（动物学专业论文）大鼠脑缺血再灌注后大脑皮质细胞凋亡的体视学观察.pdf

摘要 摘要 为了观察脑缺血再灌注后不同存活时间内大鼠大脑皮质不同区域细胞凋亡 的变化情况，本实验选取4 2 只s d 大鼠，将其随机分为对照组，缺血1 5 m i n 再 灌注6 h 、1 2 h 、2 4 h 组，缺血2 h 再灌注6 h 、1 2 h 、2 4 h 组，每组6 只。通过结扎 左侧颈总动脉，动脉夹夹闭右侧颈总动脉1 5 m i n 和2 h 后松开动脉夹恢复血流的 方法构建脑缺血再灌注模型。采用h o e c h s t 3 3 2 5 8 荧光染色和b a x 免疫组化方法 观察海马c a l 、c a 2 、c a 3 、c a 4 区、齿状回及顶叶皮质区细胞凋亡情况，用 体视学参数一一体积密度( v v ) 和数密度( n v ) 定量地分析这些区域细胞在脑 缺血再灌注后不同存活时间内的凋亡情况。结果如下： h o e c h s t 3 3 2 5 8 荧光染色：凋亡细胞细胞核在紫外光下呈现出明亮鲜艳的蓝 色荧光。各缺血再灌注组中上述大脑皮质各部位凋亡细胞v v 和n v 与对照组比 较均有极显著性增大( p 0 0 1 ) 。 上述大脑皮质各部位凋亡细胞v v 和n v 变化情况：在3 组缺血1 5 m i n 再灌 注中，凋亡细胞v v 和n v 在1 2 h 显著上升( p 0 0 5 ) ，海马c a l 、c a 2 区以及 顶叶皮质区在2 4 h 极显著上升( p o 0 1 ) 。在3 组缺血2 h 再灌注中，凋亡细胞 v v 和n v 在1 2 h 极显著上升( p o 0 1 ) ，海马c a l 、c a 2 区以及顶叶皮质区在 2 4 h 极显著上升( p o 0 1 ) 。缺血2 h 再灌注后6 h 、1 2 h 、2 4 h 组分别与缺血1 5 m i n 再灌注后6 h 、1 2 h 、2 4 h 组比较，3 个缺血2 h 组有显著( p 0 0 5 ) 或极显著增 大( p 0 0 1 ) 。 大脑皮质不同区域的凋亡细胞v x , 和n v 比较：脑缺血1 5 m i n 再灌注后，在 海马结构中，c a l 区凋亡细胞v v 和n v 最大，c a 2 区其次，然后是c a 3 ，最后 为c a 4 。c a l 与c a 2 、c a 3 及c a 4 比较均有极显著性差异( p o 0 1 ) ，c a 2 与c a 3 及c a 4 比较有显著性差异( p o 0 5 ) 。顶叶皮质区凋亡细胞v v 和n v 均高于海马和齿状回区，并且有极显著性 差异( p 0 0 5 ) 。 脑缺血2 h 再灌注后，c a l 区凋亡细胞v v 和n v 最大，c a 2 区其次，然后是c a 3 ， 最后为c a 4 。c a l 与c a 2 、c a 3 及c a 4 比较均有极显著性差异( p o 0 1 ) ， c a 2 与c a 3 及c a 4 比较有显著性差异( p 0 0 5 ) 。项叶皮质区凋亡细胞v v 和n v 高于海马和齿状回，并且有极显著 n 摘要 性差异( p o 0 5 ) 。 b a x 免疫组化结果：b a x 免疫组化阳性细胞胞浆、胞核均着色，呈棕黄色， 且b a x 免疫组化阳性细胞多为锥体细胞。各缺血再灌注组中上述大脑皮质各部 位b a x 免疫组化阳性细胞的v v 和n v 与对照组比较均有极显著性增大( p 0 0 1 ) 。 各缺血再灌注组b a x 免疫组化阳性细胞v v 和n v 组间比较结果：在3 组缺 血1 5 m i n 再灌注中，v v 和n v 在1 2 h 显著上升( p 0 0 5 ) ，海马c a l 、c a 2 区 以及顶叶皮质区在2 4 h 极显著上升( p o 0 1 ) 。在3 组缺血2 h 再灌注中，v v 和 n v 在1 2 h 极显著上升( p 0 0 1 ) ，海马c a l 、c a 2 区以及项叶皮质区在2 4 h 极 显著上升( p o 0 1 ) 。缺血2 h 再灌注后6 h 、1 2 h 、2 4 h 组分别与缺血1 5 m i n 再灌 注后6 h 、1 2 h 、2 4 h 组比较，3 个缺血2 h 组有显著( p o 0 5 ) 或极显著增大( p 0 0 1 ) 。 b a x 免疫组化阳性细胞v v 和n v 比较：脑缺血1 5 m i n 再灌注后，在海马结 构中，c a l 区b a x 免疫组化阳性细胞v v 和n v 最大，c a 2 区其次，最后为c a 3 、 c a 4 。c a l 与c a 2 比较有显著性差异( p 0 0 5 )，与c a 3 及c a 4 比较均有 极显著性差异( p 0 0 1 ) ，c a 2 与c a 3 及c a 4 比较有显著性差异( p o 0 5 ) 。与海马比较，顶叶皮质区b a x 免疫组化 阳性细胞v v 和n v 更大，且两者之间有极显著性差异( p o 0 1 ) 。在齿状回未 发现b a x 表达。脑缺血2 h 再灌注后，在海马结构中，c a l 区b a x 免疫组化阳性 细胞v v 和n v 最大，c a 2 区其次，然后是c a 3 ，最后为c a 4 ，c a l 与c a 2 、 c a 3 及c a 4 比较均有极显著性差异( p o 0 1 ) ，c a 2 与c a 3 及c a 4 比较有显 著性差异( p o 0 5 ) 。