生产t h a u m a ti n 的新途径希望能 够获得大量廉价的t h a u m a t i l 3 产品。t h a u m a t i n 先后被克隆到大 肠杆菌、酵母及植物中进行表达。而1 9 9 0 年，w n t y m 1 9 1 应用毛 根转化技术将t h a u m a t i n 在马铃薯中进行了成功的表达，表达产 物的浓度约为3 x 1 0 - s m ，并且整个马铃薯植株都是甜的，使 t h a u m a t i n 成为第一个在转基因植物中表达的甜蛋白。 t h a u m a t i n 是从西非热带雨林中一种属竹竽科灌木 ( t h a u m a t o c o c c u sd a n i e l l i i ) 果实的胶质假种皮中分离出的一 种甜蛋白f 2 。该蛋白被认为是世界上已知的最甜的物质，浓度达 2 x 1 0 。8m 即可感受其甜味，比同一摩尔单位的蔗糖甜10 万倍，比 同一重量单位的蔗糖甜数千倍。t h a u r e a t i n 由一基因家族编码， 已知最少存在5 种( 或6 种) 关系相近的蛋白产物：t h a u m a t i n i 、 i i 、i i i 、b 、c 、a 。其中t h a u m a t i n i 及i i 是含量最多的主要两 种，各占假种皮干重的2 0 以上。它们的分子量均为2 2 k d a ，都由 一条2 0 7 个氨基酸的多肽链组成。该蛋白是等电点为1 2 左右的碱 性蛋白，且其等电点及甜味活性按着c 、b 、a 、i 、i i 、i i i 的顺 序依次增加 2 0 j 。多肽链中有15 个二肽及二个三肽含有相同的残 基。含8 个二硫键。对t h a u m a t i nt 晶体结构分析表明，t h a u m a t i n i 蛋白晶体分子包含三个结构域。其核心结构域是一个平滑的b 一折 叠桶，含有1 1 个b 一折叠片层。除n 端片层和c 端片层相互平行外， 其它片层皆为反向平行。与其相连的是两个富含二硫键的结构域 当其二硫键部分还原后，t h a u f l l a t i i l 会有一种快速的自我消化 作用，在合适的底物存在的情况下，还原的t h a u m a t i n 显示出蛋 白酶、酰胺酶及酯酶活性。t h a u m a t i n 中赖氨酸残基的一氨基的 乙酰化会导致其酶活性的增加。由于t h a u m a t i n 可被还原剂激活， 因此可将其归于半胱氨酸蛋白酶类，但t h a u m a t i n 缺少存在于半 胱氨酸蛋白酶活性位点的组氨酸，且t h a u m a t i n i 与植物组织内的 半胱氨酸蛋白酶类如木瓜蛋白酶的氨基酸顺序无任何相似性。亦 有研究者认为t h a u m a ti n 的自消化活性可能是与其一起纯化的半 胱氨酸蛋白酶的作用而非t h a u m a t i n 的作用1 2 3 。t h a u m a t i n 具有 一独特的序列为r - l c u g l u - l c u g l u - a s p - g i u - - c o o l l 的羧基肽，该 羧基肽的酸性残基可能会在碱性的t h a u m a t i n 前体分子的成熟过 程中产生一些重要影响，切除羧基肽密码子会导致t h a u m a t i n 的 合成从每个细胞2 0 0 0 0 个分子减少至不足10 个分子。在 t d a n i e l l i i 内，t h a u m a t i n 前体蛋白除去一段2 2 个氨基酸的信 号肽即成为成熟的t h a u m a t i n ，该信号肽的切割住点位于2 2 2 3 位的a 1 a - a l a 之间。t h a u m a ti n 的甜味是由该蛋白质高级结构中 的特定基团与舌上的甜味受体结合而产生的味觉效应。所以，当 温度、p h 等因素破坏了它的二硫键，影响其高级构象时会对该蛋 白的甜味活性产生明显影响旧。