（化学专业论文）cdk4酶抑制剂的计算机辅助分子设计研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 细胞周期蛋白依赖性激酶4 ( c y c l i n - - d e p e n d e n tk i n a s e4 ，c d k 4 ) 是一类丝氨 酸苏氨酸蛋白激酶，由催化亚基和调节亚基( 周期蛋白) 组成，在细胞循环过 程中起着重要作用。由于一些细胞周期蛋白的失控和一些与肿瘤相关联的c k i ( c d k s 抑制剂) 的缺乏有关，c d k s 抑制剂作为新的抗肿瘤药物倍受关注。 本论文主要围绕细胞周期蛋白依赖性激酶4 ( c d k 4 ) 、c d k 4 的嘧啶并毗唑类抑 制剂及其嘧啶并毗唑类抑制剂的烯醇式异构体进行了理论计算方面的研究，主 要包括同源模建、分子对接以及三维定量结构括性关系的研究。全文共分四 个部分，概述如下： 第一部分首先以细胞周期蛋白依赖性激酶2 ( c d k 2 ) 的晶体结构为模板，利 用同源模建方法构建了与其高度同源的细胞周期蛋白依赖性激酶4 ( c d k 4 ) 的三 维结构，并对模建结构的合理性进行了分析。在模建结果的基础上，选取了5 7 个嘧 啶并吡唑类抑制剂与c d k 4 酶进行分子对接计算，将对接后各个抑制剂的能量得 分与其活性数据进行相关性回归，得到了较好的结果，相关系数r = 0 5 7 1 。根据 对接的结果，比较了不同抑制剂在与c d k 4 对接时结合模式的异同，从形成氢键 能力方面对这些抑制剂活性的差异性提供了一些合理阐释。 第二部分是在分子对接得到的构象的基础上采用比较分子场分析法 ( c o m p a r a t i v em o l e c u l a rf i e l da n a l y s i s ，c o m f a ) 和比较分子相似性指数分析法 ( c o m p a r a t i v es i m i l a r i t yi n d i c e sa n a l y s i s ，c o m s i a ) ，系统研究了5 7 个c d k 4 抑制 剂的三维定量结构一活性关系。所建立c o m f a 和c o m s i a 模型的交叉验证系数 q 2 值分别为o 5 4 5 和0 4 7 8 ，非交叉验证相关系数r 2 分别为0 9 7 4 和0 9 3 4 ，都具 有较好的预测能力。c o m f a 和c o m s i a 模型的三维等值图能够很好地解释实 验结果，指导新的抑制剂的设计，为进一步研究提供重要依据。 从c d k 4 的嘧啶并吡唑类抑制剂( 酮式) 结构上可知，在酮式与烯醇式的互 变反应中，烯醇式结构也占有一定的比例，在药物分子设计中也应该考虑其烯 醇式异构体的影响，因此又进一步考察烯醇式结构的嘧啶并毗唑类抑制剂与 c d k 4 的相互作用情况。嘧啶并吡唑类抑制剂的抑制活性是酮式和烯醇式结构 i i i 浙江大学硕士学位论文 共同作用的结果，因此很有必要对烯醇式结构的嘧啶并吡唑类抑制剂进行三维 定量结构一活性研究。 第三部分选取了5 7 个嘧啶并吡唑类抑制剂的烯醇式互变异构体与c d k 4 酶进行分子对接计算，将对接后各个抑制剂的能量得分与其活性数据进行相关 性回归，得到了较好的结果，相关系数r = 0 6 0 1 。根据对接的结果，比较了不 同抑制剂在与c d k 4 对接时结合模式的异同，从形成氢键能力方面对这些抑制 剂活性的差异性提供了一些合理阐释。 第四部分是在分子对接得到的构象的基础上采用比较分子场分析法 ( c o m p a r a t i v em o l e c u l a rf i e l da n a l y s i s ，c o m f a ) 和比较分子相似性指数分析法 ( c o m p a r a t i v es i m i l a r i t yi n d i c e sa n a l y s i s ，c o m s i a ) ，系统研究了5 7 个c d k 4 抑制 剂烯醇式互变异构体的三维定量结构一活性关系。所建立c o m f a 和c o m s i a 模 型的交叉验证系数q 2 值分别为0 4 9 2 和0 6 2 6 ，非交叉验证相关系数1 2 分别为 o 8 8 7 和o 9 7 8 ，都具有一定的预测能力。c o m f a 和c o m s i a 模型的三维等值 图能够很好地解释实验结果，指导新的抑制剂的设计，为进一步研究提供重要 依据。 关键词i 细胞周期蛋白依赖性激酶4 ( c d k 4 ) ，细胞周期蛋自依赖性激酶2 ( c d k 2 ) ，同 源模建，分子对接，嘧啶并吡唑类抑制剂，烯醇式互变异构体，三维定量构效关系，比较分 子场分析法。 