（果树学专业论文）苹果果实中苹果酸代谢关键酶基因的克隆和表达分析.pdf

英文缩写符号及其中英文对照表 英文缩写英文名称中文名称 a c r y l a m i d e 丙烯酰胺 a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e a m p i c i l l i n a m m o n i u mp e r s u l f a t e n n - m e t h y l e n eb i s a c r y l a m i d e b a s ep a i r c o m p l e m e n t a r yd n a c e t y l t 血m c t h y l a m m o f l o n i u mb r o m i d e c y t o s o l i cm a l a t ed e h y d r o g s c d i s t i l l e d a n td c i o n i z e dw a t e r d a y sa f t e rf a l lb l o o m d i e t h y lp y r o c a r b o n a ：c c d e o c y r i b o n u c l e o s i d e ；r i p h o s p h a l e d i e t h i o t h r e i t o l e s c h e r i c h i a c o l i 鼬i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n et e t r c e t i ca c i d h 0 嗍i 血珏 n g a l a 咖s i d c k a r m m y c i n l u r i a - b c m a n im e d i u m 3 - ( n - m o l p h p l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i c m a l i ca c i de b z y m e m e s s a g er n a s o d i u ma c e t a t e n o n i d c tp - 4 0 p o l y a c r y l a m i d eg e le i e c 岫) p h o r e s i s p o l y m 日a s ed m i i lr e a c t i o n 腺苷三磷酸 氨苄青霉素 过硫酸胺 亚甲基丙烯酰胺 碱基对 互 f d n a 十六烷基三乙基溴化铵 细胞质型苹果酸脱氢酶 重蒸水 盛花期后天数 焦碳酸二乙醑 脱氧核糖核苷三磷酸 二硫苏糖醇 大肠杆菌 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 异丙基廿喇i 代半乳糖苷 卡那霉素 l b 培养基 3 - n 吗啉代丙磺酸 苹果酸酶 信使r n a 醋酸钠 润湿剂p - 4 0 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 船册挪鹏盖印一一一一：一町一髓一哪：曼m一曼|一腿 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： 日期： 山j 寨农业大学硕士学位论文 中文摘要 苹果( 1 a l u sd o m e s t i c ab ) 是世界上最重要的鲜食和加工果品之一 目前，我国已成为世界上最大的鲜食苹果和苹果浓缩汁生产国，但加工原 料多是含酸量较低的鲜食苹果，浓缩汁产品酸度不高，使其在国际市场上 价格竞争力较低。生产上迫切需要发展酸度高的加工品种。为了研究苹果 酸度的调控机制，本文克隆了苹果酸代谢和储藏过程中4 个关键酶基因的 全长或部分c o n a ，并对其进行了表达分析。主要结果如下： 1 从苹果果实中克隆了细胞质n a d p - m e 基因m - m e ( g e n b a n k 注册 号；d q 2 8 0 4 9 2 ) 、液泡膜t p a s ea 亚基基因j 泖谨卅( g e n b a n k 注册号：e f l 2 9 0 3 3 ) 和液泡膜w - p e a s e 基因m - p p i ( g e n b a n k 注册 号：d q 9 8 9 3 3 5 ) 的全长c d n a 序列，以及p e p c 基因的部分e d n a 序列。 1 ) m - m e 编码区全长2 0 4 8b p ，编码一个含有5 9 0 个氨基酸残基 的蛋白质，估计分子量大小为6 4 9 8k d ，预测等电点( p i ) 为5 9 。m - m e 与其它植物n a d p - m e 的同源性在9 0 以上，含有5 个与n a d p 结 合有关的高度保守区。 2 ) m v a - a 编码区全长1 8 7 2b p ，编码一条6 2 3 个氨基酸残基的多 肽链，分子量约6 8 9k d 。m v a 。a 与拟南芥、番茄、胡萝卜、棉花、 绿豆等草本植物的同源性均高于9 0 ：与梨、桃、蜜橘等果树的同源 性达到9 5 以上，其中和梨的同源性高达9 9 2 0 0 ，仅有6 个氨基酸 残基存在差异；其氨基酸序列中存在一段富含甘氨酸的保守序列 g a f c g k t ( 2 5 2 - 2 5 9a a ) 3 ) m - p p i 编码区全长2 2 8 0b p ，编码一条7 5 9 个氨基酸残基的多 肽链，分子量约7 9 4k d 。