（外科学专业论文）肾上腺髓质素在肾脏肿瘤组织中的表达及其与微血管密度的相关性研究.pdf

目录 | l u li ii llui l uii i iu l y 19 0 0 3 5 9 中文摘要”1 英文摘要“3 研究论文肾上腺髓质素在肾脏肿瘤组织中的表达及其与微血管密度的 相关性研究 前言。5日l j 青”5 材料与方法6 结果1o 附图12 附表14 讨论l5 结论19 参考文献2 0 综述肾上腺髓质素的研究进展2 5 致谢35 个人简历3 6 中文摘要 肾上腺髓质素在肾脏肿瘤组织中的表达及其与微血管密度的相 关性研究 摘要 目的：肾细胞癌( r e n a lc e l lc a r c m o m a ，r c c ) 是泌尿系统中致死率最 高的肿瘤，近些年来它的发病率以及死亡率在不断的升高，因而要加大对 肾癌的发病机制的研究，为最终的临床治疗提供有效的客观指标。有关血 管形成在肾肿瘤的发生发展中的作用已经确立，而肾上腺髓质素 ( a d r e n o m e d u l i n ，a d m ) 是一个新的血管活性肽，通过应用免疫组织化学 法观测其在肾脏肿瘤中的表达以及与肾肿瘤组织中微血管密度 ( m i c r o v e s s e ld e n s i t y ，m v d ) 的相关性，从而为肾肿瘤的临床治疗提供一个 可靠的分子生物学指标，并为肾肿瘤的临床治疗提供理论基础。 方法：收集河北医科大学第二医院泌尿外科2 0 0 9 年4 月- - 2 0 0 9 年9 月资料完整的肾细胞癌手术病例共3 3 例，术前患者未经过任何抗肿瘤治 疗，手术标本均在无菌条件下离体取得，标本均包括癌组织、距肿瘤边缘 5 c m 以上的正常肾实质组织。直径约l c m 各两例，用1 0 甲醛固定。 结果：通过免疫组织化学检测肾癌组织中癌细胞有明显的a d m 标 记，阳性率为1 0 0 ，主要表达于细胞质中。而正常组织中a d m 的阳性 表达率为9 1 。肾癌组织与正常肾组织中a d m 水平表达有差别。 肾肿瘤组织中微血管密度值为4 3 3 9 士7 8 1 ，正常肾组织中微血管密度 值为9 7 3 4 - 4 2 2 。经检验采用非参数检验，z 检验统计量为5 0 1 4 ，双侧概 率为p - - - 0 0 0 0 0 0 5 ，拒绝h o ，接受h l ，肿瘤组织中和正常肾脏组织中微 血管密度有差别，肿瘤组织中计数明显高于正常组织中的微血管计数。免 疫组织化学检测中高表达的a d m 中微血管密度值为4 3 7 8 + 7 6 1 ，低表达 值为1 0 3 5 + 5 5 3 ，经方差检验f = 4 2 0 2 6 6 ，p - - 0 0 0 0 0 0 5 ，拒绝h 0 ，接受 h l ，认为肾癌组织中a d m 的表达高低与微血管计数有相关性。a d m 表 达越高，微血管密度值越高。 结论：本研究通过对3 3 例肾癌患者癌组织与正常组织的对比，通过 免疫组织学检测得出a d m 在肾肿瘤组织中有高表达，在部分正常组织有 少量表达，且a d m 的高表达与微血管密度的数量有相关性，表明a d m 中文摘要 生物学指标，在肾肿瘤的发生发展中起到一定的作用，通过 a d m 的特性，为肾肿瘤的发病机理、综合治疗提供理论基 的制定出肾肿瘤的临床治疗方案。 肾上腺髓质素；微血管密度；免疫组织化学；肾细胞癌 英文摘要 s t u d yo nt h ee x p r e s s i o no fa d r e n o m e d u l l i ni nt h er e n a lc a n c e r t i s s u ea n di t sc o r r e l a t i o nw i t ht h em i c r o v e s s e ld e n s i t y a b s t r a c t o b j e e t i v e ：r e n a lc e l lc a r c i n o m a ( r c c ) i st h el e a d i n gc a u s eo fd e a t hi n u r i n a r ys y s t e mt u m o r s i nr e c e n ty e a r si t sm o r b i d i t ya n dm o r t a l i t yi nt h e c o n t i n u i n gr i s e ，s oi n c r e a s et h ep a t h o g e n e s i so fr e n a lc e l lc a r c i n o m a , c l i n i c a l t r e a t m e n tf o rt h e u l t i m a t eo b je c t i v et op r o v i d ee f f e c t i v ei n d i c a t o r s 硼1 er o l eo f t h ea n g i o g e n e s i si nt h er e n a lc a n c e rd e v e l o p