比较分子相似性指数分析法 i v 浙江大学硬士学位论文 a b s t r a c t c y c l i n - d e p e n d e n t - k i n a s e s4 ( c d k 4 ) i sas e x t h rp r o t e i nk i n a s e ，p l a y i n ga l l i m p o r t a n tr o l e i n c e l lc y c l i n t h ec d k 4c o n s i s t so f r e g l l l a t o r ya n dc a t a l y t i c s u b u n i t s l o s i n go o n t r o lo fc y e l i ni sr e l e v a n tt ol a c ko fc k lw h i c hi sr e l a t e dt o c a n c 盯a s t h e d r u g o f a n t i - c a n c e r , c k i s a t t r a c tm o r ea n dm o r e p e o p l e s a t t e n t i o n t h et h e s i si sa b o u tc y c l i n d e p e n d e n t - k i n a s e s4 ( c d k 4 ) , i n h i b i t o r so f p y r i m i d i n e - p 烨o l y la n a l o g u e sa n dt h ee n o l i ct a u t o m e r h o m o l o g ym o d e l i n g m e t h o d 、m o l e c u l a rd o c k i n ga n dt h r e ed i m e n s i o n a ls t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p ( 3 d q s a r ) h a db e e na p p l i e d t h e r ea l ef o u rm a i np a r t s ，a sf o l l o w s ： i nt h ef i r s tp a r t , u s i n gc y c l i n - d e p e n d e m - k i n a s e s2 ( c d k 2 ) a sas t r u c t u r a l t e m p l a t e t h e3 ds t r u c t u r eo fc d k 4w a sb u i l tw j t hh o m o l o g ym o d e l i n gm e t h o d r a t i o n a la n a l y s i so ft h em o d e l e ds t n 】c ：t i 】舱w a sp e r f o r m e d s u b s e q u e n t l y f i f t y - s e v e n k n o w ni n h i b i t o r so f p y r i m i d i n e - p y r a z o l y la n a l o g u e sw e r es e l e c t e df o rd o c k i n gs t u d y t h er e s u l ts h o w st h a tt h e r ee x i s t sag o o dc o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ec a l c u l a t e db i n d i n g e n e r g ya n dt h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yw i t ht h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t 艰) b e i n go 5 7 1 w h i l e , d i f f e r e n td o c k i n gp a t t e r n sh a db e e nr e s e a r c h e d , s o m er a t i o n a le x p l a n a t i o n s w g r ep r o v i d e df o rt h ed i f f e r e n ta c t i v i t i e so f t h e s ei n h i b i t o r s i nt h es e c o n dp a r t ，u s m gc o m p a r a t i v em o l e c u l a rf i e l da n a l y s i k c o m f a ) a n d c o m p a r a t i v es i m i l a r i t yi n d i c e sa n a l y s i s ( c o m s i a ) ，t h r e ed i m e n s i o n a ls t r u c t u r e - a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p ( 3 d q s a g ) h a v eb e e ns t u d i e do ni n h i b i t o r so fc d k 4 ，b a s e do nt h e s t r u c t u r e sg e t t i n gf r o md o c k i n g t h er e s u l t i n gc o m f aa n dc o m s