（分析化学专业论文）毛细管电泳和化学发光联用方法的研究.pdf

摘要 毛细镑电泳( c e ) 分离技术因其分离效率高、分离速度快、样品消耗小、 分离装置简单和操作成本低等优点，成为一种强有力的分离分析技术，特别是对 复杂化合物的分离更具有显著的分辨能力。但c e 采用极小的样品体积和极细的 毛细管内径，使光度检测法的浓度检出限变麓。化学发光( c l ) 检测的一个主 要特性是它的光路系统简单便宜，不需要光源，这样就避免了杂散光和光源不稳 定的彩晌，从而使它的背景低，灵敏度高。同时，c l 是实现小体积，在线检测 豹理想方法，主要是癌予它翡凝痖遮度茯，允许在裙对大体积酌流动滟中袄速裣 溅焉不会产生因为体积大嚣带寒懿嚣带惩宽。c l 浆这整饶点傻宅更接近瑾想静 检测体系，因藤号l 起广泛豹硬突。 本论文在蕞细管电泳化学发光联用研究工作的基础上，提出了一秘麓单霹 熊的联用梭测体系，并对其作了改进。反应管的改进是用改性聚四氯乙烯管作反 应管，与毛细管作反应管比较，前袭的分离效率不如毛细管的好，但分离度并不 麓，同时由于管子的透光性好，发光检测的横截面积比毛细管的大，所以检测到 的信号比詹者强。同时，使用这种柔软的管予做反应管插接容易，接口处的气泡 翁排除，使体系简单稳定。高电位端缓冲池的改进将含鲁米诺缓冲液的高电位池 与电椴沲分隔开，解决了支持缓、辟液中鲁米诺电解造成的发光信号的漂移问题； 低窀像端缓、挣滚静改进楚密盈端采雳流动隔离潼，纯学反巍君翡废液能及拜于撵 走，不污染缓冲溶液。戬上两方霞致进霹避免发走试裁鹃撰耗窝延长缓滓滚使蠲 时藤。与蕺缨謦电泳躲紫於吸收检测法翘毙，c e - c l 法款浓度捡出眼改善了掰 个数量级；整个体系篾单稳定，能够应用于实际样晶分辑。 采用此联用系统和鲁米诺铁氰化钾间接化学发光法，分离绿原酸和芸褥萤， 与毛细管电泳紫外吸收法比较，毛细管电泳- 化学发光法的梭出限达到1 4 l o 。 m o l l ，比琵细管电泳紫外吸收法改善约2 个数量级。实验中发现基体对化学发 光有抑制作用，使被抑制的化学发光基线形成类似于高斯型分布，而我们的标准 溶液的谱圈的基线无基体千扰。分析原因发现，样品基体是有色的电中性物质， 在电泳中不能祷翻分离，褥是发生扩散，产生类似离新燮的化学发光帮箭背景信 号，分析物的化学发光反应的抑制信号叠加在它的上面，影响我们的分析检测。 因此我们采用标准加入法并对其背景进行手工描绘扣除，得到回归方程具有良好 的线性相关系数，分析物的含量符合烟叶中的含量范围。 i l a b s t r a c t c eh a sb e c o m eo n eo ft h em o s tp o w e r f u ls e p a r a t i o nt e c h n i q u e sf o rt h ea n a l y s i so fc o m p l e x s a m p l e s f o ri tc r np r o v i d eh i g hs e p a r a t i o ne f f i c i e n c y ，f a s ta n a l y s i sv e l o c i t ya n dl o wo p e r a t i o nc o s t c o m p a r e d ，h o w e v e r , t h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t yo f c ei ss t i l la c h a u e n g ei np r a c t i c eb e c a u s eo f i t s m a n i p u l a t i o nw i t ht i n ys a m p l ev o l u m ea n ds m a l lc a p i l l a r yi n n e rd i a m e t e r c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) i sah i g h l ys e n s i t i v ed e t e c t i o nm e t h o d i ti sc h a r a c t e r i z e db ys i m p l ec h e a po p t i c a ls y s t e m s r e q u i r i n gn ol i g h ts o u r c e s ，w h i c ha v o i dt h ee f f e c t so fs t r a yl i g h ta n dt h ei n s t a b i l i t y o ft h el i g h t s o u r c e ，a n dt h u sp r o v i d i n gl o wb a c k g r o u n dw i t he x c e l l e n ts e n s i t i v i t yc o m p a r a b l e t ot h a to f l i f c li s i d e a l l ys u i t e d t ol o w v o l u m e ，o n - l i n ed e t e c t i o nb e