顶叶皮质区b a x 免疫组化阳性细胞v v 和n v 均高于海马区，且两者之间有极显著性差异( p 0 0 1 ) 。在齿状回未发现b a x 表达。 各缺血再灌注组中上述大脑皮质各区域h o e c h s t 3 3 2 5 8 荧光染色显示的凋亡 细胞v v 和n v 与b a x 免疫组化阳性细胞v v 和n v 比较均有显著性差异( p c a 3 c a 4 ，顶叶皮质区 海马 齿状回，而大脑左 右两侧比较无明显差异。 摘要 关键词：脑缺血再灌注、凋亡、大脑皮质、体视学、b a x 、h o e c h s t 3 3 2 5 8 i v a b s t r a c t a b s t r a c t i no r d e rt oa n a l y z et h ec e l la p o p t o s i sc h a n g e si nc e r e b r a lc o r t e xa tv a r i o u st i m e p o i n t sa f t e rc e r e b r a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni nt h er a t s ，4 2s p r a g u e d a w l e yr a t sw e r e r a n d o m l yd i v i d e di n t os e v e ng r o u p sw h i c hw e r ec o n t r o lg r o u p ，15 m i nr e p e r f u s i o no f 6 h ，12 h ，2 4 hg r o u p sa n d2 h i s c h e m i ar e p e r f u s i o no f6 h ，12 h ，2 4 hg r o u p s ，e a c hg r o u p i n c l u d e ds i xr a t s t h ea n i m a lm o d e lo fc e r e b r a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o nw a sm a d eb y l i g a t i n go ft h el e f tc o m m o nc a r o t i da r t e r ya n dc l a m p i n go ft h er i g h tc o m m o nc a r o t i d a r t e r y f o r15 m i no r2 h t h ec h a n g e so fc e l l a p o p t o s i s w e r eo b s e r v e db y h o e c h s t 3 3 2 5 8f l u o r e s c e i ns t a i na n db a xi m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o d ，a n dt h e v o l u m ed e n s i t y ( v v ) a n dt h en u m e r i c a ld e n s i t y ( n v ) o fb a xp o s i t i v ec e l l sa n d a p o p t o t i ci nd i f f e r e n tr e g i o n so fc e r e b r a lc o r t e xw a se v a l u a t e db ys t e r e o l o g y t h e r e s u l t ss h o w e da sf o l l o w e d ： 1 ) h o e c h s t 3 3 2 5 8f l u o r e s c e i ns t a i n ：t h en u c l e u so fa p o p t o t i cc e l ls h o w e d b r i g h t b l u ef l u o r e s c e r i c eu n d e ru l t r a v i o l e t t h ev va n dn vo fa p o p t o t i cc e l l si nd i f f e r e n t r e g i o n so fc e r e b r a l c o r t e xi n e x p e r i m e n t a lg r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s i n g c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ( p 0 0 1 ) i nt h et h r e e15 m i n i s c h e m i ar e p e r f u s i