对其分子的化学修饰表明赖氨酸 残基及10 1 位的天冬氨酸残基对t h a u m a t i n 的甜味活性有重要影 响，赖氨酸残基可能参于t h a u m a t i n 分子与甜味受体的结合。 人们对嗅觉的作用机理已有相当深入的了解 2 4 - 2 5 1 ，然而对产 生甜味的感觉机制却还知之甚少。由于t h a u m a t i n 与味觉受体有 极强的亲合性，极低浓度的( 1o - * m ) t h a u m a t i n 即可产生甜味， 所以检测味觉受体的研究中t h a u m a t i n 可以用做探针拉。有趣的 是：许多植物诸如樱桃2 引、烟草、蕃茄j 、马铃薯勰】、大麦2 引、 小麦 3 0 1 在压力的诱导下会产生一些与t h a u m a ti n 有很高的同源性 却无甜味的t h a u m a t i n l i k e 蛋白。这些蛋白多是一些与发病机理 有关的蛋白。且w e s t e r n 分析表明成熟妁果实中存有t h a u m a t i n li k e 蛋白可能是一种普遍的现象【3 “。 t h a u m a t i l l 作为一种高甜度低热量叉不易被细菌所利用的甜 蛋白，所制成的食品适合于糖尿病患者，心血管病患者食用，并 能预防龋齿n 8 l 。由于低于味觉闽值的t h a u m a t i n 能选择性的增加 其它物质的味觉强度，因此t h a l 1 l l l a t i n 作为一种食品添加剂用以 改善糖果、香烟及干海产品的味道以及作为饲料添加荆促进增重 也有一定的应用【3 2 1 。t h a u m a t i n 在微生物中的表达研究以及其在 马铃薯中的成功表达都说明t h a u l n a t i n 在作为食品添加剞以及用 以改良蔬菜及水果的营养品质和风味等方面都有着广阔的发展前 景 2 1 1 。 三、绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 基因及 在植物研究中的应用： 生物发光是一种古老而又普遍的生物学现象，据统计，在动 物界的2 5 个门中，有13 个门2 8 个纲有发光动物，如鞭毛虫、水 母、鱼等n 引。六十年代初期s h i m o m u r a 等首先从多管水母属 ( a e q u o l i av i c t o r i a ) 中分离出管蛋白( a e q u o r i n ) 3 4 1 。该蛋白 与c a 2 + 结合后可发蓝光。尽管管蛋白体系本身发蓝光，但水母的 整体发光及其颗粒提取物均为绿色，因此推测其提取液中还有一 种蛋白，即绿色荧光蛋白( g r e e nf 1 u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 口钔。 m o r is e 等 3 4 1 对其进行了分离和纯化，研究结果表明g f p 的荧光发 射峰在5 0 9 n m ，最大激发波长为3 95 n n l ，并在4 7 5 n m 处有一肩峰。 九十年代以来，随着分子生物学技术的发展，对g f p 的研究 也取得了突破性的进展。1 9 9 2 年p r a s h e r 等5 1 根据g f p 的氨基酸 序列合成一寡核苷酸探针从a e q u o r e av i c t o r i ac d n a 文库中筛选 出a v i c t o r i ag f p 基因并测出其全序列。g f p 基因编码23 8 个 氨基酸，分子量约为2 7 k d 。研究表明g f p 是由两个相当规则的1 3 一 桶状结构组成的二聚体。b 一桶状结构直径约为3 n m ，高约4 n m ，由 1 1 个b 一折叠链包围一个一螺旋组成。该桶状结构结构致密，外围 的b 一折叠链彼此紧密结合，保护着位于其内的仪一螺旋( 生色基因 即位于此螺旋) 。这种结构决定了g f p 具有稳定、抗热和抗变性剂 的性质好3 。 