m e n th a sb e e ni d e n t i f i e d a n dt h e a d r e n o m e d u l l i n ( a d m ) i s an e wv a s o a c t i v e p e p t i d e t h r o u g h t h e i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ，t h ee x p r e s s i o no fa d r e n o m e d u l l i ni nt h er e n a l c a n c e ra n di t sc o r r e l a t i o nw i t ht h em i c r o v e s s e ld e n s i t yi st ob eo b s e r v e dt o p r o v i d ear e l i a b l em o l e c u l a r - b i o l o g i c a li n d i c a t o ra n dt h e o r e t i c a lb a s i sf o rt h e c l i n i c a lt r e a t m e n to fr e n a lc a n c e r m e t h o d ：c o l l e c t e dt h er e n a lc a n c e ro p e r a t i o nc a s e sw i t hc o m p l e t ed a t a f r o mt h eu r i n a r ys u r g e r yd e p a r t m e n to fh e b e iu n i v e r s i t ys e c o n dh o s p i t a lf r o m a p r i l2 0 0 9t os e p t e m b e r2 0 0 9a n dt h et o t a lc a s en u m b e r w a s3 3 b e f o r et h e o p e r a t i o n ，t h ep a t i e n td i dn o tr e c e i v ea n ya n t i t u m o rt h e r a p y 1 1 1 eo p e r a t i o n s a m p l e sw e r eo b t a i n e di nv i t r ou n d e rt h ea s e p t i cc o n d i t i o n a n dt h es a m p l e s i n c l u d e dt h et u m o rt i s s u ea n dt h en o r m a lr e n a l p a r e n c h y m at i s s u ew h o s e d i s t a n c et ot h et u m o re d g ew a so v e r5 c m t h e r ew e r et w os a m p l e sw h o s e d i a m e t e rw a sa b o u tlc m b o t hw e r ef i x e db yl0 m e t h a n 0 1 r e s u l t ：t u m o rc e l l sw i 血o b v i o u sa d mm a r k e ri nt h er e n a lc a n c e rt i s s u e w o u l db ed e t e c t e du s i n gt h ei m m u n o h i s t o c h e m i s t r ym e t h o d 们1 ea d m m a i n l y e x p r e s s e di nt h ec y t o p l a s ma n di t sp o s i t i v er a t ew a s1o o ，w h i l et h ep o s i t i v e e x p r e s s i o nr a t ei nn o r m a lt i s s u ew a s9 1 w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h ea d m e x p r e s s i o n1 e v e li nt h er e n a lc a n c e rt i s s u ew a sd i f f e r e mf r o mt h a ti nt h e n o r m a lr e n a lt i s s u e t h em i c r o v e s s e ld e n s i t yi nt h er e n a lc a n c e rt i s s u ew a s4 3 3 9 士7 81 w h i l e t h em i c r o v e s s e ld