i am o d e l sh a v e c r o s s v a l i d a t e dc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tq 2o f0 5 4 5a n d0 4 7 8 ，a n dn o n - c r o s s v a l i d a t e d c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t，o fo 9 7 4a n d0 9 3 4r e s p e c t i v e l y , w h i c hs h o wg r e a t p r e d i c t i v ea b i l i t yo i lb o t ht c s ts e ta n dt r a i n i n gs e t ，t h e3 d q s a rc o n t o u rm a p so f c o m f aa n dc o m s i ap r o v i d es m o o t ha n di n t e r p r e t a b l e e x p l a n a t i o no ft h e v 浙江大学硕士学位论文 s l r u e t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i pf o rt h ec o m p o u n d s ，w h i c hw i l lg u i d et h ef b r t h e l r e s e a r c h f r o mt h es t r u c t u r e so fp y r i m i d i n e - p y r a z o l y la n a l o g u e s ( k a o ) ，e n o l i ct a u t o m e r s h a v es o m e p r o p o r t i o ni nt h ee n a n t i o t r o p i er e a c t i o no fk e t o - e n o h c w es h o u l d c o n s i d e rt h ei n f l u e n c eo ft h ee n o l i et a u t o m e r si nt h ed r u gd e s i g n s of o rt h ef u r t h e r s t u d i e s , w es a wa b o u tt h ei n t e r a c t i o no f c d k 4a n de n o f i et a u t o m e r i n h i b i t o r ya c t i v i t y o f t h ei n h i b i t o r so f p y r i m i d i n e p y r a z o l y la n a l o g u e si sd e t e r m i n e db yk e t oa n de n o l i e t a u t o m e r s ot h r e ed i m e n s i o n a ls t r u c t u r e - a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p ( 3 d q s a r ) s h o u l db e s t u d i e do ni n h i b i t o r so f e n o l i ct a u t o m e r i nt h et h i r dp a r t , f m y 一v e nk n o w ni n h i b i t o r s e n o l i et a u t o m e rw e r es e l e c t e df o r d o c k i n gs t u d y t h er e s u l ts h o w st h a tt h e r ee x i s t sag o o dc o r r e l a t i o nb e t w e e nt h e c a l c u l a t e db i n d i n ge n e r g ya n dt h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yw i t ht h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t b e i n g0 6 0 1 w h i l e ，d i f f e r e n td o c k i n gp a t t e r n sh a db e e nr e s e a r c h e d s o m er a t i o n a l e x p l a n a t i o n sw e r ep r o v i d e df o rt h ed i f f e r e n ta c t i v i t i e so f t h e s ei n h i b i t o r s i nt h el a s t p a r t , u s i n gc o m p a r a t