o ng r o u p s ，t h ec h a n g e sw i t ht h ev va n dn v o fa p o p t o t i cc e l l si nd i f f e r e n tr e g i o n so fc e r e b r a lc o r t e xb e t w e e na tv a r i o u st i m e p o i n t sa f t e rc e r e b r a li s c h e m i ar e p e r f u s i o n ：a t12 ha f t e rr e p e r f u s i o nt h ev va n dn vo f a p o p t o t i cc e l l si nc e r e b r a lc o r t e xs i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( p o 0 5 ) ，a t2 4 ha f t e r r e p e r f u s i o ni ts i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( p 0 0 1 ) i nh i p p o c a m p lc a1 ，c a 2a n dp a r i e t a l c o r t e x i nt h et h r e e2 h i s c h e m i ar e p e r f u s i o ng r o u p s ，t h ec h a n g e sw i t ht h ev va n dn v o fa p o p t o t i cc e l l si nd i f f e r e n tr e g i o n so fc e r e b r a lc o r t e xb e t w e e na tv a r i o u st i m e p o i n t sa f t e rc e r e b r a li s c h e m i ar e p e r f u s i o n ：a t12 ha f t e rr e p e r f u s i o nt h ev va n dn vo f a p o p t o t i cc e l l si nc e r e b r a lc o r t e xs i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( p o 。0 1 ) ，a t2 4 ha f t e r r e p e r f u s i o ni ts i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( p 0 0 1 ) i nh i p p o c a m p lc a1 ，c a 2a n dp a r i e t a l c o r t e x t h ev va n dn vo fa p o p t o t i cc e l l si nc e r e b r a lc o r t e xi nt h r e e2 h i s c h e m i a g r o u p s i n c r e a s e dd i s t i n c t l y ( p 0 0 5o r p o 0 1 ) c o m p a r e dw i t h t h a ti n 15 m i n i s c h e m i ag r o u p s v a b s t r a c t t h ed i f f e r e n c e sb e t w e e nt h ev va n dn vo fa p o p t o t i cc e l l si nd i f f e r e n tr e g i o n so f c e r e b r a lc o r t e x ：i nt h eh i p p o c a m p u s ，t h ev va n dn vo fa p o p t o t i cc e l l si nc a lw e r e b i g g e s t ，a n dt h a ti nc a 2 w e r eb i g g e rt h a nt h a ti nc a 3a n dc a 4 ( p 0 0 5 ) ，a n di tw a s s i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c e sb e t w e e nc a lr e g i o na n dt h eo t h e rr e g i o n si nh i p p o c a m p u s ( p 0 0 5 ) c o m p a r e d w i t ht h eh i p p o c a m p u sa n dd e n t a t eg y m s ，t h ev va n dn vw e r eb i g g e ri np a r i e t a l c o r t e x ( p o 0 1 ) t h ev vi nh