e n s i t yi nt h en o r m a lt i s s u ew a s9 7 3 4 - 4 2 2 i n t h e 英文摘要 n o n p a r a m e t r i ct e s t ，t h ez v a l u ew a s 5 014a n dt h et w o - s i d ep r o b a b i l i t ypw a s e q u a lt oo 0 0 0l e s st h a no 0 5 s or e f u s e dr t 0a n da c c e p t e dh 1 ，w h i c hi n d i c a t e d t l l a tt h em i c r o v e s s e ld e n s i t yi nt h et u m o rt i s s u ew a sd i f f e r e n tf r o m 协a ti nt h e n o r m a lt i s s u ea n dt h em i c r o v e s s e lc o u n tw a so b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h a ti nt h e n o r m a lt i s s u e i nt h ei m m u n o h i s t o c h e m i s t r yd e t e c t i o n ，t h em i c r o v e s s e ld e n s i t y i nt h er e n a lc a n c e rt i s s u ew i t hh i g he x p r e s s i o no fa d mw a s4 3 7 8 士7 61 ，w h i l e t h em i c r o v e s s e ld e n s i t yi nt h er e n a lc a n c e rt i s s u ew i t hl o we x p r e s s i o no fa d m w a s1 0 3 5 士5 5 3 i nt h ev a r i a n c et e s t ，fw a s e q u a lt o4 2 0 2 6 6a n dpw a s0 0 0 0 l e s st h a n0 0 5 s or e f u s e dh 0a n da c c e p t e dh 1 a n di tw a sc o n s i d e r e dt h a tt h e h i g ho rl o we x p r e s s i o no fa d m i nt h er e n a lc a n c e rt i s s u ew a sc o r r e l a t e dw i t h t h em i c r o v e s s e lc o u n t 1 1 1 eh i g h e rt h e 删e x p r e s s i o n ，t h el a r g e rt h e m i c r o v e s s e ld e n s i t yv a l u ew a s c o n c l u s i o n ：a f t e rc o m p a r i n gt h et u m o rt i s s u e 、i mt h en o r m a lo n ei n3 3 r e n a lc a n c e rp a t i e n t sa n dt h r o u g ht h ei m m u n o h i s t o c h e m i s t r yd e t e c t i o n ，t h i s s t u d yc o m e st oa nc o n c l u s i o nt h a ta d m h a sh i g he x p r e s s i o ni nr e n a lc a n c e r t i s s u ew h i l ei t se x p r e s s i o ni nc e r t a i nn o r m a lt i s s u ei s l o w , a n dt h eh i g h e x p r e s s i o no fa d m i sc o r r e l a t e dw i t ht h en u m b e ro fm i c r o v e s s e ld e n s i t y t h i s i n d i c a t e st h a t ，a sab i o l o g i c a li n d i c a t o r , a d mp l a y sac e r t a i nr o l ei nt h e o c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to fr e n a lc a n c e r a f t e rf u r t h e rs t u d