i v em o l e c u l a rf i e l da n a l y s i s ( c o m f a ) a n d c o m p a r a t i v es i m i l a r i t yi n d i c e sa n a l y s i s ( c o m s i a ) ，t h r e ed i m e n s i o n a ls t r u c t u r e - a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p ( 3 d - q s a r ) h a v eb e e ns t u d i e do ni n h i b i t o r so fe n o l i et a u t o m e r , b a s o do n t h es t t u c t t t r c sg e t t i n gf r o md o c k i n g t h er e s u l t i n gc o m f aa n dc o m s i am o d e l sh a v e c r o s s - v a l i d a t e dc o r r e h t i o nc o e f f i c i e n tq 2o fo 4 9 2a n do 6 2 6 a n dn o n e r o s s v a l i d a t e d c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t，o fo 8 8 7a n d0 9 7 8 r e s p e c t i v e l y , w h i c hs h o wg r e a t p r e d i c t i v ea b i l i t yo nb o t ht e s ts e ta n dt r a i n i n gs e t t h e3 d q s a rc o n t o u rm a p so f c o m f aa n dc o m s i ap r o v i d es m o o t ha n d i n t e r p r e t a b l ee x p l a n a t i o no ft h e s t r u c t u r e - a c t i v i t yr e l a t i o n s h i pf o r t h ec o m p o u n d s ，w h i c hw i l lg u i d et h ef b r t h e t r e s e a r c h k e y w o r d s ：c y c l i n - - d e p e n d e n t - - k i n a s e s 4 ( c d k 4 ) ，c y c l i r r - - d e p e n d e n t - - k i n a s e s 2 ( c d k 2 ) , v i 浙江大学硕士学位论文 h o m o l o g ym o d e l i n g , m o l e c u l a rd o c k i n g , i n h i b i t o r so f p y r i m i d i n e - p y r a z o na n a l o g u e s , e n o l i c t a u t o m e r ，3 d - q s a c o m f a ，c o m s i a v i i 独创性声明 奉人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究l ：作及取得f j 研究成粜。据我所女i i ，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论义- j 小包含j e 他人l 经发表或撰，j 过的研究成果，也4 ：包含为获得逝姿盘鲎或j t 他教f r 机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对奉研究所做的任何责献 均已往沦文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者躲扬翱签字隅加年饥射 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盘姿盘茔有关保留、使j 耶学位论义的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论史被仓蒯 i i 借阅。奉人授权逝姿盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数丑c j 乍 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 扬善协 钟：列年乡月f 开 学位论文作者毕业衍上向： 工作舭伉： 通讯地址： 导师签名： 关京妻 签字n 期西7 午0 川， | 电话： 邮编： 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师指导 下完成的成果，该成果属于浙江大学理学院化学系，受国家知砂 产 权法保护。