i p p o c a m p u sw a sb i g g e rt h a nt h a ti nd e n t a t eg y r u s ( p o 0 5 ) 2 ) t h er e s u l to fb a xi m m u n o h i s t o c h e m i e a lm e t h o d ：t h ec y t o p l a s ma n dn u c l e u s o ft h eb a xp o s i t i v ec e l lb o t hw e r es t a i n e db r o w n ，a n dm o s to ft h eb a xp o s i t i v ec e l l s w e r ep y r a m i d a lc e l l s t h ev va n dn vo fb a xp o s i t i v ec e l l si nd i f f e r e n tr e g i o n so fc e r e b r a lc o r t e xi n e x p e r i m e n t a lg r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s i n gc o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ( p 0 0 1 ) i nt h et h r e e15 m i n i s c h e m i ar e p e r f u s i o ng r o u p s ，t h ec h a n g e sw i t ht h ev va n dn v o fb a xp o s i t i v ec e l l si nd i f f e r e n tr e g i o n so fc e r e b r a lc o r t e xb e t w e e na tv a r i o u st i m e p o i n t sa f t e rc e r e b r a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o n ：a t12 ha f t e rr e p e r f u s i o nt h ev va n dn vo f b a xp o s i t i v ec e l l si nc e r e b r a lc o r t e xs i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( p 0 0 5 ) ，a t2 4 ha f t e r r e p e r f u s i o ni ts i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( p o 0 1 ) i nh i p p o c a m p lc a1 ，c a 2r e g i o na n d p a r i e t a lc o r t e x i nt h et h r e e2 h - i s c h e m i ar e p e r f u s i o ng r o u p s ，t h ec h a n g e sw i t ht h ev v a n dn vo fb a xp o s i t i v ec e l l si nd i f f e r e n tr e g i o n so fc e r e b r a lc o r t e xb e t w e e na tv a r i o u s t i m ep o i n t sa f t e rc e r e b r a li s c h e m i a r e p e r f u s i o n ：a t12 ha f t e rr e p e r f u s i o nt h ev va n d n vo f b a xp o s i t i v ec e l l si nc e r e b r a lc o r t e xs i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( p 0 0 1 ) ，a t2 4 h a f t e rr e p e r f u s i o ni ts i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( p 0 0 1 ) i nh i p p o c a m p lc a1 ，c a 2r e g i o n a n dp a r i e t a lc o r t e x t h ev va n dn vo fab a xp o s i t i v ec e l l si nc e r e b r a lc o r t e xi nt h r e e 2 h i s c h e m i ag r o u p si n c r e a s e dd i s t i n c t l y ( p 0 0 5o rp 0 01 ) c o m p a r e dw i t