yo nt h e p r o p e r t yo fj 如m ，i tm i g h tp r o v i d eat h e o r e t i c a lb a s i sf o rt h ep a t h o g e n e s i so f r e n a lc a n c e ra n dt h e c o m p r e h e n s i v et h e r a p y , t h u sm a k i n gb e t t e rc l i n i c a l 仃e a t m e n tf o rt h er e n a lc a n c e l k e y w o r d s ： a d r e n o m e d u l l i n ；m i c r o v e s s e l d e n s i t y ； i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ； r e n a lc e l lc a r c i n o m a 研究论文 肾上腺髓质素在肾脏肿瘤组织中的表达及其与微血管密度的相 关性研究 让| 鱼 刖再 肾肿瘤的发病率和死亡率在我们全身的肿瘤中占2 左右，而在我国 的泌尿外科恶性肿瘤中占第二位。它的病因到现在还不是很清楚，流行病 学家的调查研究表明跟吸烟、肥胖、高血压、药物等有关系。在肾肿瘤中 恶性占大多数，肾细胞癌( r e n a lc e l lc a r c i n o m a ，r c c ) 即肾癌是起源于肾 实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，占肾恶性肿瘤的8 0 - - - 9 0 ，它的主 要病理学类型有透明细胞癌、乳头状癌和嫌色细胞癌，其中以占肾细胞癌 7 0 8 0 的透明细胞癌最为常见n 1 。近年来有文献报道肾癌的发病率在 不断的上升，并且症状出现的比较晚，大部分的患者预后都不怎么好1 。 肾癌成为了泌尿外科恶性肿瘤中很大的问题，因此很有必要在临床中找到 全面可靠的指标来为肿瘤的早期诊断、治疗和预后提供有效可行的方案。 “肿瘤组织的生长和扩散需要血管的生成 这一观点由f o l k m a n 巧1 提出，多 年来通过大量的实验和i 临床研究证实：恶性肿瘤的生长转移与肿瘤的新生 血管密切相关。它不仅为肿瘤的生成提供营养和气体交换，同时也成为肿 瘤细胞转移最直接的原因t 6 | 。 肿瘤细胞转移是一个很多步骤相衔接的过程。肿瘤细胞从原发部位进 入血管，在血液循环中生存，到达靶器官循环后停留、逸出血管外。随着 肿瘤血管的生长增多，肿瘤细胞进入血液循环的机会也随之增大：很显然 在肿瘤转移的这些过程中，血管形成起到了很重要的作用，它是肿瘤转移 所必需的。触发血管形成的表现型是严格地按照肿瘤细胞进行性生长的需 要来完成的。也就是说，在高血管区的“热点 ，血管计数的增加与肿瘤不 良预后相关。皮下黑色素瘤血管形成的研究证明，血管密度的增高预示着 肿瘤细胞转移的潜在危险性7 1 。通过血管造影发现9 2 以上的肾癌病灶 内有新生的肿瘤血管，并且具有许多异常的血管结构，表现为滋养血管大而 不规则，血管扭曲和中断、密集成团状及动静脉短路等t s i 。这些均为肾癌 的血管生成研究提供了病理学基础。这种发现随后被许多研究者所证明 t 9 l 。血管生成在肿瘤的生长过程中起重要作用的这一观念已经为广泛接 研究论文 受，并且新生血管需要在促生成因子的作用下才能有更异常的增生，从而 对肿瘤的生长起作用，而肾上腺髓质素( a d r e n o m e d u l l i n ，a d m ) 正是 这种促血管生成因子的论点正受到关注。 肾上腺髓质素最初是从人的嗜铬细胞瘤中分离出来的一种生物活性 肽，属于c g r p 家族。在人体的各个组织器官都有表达，血浆a d m 主要 来源于血管平滑肌细胞和内皮细胞。心脏平滑肌细胞和肿瘤细胞等可以合 成分泌a d m ，并通过旁分泌自分泌途径促进血管的生成、扩张血管、抗 凋亡以及帮助肿瘤细胞逃避免疫系统的作用，参与人体多种良恶性疾病的 发生发展过程。 目前国内外关于a d m 的研究多是关于内科系统的疾病，而国内关于 a d m 与肾肿瘤的研究相对较少。故而本文通过免疫组化的方法研究检测 了a d m 和微血管密度( m v d ) 在肾肿瘤组织中的表达并对其相关性进行了 分析。从而发现a d m 与肾肿瘤生成的关系，以及它在判断恶性程度和评 估不良预后中的作用，为肾肿瘤的预防和治疗开辟新途径。 材料与方法 1 实验材料 收集河北医科大学第二医院泌尿外科2 0 0 9 年4 月 2 0 0 9 年9 月资料 完整的肾细胞癌手术病例共3 3 例，手术前患者未经任何抗肿瘤治疗，在 无菌状态下取得手术标本，肾癌手术标本每l 例均包括癌组织、距肿瘤边 缘5 c m 以上正常肾实质组织，直径各约1 0 e r a 两份，1 0 甲醛固定。 2 主要试剂及仪器 a d m 多克隆抗体购于s a n t ac r u z 生物技术有限公司。 