最初由s h i m o m u r a 所提出的g f p 的生色基圃的化学结构现亦 已公认( 图1 ) ”引。 图1 ：绿色荧光蛋白的生色基团的化学结构 构成生色基团的2 个氨基酸位于第6 5 - 6 7 位。生色基团的形成过 程如下：翻译后，前体g f p 在有0 ：的条件下，g l y 6 7 与s e r 6 5 羧 基环化形成c 5 位碳原子上的咪唑基，新的n = c 双键促其脱氢连接 生成生色基团，c 5 上的咪唑基再自身氧化与c 4 形成c = c 双键构成 完整的生色基团。生色基团在各种苛性条件下都很稳定，月酸、 碱或是用盐酸胍处理后，一旦恢复中性p h 环境，或除去变性剂则 荧光可以恢复，并有和原来一致的发光光谱f 3 9 】。基于g f p 的晶体 学证据和g f p 生色基团结构等研究成果，y o u v a n 等“提出了g f p 荧光发生机制的简单模型( 图2 ) 。 h o o h h + ；= 曼 h + 图2 ：绿色荧光蛋白荧光发生机制 o 0 h 该模型认为在高p h 或在生色基团刚近引入突变时，t y r 6 6 处于酚 盐形式；在低p h 下贝4 处于酚羟基形式。生色基躅通过t y r 6 6 的脱 质子状态( 酚盐) 和质子化状态( 酚羟基) 的转换决定荧光发射。 由于酚的激发态酸性远大于其基态，故仅脱质子态的类型发射荧 光。 1 9 9 4 年c h a l f i e 等n 鲫在大肠杆菌和线虫体内表达了g f p ，表 达产物保持了天然g f p 的光谱特性，且发光不需特殊的辅助因予。 随后g f p 基因分别在酵母、果蝇、昆虫细胞和c o s 细胞内表达成 功。这说明g f p 的生色基圉可在异源细胞式自发形成是一个普遍 现象。它标志着g f p 做为一种全新的标记物将有着广泛的应用。g f p 做为一种新型的生物标记物有着许多优越性：( 1 ) 分子量小，只 编码2 3 8 个氨基酸：( 2 ) 对细胞无毒害，不干扰标记蛋白的功能 和定位；( 3 ) 在异源细胞中表达后自发产生荧光，不需任何辅助 因子；( 4 ) 检测手段方便；( 5 ) 甲醛试剂固定后活性不丧失，可 用于切片显微镜观察。因此目前g f p 已广泛应用于病毒学、微生 物学争昆虫学等生物学领域。为使g f p 应用于植物学领域人们对 来自水母的g f p 进行了一些改造：( 1 ) 更换g f p 生色基团氨基酸， 将6 5 位的s e r 突变为t h e ；( 2 ) 添加植物内含子；( 3 ) 换用强的 花椰菜花叶病毒的3 5 s 启动子；( 4 ) 调整密码子；( 5 ) 剪除隐蔽 型内含子t 4 1 - 43 。改造后的g f p 在植物学领域中的应用得到了迅 速发展，主要有下述几个方面：( 1 ) 用作报道基因：g f p 不需任 何辅助因子，可自发产生荧光，用其作报道基因可以克服目前常 用的报道基因所带来的弊病。 ( 2 ) 用于研究基因表达和蛋白质定位：g f p 与一种新的双香 叶基焦磷酸合酶基因在烟草b y z 细胞系中成功的融合表达为g f p 在这方面的应用提供了模型【4 圳。 ( 3 ) 研究植物与微生物的关系：利用g f p 可直观、简便的实 现对病原等微生物侵入活细胞的实时实态观察。利用g f p 融合标 记研究了多种致病微生物蛋白在植物体内的分布和运动h 5 1 。 ( 4 ) 研究植物细胞器的相互作用：通过将g f p 导入细胞器，借 助g f p 的绿色荧光可以用来研究细胞器之间的物质和信，g - 交换 4 8 】 ( 5 ) 转基因植物的生态监测：运用g f p 的标记作用可以检 测转基因植物是否稳定遗传，是否由于传粉等因素而造成基因漂 夥。 四、杆状病毒生物学： 世界上昆虫种类多达一百万多种，可以感染昆虫的病毒大约 有1 2 0 0 种。