ht h a ti n 15 m i n i s c h e m i ag r o u p s t h ed i f f e r e n c e sb e t w e e nt h ev va n dn vo fb a x p o s i t i v ec e l l si nd i f f e r e n tr e g i o n s o fc e r e b r a lc o r t e x ：i nt h eh i p p o c a m p u s ，t h ev va n dn vo fa p o p t o t i cc e l l si nc a lw e r e b i g g e s t ，a n dt h a ti nc a 2 w e r eb i g g e rt h a nt h a ti nc a 3a n dc a 4 ( p 0 0 5 ) ，a n di tw a s s i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c e sb e t w e e nc a ir e g i o na n dt h eo t h e r sr e g i o ni nh i p p o c a m p u s v i a b s t r a c t ( p 0 0 5o rp 0 0 5 ) c o m p a r e dw i t ht h eh i p p o c a m p u s ，t h ev va n d n vw e r eb i g g e ri np a r i e t a lc o r t e x ( p 0 0 1 ) b a xd i d i l te x p r e s si nd e n t a t eg y m s a p o p t o t i cm e c h a n i s mw a s i n v o l v e di nt h ec e r e b r a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni n j u r y a n dt h et i m eo fc e r e b r a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni m p a c t e dt h ec e l la p o p t o s i s t h ee x t e n t o fc e l la p o p t o s i si nd i f f e r e n tr e g i o n so fc e r e b r a lc o r t e xw a sd i f f e r e n ta f t e rc e r e b r a l i s c h e m i a - r e p e r f u s i o n k e yw o r d s ：c e r e b r a li s c h e m i ar e p e r f u s i o n , a p o p t o s i s ，c e r e b r a lc o r t e x ，s t e r e o l o g y , b a x ，h o e c h s t 3 3 2 5 8 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：叼易签字日期：勿咿年多月名日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌太堂有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直昌友堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：铂 签字日期：少移年占月z 日 少匕 月 多1 矜 ： 矿 名 玑 戳 瑚 燃 阳 黝 婵 第1 章引言 第1 章引言 脑血管病是危害人类生命与健康的常见病，具有发病率高、致残率高、死 亡率高和复发率高的特点，一直在人类各种疾病死因前三位之内，是中老年人 致死和致残的主要疾病。由于老年人口的不断增加和生活水平的提高，脑血管 病的发病率仍在不断上升，还有随着社区和医疗机构脑血管病综合防治体系的 不断建立和完善，越来越多的脑缺血病人在起病后六小时内接受超早期溶栓治 疗的机会逐渐增多，随之而来的缺血再灌注损伤便成亟待解决的问题。因此， 对脑缺血再灌注损伤机制以及如何进行防治进行研究具有重要的医学意义和社 会价值。 1 1 脑缺血再灌注损伤的机制 脑缺血后，缺血缺氧的环境会损伤脑组织，以前研究认为，缺血后再灌注 会使组织、器官功能得到恢复，损伤的结构得到修复。但是目前研究发现，缺 血后再灌注后不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重组织、器官的功能障 碍和结构损伤，神经损害体征和形态学改变较前更加明显。进一步研究表明， 脑缺血和缺血再灌后会引起一系列病理和生化的变化，主要表现为脑能量耗竭， 凋亡和坏死，兴奋性氨基酸释放增加，胞内c a z + 超载，细胞膜功能受损毒性自 由基产生，细胞肿胀等i l ，2 1 。