m - p p i 与拟南芥、水稻、大麦、玉米、绿 豆、桃、梨、葡萄等陆生植物的同源性都在8 0 以上，含有 d v g a d l v g k v e ( 2 4 6 - 2 5 6a a ) ，t e y y t s ( 4 1 5 - 4 2 0a a ) 和g d l l g d ( 7 1 5 7 2 0a a ) 三个保守序列。亲水性分析发现存在1 4 个跨膜区。 4 ) p e p c 的e d n a 片断长3 0 8 4b p ，含有y - p o l y ( a ) 尾巴，同 预计e d n a 全长相差1 1 0b p 左右，推导氨基酸序列同其它物种有较高 苹果果实中苹果酸代谢关键酶基因的克隆和表达分析 同源性。 2 p e p c 在高酸基因型果实中的转录水平随着果实发育趋于下降，在低 酸基因型果实中其转录水平趋于增加。两种基因型之间相比较，花后 3 0 - - - 9 0 天该基因在高酸果实中的转录显著高于低酸果实，而花后 9 0 1 5 0 天两种基因型之间的差异不明显。 3 m - m e 在高酸基因型果实中转录水平随着果实发育趋于降低；在低酸 基因型果实中，其转录呈双峰曲线，分别在花后6 0 和1 2 0 天出现两 个转录高峰。花后6 0 1 5 0 天m - m e 在高酸基因型果实中的转录水平 直低于低酸果实。 4 删一在高酸基因型果实中转录水平逐渐降低；而低酸基因型果实 中该基因的转录水平趋于增加。花后3 0 - - 6 0 天，高酸基因型果实中 m 翻一的转录水平显著高于低酸果实；但在花后9 0 - 1 5 0 天，高酸基 因型果实中该基因的转录水平则低于低酸果实。 5 m - p p i 在高酸基因型果实中转录水平随着果实发育趋于降低；在低酸 基因型果实中，其转录水平一直维持在一个较低水平。就两种基因型 而言，m - p p i 在高酸基因型果实中的转录水平一直高于低酸果实 6 重组载体p e t 3 0 a - m e 转化表达菌株b l 2 1 后，用i p t g 诱导表达一条 约6 6 k d 的融合蛋白，诱导8 h 后其表达量最大 关键词：苹果( m a l u sd o m e s t i c ab ) ；果实酸度；苹果酸代谢关键酶；荧 光定量p c r 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t a p p l ei so n eo f t h em o s ti m p o r t a n tp r o c e s s i n ga a dt a b l ef r u i t sw o r l d w i d e c h i n ai st h e l a r g e s tc o u n t r yw h i c hp r o d u c e sf r e s h ya p p l e f r u i t sa n d c o n c e n t r a t e da p p l ej u i c ei nt h ew o r l d h o w c v c r , w ea s t i l lf a c i n g1 3 e m e r g e n t r e q u i r e m e n tf o rs p e c i a lp r o c e s s i l a gv a r i e t i e sw i t hh i 曲a c i d i t y i no r d e rt o i n v e s t i g a t et h em e c h a n i s mo fm a l i ea i c da c c u m u l a t i o ni na p p l ef r u i t s , w e c o n d u c t e ds 0 1 1 1 er e s e a r c h e so ns e v e r a ll c e yg e n e si n v o l v e di nm a l j ca c i d m e t a b o l i s ma n da c c u m u l a t i o n n 忙r e s u l t sf i l es h o w na sf o l l o w s 1 i s o l a t i o na n ds e q u e e n oa n a l y s i so f4k e yg e n e si n v o l v e di nm a l i ca c i d m e t a b o l a i s m 耶把c o m p l e t ec d n a s e q u e n c eo f n a d p 小征 ，v 二a r p a s es u b u n i t a 。 