c a u s eo ft h ef a s tk i n e t i cn a t u r eo fc l r e a c t i o n s ，a l l o w i n gf o rr a p i dd e t e c t i o n i n r e l a t i v e l yl a r g ev o l u m ef l o w - c e l l sw i t h o u tt h eb a n d b r o a d e n i n ge x p e c t e df r o ms u c hv o l u m e s s oc o m b i n i n gc l w i t hah i g h - p e r f o r m a n c es e p a r a t i o n t e c h n i q u e c a na c h i e v eb o t ht h eh i g h l ya n a l y t i c a ls e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y a s i m p l ea n d r e l i a b l ec e - c l s y s t e mw a sd e v e l o p e d o nt h er e s e a r c h e si nt h i sp a p e r m o r e o v e r i t sb u f f e rr e s e r v o i r sw e r ei m p r o v e d t h ea m e l i o r a t i o no ft h eh i g hp o t e n t i a lb u f f e rr e s e r v o i rc a n o v e r c o m et h ec ls i g n a le x c u r s i o n ，w h i c hr e s u l t e df r o mt h ee l e c t r o l y s i so fl u m i n o li nr u n n i n g b u f f e r t h ei m p r o v e m e n to f t h el o wp o t e n t i a lb u f f e rr e s e r v o i rc a l lp r e v e n tt h ec o n t a m i n a t i o no f t h e r u n n i n gb u f f e rf r o mt h ec l r e a c t i o nw a s t e a sar e s u l t ，t h ec e - c l s y s t e mc a nr e t a i nt h es t a b i l i t y o fc l b a s e l i n e ，a v o i dt h ee x c e s s i v ec o n s u m p t i o no f t h ec l r e a g e n ta n dp r o l o n gt h ew o r k i n gt i m e o ft h ee l e c t r o d eb u f f e rs o l u t i o n t h ep r o p o s e dc e - c ls y s t e mw a sa d o p t e df o rt h es e p a r a t i o na n d d e t e r m i n a t i o no fc h l o r o g e n i ca c i da n dr u t i nw i t ht h ei n d i r e c tc h e m i l u m i n e s c e n c eo fl u m i n o l * p o t a s s i u m f e r r i c y a n i d e t h ed e t e c t i o n l i m i to f c e c l i s1 , 4 x 1 0 一m o l l ，w h i c h i sa b o u t 2o r d e r o f m a g n i t u d e sb e t t e rt h e n t h a to f c e u v t h ei m p r o v e dc e - c l s y s t e mw a s u s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f c h l o r o g e n i ca c i da n dr u t i ni n c i g a r e t t es a m p l e s w i t h t h e i n d i r e c t c l o f i u m i n o l - p o t a s s i u m h e x a c y a n o f e r r a t e w i t h t h eo p t i m i z e d c o n d i t i o n so f c ea n dc l ，t h ed e t e c t i o nl