相关机制如下： ( 1 ) 能量耗竭：脑细胞功能正常维持需要足够能量保障，一般生理状况下 脑组织代谢的能量供应一小部分来自脑内的三磷酸腺苷( a t p ) ，其余绝大部分 依靠血液循环带来的葡萄糖的有氧代谢产生。在缺血、缺氧状态下，线粒体的 能量代谢转为无氧代谢，所需能量几乎全部靠葡萄糖的无氧酵解来生成。而无 氧酵解产生的能量远低于有氧氧化，其生成a t p 的效率仅为正常的1 1 8 ，a t p 生成不足，脑功能受损p l 。 ( 2 ) 酸中毒：细胞缺血、缺氧后能量耗竭，a t p 的产生减少，无糖酵解增 加，产生大量的乳酸，p h 下降，而组织乳酸酸中毒是缺血细胞死亡的重要决定 因素，脑组织乳酸水平超过2 5 # g g 脑组织，将导致不可逆性神经学缺陷卜j 。 ( 3 ) 兴奋性氨基酸的毒性作用：兴奋性氨基酸( e x c i t a t o r y a m i n o a c i d ，e a a ) 第l 章引言 是中枢神经系统的主要兴奋性神经递质，它们对缺血脑细胞具有兴奋毒性作用， 是缺血脑损害的重要环节。e a a 受体可分为五种，但以n 甲基d 。天门冬氨酸 ( n m e t h y l d a s p a r t a t e ，n m d a ) 受体为主。e a a 造成的细胞毒性作用主要包括 两个方面：一是缺血后e a a 介导的大量n a + 、c l 及h 2 0 的内流，造成细胞毒性 脑水肿：二是通过激活n m d a 受体，介导c a 2 + 大量内流以及1 ，4 ，5 三磷酸肌 醇使细胞内钙库贮存的c a 2 + 释放增加，导致细胞内c e + 超载，激发一系列瀑布 样的病理生理过程，进一步导致细胞的迟发性死亡p 1 。 ( 4 ) 细胞离子失衡：由于能量耗竭使细胞能量依赖性离子泵功能衰竭，加 上细胞膜通透性增高使n a + k + ，c a 2 矿交换受阻，n a + 、c a 2 + 大量进入细胞内， 细胞外k + 增多。细胞内钙可介导细胞损伤，又可通过磷酸化作用调节体内许多 重要的酶系统，如钙调蛋白依赖性蛋白激酶i i 。钙通过该酶调节细胞递质的合 成与释放，从而使细胞a t p 钙依赖蛋白酶、磷脂酶和核酸进一步耗竭引起细胞 死亡f 6 】。 ( 5 ) 自由基损伤：正常情况下体内产生少量自由基属生理范围，体内同时 存在着超氧化物酶、过氧化氢酶等，可清除这些对细胞有毒性作用的自由基， 体内自由基的产生和消除处于动态平衡状态。当急性脑梗死时，由于缺血造成 氧供应下降和a t p 减少，使脑细胞正常代谢途径受到破坏，上述动态平衡状态 遭到破坏，使得氧自由基积聚蓄积而造成脑损伤【7 1 。 ( 6 ) 炎症反应：缺血时，最早的反应是缺血区白细胞聚集及炎症细胞因子 释放。脑缺血时，局部血管内皮细胞和中性粒白细胞被病变组织产生的可扩散 性介质激活，细胞间粘附分子释放增加，细胞粘附性加强，加之缺血区灌注明 显下降，白细胞牢固粘附于血管内皮细胞表面。导致毛细血管的堵塞、渗漏及 减少微血管血流，甚至导致缺血区域的血液停滞现象。聚集的白细胞释放氧自 由基、溶蛋白酶及细胞激动素等造成组织坏死【8 l ( 7 ) 凋亡和坏死：缺血引起的细胞死亡不同于一般意义的细胞死亡。神经 系统的细胞死亡可通过多种机制发生。过去一直认为脑缺血后细胞死亡形式是 坏死。1 9 9 3 年，t o a g a 等首次证实成熟动物脑缺血后可引起细胞凋亡，缺血性脑 损伤脑死亡存在坏死和凋亡两种形式，分别涉及被动和主动机制。较温和的脑 缺血损伤以细胞凋亡为主，剧烈脑缺血损伤以细胞坏死为主。凋亡出现在缺氧 缺血脑损伤的2 4 h 内，早于脑细胞明显坏死之前。而且脑缺血再灌注损伤后细 胞凋亡的发生与缺血的类型、严重程度、再灌注时间的长短有关1 9 , 1 0 l 。 2 第1 章引言 1 2 细胞凋亡 1 2 1 细胞凋亡与脑缺血再灌注损伤 细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理状态下，遵循自身的程序，自己结束 自己生命的过程，是由细胞内外因素激活细胞本身的自杀程序引起。其是一种 主动的由基因介导的可能引起细胞死亡过程，涉及一系列基因的激活、表达调 控并依赖新的蛋白质合成。研究表明抑制神经细胞凋亡就可能减少脑缺血后迟 发性神经元损伤，有可能阻止脑梗塞范围扩大，减轻脑损害，保护脑组织。因 此寻找抑制神经细胞凋亡的干预措施将为脑缺血的治疗开拓新思路，并且为防 治脑缺血提供一条新途径，这已经成为近年来国内外学者们研究热点。 近年来大量研究表明，细胞凋亡是维持机体正常生理功能和自身稳定的重 要机制，它参与多种生理和病理过程。细胞凋亡与脑缺血再灌注损伤有着密切 的关系，缺血的类型、严重程度、再灌注时间的长短都影响着脑缺血再灌注后 细胞凋亡的程度。 过去研究脑复苏是从生存角度寻找造成损害的种种病理生理因素以避免发 生或减轻损害，而现在通过抑制或避免凋亡的发生有利于找到脑复苏关键所在， 其中调节细胞凋亡的控制基因的表达有重要的治疗潜力。凋亡的发生需要一定 的时间延搁，以便d n a 损伤积累及相关基因表达和蛋白质合成等程序的启动， 可通过有效阻止启动凋亡的基本因素及其后的各个环节而得以控制。