v - p p a s ea n dp a r t i a ls e q u e n c eo fp e p cw e r ei s o l a t e df r o ma p p l ef r u i t m o t i f a n a l y s i sa n da l l g n m e n to f p r e d i c t e da m i n oa c i ds e q u e n c ei a d i e a t e a t h a tt h o s es o , q u c n c e $ w e p u t a t i v ec a n d i d a t e s m f u l l - l e n g t hc d n ao f 地凇c o n t a i n e da2 ，0 4 8b po r fe n d i n g a5 9 0a m i n oa c i d 1 1 壕p ia n dm o l e c u l a rw e i g h to ft h ep r o t e i nw m5 9 a n d6 4 9 8k d ，r e s p e c t i v e l y c o m p a r e d 、 i t ho t h e rp l a n th o m o l o g si n g b 锄km 加s h o w e dl l l o l t 把t h a n9 0 i d e n t i t ya ta m i n o - a c i dl e v e l e s p e c i a l l yu p 协9 5 w i t he a s t o r - o i lp l a n t f i v en a d p b i n d i n gm o t i f s e x i s t e di n i - m 匪a m i n oa c i ds e q u e n c e 1 1 把f u l m e n g t l ac i ) n ao fm v a - 4c o n t a i n e dal ，8 7 2b p0 i 礤w h i c h e n c o d e da6 2 3a ap r o t e i nw i t he s t i m a t e dm o l e c u l a rw e i g h to f6 8 9l d 睫 c o m p a r e d w i t ho t h e rp l a n th o m o l o g si ng e n b a n k , m v a as h o w e dm o l e t h a n9 0 i d e n d t y 缸t h ea m i n o - a c i dl e v e l e s p e c i a l l yw i t hh o m o l o g si n f r u i tt r e e ss u c ha sp y r u se o m m u n i s 、p r u n u sp e r s i c a 、c i t r u sa n ds oo n , t h e i d e n t i t ye x c e e d e d9 5 a n d r e a c h e d9 9 。批w i t h i y r u sc o l l l m u l 】i sf r o mt h e 跚es u b f a m i l y n 把h i g h l ye o m e r v e ds e q u e n c eg a f o c g k t ( 2 5 2 - 2 5 9 a a ) a l s op r e s e n t e di nm 、， - aa n l i l l oa c i ds e q u e n c e 1 1 圮f u l l - l e n g t he d n a o f m - - p p ic o n t a i n e da2 2 8 0 - b p0 r f t b eo r f e n c o d e da7 5 9 - a m i n o - a c i dp r o t e i nw i t he s t i m a t e dm o l e c u l a rw e i g h to f 7 9 4 k d c o m p a r e dw i t ho t h e rp l a n th o m o l o g si ng e n b a n k , m p p i s h o w e dm o r et h a n8 0 i d e n t i t yi na m i n oa c i ds e q u e n c e t h r e ec o n s e r v e d s e q u e n c e sd v g a d l v g k v e ( 2 4 6 - 2 5 6 a a ) 、t e y y t s ( 4 1 5 - 4 2 0a a ) a n d g d n g d ( 7 1 5 7 2 0a a ) a l s op r e s e n t e di nh i _ p p il t m i l l oa c i ds e q u e n c e a 3 0 8 铀p p a r t i a l c d n a o f p e p c w a s c l o i l e d a n d a b o u t1 1 0 b p f a r t o 3 苹果果实中苹果酸代谢关键酶基因的克隆和表达分析 t h es t a r tc o d o na t qt h ei n f e da m i n oa c i dw a sh i g h l ys i m i l a rw i t hi t s h o m o l o g si no t h e rs p e c i e s 2 t h ct r a n s c r i p t i o no f 饱p