这些病毒主要分属四个科：杆状病毒科 ( b a c u l o v i r i d a e ) ；呼肠孤病毒科( r e o v ir i d a e ) ；虹彩病毒科 ( ir i d o v ir i d a e ) ；和痘病毒科( p o x v i r i d a e ) 。其中杆状病毒科 为数最多，目前所发现的杆状病毒已超过6 0 0 种。主要感染鳞翅 目、双翅目、膜翅目和鞘翅目昆虫。杆状病毒的基本毒粒呈杆状， 病毒粒子由包埋在单一囊膜内的一个或多个杆状核衣壳组成。核 衣壳含有病毒基因组，基固组为共价闭合环状双链超螺旋d l q h ， 大小在8 8 - 2 0 0 k b 之间 3 9 1 。杆状病毒有高度的宿主特异性，某些 杆状病毒对昆虫有显著的杀灭效果，对人畜和其它植物无害，因 而可以作为生物杀虫剂在农业上用于生物防治。随着基因工程技 术的迅猛发展，杆状病毒的分子生物学得到了深入和广泛的研究， 在此基础上发展了独特而优越的杆状病毒高效表达载体系统。并 形成了相对独立的杆状病毒分子生物学。 五、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒及其v - c a t h 基因： 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒( h u t o g r a p h ae a l i f o m i c am u l t i c a p s i d n u c l e a rp o l y h e d r o s i sv i r u s ，a o y n 叫) 属杆状病毒科( b a c u l o v i r i d a e ) 的核型多角体病毒属( n u c l e a rp l o y h e d r o s i sv i r u s ，刖) 【删。该病毒可 交错感染3 0 多种鳞翅目害虫【5 ，是杆状病毒分子生物学上研究 得最为广泛深入的一种杆状病毒。1 9 8 2 年建立了a c n p v 的物理图 谱。19 9 4 年英国牛津病毒研究所a y r e s 等首次报道了a c n p v 的全 序列，该环状双链d n a 含有13 3 8 9 4 个碱基对t 5 1 - s z l 。对其中7 2 个 基因进行了定位，其中有3 4 个基因的功能得到确定【5 3 】。在a c b l p v 基因组中g p 6 7 基因的下游7 9 8 到8 1 。l m u 之间存在一9 6 6 b p 的开 放阅读框，该阅读框所编码的一种蛋白酶与木瓜蛋白酶家族的组 织蛋白酶有显著的同源性，被称作病毒组织蛋白酶( v - o a t h ) h 引。 v - c a t h 阅读框的上游( 一2 9 至一2 5 ) 病毒的晚期启动子区域有一 “t a a g ”框，该框可能是v c a t h 基因表迭的起始位点。v - c a t h 基因为晚期基因，该酶的表达要到病毒感染的后期才能检查到。 v - c a t h 蛋白酶主要发现于含有核酸、线粒体、及溶酶体的细胞部 分” 。a c n p v 感染的细胞内检测存有3 2 k d a 及3 5 5 k d a 及2 7 k d a 的v - c a t h 多肽，且当v - - c a t h 过量表达时，2 7 k d a 肽的积累的增加 会导致3 2 k d a 及3 5 5 k d a 肽的显著增加。初步认为3 2 k d a 及3 5 5 k d a 是v - c a t h 蛋白的前体形式，经过在p r 0 1 l3 位点翻译后切割形成 成熟的2 7 5 k d a 的v c a t h 蛋白，该蛋白的p i 值为5 o 。与之相 类似的是：当用杆状病毒载体系统表达2 4 5 k d a 的木瓜蛋白酶时 也发现有4 1 k d a 及3 6 k d a 的前体形式【5 卜5 ”。运用n 端糖基化抑制 剂证实了3 2 k d a 的v - c a t h 蛋白在a s h l5 8 位处发生n 一糖基化形成 3 5 5 k d 的形式1 5 扪。