i m i to f c h l o r o g a n i ca c i da n dr u t i nw a s2 2 x i 0 m o l la n d n i 1 3 x l o m o l l ，r e s p e c t i v e l y t h es y s t e m h a v eb o t h h i g h l ya n a l y t i c a ls e n s i t i v i t y a n d g o o d s e l e c t i v i t y ，m o r e o v e ri t i s s i m p l e a n df a s t ，s oi ti su s e dt od e t e r m i n et h et w op o l y p h e n o l s s u c c e s s f u l l y i v 致谢 本论文是程导师赵化章老师和何友昭老师的悉心指导下完成的。 感谢赵老师在这一阶段的精心指导和谆谆教诲。他勤勉治学，求真务实，精 益求精静工作态度，使我无论在科研工作还蔻今瑶的工作学习中都受菔匪浅。何 老帮蔻接搔导我翡磷究工作，德开拓的憨维、严谨静学风和对科轿工佟的亥苦奉 献壤毒睾是我在季嘻黟 工作孛的壤季孛动力，德乎茹近入憝态度和瓣我瓣严格要求使我 体会到科磷工髂的艰辛帮乐趣，培葵了我良好戆科硬态度，让我不魅感激。 谯实验期闻，我们实验室的扬藤、甓其暖、赵要强、马强，王蓥，邓宁、房 莉、张召香、许庆平、胡艳云和李云等团结合作，创造了积极进取、共同进步、 和谐愉快的科研氛围，他们在我的科研工作和生活中给了极大的帮助和支持。在 此表示深深的谢意。 同时感谢槎华老师及她实验室的学生的热心帮助。 还要感谢我周围所有箕德的老师和同学的关心和帮助，让我的这一段学习期 闻留下许多美爵的醋亿。 最螽，感谢筏父母幕羹妹妹，德稍鹣激黝_ 稻支簿，是我战羧一留困难和承蕊面 对生港载糖李孛滚泉积罄强螽霪。本论文凌献给健稍。 娄会黼 2 0 0 3 5 7 中国科学技术大学碗士学位论文 第一颦绪论 第一章绪论 第一节毫细管电泳的发展 1 1 弓f 言 毛细瞥电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，简称c e ) 是7 0 8 0 年代迅速发展起 来的类新型的电泳和色谱相结合的分离分析技术，具有分离效率高、分析速度 袄、样品粥董少、应用范围广等特点，穗成为9 0 年代重要的高教分离手段，在 生物、仡学、藩蓊、环保、食晶等领域交有缀鼢酌应瘸前景。毛缅管魂泳和高效 液柱魏谱( h p l c ) 都楚滚榛分离技术，崮予宅靠j 遵循不鼹的分离瓤理，豫了其有 囊己的特点孙鼹老奁缀大程度上可以互为李 兖。但是无论放效率、速度、榉晶越 量程成本来说，毛缨蟹电泳都照示了定的优势。与h p l c 姻比，毛缨管魄泳蛉 柱效璺高一些，速度更快些；同时，它的样品用魑仅为h p l c 的于分之，且 溶剂消耗量极小，又没有泵输运系统，因此成本相对较低。麓细镑电泳具备许多 分离模式，通过改变其缓冲液成分、添加剂和柱型，毛细管电泳有很大的选择性， 可以根据不同的分子性质( 诸如大小，电荷数，手性，疏水性等) 对极广泛的对象 邂行有效的分离。相比之下，为达到类似的目的，h p l c 要消耗许多价格昂贵的 柱子和溶裁。 罨缨警龟泳辩原理并不复杂，裔晶饺器静结构也很简单：通瀚包括一个高压 源，一棂毛缨管，一个检测器潋及瑟令供琵缨管嚣溺插入盈又霹釉毫滚裙遘豹缓 砖滚贮檀，输出傣号秘记彖装鬟。感者霹默是一个蒋逶熬记蒙纹、积分佼也霹越 是寅控镱4 功能的计算机工佟蛄。装受的示意如匮l 。l 麟示。 申蓦辩掌技术丈学鞭士学位论文 第一章绪论 避口漶 1 2 电泳发展简史1 1 】 围l1 毛绷管电裱彖意图 出鲻遣 电泳怒带电粒予在嘏场作用下以不同的速度向与举电粒子的电旖相反方向 的电极迁移的现象，利用这种现象对化学或生物化学组分进行分离分桥的技术称 之为电泳技术。电泳技术莉很多种，通常按照电泳实验条件中的某一特征来命名。 蓿按照电泳所使用的载体来命名，可分为自由溶液电泳、凝胶电泳、纸电泳等； 若以电泳支持物的形状或位置命名，分为u 型电泳、柱状电泳、板状电泳等： 还有怒按照原理命名的，如区带电泳、等电聚焦电泳、等速电泳、免疫电泳等。 这歪所讨论静毛细管电泳泛指在裰纲的葱缅管内实现韵一大类电泳分离技术。 1 8 0 9 年，俄国物理学家p e 薤c e 首次发魂逛泳现象，腻托电泳作为一种分离 按零爨理，蠢透露年瓣历史。键真正技李燕俸一蕈孛在生物耱生物纯学中鸯重要意义 的分离技术，则是在1 9 3 7 年幽瑞典科学家a 。t i s e l i u s 营淼提爨的。恁剑造了 t i s e l i u s 电泳仪，弗和他的圊事们第一次成功的从人敷瀵中分亵出熬蛋篷以及珏l 、 c 【2 、p 和y 球摄自等五种蛋白，并建立了移动界蕊电泳方法。由于a t i s e l i u s 对电泳技术发展和应用的杰出贡献，使他成为1 9 4 8 年诺贝尔化学奖的得主。 但是a t i s e l i u s 移动界面电泳分辨率有限，而且魄泳过程产生的焦耳热使 自由溶液受热后发生密度变化，产生对流，导致区带扰乱，因此在5 0 年代以后， 出现了各种抗对流支持介矮，如滤纸，醋酸纤维素，琼脂凝胶和淀粉凝胶的区带 彀泳。