c d 3 4 + 多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司。 p v 6 0 0 1 、p v 6 0 0 2 免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。 d a b 显色试剂盒 购自北京中山生物技术有限公司。 切片机德国l e i c a 公司 电热恒温箱重庆实验设备厂 z d l l i b 型医用微波炉上海中达医学应用研究所 i - i z s - h 恒温水浴振荡器哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 研究论文 光学显微镜 电子天平 台式高速离心机 3 研究方法 日本o l y m p u s 公司 德国s a r t o r i u s 股份公司 北京医用离心机厂 3 1 临床资料收集与分析 在收集的临床病例中女性患者6 例，男性患者2 7 例，年龄范围为4 6 7 3 岁，平均年龄6 0 5 岁。在3 3 例肾癌患者中透明细胞癌2 1 例，肾集合 管癌2 例。按照2 0 0 2 年a j c c 的t n m 分期标准，在3 3 例肾癌患者中i 期为2 3 例，i i 期为6 例，期为2 例，期为2 例。 3 2 免疫组织化学染色 将正常的肾脏组织、肾癌组织用1 0 的甲醛溶液固定，石蜡包埋，每 个蜡块切4 v m 厚，一共切片5 张。其中l 张用苏木精伊红( 既) 常规染 色；1 张用o 1g l 磷酸盐缓冲盐水( p b s ) 代替一抗作为阴性对照，以正 常肾上腺髓质作为阳性对照；另外3 张分别用a d m 和e r p r 抗体标记。 在相同条件下应用链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶染色法( s p 法) 染色。 3 2 1 免疫组织化学染色步骤如下： 3 2 1 1 烤片：6 0 烤箱内烤片3 0 分钟 3 2 1 2 石蜡切片：脱蜡至水。二甲苯i 、i i 各十分钟，无水乙醇i 、i i 各五分钟，9 5 乙醇、8 5 乙醇各五分钟。 3 2 1 3 蒸馏水冲洗5 分钟 3 2 1 43 过氧化氢去离子水室温孵育5 1 0 分钟，避光( 消除内源性过氧 化物酶活性) ( 3 0 过氧化氢2 0 m l + 甲醇1 8 0 m 1 ) 预先配好，现配现用。 ( 可延长时间或提高过氧化氢浓度) 3 2 1 5p b s 洗3 次，每次5 分钟 3 2 1 6p h 6 0 枸橼酸抗原修复液进行微波修复。8 0 c5 m i n ，4 0 1 0 m i n ( 修复液倒入槽中，盖上盖子) 放置5 分钟后取出修复盒，室温放置4 5 m i n 以上，让其自然冷却。注意修复液多少，防止干片。抗原修复液配方：柠 檬酸三钠3 9 、柠檬酸0 4 9 、水1 0 0 0 m l 3 2 1 7p b s 冲洗3 次，每次5 分钟 3 2 1 8 滴加一抗：0 0 1 m p b s 稀释一抗，一抗浓度1 ：1 0 0 ，4 。c 过夜。 3 2 1 9p b s 冲洗3 次，每次5 分钟( 可延长冲洗时间) 研究论文 3 2 1 1 0 滴加二抗，室温或3 7 孵育1 0 一3 0 分钟。 3 2 1 1 1p b s 洗3 次，每次5 分钟 3 2 1 1 2d a b 显色： 准备l m l 双蒸水，加入一滴( 约5 0 u 1 ) 试剂a ，混 合均匀，然后将试剂b 和试剂c 各一滴加入其中，再次混匀( 必要时可 过滤此溶液) 现用现配，避光保存，3 0 分钟内使用，剩余弃去。 3 2 1 1 3 自来水充分冲洗 3 2 1 1 4 将切片放入苏木精复染，染色2 分钟 3 2 1 1 5 自来水冲洗后放l 盐酸酒精中分化后立即取出 3 2 1 1 6 自来水冲洗 3 2 1 1 7 放入o 5 - 1 氨水中返蓝3 0 s 后自来水冲洗( 使胞浆胞核蓝色形 成反差) 3 2 1 1 88 5 酒精1 分钟，9 5 酒精i 、i i 各3 分钟，无水乙醇i 、各5 分钟，二甲苯i 、各1 0 分钟 3 2 1 1 9 中性树胶封片。( 盖玻片在醋酸中浸泡处理) 3 2 1 2 0 显微镜下观察 3 2 2 免疫组织化学染色结果判定采用a d m 在肾癌组织染色强弱和阳性 细胞比例结合的方式来描述a d m 的表达水平。 用显微镜观察每张切片肿瘤细胞阳性表达的染色强度及百分比，计算 其平均数。阴性：( 一) ，无阳性着色或着色颗粒细微浅黄，阳性细胞数 5 0 。 3 2 3 统计学处理 应用s p s s1 2 0 软件进行统计学分析，采用# 检验，p 0 0 5 有统计 学意义。 3 3 微血管密度 将正常的肾脏组织、肾癌组织用1 0 的甲醛溶液固定，石蜡包埋，每 个蜡块切4 1 u n 厚切片5 张，l 张苏木精伊红( 髓) 常规染色，1 张用o 1 g l 磷酸盐缓冲盐水( p b s ) 代替一抗作为阴性对照，以正常肾上腺髓质 作为阳性对照，另3 张分别行a d m 和e r p r 抗体标记，在相同条件下 应用链霉菌抗生物素蛋白- 过氧化物酶染色法( s p 法) 染色。 