c y s l 3 6 及h is 2 6 9 被认为是v - c a t h 蛋白酶的催 化位点残基。通过对底物特异性、反应条件、对蛋白酶抑制剂和 激活剂的敏感性及氨基酸序列同源性的研究认为：v c a t h 蛋白酶 是一种类似于半胱氨酸蛋白酶的组织蛋白酶b ”。实验表明虽然组 织蛋白酶的最适蛋白质水解活性要求酸性p h ，但亦可在中性p h 附近降解细胞骨架蛋白，说明v - c a t h 既可在中性p h 附近作用于 细胞内蛋白，也可在酸性环境下作用于细胞外蛋白”引。病毒感染 后期v - c a t h 的表达有助于宿主的组织液化。v - c a t h 具有水解肌 动蛋白的蛋白酶活性，并可能参与诱导细胞内肌动蛋白细胞骨架 的重排及崩解】。v - c a t h 能够优先结合于丝状肌动蛋白亲合柱， 但对于该蛋白与肌动蛋白的相互作用是直接的还是通过其它未知 的肌动蛋白结合蛋白进行的尚不清楚。丝状肌动蛋白是昆虫组织 细胞内连接的重要组成部分，v - c a t h 对这些连接的降解会导致宿 主昆虫的液化。 实验材料和方法 实验材料 1 、菌株- 大肠杆菌t g l ，b l 2 1 均来自武汉大学分子病毒实验室。 2 、质粒：p g e m 7 z f ( + ) ；p b l u e ；p u c 一1 9 ；p r s e tb ；来自武汉 大学分子病毒实验室；p b l l 2 1 由马小军教授惠赠。 3 、化学试剂：所用的化学试剂均为分析纯。 4 、常用贮存液： 5 t o o l ln a c l ：l m 0 1 lt r is c l ( p h 8 o ) ： 0 5 m o l le d t a n a 2 ； 1 0 m o l l n h 4 a c ； 5 m o l lh c l ：1 0 m o l l n a o h ； 1o m g m l 溴化乙锭；8 m g m l i p t g ； 2 0 m g m lx - g a l ( 溶于二甲基甲酰胺) 5 、限制性内切酶及其它工具酶： ( 1 ) d n a 限制性内切酶及反应缓冲液为华关生物工程公司、 p r o m e g a 公司、及g i b c o 公司产品。 ( 2 ) t 。d n a 连接酶为华美生物工程公司产品。 ( 3 ) 溶菌酶为华美生物工程公司产品。临用前用1 0 n m l o l l t r i s c 1 ( p h 8 0 ) 配成1 0 m g m l 溶液。 ( 4 ) r n a s e a 为华美生物工程公司产品。溶于l ( h t n o l lt r i s - c l ( p 1 1 7 5 ) 1 5 l n n o l ln a c l 中，配成1 0 m g m l 浓度，于1 0 0 0 c 加 热1 5 分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于- 2 0 0 c 。 6 、培养基- ( 1 ) 细菌l b ( l u r i a - b e r t a n i ) 液体培养基 每升含：b a c t o - 胰蛋白胨】o 克； b a ct o - 酵母提取物5 克； n a c l10 克； 用5 m 0 1 ln a o h 调d i l 至7 2 ( 2 ) l b 固体培养基： 每井l b 液体培养基加l5 克琼脂，灭菌备用。 