1 9 5 9 年，r a y m o n d 和w e i n t r u b 剥箱入工合成的凝胶作为支持介质，剖造 了蒙秀燔酸黢凝胶电泳，极大戆提离了嚣带电泳豹分辨率。诧后凝胶电泳在理论 葶珏实验上有了缀犬酶发展，被广泛盛弱予生携大分子戆分离。 6 0 年代规，s v e n s s o n 挺出t 妻然p n 梯度豹理论，即裂建宅场使嚣性邀瓣震 2 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章绪论 产生一个稳定的“自然”p h 梯度，v e s t e r b e r g 合成了具有s v e n s s o n 预言性质的 脂肪族多氨基多羧酸，这种两性电解质的合成，使等电聚焦( i e f ) 技术有了很 大的发展，并已成为一种广泛采用的分离和制备技术。 6 0 年代后期，m a r t i n 和e v e r a e r t s ，k o n s t a n t i n o v , o s h u r k o v a 和o m s t e i n 分别 独立地解决了不连续介质电泳的理论与装置等问题，使等速电泳取得了突破性进 展。7 0 年代后期，商品仪器的问世，使等速电泳研究及应用得以广泛展开【2 。 开管毛细管电泳是h j e r t e n 在1 9 6 7 年首先报导的【3 】。对于毫米级内径的毛细管， h i e n c n 采用沿轴向旋转的方法以使对流影响降低到最小。后来v i r t a n e n 4 】以及 m i k k e r s 5 先后分别在约2 0 0 岫内径的玻璃或t e f l o n 毛细管中进行电泳。目前 所淡及的那种在细管径毛细管内实现电泳的开创性工作是由j o r g e n s o n 、l u k a c s 6 l 在1 9 8 1 年首先提出的。它们使用7 5g m 内径，1 0 0 c m 的玻璃毛细管在3 0k v 的 高压下进行电泳，获得了数十万理论塔板数的高分离效率，并阐明了其理论，描 述了操作条件与分离效率的关系，证明了毛细管电泳作为分析技术的潜力，使该 技术有了突破性进展。同时他们还就分离的机理、高电场和小内径对高分离效率 的决定性影响等问题进行了讨论。 1 9 8 4 年，t e r a b e 等 7 】引入了毛细管电泳的一个重要分支，将离子型表面活 性剂胶束引入毛细管电泳中，以胶束作为分配相，使电中性物质可以通过在胶束 相和水相的分配不同达到分离，从而发展了毛细管电泳的新分支毛细管胶束 电动色谱( m i c e l l a re l e c t r o k i n e r i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y , m e c c m e k c ) ，提高 了分离选择性，扩大了毛细管电泳的应用范围。 1 9 8 7 年h j e r t e n 等 8 】把传统的等电聚焦过程移到毛细管内进行，提出了毛细 管等电聚焦( c a p i l l a r y i s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，c i e f ) ，同年，c o h e n 和k a r g e r 9 发表了 毛细管凝胶电泳的工作( c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) ，1 9 8 8 年r o s e 和 j o r g e n s o n 1 0 。首先提出了毛细管电泳作微量制备的可能性，实现了5 0 1 0 2 m o l 的蛋白质和肽的毛细管电泳提取。与此同时，z a r e 和他的同事把激光引入毛细管 电泳检测器，使之在提高灵敏度方面做了重要工作。 。 1 9 9 0 年，j o n e s 和j a n d i k 等【1 1 】首次报道了无机离子和小分予离子的毛细管 电泳分析，提出了毛细管离子分析法( c i a ) 。 以1 9 8 9 年2 月在美国波士顿召开的第一届国际毛细管电泳会议和在此前后 串蕃辩学拄术大学萌士学位论文 第一章绪论 出褒鹃第一搅筏缨镑窀溶藩晶仪嚣为代表，在8 0 年彳弋盾麓出珑了全瞧界范围瀚 大援模关予毛缨管魄泳靛硬究秘盛愿工l 睾【1 2 】，麓来，有a 把这瓣麓称之为分 离科学个薪时代熬开始【1 3 】。从t 9 8 9 年到1 9 9 4 每连续六属重躲毛缨管魄泳会 议和1 9 9 3 年，1 9 9 5 年遣续鼹届全国毛细管电泳会议上看出 1 4 】，有越来越多躲 原来从事识谱研究的学者参与了这一工作，他们充分考虑到匿细餐电泳和色谱谯 理论、技术和功能上的相似性，从各自原有的基础出发，迅速地对毛细管电泳技 术开展了大量的研究，从而极大地推动了这一分离技术的发展 1 3 电泳中的一些基本理论 索。 在毛细管电泳中，电泳、电渗、焦耳热和区带展宽等都是影响分离的重要豳 1 3 1 电泳 电泳( e l e c t r o p h o r e s i s ) 分离是基于缀分狂电场下的迁移速度不同恧进行鲍。 葡电离子在外加电场强度e 作用下，会向相反电荷极性电极定向迁移，其电泳迂 移速度v c 。