因此抗凋 亡治疗将可能成为脑缺血治疗的主要内容，而且凋亡的发生呈相对延迟的方式 为治疗创造了机会。 目前对脑缺血再灌注后细胞凋亡的发生机制尚未完全明了，凋亡既是凋亡 相关基因表达的结果，又受许多内外因素的调节。脑缺血再灌注后一些病理生 理机制，如e a a 的毒性作用、自由基含量以及细胞内钙离子浓度，同样都会对 脑缺血再灌注后细胞凋亡产生影响。e a a 的兴奋毒作用在脑缺血急性期的细胞 死亡以及再灌注后的细胞损害和迟发性细胞死亡起主要作用，可能通过激活 n m d a 受体引起细胞内c d + 浓度升高或介导钾离子外流导致细胞凋亡i i j 引。而 各种自由基的产生已公认在再灌注细胞损害中起主要作用1 1 卜b l 。自由基在生理 及病理条件下可诱导凋亡。氧化应激可导致脂质过氧化，使得细胞内脂质过氧 化物积聚并诱导细胞凋亡。抗氧化剂可抑制脂质过氧化，保护细胞免遭氧化性 损伤所致的凋亡。脑缺血前给予环氧化酶抑制剂可减少自由基的产生，减少和 第1 章引言 延缓细胞凋亡的发生。此外将自由基生成剂注入侧脑室2 0 r a i n 后即有凋亡特征 的d n a 断片出现，由此认为d n a 是自由基主要攻击的目标i t 6 1 。关于细胞内钙 超载方面，有研究表明在被各种因素诱导的细胞凋亡出现之前，胞浆内游离c a 2 + 浓度均持续性升高，抑制c a 2 + 浓度的升高则可阻止诱导的细胞发生凋亡【1 7 】。目 前认为细胞内钙超载引起凋亡的机制可能是激活凋亡过程中两个主要的钙离子 依赖性酶核酸内切酶和谷氨酰胺转移酶。前者激活后使细胞内d n a 断裂形 成1 8 0 2 0 0 b p 的单个寡聚核苷酸小体；而后者激活后，使蛋白质发生交换，并在 细胞膜下形成蛋白质网，以防止凋亡细胞膜破裂而造成的胞浆成分外溢，从而 避免了周围的炎症反应，同时该酶也参与了凋亡小体的形成i l 引。 也有研究表明脑缺血后细胞内n o 含量的升高也可能是诱导细胞凋亡的一 个因素【l9 1 。把大鼠皮质细胞与n o 生成剂一起培养1 0 m i n ，1 2 1 6 h 后细胞死亡， 其死亡的细胞经电镜和电泳证实为凋亡，也提示了n o 可直接诱导细胞凋亡。 n o 诱导细胞凋亡可能通过以下途径：n o 的直接损伤细胞的d n a ，导致细胞凋 亡；n o 氧化生成过氧化亚硝酸盐途径，直接或通过分解成许多小分子毒性物质 损伤细胞而导致凋亡：n o 作用于细胞凋亡的信号通路作用于细胞凋亡基因，启 动凋亡程序；n o 与细胞因子相互协同诱导细胞凋亡i z 川。 脑缺血后细胞生存环境的变化对细胞凋亡发生的影响也是不容忽视的，因 为在生理情况下，细胞生存环境中的神经胶质细胞、靶细胞、神经营养因子、 细胞因子、细胞外间质等因素对细胞的可塑性有直接的影响。这种细胞外的多 因素控制主要对细胞发育过程中的生存与死亡以及细胞数量的恒定起关键的控 制作用。早期的过量细胞竞争学说以及近年来神经因子对细胞生存影响的研究 发现，细胞发育过程中的死亡不仅取决于靶细胞的数量和体积、形成突触与否 以及突触后受体的特性，而且也取决于靶细胞分泌的神经营养因子，只有那些 得到足够因子的细胞存活，反之则死亡。神经营养因子可减轻无血清培养液所 致鼠皮质细胞的凋亡，但也有相反的报道认为它们可引起凋亡【1 1 】。神经胶质细 胞与细胞之间存在复杂的细胞间相互作用，以维持神经系统内环境的稳定。在 某些病理条件下，激活的神经胶质细胞对细胞产生毒性作用，如小胶质细胞和 星状胶质细胞参与多种神经退行性疾病及脑缺血的病理发生过程【2 卫。尽管胶质 细胞调制神经毒的作用机制还不清楚，但有资料表明与胶质细胞分泌产生的多 种免疫调制物如细胞因子、毒性自由基、谷氨酸等神经毒素有关。其中对细胞 因子的神经毒作用研究较多。脑缺血时有大量细胞因子如白细胞介素1 、转化生 4 第1 章引言 长因子、白细胞介素6 、白细胞介素8 、肿瘤坏死因子的表达，它们中有的具有 神经保护作用，但更多的是神经毒作用1 2 引。 1 2 2 细胞凋亡的基因调控 目前已经有许多研究资料证实，有多种基因参与了细胞凋亡基因调控。多 种基因产物的主动表达在脑缺血后细胞凋亡的发生过程中或起保护作用，或起 促进作用，其中研究较多的有b c l 一2 家族、c m y c 基因、p 5 3 基因、早期快速反 应基因( i e g s ) 和白介素1 口转化酶( i c e ) 基因家族等。现将b c l 2 家族、c m y c 基因、p 5 3 基因、早期快速反应基因( i e g s ) 和白介素1b 转化酶( i c e ) 基 因家族在细胞凋亡中的作用分别阐述如下： ( 1 ) b c l 一2 基因家族：b c l 一2 基因家族的成员在体内通常以3 聚体的形式发 挥作用，但因它们起动的基因不同，作用的转导通道各异，可引起相反的结果， 故分两类，一类具有抑制凋亡作用，如b c l - 2 、b c l x l 、m c l l 等；一类具有促进 凋亡作用，如b a x 、b c l x s 、b a k 等。目前主要集中在对保护蛋白b c l 一2 、b c l x 和凋亡蛋白b a x 的研究。 b c l 2 ( bc e l ll y m p h o m a l e u k e m i a - 2 ) 即b 细胞淋巴瘤白血病2 基因，是一 种抗凋亡原癌基因，b c l 2 蛋白是一种跨膜蛋白，主要是位于核膜皱折处、内质 网膜及线粒体内膜上。