在学期间与毕业后以任何形式公开发表论文或申请0 利， 均需由导师作为通讯联系入，未经导师的书面许可，本人不得以任 何方式，以任何其它单位作全部和局部署名公布学位论文成果。本 人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名 绷 嘲j ：耳舌月h 浙江大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 文献综述：细胞周期蛋白依赖性激酶 越来越多的研究表明，恶性肿瘤是一类细胞周期性疾病。细胞周期指由细胞 分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。可 分为四个阶段：( 1 ) g l 期( g a p l ) ，指从有丝分裂完成到期d n a 复制之前的间隙 时间；( 2 ) s 期( s y n t h e s i sp h a s e ) ，指d n a 复制的时期，只有在这一时期h 3 t d r 才能掺入新合成的d n a 中；( 3 ) g 2 期( g a p 2 ) ，指d n a 复制完成到有丝分裂开 始之前的一段时间；( 4 ) m 期又称d 期( m i t o s i so rd i v i s i o n ) ，细胞分裂开始到结 束 1 - 3 1 。如图1 1 所示， 图1 1 细胞周期循环的四个阶段 c d k 4 。6 c y c d r e s t r i c t i o np o i n t 细胞周期的运行与否，能否按序完成众多细胞周期事件，均受控于精密的细胞周 期调控机制。细胞周期调控模式就是在细胞周期过程中不同时相的多个调控点上 加以调节，以达到抑制瘤的产生。其中有三个调控点最为重要，它们就是g 1 s ， 浙江大学硕士学位论文 0 2 m 和有丝分裂中期后期的交界处，在这些调控点上的失控就很容易导致 肿瘤的发生。到目前为止，已有三类细胞周期调控因子被发现，分别是细胞周期 蛋白( c y c l 询，细胞周期蛋白依赖性激酶( c d k ) 和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物 ( c k d ，它们之间的相互作用调节着细胞周期的进程。细胞周期蛋白依赖性激酶 ( c d k ) 是一类重要的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，由催化亚基和调节亚基( 周期蛋 白) 组成，在细胞循环过程中起着重要作用，它的主要生物学作用是启动d n a 的 复制和诱发细胞的有丝分裂，以复合物形式出现，通过对其他蛋白质的作用来调 控细胞周期。c d k s 只有与其相应的周期蛋白结合，而且由c a k ( c d k 的激活因 子) 将其苏氨酸残基磷酸化才具有活性【4 l 。由于一些细胞周期蛋白的失控和一些 与肿瘤相关联的c 1 0 的缺乏有关，c d k s 抑制剂作为新的抗肿瘤药物倍受关注。 2 0 世纪8 0 年代初，i e l a n d h a r t w e l l 等利用遗传学的方法研究啤酒酵母时， 发现了一群基因与细胞周期的调控相关，称为细胞分裂周期基因( c e l ld i v i s i o n c y c l e g e n e s ，c d c g e n e s ) ，其中的e d c 2 8 又被称为”s t a r t ”，8 0 年代中期p a u l n u r s e 等发现了e d e 2 基因，后来e d c 2 基因被命名为e d k l ，这类蛋白质必须与周期蛋白 结合才能发挥激酶活性，因此被称为周期蛋白依赖性激酶( c y c l i nd e p e n d e n t k i n a s e ，c d k ) s l 。c d k 有三个重要的功能区，第一功能区是a t p 的结合部位和 该酶的活性部位，第二功能区是调节亚基( 细胞周期蛋白) 的结合部位，第三功能 区是p 1 3 s u e l 的结合部位( p 1 3 s u c l 能抑制激酶的活性，阻止细胞进入或退出m 期) 嘲。调节c d k 活性最主要的蛋白质就是周期蛋白，每个c d k 分子中都有一 小段与周期蛋白结合有关的保守序列。周期蛋白水平的周期性变化导致c y c l i n c d k 复合物周期性地装配和活化，这种活化转而触发细胞周期事件。主要的 周期蛋白依赖激酶周期蛋白复合物有： 表1 1 周期蛋白依赖激酶周期蛋白复合物及其作用 周期蛋白依赖激酶周期蛋白控制细胞周期的阶段 c d k l c y c l i na o ( 1 a ) c d k l c y c l i nb f k l b ) c d k 2 c y c l ma ( k 2 a ) c d k 2 c y c l i ne ( k 2 e ) c d k 4 c y c l i nd i ( k 4 d i ) 2 s g 2 g 2 m s g 2 g 1 s g 1 s 浙江大学硕士学位论文 c d k 6 c y e l i nd 2 ( k 6 d 2 ) g 1 s 不同类型周期蛋白和c d k 的组合在细胞周期的每个阶段有不同的作用，例如 g 1 s 过程主要受到c d k 2 c y c l i ne ( k 2 e ) 、c d k 4 c y e l i nd i ( k 4 d 1 ) 以及 c d k 6 c y c u n d 2 ( k 6 d 2 ) 的调节；而s g 2 过程主要由c d k 2 c y c l i n a ( k 2 a ) 、 c d k l c y e l i na ( k 1 a ) ；g 2 m 过程主要由c d k l c y e l i nb ( k 1 b ) 调控。