为： v 旷p e ( 1 1 ) 球形离子淌度。为： ，。南 ( 2 ) 式中，q 为离子电荷电量， 1 为介质粘度，r 为表观液态动力学半径。 由此可见，荷电离子的电泳速度除了与井加电场和介质特性有关外，还与粒 子豹有效电荷戳及粒子静大小和形状有关。离子的有效电荷、形状及大小的麓异， 导致它靛静逛泳满废熬不溺，擒残窀泳分离鹃基穑。 4 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章绪论 1 3 2 电渗 电渗( e l e c t r o p h o r e s i s ) 是外加电场和管壁溶液双电层的共同作用而产生的 溶液的整体移动，其大小与毛细管壁表面电荷密度有关。对石英毛细管来说，在 一般情况下，由于硅羟基( s i o h ) 电离成s i o ，使管壁表面带负电，为了保持电 荷平衡，溶液中对离子( 在一般情况下是阳离子) 被吸附到表面附近，形成了双 电层。当在毛细管两端加电压时，双电层中的阳离子向阴极移动，由于离子是溶 剂化的，所以带动了毛细管中整体溶液向阴极移动。石英的准确p k a 值难以测 定，但在p h 大于3 时，电渗不可忽视。 电渗在各种电泳模式中均存在，但在c e 中由于采用了细内径的毛细管，毛 细管的表面体积比较大，因此电渗显得特别重要。 电渗流( e o f ) 速度v 。的大小决定于电渗淌度。和电场强度e v e o = u e 0 e ( 1 3 ) 电渗淌度。与介质溶液性质及双电层的z e t a 电势有关： p 。= ( o 亏) ( 1 4 ) 芎= ( 4 r r s e ) ( 1 5 ) 式中o 为真空介电常数，为介质溶液介电常数，t 为双电层的z e t a 电势，e 为毛细管内壁扩散层单位面积的过剩电荷数，6 为扩散层厚度，其大小与溶液的离 子强度和电价有关。 由上可知，影响e o f 速度的主要因素有电场强度、管壁z e t a 电势和溶液特 性。而e 电势受管壁的材料和表面特性的影响，也受介质溶液的组成及性质的影 响。 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章绪论 1 3 3 焦耳热 在细内径毛细管中进行电泳与常规电泳比较主要是减少了焦耳热的影响。焦耳 热会引起温度梯度和粘度的变化( 粘度梯度) ，从而引起区带的扩展。而理论上导 出的柱效和分离度的方程要求尽可能地使用高电场强度。但焦耳热的产生使高电 场使用受到限制。 焦耳热是由于电流通过电泳介质而产生，其大小取决于功率( 电压和电流乘积) 的大小，与毛细管尺寸、缓冲溶液电导率及电压等有关，当产生的热量超过耗散 的热量，温度将明显升高。c e 中产生的功率一般为o 5 5 w m ，可能引起温度升 高达1 0 c 或更高。 仅仅是温度的升高除了可能破坏样品外，温度梯度对分离不利。热从毛细管壁 扩散，因此在毛细管中心的温度高于毛细管壁的温度。温度梯度一方面可能导致 密度梯度，产生自然对流，而对流会使已分离样品区带重新混合，使柱效降低； 另一方面会引起缓冲溶液的粘度变化，从而引起径向电泳迁移改变，导致区带展 宽。一般来说，温度每变化l c ，粘度或电泳淌度变化2 3 。 1 3 4 影响柱效的因素 在毛细管电泳中，两个电泳区带的分辨率与区带宽度有关，而区带宽度在很 大程度上取决于扩散过程。由于扩散会使区带加宽，引起分辨率降低，因而需要 控制。由公式： ：盟：坐( 1 6 ) 2 d 2 d 当l z ，时5 。关 ( 1 7 ) 2 d 、 。 式( 1 7 ) 表明，高电场可使柱效增加，这是因为在高电场下溶质在毛细管中 的时间短，扩散小，当毛细管总长与有效长度接近时，柱效与柱长几乎无关。 除了纵向分子扩散和焦耳热温度梯度引起区带展宽的因素外，主要还有进样 区带长度，溶质与毛细管壁的相互作用等，而这些因素通常是可以控制的。用系 6 中国科学技术大学硕士学位论文 熊一章绪论 统总方差( 1 8 ) 来描述所有分散因素度区带增宽的影响，于是 0 2 t = 0 2 d i 0 2 1 n j - i - 0 2 t e m p + ( n 2 a d s + 0 2 e l e + d 2 d e t 十0 2 0 t h ( 1 8 ) 式中右边各项脚标分别标是扩散、进样、温度、吸附、电分散、检测和其它。 表1 1 列出了几种限制焦耳热和温度梯度的方法。 表1 1 控制焦耳热和温度梯度的方法 方法作用 降低电场强度热量成比例降低 减低柱效和分辨率 减少毛细管内径电流大大降低 降低灵敏度 可能引起样品吸附的增加 减少缓冲溶液离子强度或浓度电流成比例降低 可能引起样品吸附的增加 温度控制恒温并有效地转移毛细管中的热量 毛细管电泳( c e ) 分离技术因其分离效率高、分离速度快、样品消耗小、 分离装置简单和操作成本低等优点，成为种高效的分离分析技术，特别是对小 体积样品更具有显著的分辨能力。但c e 采用极小的样品体积和极细的毛细管内 径，使光度检测法的浓度检出限变差，限制了c e 的广泛应用。 第二节化学发光 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c l ) 【1 8 】可定义为由化学反应而导致的一种 光发射现象。