cw a sd o w n - r e g u t a t e dg r a d u a u yw i t hf t u i t d e v e l o p m e n ti nh i g h - a c i df r u i t , w h i l el e v c r s er e s u l t sa p p e a r e di nl o w - a c i d f i l l i t i t st r a n s c r i p t i o nw a s1 1 i g h 朗i nl l i 咖a c i d 奇i l i tt h 锄i nl o w - a c i do n e f r o m3 0t o9 0d a b w h e r e a sn oo b v i o u sd i f f e r e n c ef r o m9 0t o1 5 0 3 i nh i g h - a c i df r u i t , m - m ea a n s c r i p t sd e c r e a s e d g r a d u a n yw i t hf r u i t d e v e l o p m e n t h o w e v e r , t w op e a k sa p p e a r e da t6 0a n d1 2 0d a bi n l o w - a c i df r u i t i t st r a a s c r i p t i o nw a sa l w a y sh i 衄i nl o w - a c i d 砌tt h a ni n h i g h - a c i do n ef r o m6 0t o1 5 0 d a b 4 啊豫t r a n s c r i p t i o no f m v a - ae x h i b i t e dd i f f e r e n tp a t t e r ni n2g e n o t y p e s 。i e ag r a d l l a li n c r e a s ei nh i g h - a c i df i - u i tb u tag r a d u a ld e c r e a s ei nl o w - a c i do n e a c c o r d i n g l y , i t st r a n s c r i p t i o nw a sh i g hi nh i g h - a c i df r u i tf r o m3 0t o6 0 d a bw h e r e a si tw a sh i g hi nl o w - a c i do n ef t o m9 0t o1 2 0 5 n 圮t r a n s c r i p t i o no f 扣p p fe x h i b i t e dad e c r e a s i n gt r e n dw i t hd e v e l o p m e n t o fh i g h - a c i df r u i t , w h i l ei nl o w - a c i df x u i t , i td e c r e a s e da 矗盯a n i n c r c a s e m e n t i t st r a n s c r i p t i o ni nh l g h - a c i df r u i tw a sh i 曲e rt h a nt h a ti n l o w - a c i do n ed u r i n gd e v e l o p m e n t 6 1 1 l er e c o m b i n a n tp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nc o n s t r u c tp e t 3 0 a - m e p m o d t t c c d a6 6k df u s i o np r o t e i ni ne c o i lb l 2 l k e yw o r d s ：a p p l e ( m a l u sd o m e s t i c ab ) ：f r u i ta c i d i t y ：k e ye 1 1 z y m eg e n e s i n v o l v e di nm a l i ca c i dm e t a b o l i s m ：r e a l - t i m e q u a n t i t a t i v ep c r 4 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 苹果( m a l u sd o m e s t i c ab ) 是世界上栽培规模最大、产业化水平较高 的温带落叶果树之一。根据f a o 公布的数据( h t t p ：f a o s t a t f a o o r g ，2 0 0 6 ) ， 2 0 0 5 年世界果品总产量5 1 亿吨，其中苹果6 3 4 9 万吨，占水果份额的8 0 我国是世界最大的苹果生产国，2 0 0 5 年苹果总产量达到2 5 0 0 万吨，占世 界苹果总产量的3 9 4 ；面积达到2 2 0 万公顷，占世界苹果总面积( 5 2 4 8 万公顷计算) 的4 1 9 。