这些激酶 的调控活性指导着细胞复制的过程并且保证下一代细胞的活性【7 - 1 0 】。在细胞周期 的整个过程中，细胞中某一c d k 的含量是恒定的，即活化c d k 与非活化c d k 的总量是不变的，不因细胞周期进行到某一期，某一c d k 含量增加或减少，只 是活化的c d k 与非活化c d k 的比例变化。为了确保细胞周期事件发生的时间 性和协同性，c d k 的时相性激活主要依赖于细胞周期蛋i 刍( c y c l i n ) 的细胞周期特 异性或时相性表达、累积与分解。另外，还涉及到其他大量的c d k 调节蛋白， 这些调节蛋白组成复杂的网络系统，如果这个网络中的一个或多个因素失调，都 可能导致肿瘤的发生和发展。其中一些c d k 调节蛋白作为癌基因产物催化激活 c d k 分子，导致细胞增殖失控，向肿瘤性增生方向发展，它们主要为c y c l i n ， 包括c y c l i nb 1 、c y c l i na 、c y e l i n e 、c y e l i nd i 、c y c l i nd 2 和c y c l i nd 3 等；另 外一些c d k 调节蛋白作为抑癌基因产物作用于c d k 分子，抑制其功能，从而 有效地抑制细胞的增殖生长，防止细胞增殖失控，有效地抑制肿瘤的发生。这些 蛋白缺失、减少或失活，往往导致细胞增殖失控，使其向肿瘤性增生方向发展， 它们主要为p 2 1 、p 2 7 、p 1 5 ，p 1 6 、p i g 、p 1 9 等。越来越多的证据已经表明在肿 瘤的产生和c d k 功能的失调之间存在着密切的关系。根据文献报道细胞周期调 控蛋白的过度表达和激酶的过渡活跃已经和一些类型的癌症的产生存在着关系 1 1 - 1 4 1 。在近十年来，许多的c d k 的抑制剂已经被发现，它们具有良好的抑制活 性。虽然它们中的大多数是c d k l 或c d k 2 的抑制剂1 5 - 2 9 1 ，但是有一些是c d k 4 的选择性抑制剂 3 0 - 3 7 1 。 3 浙江大学硕士学位论文 表1 2一些c d k 的抑制剂 一飞。 孔 1 豫够 飞曾“ 泓h 现在已经证实了1 3 种细胞周期蛋白依赖性激酶( c d k ) 和2 5 种细胞周期蛋白 ( c y d i n ) ，其中晶体结构已经解析出来的包括c d k 2 ，c d k 5 ，c d k 6 三种。c d k 4 的晶体结构虽然还不了解，但它对控制细胞分裂有关键作用，与周期蛋白d 1 结 合使底物磷酸化，控制g l 时期的进行。由于正常细胞通常在g o g i 时期之间 休眠，要缓解肿瘤细胞对正常细胞的威胁，在g 1 阶段抑制肿瘤细胞生长要比在 细胞周期的其它阶段的程度大，因此c d k 4 成为基于c d 融抗癌药物设计中最 吸引人的一个靶标。另外，其它的同源的c d k s 的晶体结构包括不带配体的和带 有配体的，已经提供了大量的有关c d k 4 作用机制的信息1 3 8 - 4 1 】。研究表明：c d k 4 4 浙江大学硕士学位论文 和c d k 2 在一级序列上有较高的一致性，一致性为4 5 ，因此可以c d k 2 的三 维结构为基础，采用同源模建( h o m o l o g y m o d d i n g ) 方法构建c d k 4 的三维结构。 1 2 研究方法 1 2 1 蛋白质结构预测 蛋白质是一切生物籍以表现生命的最重要的基本单元，任何一个生命体的繁 衍、新陈代谢、运动等等，都需要数十亿蛋白质的协调行动才能得以顺利进行。 为了执行特定的生物功能，每一个蛋白质分子都有一个独特的三维结构。假如一 种蛋白质的空间结构发生了变化，该蛋白质就失去了它应有的功能，甚至会对生 物体的生命活动产生巨大的影响。老年痴呆症和疯牛病的发生就是典型的例子。 研究蛋白质的结构，有助于了解蛋白质的功能，了解蛋白质的作用机制以及了解 蛋白质与其他分子之间的相互作用，这对于生物学、医学和药学，都有非常重要 的影响。对于功能未知或全新的蛋白质分子，通过结构分析，可以进行功能诠释， 指导设计生物学实验来进行功能研，而且通过分析蛋白质的结构，确认结构域， 为设计新的蛋白质或改造已有的蛋白质提供可靠的依据，同时为新的药物分子设 计提供合理的靶标分子及结构。 1 2 1 1 蛋白质结构预测方法 到目前为止，对于这一领域的研究方法分为两大类，第一种是利用实验的方 法来决定；第二种则是利用计算机技术，利用现有的理论和已知的基因序列等信 息进行蛋白质的结构预测。目前应用x 射线晶体衍射法和n m r 法已测定出1 万多种蛋白质及其复合物的结构。但与已测得的3 0 多万中蛋白质序列相比，还 有很大的差距，大大地影响了人们对蛋白质结构和功能关系的研究。与实验的方 法相比较，理论预测的方法由现有的资料库中获取参数，通过计算机模拟技术获 得蛋白质的空间结构信息，帮助解决x 射线晶体衍射法和n m r 法无法克服的问 题，并节省大量时间。 蛋白质结构的理论预测方法都是建立在氨基酸的一级结构决定高级结构的 理论基础上，大致分为以下三类。 