此化学反应至少需要两种反应试剂( a 和b ) ，反应产生一电子激 发中间体或产物c ，小部分处于电子激发态的产物c + 驰豫回到基态时，产生光 子。 一+ 曰一c + 一c 十h v ( 1 9 ) 或将能量传递给另一分子来发光。他们的能级是通过荧光现象来识别的，只是化 7 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章绪论 学发光与荧光的激发模式不同。一般只有放热的反应才能产生所需的能量。因此 c l 试剂大多数是氧、过氧化氢、或其它可能的氧化剂。 光激发的强度取决于化学反应的速度，从基态到激发态的量子产率和激发态 发光的量子效率等。 与荧光检测法相似，化学发光法也可通过衍生法将非化学发光的分子转换成 化学发光物。由于c l 不需要额外的光源，光路系统简单。从而使仪器微型化。 由于不存在吸收检测法中的强背景光，所以减小了背景信号，改善了检出限。 c l 被称为“暗场技术”就是因为它在相对暗的背景光下产生光信号，这样，小 背景下的微小光变化比大背景下的光变化易观测。原则上，荧光计的光电倍增管 在其灵敏的光谱范围内，只需要关掉荧光计的激发光源，就能用该仪器来检测 c l 。虽然如此，化学发光仍然有许多缺陷。由于c l 试剂可与多种分析物反应， 因此选择性差。同时，c l 发射还受环境的影响，比如温度、p h 值、离子强度、 溶剂和溶液组成等。另外，c l 反应的光强随着时间发生变化，发光信号在试剂 混合后就开始产生，不断增强至最大值后又逐渐减小至基线。并且c l 的发光强 度时间曲线对不同的化合物变化很大，因此化学发光在流动相中信号的检测 一定要控制在发光的周期内。 第三节毛细管电泳和化学发光的联用技术 3 1 引言 目前，研究c e 的高灵敏检测技术是c e 发展的重要课题。常用的c e 高灵敏检 测技术有荧光法，电化学法和质谱法等，一个理想的c e 检测器应具有以下特点： 1 设计简单，组装费用低。2 高分辨率和高灵敏度。3 对大多数分析物 通用。4 不需要其它化学反应的直接分析。5 检测不受c e 分离高压的影响。 目前u v _ v i s 检测是c e 中最常用的检测方法，它的应用广泛，费用低j 不 需要衍生测定的样品种类多。它的主要缺陷是光检测灵敏度较差，动态范围小， 浓度检出限通常受到在柱检测体系的光程短和样品通过检测池的时间短的影响。 c e 的电化学检测池的灵敏度不依赖于样品的体积，所以能得到高灵敏度的 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章绪论 检测。然而需要把极高的分离电压有效地与检测区隔离开。另外，电极的表面污 染也是实际样品分析时的一个严重问题。 c e 的激光诱导荧光检测( l i f ) 已被采用，这主要是由于它的灵敏度高、检 出限一般在a m o l f m o l 范围 5 7 1 9 2 1 。然而，它的设备费用额外昂贵，而且需 要采用把荧光基团标记在非荧光分析物上的柱前或柱后衍生技术。 c e 的c l 检测法研究得相对较少，然而c l 的许多优点使它更接近理想的检 测体系，因而引起广泛的研究。c l 检测的一个主要特性是它的光路系统简单便 宜，不需要光源，这样就避免了杂散光和光源不稳定的影响，从而使它的背景降 低，检出限改善。同时，c l 是实现小体积，在线检测的理想方法，主要是由于 它的反应速度快，允许在相对大体积的流动池中快速检测，减小因为体积扩散而 带来的影响f 8 ，9 ，2 2 2 3 。只要c l 的反应速度足够快，分析物在大量扩散到周围 溶剂前使发光快速发生并结束，这样依然能得到相当窄的峰宽。这就是所谓的 “化学窄带”效应。就目前大量的有关文献报道表明人们对此检测法具有很大的 兴趣，在这方面已做出了许多工作。这里我们总结前人的报道，详细介绍c e c l 的几种接口技术和在c e c l 中应用的c l 试剂。 3 2c e c l 中使用的接口 3 2 1 概述 c e c l 法的仪器组装相对简单，由于它不需要光源，检测部分般只需要 光电倍增管即可。然而，c e 中的c l 反应需要在线引进一种或两种发光试剂到 反应体系中，这样在c e c l 的接口设计中，分析物和c l 试剂的混合方式和检 测池的体积大小是取得良好分离效果和灵敏度的关键。同时c e 分离的p h 条件 与c l 反应的p h 值间的相容性在设计中也要严格地考虑。基于柱后流体的混合 模式不同，接口设计可分为合并流，共轴流和池混合等方法。同时根据检测器的 位置分为离柱，在柱和柱端检测等方法。 9 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章绪论 3 2 2 离柱合并流接口 z h u 和z h a o 2 4 在1 9 9 0 年首先介绍了c e 的c l 检测系统，他们用的是离柱 混合流动接口。此体系的结构图如图1 2 。用一内径为o 6 5 m m ，外径为1 0r n n l ， 长7 0c m 的玻璃毛细管旋管作c l 检测的流动池。c l 试剂和c e 流出液在分离毛 细管口通过四通的两个管道简单地混合后再引入反应毛细管来检测。通过把地电 极放在电解质缓冲液中，使其与c l 反应液通过半透膜隔离。