7 、常用缓冲液： ( 1 ) t e 缓冲液：1 0 m m o l lt r is - c l ( p h 8 0 ) ：l m m o l le d t a n a ， ( p h 8 0 ) ( 2 ) 电泳缓冲液t a e ( 5 0 ) 每升含：2 4 2 9y r is 碱；5 7 1 m l 冰乙酸；1 0 0 m le d t a n a ， 使用缓冲液为l xt a e ( 3 ) 凝胶加样缓冲液( 6 x ) ： 0 2 5 溴酚蓝：4 0 蔗糖水溶液 8 、碱法提取质粒所用溶液： s t e ：0 1 m 0 1 ln a c ls 0 1 i ：5 0 m m 0 1 l 葡萄糖 10 m m 0 1 lt r is c 1 ( p h 8 0 ) 2 5 m m l l t r i s - c l ( p 腿0 ) 1 m l n o l le d t a ( p h 8 0 )1 0n n d l l 团r a ( p h & o ) s 0 1 i i ：0 2 m m o l ln a o hs 0 1 i i i ：铀l l 乙酸钾6 嘶l 1 s d s冰乙酸1 1 5 m l 、加双蒸4 蛭琶林积1 0 咖 9 、d n a 片段回收洗脱液： 低盐洗脱液：5 0 m m o l lt r is - c 1 ( p h 8 。o ) ； 10m m o l le d t a ( p h 8 0 ) 高盐洗脱液：5 0m m o l lt r i s c 1 ( p h 8 0 ) ； 1 0f 1 1 1 1 l o l l e d t a ( p h 8 0 ) 0 。15 m o l ln a c l ： l m 0 1 ln a c l ： 1 0 、从核酸样品中去除蛋白使用的有机试剂 ( 1 ) 平衡酚：将市售酚重新蒸馏，加入羟基喹啉至终浓度为 0 1 ，用0 5m o l lt r is - c 1 ( p h 8 0 ) 平衡酚 至酚相p h 大于7 8 ，再用0 。1m 0 1 lt r i s c 1 ( p h 8 0 ) 平衡2 次。最后用0 1 倍体积含有0 2 6 一巯基乙醇的0 1m o l lt r is c l ( p h 8 0 ) 覆盖酚相，装棕色瓶4 0 c 保存。 ( 2 ) e k ：氯仿：异戊醇按体积比2 5 ：2 4 ：1 混合平衡酚、氯 仿和异戊醇，放于棕色瓶中，并处于1 0 0 r m o l l t r i s - c 1 ( d & o ) 缀中液覆盖之下，置4 0 c 保存。 1 1 、s d s - p a g e 电泳所用溶液： 1 0 m l1 0 分离胶：水4 0 m l 3 0 丙烯酰胺溶液3 3 n 1 1 1 5 m 0 1 lt r is ( p h 8 8 )2 5 m 1 1 0 s o s0 1 m l 1o 过硫酸铵0 1 m l t e m e do 0 0 4 m 1 5 m l5 浓缩胶：水3 4 m l 3 0 丙烯酰胺溶液0 83 m l 1 0 t o o l lt r is ( p h 6 8 ) 0 63 m 1 10 s d s0 0 5 m 1 1o 过硫酸铵0 0 5 m l t e m e d0 0 0 5 m l ( 甲叉丙烯酰胺：丙烯酰胺摩尔比为1 ：2 9 ) 2 x s d s 凝胶加样缓冲液：1 0 0m m 0 1 lt r is c 1 ( p h 6 8 ) 2 0 0m m 0 1 l 二硫苏糖醇( d t t ) 4 s d s 0 2 溴酚蓝 20 甘油 5 t ris 一甘氨酸电泳缓冲液： 9 0 0 m l 双蒸水中溶解l5 1 克t r is 碱和9 4 克甘氨酸，然后加 入50 m l1o ( w v ) 的s d s 贮存液，加双蒸水定溶至1 0 0 0 咄 染色液：在9 0 0 m l 甲醇：水( 1 ：1 ) 和10 0 m l 冰乙酸的混合液中 溶解2 5 克考马斯亮蓝，过滤以除去颗粒状物质。 脱色液：9 0 0 m l 甲醇：水( 1 ：1 ) 和1 0 0 m l 冰乙酸。 1 2 、抗菌素均为市售产品 ( 1 ) 氨苄青霉素( a p ) ：用无菌水配成2 0 m g m l 母液，一2 0 。c 保存，使用浓度5 0 9 g m l ( l b 液体培养基) 或1 0 0 g m l ( 固体培养基) ( 2 ) 硫酸卡那霉素( k m ) ：用无菌水配成1 0 m g m l 母液，一2 0 保存，使用浓度5 0 “g m l ( l b 液体培养基) 或1 0 0ug m l ( 固体培养基) 。 