5 浙江大学硕士学位论文 一比较建模法( c o m p a r a t i v em o d e l i n gm e t h o d ) 比较建模法是基于知识的蛋白质结构预测方法，又称为同源结构预测，是根 据大量已知的蛋白质三维结构来预测序列已知而结构未知的蛋白质结构。 二反向折叠法 反向折叠法是近年来发展起来的一种比较新的方法。它可以应用到没有同源 结构的情况中，且不需要预测二级结构，即直接预测三级结构，从而可以绕过现 阶段二级结构预测准确性不超过6 5 的限度，是一种有潜力的预测方法。 三从头预测法 从理论上说，从头预测法是最为理想的蛋白质结构预测方法。它要求方法本 身可以只根据蛋白质的氨基酸序列来预测蛋白质的二级结构和高级结构，但现在 还不能完全得到这个要求 4 2 - 4 3 。 1 2 1 2 同源模建法 同源模建法是蛋白质三维结构预测的主要方法附删。按照目前的定义，若待 构建模型蛋白质的序列与模板序列经比对( a l i g n m e n t ) 后的序列同源性( s e q u e n c e i d e n t i t y ) 在3 0 ( 也有人认为在3 5 ) 以上，则它们的结构可能属于同一家族， 它们是同源蛋白( h o m o l o g y ) ，可以用同源蛋白模型构建的方法预测其三维结构。 因为它们可能是由同一种蛋白质分化而来，它们具有相似的空间结构，相同或相 近的功能。因此，若知道了同源蛋白家族中某些蛋白质的结构，就可以预测其它 一些序列已知而结构未知的同源蛋白的结构，可以用同源模型构建的方法预测未 知蛋白质的三维结构。 同源蛋白模型构建( 模建) 的步骤： 1 搜索结构模型的模板。搭建模型前，需要找出和目标序列同源且结构已 知的蛋白质。所谓模板就是一个已知结构的蛋白质，该蛋白质的序列与目标蛋白 质的序列非常相似。如果找不到这样的模板，则无法运用同源模建法。 2 序列比对。序列的定位和排列是同源模建的关键步骤，通过序列比对可 以确定序列保守区域，进而为下一步做好准备。将目标蛋白质的序列与模板蛋白 质序列进行比对，使目标蛋白质的氨基酸残基与模板蛋白质残基匹配。比对中允 许插入和删除操作。 3 蛋白质模型构建。利用比对结果进行蛋白质模型的构建，其中包括建立 6 浙江大学硕士学位论文 目标蛋白质的骨架，构建目标蛋白质的侧链，构建目标蛋白质的环区等。 h o m o l o g y 、u q a n t a c h a r m 、c o 噼0 s e r 、c o n s e n s u s 、m o d e l l e r 和 c o l l a r e x t e n s i o n 等软件和方法可以用于目标蛋白结构模型的构建。 4 优化模型。通过上述同源结构模建( 预测) 得到的蛋白质结构模型为目 标蛋白质建立的初步的结构，通常含有一些不合理的原子间接触，需要进行优化， 如利用分子力学、分子动力学和模拟退火等方法进行结构优化，消除模型中不合 理的接触。 5 模型评价。对得到的蛋白质结构预测结果需要进行验证，以确定预测方 法是否可行，确定其适应面。a c c e l r y s 公司的i n s i g h t i i 和d sm o d e l i n g 软件都具 有这样的功能。例如，模型中有些键长、键角和二面角也有可能不合理，也需要 检查评估，蛋白主链二面角的r a m a c h a n d r a n 分布图可以用来检查评估。另外软 件中的p r o f i l e s - - 3 d 程序可以通过比较序列中的氨基酸可能采取的首选环境与模 建模型中的氨基酸的环境来评估模型。 1 2 2 分子对接 随着x 射线衍射以及核磁共振等技术的发展，越来越多的生物大分子的三 维结构被测定出来，或者以同源蛋白模建方法获得，以及商用小分子数据库的不 断更新，基于受体三维结构的药物设计方法一分子对接在药物设计中取得了巨 大的成功，已经成为基于结构药物设计中最为重要的方法，下面主要介绍分子对 接方法的基本原理以及方法【4 7 l 。 1 2 2 1 分子对接原理 分子对接的最初思想起源于1 0 0 年前f i s h e re 的“锁一钥匙模型”。然而， 配体与受体的结合过程是一个复杂的过程，涉及到配体和受体的去溶剂化、配体 和受体( 主要是活性部位处的残基) 的构象变化以及配体与受体之间的相互作用。 配体与受体能否结合，以及配体与受体的结合强度则取决于结合过程的自由能变 化【4 8 】： g 咖= 一r t i n k i 其中瞄是药物对受体的结合常数。而结合自由能又可以表示为： 硒b m 咖。龋8 “g 一髑h 慨 7 浙江大学硕士学位论文 大部分的分子对接法忽略了全部的熵效应，而在焓效应中也只考虑配体与受 体的相互作用能。配体与受体的相互作用包括静电作用( 两。i 。) 、范德华作 用( 届曲) 和氢键相互作用( 最i 七。l l d ) ，即： e h 朋d 瑚= e 咖+ e d 啪嘲蛳+ e h 。州 根据所采用的力场的差异，上式中的氢键作用可以显式地表达，也可以通过调整 相应原子的范德华半径来处理，或者将其包含在静电作用能中。 1 2 2 2 a u t o d o c k 程序简介 a u t o d o c k 4 9 5 1 1 是s c r i p p s 的o l s o n 科研小组开发的分子对接软件包，最新的 版本为3 0 5 。