研究论文 3 3 1 免疫组织化学染色步骤如下： 3 3 1 1 烤片t6 0 烤箱内烤片3 0 分钟 3 3 1 2 石蜡切片：脱蜡至水。二甲苯i 、i i 各十分钟，无水乙醇i 、i i 各五分钟，9 5 乙醇、8 5 乙醇各五分钟。 3 3 1 3 蒸馏水冲洗5 分钟 3 3 1 43 过氧化氢去离子水室温孵育5 1 0 分钟，避光( 消除内源性过氧 化物酶活性) ( 3 0 过氧化氢2 0 m l + 甲醇1 8 0 m 1 ) 预先配好，现配现 用。( 可延长时间或提高过氧化氢浓度) 3 3 1 5p b s 洗3 次，每次5 分钟 3 3 1 6p h 6 0 枸橼酸抗原修复液进行微波修复。8 0 5 m i n ，4 0 1 0 m i n ( 修复液倒入槽中，盖上盖子) 放置5 分钟后取出修复盒，室温放置4 5 m i n 以上，让其自然冷却。注意修复液多少，防止干片。抗原修复液配方：柠 檬酸三钠3 9 、柠檬酸0 4 9 、水1 0 0 0 m l 3 3 1 7p b s 冲洗3 次，每次5 分钟 3 3 1 8 滴加一抗：0 0 1 m p b s 稀释一抗，一抗浓度1 ：1 0 0 ，4 。c 过夜。 3 3 1 9p b s 冲洗3 次，每次5 分钟( n - - i 延长冲洗时间) 3 3 1 1 0 滴a n - 抗，室温或3 7 孵育1 0 3 0 分钟。 3 3 1 1 1p b s 洗3 次，每次5 分钟 3 3 1 1 2d a b 显色：准备l m l 双蒸水，加入一滴( 约5 0 u 1 ) 试剂a ，混 合均匀，然后将试剂b 和试剂c 各一滴加入其中，再次混匀( 必要 时可过滤此溶液) 现用现配，避光保存，3 0 分钟内使用，剩余弃去。 3 3 1 1 3 自来水充分冲洗 3 3 1 1 4 将切片放入苏木精复染，染色2 分钟 3 3 1 1 5 自来水冲洗后放1 盐酸酒精中分化后立即取出 3 3 1 1 6 自来水冲洗 3 3 1 1 7 放入0 5 1 氨水中返蓝3 0 s 后自来水冲洗( 使胞浆胞核蓝色形 成反差) 3 3 1 1 88 5 酒精1 分钟，9 5 酒精i 、i i 各3 分钟，无水乙醇i 、i i 各5 分钟，二甲苯i 、i i 各1 0 分钟 3 3 1 1 9 中性树胶封片口( 盖玻片在醋酸中浸泡处理) 3 3 1 2 0 显微镜下观察 研究论文 3 3 2 微血管计数方法 m v d ( m i c r o v e s s e ld e n s i t y ) 判断标准使用鼠抗人c d 3 4 染色，按照 w e i d e rd 蜘的判断标准，任何被c d 3 4 抗体染成棕黄色孤立的内皮细胞或 内皮细胞簇团，只要与邻近微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开，就把 它们作为一个微血管；只要结构不相连，其分支结构也作为一个微血管计 数。血管内径大于容纳8 个红细胞及有肌层的血管也不包括在内。先在低 倍镜( x 4 0 ) 下扫视整个切片，寻找3 个高血管密度区，即“热点 ，换高 倍镜( x 2 0 0 ) ，再观察3 个视野进行计数，取其均值作为m v d 。观察视 野为0 7 3 4 x 3 8 i n z 。 3 3 3 统计学处理 运用s p s s1 2 0 统计软件进行分析。计量资料用( x 士s ) 表示，计量 资料方差不齐，两组间比较用非参数检验，p o 0 5 为差异有统计学意义。 结果 1 免疫组织化学检测a d m 在肾癌组织和正常肾组织中的表达情况 肾癌组织中a d m 在癌细胞中有很明显的标记，阳性表达率为1 0 0 ， 主要定位于癌细胞的外膜和细胞质中( f i g 1 ) ，在大多数的正常肾脏组织 中没有阳性表达，阳性表达率为9 1 。a d m 的表达强度，在肾癌组织中 a d m 的表达强度范围分别为：( 卅) 2 8 例，( + + ) 4 例，( + ) 1 例，( 一) o 例；正常肾脏组织的a d m 表达情况为：( + ) 3 例，( 一) 3 0 例。( t a b l e 1 ) 经卡方检验：表中p e a r s o n = 6 3 ，d f = 3 ，p = 0 0 0 0 0 0 0 1 。按a = 0 0 5 水 准，拒绝h 0 ，接受h l ，故可以认为肾癌组织和正常。肾组织中a d m 的表 达有差别，肾癌组织中a d m 表达强于正常肾组织中a d m 表达( f 嘻2 ) 。 2 微血管密度结果 3 3 例手术标本中观察计算，在肾肿瘤组织中微血管密度值为 4 3 3 9 士7 8 1 ，正常肾组织中微血管密度值为9 7 3 “2 2 。经检验，两样本均 符合正态分布，但方差不齐，所以采用非参数检验，z 为5 0 1 4 ，双侧概 率为p - - 0 0 0 0 0 0 5 ；按a = o 0 5 水准，拒绝h 0 ，接受h l 。可以认为肾肿瘤组 织和正常肾组织中微血管密度值有差别。肿瘤组织中微血管计数明显高于 正常组织微血管计数( f i g 3 ) 。 