实验方法 l 、质粒d n a 的提取 碱解法小提质粒： ( 1 ) 用高压灭菌的芽签挑单菌落接种于加适当抗菌素的l b 液管内培养过夜，取1 5 m l 菌液于e p p e n d o r f 管内( 剩余 菌液存于4 0 c 备用) ， 12 ，0 0 0 r p m 室温离心3 0 秒，彻底除去上清。 ( 2 ) 加s t e 2 0 0v tl 洗一次，加1 0 0 “l 冰预冷的溶液i ，重 悬细菌。 ( 3 ) 加2 0 0u1 新鲜配制的溶液i i 上下颠倒5 次，冰浴5 分 钟再加15 0 l 冰预冷溶液i i i ，上下颠倒l o 秒，冰浴5 - 1 0 分钟。 ( 4 ) 1 2 ，0 0 0 r p m 室温离心1 0 嗡。钟，弃沉淀。 ( 5 ) 上清用等积体酚氯仿异戊醇抽提一次。 ( 6 ) 小心吸取上清液，加2 5 倍体积无水乙醇，- 2 0 。c 放置 2 小时以上，1 2 ，0 0 0 r p m 室温离心10 分钟沉淀d n a 。 ( 7 ) d n a 沉淀用70 乙醇洗一次、燥后溶于2 0 “1t e 备用。 质粒d n a 的大量制备： ( 1 ) 将10 0 m l 培养过液的菌液置于2 5 0 m l 离心管中，4 0 c 下 4 ，0 0 0 r p m 离心5 分钟。 ( 2 ) 沉淀用5 m l 溶液i 充分悬开，加溶菌酶至终浓度l m g m l 混匀溶解，室温作用l0 分钟。 ( 3 ) 加1 0 m l 新配的溶液i i 轻轻混匀，室温放l o 分钟至溶 1 4 液澄清。 ( 4 ) 加上7 5 m l 溶液i i i 混匀，有大量絮状沉淀产生，8 0 0 0 r p m 4 0 c 离心10 分钟。 ( 5 ) 取上清加0 6 倍体积异丙醇混匀，室温放置l5 分钟， 8 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，弃上清。 ( 6 ) 沉淀用2 m lt e 溶解，加等体积5 m o l i 五c l 混匀，室温 放1 0 分钟，1 0 ，0 0 0 r p m 室温离心1 0 分钟，取上清加等 体积异丙醇沉淀，1 2 ，0 0 0 r p m 离心15 分钟。 ( 7 ) 沉淀溶于l m lt e 中，酚氯仿异戊醇抽提一次。 ( 8 ) 取上清加0 1 倍体积3 t o o l l 乙酸钠、2 5 倍体积无水 乙醇沉淀d n a ，70 乙醇洗涤后重溶于2 0 0u1t e 中， - 2 0 0 c 保存备用。 2 、溴化乙锭荧光法测定d n a 含量： 制备1 含溴化乙锭( o 5ug m 1 ) 的琼脂糖凝胶，取2ul d n a 样品与2u1 的一系列标准d n a 溶液( 2 5 、5 、10 、2 0 “gk d n a m a k e r ) 一起进行电泳在短波长紫外光照射下，通过比较样品和d n a 标准 品的荧光强度，推算出样品中d n a 的含量。 3 、d n a 的限制性内切酶消化 ( 1 ) 单酶消化： 反应一般在2 0 “l ( 小量检测) 或50 “l ( 制备回收) 体积中 进行，加合适的1 0 倍酶切反应缓冲液，每“gd n a 用3 5 单位内 切酶进行消化，轻弹小离心管壁以混匀内容物，稍离心后置适当 的温度下适时保温。 ( 2 ) 双酶消化： 用两种限制性内切酶消化d n a 时，若两种酶能在相同的缓冲 液中反应，就可以周同上方法同时进行酶切反应。若不能在同一 缓冲液中起反应，首先用一种内切酶消化，灭活后用无水乙醇沉 淀d i q a ，将d n a 沉淀重新溶解后再用另一种限制性内切酶消化。 