a u t o d o c k 采用模拟褪火和遗传算法来寻找受体和配体最佳的结合 位置，用半经验的自由能计算方法来评价受体和配体之间的匹配情况。 一、价函数 在a u t o d o c k 中，配体和受体之间结合能力采用能量匹配来评价。在1 0 和 2 0 版本中，能量匹配得分采用简单的基于a m b e r 力场的非键相互作用能。非键 相互作用来自于三部分的贡献：范德华相互作用，氢键相互作用以及静电相互作 用。范德华相互作用采用l e n n a r d - - j o n e s l 2 - 6 函数形式： r、 阻b o n d = 删e i 。r o u t 惮一剥 r q l 学喀j 在格点对接时，范德华相互作用的格点值的处理和d o c k 程序完全一样。 氢键相互作用采用传统的1 2 1 d 势函数形式： 7 、 阢“毒rout【予cij一百i)ui r o u t j j l 学r ：i c u = 5 8 x y 碍d q 砘x y 儡，碍 静电相互作用则采用了常用的库仑相互作用： z 。旷。i 邯q 洲i q j r ul h u t l j j 8 v q 产q j 介电函数可以设为常数或者是与距离有关的函数，后者在a u t o d o c k 中采用 s 函数的形式： 毋) = a + 磊i b 面1 + k c - m ” 8 浙江大学硕士学位论文 式中，b = 。o a ，8o 为7 8 4 ( 水在2 5 0 时的介电常数) ，a = 一8 5 5 2 5 ，k = 7 7 8 2 9 ，九= o 0 0 3 6 2 7 a 。 在3 0 版中，a u t o d o c k 提供了半经验的自由能计算方法来评价配体和受体 之间的能量匹配。计算采用下面的函数形式，结合自由能来自于五部分的贡献。 编= a g 咖d 挚一刳山甜斟孚一荆+ i 一喑 i o r n t e r + a g s e l + s i 。i 。置葶专一烈8 i v jv j ) e i 1 勺j r j u 、 。 叫 式中g v 撕、g h b 叫g c i e g “以及g 耐都是半经验参数，通过拟合 得到；n 。指配体在对接后被约束的可旋转键的数目。式中的静电相互作用，范 德华相互作用和氢键相互作用的计算方法和1 0 以及2 0 版本中一样，只是每个 计算出来的能量值需要乘上相应的权重系数。 二、格点对接 为了加快计算的速度，a u t o d o c k 采用格点对接的方法。但是a u t o d o c k 中格 点对接的处理方式和d o c k 中所采用的方式有明显的区别。在d o c k 中，格点上 所保存的不是能量值，而是仅与受体有关的特征量。在a u t o d o c k 中，格点上保 存的是探针原子和受体之间的相互作用能。 对于范德华相互作用的计算，每个格点上保存的范德华能量的值的数目与要 对接的配体上的原子类型的数目一样。如果一个配体有c 、0 和h 三种原子类 型，那么在每个格点上需要用三个探针原子来计算探针原子与受体之间的范德华 相互作用。当配体和受体进行分子对接时，配体中某个原子和受体之间的相互作 用能通过周围8 个格点上的原子类型为探针的格点值用内插法得到。 静电相互作用的计算采用了一个静电势格点。其实这和d o c k 的处理方式也 基本类似，在格点上储存受体分子的静电势。静电势的计算采用a u t o d o e k 提供 的a u t o g r i d 程序，也可以采用其他程序比如m e a d 或d e l p h i 通过求解线性 p o s s i o n - - b o l t a m a n n 方程得到。当配体和受体分子对接时，某个原子和受体之间 的静电相互作用能通过周围格点上静电势以及原子上的部分电荷就可以计算得 9 浙江大学硕士学位论文 i沙 ；群 | i l 羁 ，马克毫灰甜i 吏麦 晨射 圹弋 图1 2 氢键受体探针和氢键给体形成的夹角图1 3 拉马克遗传算法的基本步骤 计算氢键相互作用，格点的处理和范德华相互作用有点类似，每个格点上需 要保存配体分子中所有氢键给体与氢键受体类型和受体之间的相互作用能量，而 且这些能量都是在氢键在最佳情况下的氢键能量值。在计算氢键相互作用时， d o c k 引入了与角度相关的氢键场，图1 2 中显示了氢键受体探针和氢键给体形 成的夹角。但夹角为1 8 0 0 ，氢键相互作用最强；而当夹角为9 0 0 或小于9 0 0 时， 氢键相互作用为0 。 在计算去溶剂化能时，a u t o d o c k 仅仅考虑了配体中的c 原子，也就是说每 个计算去溶剂化能的格点仅仅需要保留一个能量值。 总的来讲，a u t o d o c k 中格点对接的处理方法比d o c k 中的处理方法复杂一 些，计算量的耗费也会大一些。 三、优化方法 在最早的a u t o d o c k 版本中，作者采用了模拟退火来优化配体和受体之间的 结合。在3 0 版本中，m o m s 等发展了一种改良的遗传算法，即拉马克遗传算法 ( l g a ) 。测试结果表明，l g a 比传统的遗传算法和模拟退火具有更高的效率。 在l g a 方法中，作者把遗传算法和局部搜索( 1 0 c a ls e a r c h ) 结合在一起，遗传 算法用于全局搜索，而局部搜索用于能量优化。在a u t o d o c k 中，局部搜索方法