苹果浓缩汁是世界上规模最大的苹果加工产品， 我国经过2 0 年努力已经成为世界最大的苹果浓缩汁生产国，目前全国苹 果汁加工能力已达到3 1 7 0 吨d , 时，每天可加工苹果量6 万吨，2 0 0 4 0 5 榨汁加工鲜苹果近5 0 0 万吨，生产浓缩汁7 2 万吨，有利支持了苹果生产。 鲜苹果和苹果浓缩汁也是我国参与国际市场竞争的优势农产品。根据 商务部统计数据( h t t p ：w w w m o f c o m g o v e n t o n g j i z i l i a o ) ，2 0 0 6 年，我 国鲜食苹果出口量达到8 0 4 万吨，价值3 7 2 亿美元；同时，苹果浓缩汁 出口持续大幅度增加，达到6 7 _ 3 万吨，占世界贸易量的一半以上，价值 5 9 5 亿美元，单价突破8 8 0 美元，吨，产品主要出口美国、德国、日本、俄 罗斯等发达国家由此可见，苹果产业在我国具有重要的经济地位，已经 成为我国农村脱贫致富奔小康的支柱产业之一 我国苹果浓缩汁的快速发展是建立在鲜食苹果大规模发展的基础上 的，加工原料基本是鲜食苹果残次果及等外果。目前生产上苹果主栽品种 以富士系、元帅系、嘎啦系、金冠等为主，其中富士品种占据苹果总产量 的6 0 以上由于我国消费者对水果风味的选择偏甜而较少喜好酸，因此 苹果主栽品种也基本上以甜苹果为主，然而加工苹果浓缩汁希望有偏酸的 品种，浓缩汁含酸量越高价格越贵，由于我国加工企业以富士、秦冠、元 帅系及金冠等的残次果为原料加工出来的浓缩汁产品酸度不够，在国际市 场上不具有价格优势。因此，迫切需要培育出适合加工并且具有自主知识 产权的酸苹果，以满足我国苹果加工业的需求。目前，对植物体内有机酸 的相关研究主要集中在光合作用和植物胁迫应答方面，很少有人研究果实 中有机酸代谢和积累模式在苹果( v i s s e r ，1 9 7 8 ：m m i e p a a r d ，1 9 9 8 ) 上的 研究表明果实的低酸性状由一对主效基因控制，该主效基因与苹果酸代谢 关键酶基因是否存在关系，目前尚一无所知。 苹果果实中苹果酸代谢关键酶基因的克隆和表达分析 1 1 植物体中有机酸代谢及功能 植物体中有机酸主要在线粒体中产生。通过三羧酸循环( 1 a c 循环) 生成一系列有机酸，主要包括：柠檬酸、异柠檬酸、小酮戊二酸、琥珀酸、 延胡索酸、苹果酸、草酰乙酸等。 植物体中有机酸的跨膜运输主要涉及线粒体膜、液泡膜和细胞质膜3 个膜系统。线粒体中生成的有机酸首先穿过线粒体膜进入细胞质，一部分 有机酸参与细胞必需的生理生化反应，如葡萄糖、脂肪酸、胆固醇和蛋白 质等大分子物质的生物合成，其余部分优先存储在液泡中。在线粒体膜上 有机酸和其它辅助因子通过许多专一性转运蛋白进出线粒体，如草酰乙酸 载体和小酮戊二酸载体。液泡膜上也存在着有机酸运输载体或通道，而且 此过程需要消耗a t p 。o l e s k i 等( 1 9 8 7 ) 对番茄果实中柠檬酸和苹果酸跨 液泡膜运输机理研究表明柠檬酸和苹果酸的跨膜运输需要消耗a t p ，具有 动力饱和特性，推测柠檬酸主要以渗透性c i t r a t e 3 的形式通过主动扩散进 入液泡，以非渗透h 2 - c i t r a t e 或m g - c i t r a t e 的形式贮藏在液泡中此外， 有机酸还可以通过质膜上专门的载体蛋白运出细胞质，转移到韧皮部，再 经过长距离运输至达果实等库器官j 植物体中有机酸参与光合作用c 0 2 固定，例如：c 4 植物叶肉细胞中磷 酸烯醇丙酮酸( p e p ) 在磷酸烯酵丙酮酸羧化酶( p e p c ) 催化下生成草酰 乙酸( o a a ) ，然后o a a 脱羧生成苹果酸( m a l ) ，m a l 通过胞间连丝转移 到维管束鞘细胞，释放出的c 0 2 进入卡尔文循环；夜间c a m 植物在细胞 质中合成m a l ，m a l 暂时储存在液泡( 苹果酸库) 中，白天m a l 再释放c 0 2 进入卡尔文循环。三羧酸循环中生成的有机酸参与其它代谢途径，如葡萄 糖、脂类和蛋白质等大分子物质的生物合成。有机酸主要以渗透性c i w a t e 3 的形式进入液泡，因此可以提高细胞液的缓冲能力；还可以调节渗透压， 维持细胞膨压，提高植物在逆境条件下的适应能力。此外，有机酸在应对 营养缺乏和环境胁迫( 孙瑞莲，2 0 0 6 ) 方面起到重要作用。研究还表明外 施有机酸对于改善土壤微环境，促进种子萌发、延缓叶片衰老，提高作物 产量和质量等方面也有一定的作用( k o d a m a ，1 9 8 3 ；n e l e m a n s ，1 9 9 0 ； 啦，1 9 9 3 ；k p o m b l o k o u ，1 9 9 4 ；王向阳，1 9 9 5 ：刑雪荣，1 9 9 5 ；胡红 青，1 9 9 9 ；周春菊，1 9 9 9 ) 。有机酸在食品、医药、化工、建材等领域也 山东农业大学硕士学位论文 具有广泛的用途( 刘建军，2 0 0 3 ) 。 1 2 苹果果实中有机酸代谢 1 2 1 苹果果实中有机酸的种类 有机酸种类和含量是影响果实风味品质的重要因素。苹果属于苹果酸 型果实，苹果酸是苹果果实中主要的有机酸( h u l m e ，1 9 7 1 ：陈发兴，2 0 0 5 ) 在成熟果实中苹果酸占有机酸总量的8 0 以上( 刘金豹，2 0 0 4 ) ，还有少 量的琥珀酸( 4 ) 和草酸( 5 ) 。此外，乙酸、酒石酸和柠檬酸等有机酸 的含量非常少，合计不到有机酸总量的5 ( 赵尊行，1 9 9 5 ) 。