线粒体膜上的b c l 2 通过控制线粒体的膜电位、调节线粒 体膜的通透性等过程来抑制凋亡。电镜研究显示，b c l 2 不是随机地在核膜中分 布，而是与核微孔复合物相连，可能在核的运输、核微孔复合物的形成和核膜 的维持方面起重要作用。研究发现b e l 2 促进g s h 进入核内，改变核内的氧化 还原反应，阻止c a s p a s e 蛋白酶的活动和其它核改变，抑制细胞凋亡。定位于内 质网膜上的b c l 一2 可能通过阻断c a 2 + 从内质网向胞质中的流动而抑制凋亡【2 4 1 。也 有研究表明b c l 2 是通过抑制活性氧的产生或拮抗活性氧的作用而抑制细胞凋亡 1 2 5 。由此可知b c l 2 可通过多条途径抑制凋亡。离体细胞培养的研究证明，b c l 2 对自由基、无糖、谷氨酸、去生长因子所致的细胞凋亡有抑制作用。它对细胞 的增殖速度不产生影响，而是通过抑制各种形式的细胞死亡而使细胞寿命延长。 b c l x 蛋白是一种与b c l 2 蛋白有4 4 同源并参与调节细胞死亡的蛋白，其分两 种，b c l x l 和b c l x s 。研究证实，b c l x l 蛋白可抑制细胞凋亡，其功能相似于b c l 2 蛋白。b c l x s 的作用与b c l 2 相反，研究认为b c l x s 可能是作为b c l 2 的结构抑 制子，通过对其下游的细胞凋亡调节子的作用而抑制b c l 2 的功能，参与细胞凋 5 第1 章引言 亡调节过程。 b a x 蛋白有对抗b c l 2 蛋白抑制凋亡的作用，其分子大小为2 1 k d a ，其含有 1 9 2 个氨基酸，与b c l 2 有2 1 的同源性，与b c l 2 共存于线粒体，是极重要的 促凋亡基因之一。实验证明b a x 蛋白被钙蛋白酶裂解成1 8 k d 后比2 1 k d 的b a x 蛋白更具有诱导凋亡的能力1 7 州。普遍认为，b a x 基因的表达并不立即导致细胞凋 亡，而是仅在细胞接受死亡信号之后b a x 才开始发挥作用，通过抑制b c l 一2 的作 用而导致细胞凋亡。b a x 基因调控细胞凋亡的分子机制目前尚不清楚，但有实验 表明当凋亡发生时，b a x 蛋自从胞质中转移到线粒体膜上，并且形成一个通道， 诱导细胞色素c 从线粒体中释放出来【27 1 。b c l 2 蛋白通过抑制b a x 蛋白插入线粒 体膜或通过直接、间接的抑制b a x 蛋白通道的活性来阻止细胞色素c 的释放1 2 引， 来调控细胞的生死。目前认为，缺血脑组织中b c l 2 的表达是抑制细胞凋亡的关 键步骤，但它不能单独阻止所有细胞的凋亡，需要与其家族成员共同调节细胞 凋亡。研究发现b a x 与b c l 2 结合成异源二聚体是b c l 2 发挥抗凋亡活性所必须 的。细胞受刺激后是否存活取决于b c l 2 b a x 的比率，比值越高，细胞存活率越 高，比值越低，细胞凋亡率越高【2 虬3 l 】。 ( 2 ) c m y e 是一种癌基因，是调控细胞增殖的主要基因，既可引起细胞增 殖又可导致细胞凋亡，c m y c 的效应取决于细胞所处的环境是否存在诱导细胞凋 亡的因素。当细胞处于适宜的环境条件时，c - m y e 的表达触发细胞增殖。相反， 当细胞处于细胞凋亡诱导因素的作用下时，c - m y c 的表达可导致细胞凋亡。c m y c 编码的蛋白质本身有两种信号：增殖细胞信号和细胞凋亡信号，所以又有人称 “双重信号模型。c m y c 如何调节这两个截然相反的过程机制推测可能与c m y c 蛋白的两个特性有关：c m y c 蛋白可特异性结合于d n 的某段序列，并可与其它 蛋白形成特异性二聚体，从而调控基因转录；c m y e 蛋白可与r b 蛋白特异性结 合而调节细胞周期活动p 引。 ( 3 ) p 5 3 基因是一种促进细胞凋亡的抑癌基因，产物为一种5 3 k d a 的磷酸 化核蛋白。p 5 3 基因分为野生型和突变型两种，它们均参与凋亡的调节，但作用 效果不同。目前认为野生型p 5 3 可分别与d n a 、r n a 聚合酶连接，作为核转录 因子调节相关基因的表达，其主要功能是调节细胞周期，促进细胞凋亡，起分 子警察的作用，控制基因组完整性。p 5 3 可能作为负调控转录因子而下调b c l 一2 的表达川，b c l 2 基因下调是细胞凋亡的关键步骤，也是近年来细胞凋亡机理研 究的热点。细胞凋亡过程中p 5 3 上调与b c l 一2 下调存在严格的先后时序，p 5 3 具 6 第1 章引言 备作为b c l 一2 负转录因子的条件。细胞凋亡之前，不仅p 5 3 蛋白增多出现在b c l 一2 下调之前，同时p 5 3 的m r n a 水平也出现了一过性升高现象【3 4 j 列。突变型p 5 3 能与野生型p 5 3 亚单位结合形成寡聚体，还可抑制c m y e 介导的凋亡，干扰野 生型p 5 3 的功能而使细胞的增殖失控。p 5 3 基因产物通过诱发细胞凋亡的方式， 可为机体提供一种重要的防护手段1 3 b , 3 7 1 。 ( 4 ) i e g s ：i