研究论文 3a d m 在肾癌组织中的表达和微血管密度的相关性 3 1 免疫组织化学检测a d m 在肾肿瘤组织中表达与微血管密度的相关性 将手术标本分类，分为高低表达两组。高表达组包含( 卅) 和( + + ) ， 低表达组包含( + ) 和( ) 。则高表达组中m v d 为4 3 7 8 4 - 7 6 1 ，低表达组 中m v d 为1 0 3 5 - 4 - 5 5 3 。经方差检验，f = 4 2 0 2 6 6 ，p = 0 0 0 0 0 0 5 ，按a = 0 0 5 水准，拒绝h 0 ，接受h l ，实验结果有统计学意义，可以认为人的肾癌组 织中a d m 的表达高低与微血管计数有相关性。a d m 表达越高，则m v d 值越高。 附图 a c b ，q ；。，气； q _ 丸l 一? 、 0 o 飞。 鸳：。： ，一g j ，。t 二- 。一、： - ，0 。时j，、j j 二0 f ：乞1 d f i g 1t h ee x p r e s s i o no fa d mi nk i d n e yc a r c i n o m a p a t i e n t s a s t r o n gp o s i t i v e ( h 斗) bp o s i t i v e ( - h - ) c 研究论文 t 自t il 上广 h u 工 中心 f i g 2t h ee x p r e s s i o no fa d m i nk i d n e yc a r c i n o m at i s s u e sa n dn o r m a l k i d n e yt i s s u e s f i g 3k i d n e yc a r c i n o m at i s s u e so fm i c r o v e s s e lc o u n t 1 3 研究论文 附表 t a b l e1t h e e x p r e s s i o no fa d m i nk i d n e yc a r c i n o m at i s s u e sa n dn o r m a l k i d n e yt i s s u e s 达 强阳性中度阳性弱阳性阴性 企斗 口- ，i 组别 + - h -+ + 肾肿瘤组 2 841o3 3 正常肾组o o33 0 3 3 、 合计 2 8443 06 6 1 4 研究论文 讨论 肿瘤( t u m o r ) 是机体在各种致癌因素的作用下，局部组织的某一个细胞 在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的 新生物。一般它分为良性和恶性两大类：一般的良性肿瘤对机体的影响较 小，主要是表现为局部压迫和阻塞症状；而恶性肿瘤由于分化不成熟，生 长较快，浸润破坏器官的结构和功能，并可能发生转移，因而对机体影响 很大。它的发生发展最重要的是需要依靠新生的血管，肿瘤细胞从一个很 小的个体生长到一定大的体积，紧依靠营养物质和代谢废物的单方面的播 散是远远不够的，因而毛细血管的形成为肿瘤的营养吸收及代谢起到了非 常重要的作用。肿瘤生成中的另外一个重要因素就是提供足够的血液，从 而扩张血管和生血管物质的产生和分泌则成了肿瘤生长的一种非常重要 的方式。 近年来随着对肿瘤分子生物学的不断深入研究，越来越多的学者发现 肿瘤在宿主的体内有着诱导血管的生产能力，肿瘤血管形成是多因素的， 血管生长因子与抑制因子的平衡失调，触发血管形成“开关 ，引起新生血管 形成。其中起重要作用的是肿瘤细胞分泌的血管生长因子。实体肿瘤的发 展一般需要经历两个时期：血管形成前期和血管形成期。在血管形成前期， 肿瘤不分泌或极少分泌血管生长因子，不诱发血管形成，因此肿瘤的体积几 乎不增长，基本上不发生转移。当肿瘤诱发宿主微血管增殖，则进入血管形 成期，肿瘤细胞群迅速增加，肿瘤体积增大，并且有潜在的转移倾向。新生血 管的生成则是恶性肿瘤的生长、浸润与转移的前提之一。肿瘤细胞本身和 浸润到肿瘤组织内及其周围的炎细胞( 主要是巨噬细胞) 能产生一类血管 生成因子，这些血管生成因子促进血管内皮细胞分裂和毛细血管出芽生 长。这些新生的毛细血管则是一个很多因素相互影响的过程，许多促血管 生成因子和抑血管生成因子相互作用，相互调节，共同形成了新生的毛细 血管。这些新生的毛细血管既为肿瘤生长提供营养，又为肿瘤转移提供了 有利条件。而微血管密度( m i c r o v e s s e ld e n s i t y ，m v d ) 则是血管生成的金 标准，用相关抗体使血管上皮细胞着色，证实血管密度与肿瘤潜在的转移 性相关，故微血管密度可作为一个可靠的预后指标 1 0 l 。 血管活性肽是一类调节血管平滑肌细胞舒缩功能，维持血管张力的小 研究论文 分子肽类物质，人的体内有许多的缩血管肽和舒血管肽，而肾上腺髓质素 ( a d m ) 则是近年来新发现的一种血管活性肽，研究证实a d m 具有多 种生物活性，参与体内多种生物学过程，它有促进细胞有丝分裂和心血管 形成、减少细胞凋亡、舒血管降血压的作用 i i 1 2 1 ，在体内分布广泛，是 一种多肽类物质1 1 3 1 ，是肿瘤的发生发展和转移过程中的一个很重要的因 = 系。 