检测区接到第四管 道上，接近混合端的下游，在此工作中使用4 0 0 岬i d 的聚四氟乙烯管作为c e 的分离毛细管，流动池的容积与其它的池子的相比也大很多( 大约1 9 8 9 l ) ，但 这并不影响分离度，这主要是由于c l 试剂的流速高达1 3 m l m i f f l ，使用大体积 的流动池也提高了灵敏度，报道的丹磺酰牛血清白蛋白的检测限为1 0 f m o l ，分 离效果达到1 8 1 0 5 理论塔板数。 3 2 3 在柱共轴流接口 d a d o o 等人在19 9 2 年系统地研究了在柱共轴流动c l 检测体系 2 5 1 ，此接口 以后被广泛应用，系统结构图如图1 3 。 将分离毛细管的出口端共轴插入到内径稍大的反应毛细管中，用三通固定 电泳毛细管、试剂引入管和反应毛细管。反应管烧去一段聚酰亚胺涂层作为检测 窗，试剂管引入的发光试剂在反应毛细管中形成环绕电泳毛细管的一段液流套。 分析物、发光试剂在电泳毛细管出口处( 一般为阴极端) 相遇，进行化学发光反应。 高压电源的地电极接在反应管的低电位缓冲池中来完成c e 的电回路。 该接口存在的缺点是( 1 ) 当分析物和c l 试剂共轴从电泳毛细管移入内径较 大的反应管并与发光试剂混合时，会引起轻微的扰动，产生涡流扩散，导致峰增 宽，从而柱效降低；( 2 ) 发光试剂与分析物混合不够均匀稳定，影响重现性；( 3 ) 发光试剂的流速需与分离管中分析物的流速相匹配。如果发光试剂流速太快发 光不充分，检测到的信号不完全，影响峰高或峰面积。反之则因滞留在检测窗口 中的时间太长而造成峰增宽。 1 0 主璺型兰垫查盔堂堡主兰堡垒塞兰二要! ! 鱼 g a o h b i 泵 f i g 1 2 a ：s c h e m a t i cd i a g r a mo f o f f - c o l u m nm e r g i n gf l o wi n t e r f a c eu s e di nc e - c l a b u f f e rr e s e r v o i r ； b s e p a r a t i o nc a p i l l a r y ；c f o u r - w a yc o n n e c t o r ；d m i x i n gc o i l ；e c lr e a g e n tr e s e r v o i r fp m td e t e c t o r ；g r e s t r i c t o r b ：s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h et i e - i n a s e m i p e r m e a b l em e m b r a n e ；g c a p i l l a r yt ob u f f e rr e s e r v o i r h s e p a r a t i o nc a p i l l a r y ；i i n l e to f c lr e a g e n t ；0 o u t l e to f c lr e a g e n t 。( a d a p t e df r o mr e f e r e n c e 2 4 】) 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章绪论 h ie t r - c a t a l y 5 t r e s e r v o lr v 0 1 t 包e e d o 啦r s u p p l 7 文叁瘩薏 一e 卜eaction j 郴囊，船罕 b u f f e r d u f f e r r e s e r l ，o i r r e s a z l r o ir d a t a o u t p u t f i g 1 3 s c h e m a t i cd i a g r a mo f o n c o l u m nc o a x i a lf l o wi n t e r f a c eu s e di nc e c l ( a d a p t e df r o mr e f e r e n c e 【2 5 】) d a d o o 2 5 等人使用的这种体系与c h e n g 等人 2 6 - 2 9 使用的体系很相似，两 体系的唯一不同之处在于d a d o o 等人把反应毛细管放在抛物镜的焦点上。用聚 焦透镜来提高输出到p m t 上的光强而c h e n g 等人将p m t 直接放在反应毛细管 前。w h a n g 等人使用的接口 3 0 - 3 i 】，r u b e r t o 和g r a y e s k i 2 2 】，w u 和h u i e 【3 2 】 使用的接口与上面的结构相似，只是他们把电泳毛细管直接插入到反应毛细管 中，不蚀刻也不需要另外的聚光和光反射。h a r a 等人在他们早期的文献中使用 四通代替图1 - 3 中的三通 3 3 3 6 来容纳c l 反应中的试剂和缓冲液。后来，他们 发现缓冲溶液不需要专一的通道，采用三通代替了四通，从而使灵敏度得到了提 高 3 7 3 9 。 尽管在柱共轴流与c e 分离的结合简单而被广泛使用，但c l 试剂是在高压 下引入的，这样同时也影响它的稳定性和流动性。试剂柱后引入分离毛细管一定 要防止溶液的反迁移，否则将观察不到化学发光。