4 、d n a 片段的回收： ( 1 ) 用d e - 8 1 膜回收d n a 用适当浓度的普通琼脂糖凝胶电泳分离d n a 片段，在长波紫 外灯下对此目的条带进行定位，用手术刀在紧靠目的条带前沿切 一比目的条带稍宽的切口，将活化( i0 m m o l l ，p h 8 0 的e d t a 中 浸泡5 分钟，换0 5 m o l l 的g a o i l 浸5 分钟，用无菌水漂洗5 次) 后的d e 一8 1 膜插入裂缝中，继续电泳直到d n a 条带全部迁移至膜 上。取出膜，先用低盐缓冲液漂洗，然后将膜移入小离心管中， 加入高盐洗脱液4 0 0 “i ，于6 5 。c 水浴l 小时，用酚：氯仿：异 戊醇抽提洗脱液一次，将水相转入另一离心管，加0 2 倍体积 1 0 m o l l 乙酸铵和2 倍体积无水乙醇，一2 0 0 c 沉淀过夜。次日离心， 用7 0 乙醇洗涤核酸沉淀，将d n a 溶于适量灭菌双蒸水中。 ( 2 ) 低熔点琼脂糖法回收d n a 用适当浓度的普通琼脂糖凝胶电泳至d n a 片段分离，在需回 收的目的d n a 片段前切去一小块凝胶，再加入低熔点琼脂糖，电 泳至目的d n a 片段进入低融点凝胶后，在紫外灯下切取含欲回收 片段的凝胶，放入小离心管中加2 倍体积t e ，6 5 。c 水浴1o 分钟 后加等体积饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚：氯仿：异 戊醇抽提一次，收集上清加0 2 倍体积的1 0 m 0 1 l 乙酸铵和2 倍 体积无水乙醇沉淀，离心，用7 0 乙醇洗沉淀一次，风千后溶于 适量灭菌双蒸水。 5 、d n a 片段的连接： 按常规方法进行，一般在2 0 l 反应总体积中进行。对于粘 端连接载体与外源片段按1 ：3 加入，每ug 载体使用卜3 单位t 4 d n a 连接酶，平末端连接时载体与外源片段按1 ：5 加入，并加有 i3 的p e g 8 0 0 0 的连接酶缓冲液，每“g 载体使用3 - 5 单位t 4d n a 连接酶。16 0 c - i9 0 c 连接过夜。 6 、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 用加以改进的冷c a c l ，法小量制备感受态细胞。挑取在l b 培 养基上生长的大肠杆菌单菌落接种于5 n 1 1l b 中，3 7 。c 培养约2 - 4 小 时至o d o 2 - 0 4 ，取l m l 转入小离心管中，10 0 0 0 离心3 0 秒，倾 弃上清。每管加l m l 冰预冷0 1 m 0 1 l c a c l ，溶液轻悬细胞，10 0 0 r p m 离心，弃上清。每管加2 0 0 肚l 冰预冷0 1 m o l lc a c l ，溶液轻悬 细胞，冰浴3 0 分钟后即成为感受态细胞。 转化时将一定体积的连接产物或质粒d i q a 加入感受态细胞中 轻轻混匀，冰浴3 0 分钟再转入4 2 0 c 水浴9 0 秒，再冰浴2 分钟， 加8 0 0 “ll b 培养基，于3 7 0 c 摇床1 0 0 r p m 培养4 5 分钟，取1 0 0 2 0 呱l 涂布于含有相应抗菌素或有x - g a l i p t g 的l b 平板，筛选 转化子。 7 、重组质粒的筛选 ( 1 ) 显色平板 适用于l a c z 7 作筛选标记的克隆载体。在a p 平板上涂布4 魄1 x g a l ( 2 m g m l 溶于二甲基甲酰胺中) 和1 0 0 “g i p t g ( 8 m g m 1 ) ， 待平板表面液体消失后，涂布转化后的细菌悬液。3 7 。c 培养1 2 - 1 6 小时，白色菌落为阳性，蓝色菌落为阴性。 ( 2 ) 电泳法 将小量提取的待筛选质粒用1 琼脂糖凝胶进行电泳，设置小 量提取的载体d n a 作对照。经溴化乙锭染色后观察，泳动率慢，d n a 带位高于载体d n a ，可能是有外源片段插入的阳性重组质粒。带 位特别高的是双片段插入或双载体连接的重组体。 ( 3 ) 酶切鉴定 方法( 1 ) 和方法( 2 ) 筛选到的