肾上腺髓质素( a d r e n o m e d u l l i n ，a d m ) 是由日本的科学家k i t a m u t 【1 4 1 等人在人的嗜铬细胞瘤中分离出来的一种新的活性多肽，因为它在肾上腺 髓质中含量最高故而得名。经过药理学研究表明，a d m 与其受体结合后 可以激活腺苷酸环化酶，使细胞中的c a m p ( 环磷腺苷酸) 含量升高，这种 作用呈现剂量依赖趋势 1 5 1 6 1 它可以提高细胞内c a 2 + 浓度诱导血管舒张 并激活内皮细胞的一氧化氮( n o ) 合酶n 7 l 引；a d m 还可以激活m a p k 信号转导通路以促进细胞有丝分裂n 蛇羽。s a t o 眨3 1 等发现在培养的心肌细 胞中加入a d m 可以导致细胞内c a _ v i p 的积累，且成计量依赖性，并随后 抑制a n p 激活的表达。w i t h e r sd j 阱1 等报道a d m 可以诱导s w i s s 3 t 3 鼠 成纤维细胞的d n a 合成和细胞增殖并呈剂量依赖性，胰岛素可以进一步 提高这种反应，这种反应受c a i p 介导的肾上腺髓质素特异性受体和蛋 白激酶a 调节。a n d r e i sp g 2 卯等研究发现，肾上腺髓质素能够通过c g r p 途径刺激鼠肾小球系膜细胞增殖，而非认为的c a m p 途径。w i t h e r sd j 眩4 1 等证实a d m 可以通过c a m p 途径促进s w i s s 3 t 3 鼠纤维母细胞有丝分裂， 实验提示促进肿瘤生长浸润的机制有可能是由a d m a d m r 的自分泌系 统起作用的。肾上腺髓质素具有抑制免疫反应作用，蛋白人补体因子h 主要由肝脏产生，可以调节肾上腺髓质素的浓度和活性，并与肾上腺髓质 素的清除有关2 6 , 2 刀。在其他的细胞如单核巨嗜细胞、成纤维细胞、内皮 细胞、星形胶质细胞中也能发现补体因子h ，它是一种很重要的补体系统 调节因子，它提高肿瘤细胞的存活率的作用是通过抑制细胞溶解实现的。 功能性的细胞溶解分析表明：抗补体因子h 抗体能够提高补体介导的几种 肿瘤细胞系的杀伤能力，而肾上腺髓质素能增强这种作用。p i o r 等眈6 1 研究证实，补体因子h 能够增进肾上腺髓质素介导的人乳腺癌细胞系的 生长。h a g u e s 等2 8 1 研究发现，肾上腺髓质素在子官肌瘤中的表达同肿瘤 的血管密度呈正相关，肾上腺髓质素可增加肿瘤细胞侵袭力。s h e r e e n 研究论文 k e l e g 2 钉等研究发现肾上腺髓质素可增加胰腺癌癌细胞的侵袭力。 a d m 属于降钙素基因相关肽( o g r p ) 家族，人体的a d m 由5 2 个氨 基酸组成，第1 6 位和第1 2 位为半胱氨基酸，形成一个由二硫键组成的含 有6 个氨基酸残基的环状结构。a d m 在体内广泛分布，用免疫组化等方 法可见在嗜铬细胞瘤、肾上腺髓质、肺脏、肾脏、脾脏、十二指肠、颌下 腺、心脏、脑、胰岛等部位b 有大量的a d m 。其中在肾上腺髓质中含 量最高。生理状态下，血管内皮细胞和血管平滑肌细胞合成分泌大量的 a d m 3 l 3 加，近年来，许多研究表明a d m 与恶性肿瘤关系密切。m i l l e r 等b 3 1 首先报道，通过他们对各种组织( 如肺、肠、乳腺、卵巢、前列腺、脑、 软骨、血液) 来源的人体肿瘤细胞的实验研究，发现a d m 是人肿瘤细胞 的自分泌生长因子，9 5 的肿瘤细胞中能够产生a d m ，并且发现有几种肿 瘤如乳腺癌、细支气管肺癌等能够被纯化的单克隆抗体抑制，并且这种抗 体的抑制作用可以随着外源性的a d m 的增加而被消减。而s a t o hf 和 z i m m e r m a n n ub 4 3 发现在脑肿瘤中和神经细胞的肿瘤中有表达，并且通 过研究发现在多种组织如肾上腺髓质、肺、肠道、前列腺等中的细胞癌中 亦有表达 3 6 1 0o e h l e r 等在研究a d m 在血管平滑肌细胞生长中的作用中 发现，a d m 可以作为一种生长促进因子，它可以通过与细胞表面相应受 体结合，通过酪氨酸激酶和有丝分裂原活性蛋白激酶信号转导途径，起到 促进细胞有丝分裂及抗细胞凋亡的作用。同理，a d m 也可以通过其自身 调节机制在恶性肿瘤的发生发展中起到促细胞增殖的作用，可能的机制为 通过自分泌旁分泌促进肿瘤的生长3 7 3 9 】。 1a d m 在肾癌组织中的表达 应用免疫组化的方法j o u g a s a k i 发现4 呲蛋白主要存于肾小球， 皮质远端小管和髓质集合管，随后o w a d a 和j e n s e n 等用逆转录聚合酶链 反应( i m p c r ) 和r t - p c r 结合核酸酶保护分析方法也证实了在上面的 部位有a d m 的表达。l a ih 3 1 等在培养的人肾细胞观察了a d m 的基因转 录和蛋白合成情况，结果发现a d m 可以定位于肾小球系膜细胞，毛细血管 内皮细胞和肾小管细胞。而在