同时，有些试剂，如h 2 0 2 易 电分解成气体，这也会降低c e c l 体系的反应效果。这些缺陷在c l 的离柱检 测体系中将避免，主要由于离柱检测中c l 反应不受电解影响。 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章绪论 3 2 4 离柱共轴流接口 为了避免前面介绍的在柱检测存在的不相容性和在c e c l 荚轴流动体系中 使用c l 有机试剂与电驱动分离系统之间的不匹配，w u 和h u i e 3 2 在c e 分离后 一适当时间关掉c e 电源并在c l 反应阶段将毛细管与一注射泵联接来控制试剂 的动态流出。此方法虽然能将丹酰标记的三种氨基酸完全分离并成功检测，但操 作复杂且分离度有所降低。 后来，l e e 和w h a n g 4 0 发展了一种离柱共轴流动体系不需要断开h v 电源 ( 图，1 4 a ) ，他们将电场从c l 反应检测区隔离开，与z h u 和z h a o 2 4 的混合 流接口相似。但他们的不同之处是用多孔聚合物接口，通过用醋酸纤维素将分离 毛细管检测端切断，再涂层连接，此部分毛细管垂直粘到塑料瓶中，并使毛细管 的一小段伸出瓶底。瓶内充满缓冲溶液，并将接地电极浸入其中，此装置使c l 检测与c e 分离电位分隔开。这种检测法虽然避免了在柱检测系统中遇到的问题， 但缺点是需要e o f 来推动分析物流经接地的多孔接口。由于接口后无电泳分离 作用，分离效率会降低。此体系的另一特性是分离毛细管通过p t f e 管壁上的小 洞直接插入到管中，不需要使用任何的三通或交叉接口。高锰酸盐的化学发光使 用过此体系。 z h a n g 4 1 等人使用的另一种离柱共轴流动检测的设计与此不同。用四通接 口代替了多聚物接口( 图，1 4b ) 防止了在检测过程中由于h 2 0 2 的水解形成的 气泡的影响，四通中一端与浸入到c l 试剂中的接地电极相连。地电极从检测端 的下游( 在柱检测) 移到上游显著提高了检测效果。此体系在碱性介质中，即使 相当高浓度的h 2 0 2 也可使用，并不影响分离和检测。虽然离柱检测法能有效地 避免c l 试剂电化学分解的影响，但在一些使用中，试剂迁移到分离毛细管中仍 存在许多困难，因为在毛细管端口依然受到电解的影响。 3 2 5 柱端池接口 此接口设计的最重要特征是将c l 试剂直接放在柱后贮池内，电泳毛细管浸 中罾科学技术大学硕士学位论文 第一章绪论 入到贮遣淘，c l 发炎在亳细管末端产生并检测，可以霜p m t 直接放置在遥端 4 2 】 域用毙终掇必传递绘p m t 4 3 ，4 4 。粪羹电缀可戳塞接敖鹫在贮渣内辫1 5 。弱d a d o o 嚣人f 4 3 】和b a r n e t t 等人【4 2 】贫绥约掇戗。此结构弱优点是餐矮易毒亍，瞧搂除了试 蠢u 流与e o f 之间的不相匹配。缺点是耀光导纾维收集兜售号鸯撰失，峰璞宽懿 主要原因怒检测区域较大【3 4 】和发光反应速度慢等g l 起的区媸展宽。丽且挂后贮 池内的溶液需要经常更新以确保c l 试剂的浓度恒定。最近，h a s h i m o t o 等人 4 4 】 用光纤( 接到p m t 上) 在柱端贮池c e c l 系统中收集发光并详细研究了光纤与 毛细管端韵相对位置的影响。当单一光纤直接正对着放在毛细管出口端相距o 3 土o 0 5 m m 时，发现l u m i n o l 的化学发光强度比用两个光纤垂蕴放驻( 1 r a m ) 在毛 维管蠢口灞得至豹强t 0 0 倍。两者之问的不同可能是由于第一种设计中毛细管的 浚出泼壹羧与必绎戆溃表嚣碰撞达戮更好的混合。孺在第二释静设计中正稻反， 漩出滚垂由黔淡出光终端，贮溅中含膏静分辨镪与试裁达不戮有效韵混合。 1 4 中国科学技术大学磺士学德论文第一章绪论 b c l r e t l e n t e c t l ，e i e l t l r t o r y h o 。5 s i 8 1 2 蔷 h i 盎 v o l t e e ；a 、融y # r 0 搬 d i n l t e r 0 4 e n t i o z t p h o t 。u li 警 荔荔蚕产第学逛岢“掣1 h ” r e ct e fj = l t l le ril j 孰t 如￥ t l u t e z e s e w o ir f i g 1 4 。s c h e m a t i cd i a g r a mo nw o r k i n gp r i n c i p l e so f o f f - c o l u m nc o a x i a lf l o wi n t e r f a c eu s e di n c e c l ( a ) i n t e r f a c ew i t hp o r o u sp o l y m e r j o i n t ( b ) i n t e r f a c ew i t haf o u r - w a yc o n n e c t o ( a d a p t e df r o mr e f e r e n c e ( 4 0 】a n d 4 l 】) t oh i e h v o l t e t e e l e c t r