h u l m e 和 r h o d e s 在苹果果实中检测到1 6 种有机酸( h u l m ea n dr h o d e s ，1 9 7 1 ) ，可 见苹果果实中有机酸种类相当丰富。 1 2 2 苹果果实发育过程中有机酸含量的变化 苹果果实在生长发育过程中可滴定酸含量持续下降，果实成熟期趋于 稳定i 可滴定酸含量达到最低水平( 魏建梅，2 0 0 5 ) 。苹果果实中总酸含 量变化和苹果酸含量变化一致( 辛玉成，1 9 9 6 ) 。在不同的品种和不同的 裁培方式下，苹果果实中苹果酸含量存在明显差异，一般苹果酸含量高的 品种总酸含量也高( 刘金豹，2 0 0 4 ) ：同一品种在不同发育阶段苹果酸占 有机酸总量的比例也发生变化，由早期的8 9 降低到后期8 0 ( 姚玉新， 2 0 0 6 ) 1 2 3 苹果果实中苹果酸代谢途径 苹果果实酸低酸性状虽然由一对主效基i 天l ( m a m a ) 控制，但果实中苹 果酸的积累最终还是要通过苹果酸代谢来实现，只不过高酸品种和低酸品 种苹果酸积累模式不同。在苹果上n a d - d e p e n d e n tm a l a t ed e h y d r o g e n a s e n a d - m d h ；e c i 1 1 3 7 1 ( m n l ，1 9 9 8 ) 和p h o s p h o e n o lp y r u v a t ee a r b o x y l a s e p e p c ；e c4 1 1 3 1 】( c h o u e te ta l ，1 9 9 6 ) 是苹果酸合成途径中最关键的两 个酶。细胞质n a d p - d e p e n d e n tm a l i ee 血z y m c n a d p - m e ；f _ x 31 1 1 4 0 】 ( r u f f n e r ，1 9 8 2 ) 控制苹果酸的降解。研究表明，植物细胞中存在液泡膜 r ：- a a p a s e 和i - l + - p p a s e 两种类型的质子泵，为有机酸跨液泡膜运输系统提 供驱动力( 陈兴发，2 0 0 5 ) 。苹果果实中苹果酸的积累主要是通过液泡贮 藏的形式，目前机制还不是很清楚。液泡型w - a t p a s e v - a t p a s e ；e c 7 苹果果实中苹果酸代谢关键酶基因的克隆和表达分析 3 6 1 3 】( r a t a j c z a k ，2 0 0 0 ) 和液泡型h y r o p h o s p h a t a s e v - p p a s e ；e c 3 6 1 。1 。】( m a e s t l i r n a ，2 0 0 0 ) 被认为在有机酸的运输过程中起到了关键作 用。 围l - l 果实中有机酸积累的简单模型( e t i e n n ee ta l ，2 0 0 2 ) f 嘻1 - 1t h es i m p l em o d e l 血o w i n gt h ei n v o l v e m e n to f t h ec a n d i d a t eg e n e s ”l 舶= d t oa c i d i t yi nt h em a i n p a t h w a y sc o n d i t i o n i n gs u g a ra n do l g a n i ca c i da c c u m u l 址i n ni nf i u i t s t p , 甄l 口雠t r a c s p o r t e r ；i n v , i n v c n t a s e ；s u s , w “l s y n l h a s e ；s d h , s o r b i t o ld e h y d r o g c o a s e ；s o x , s o r b r o lo x y d a s e ； 珏0h e x o l 6 n a s e ；i e i c , p h o s p h o o x p y m v a t ec b o x y l a s e ；吼n a d - d e p e a d e n t m a l a t ed e h y d r o g c o a s e ；、d v 扯u l o r r - 口a 辩；v p , w c o l o rf f - i r y r o p h o s p h a t a s e ；a c o , a c o n i t & s e ；m b m a l i c c o z y m e ；i c d h , n a d p - d e p e n d e n t i s o c i w a t e d e h y d r o g e n a s e 苹果果实中苹果酸代谢主要涉及以下方面( 圈1 1 ) ：叶片( 源器官) 通过光合作用制造光合产物，然后经过韧皮部运输到果实( 库器官) 一 部分蔗糖通过质膜上的蔗糖一i r 共运输载体直接进入果肉细胞，也有一部 分蔗糖被细胞壁蔗糖酶分解为葡萄糖和果糖等己糖，而山梨醇可以直接进 入果肉细胞。进入细胞的蔗糖在蔗糖酶的催化下生成己糖( 葡萄糖和果糖 等) ，山梨醇在山梨醇脱氢酶和山梨醇氧化酶的催化下也生成己糖，一部 分蔗糖和己糖进入液泡储藏起来；在细胞质中己糖通过糖降解途径生成磷 酸烯醇丙酮酸，磷酸烯醇丙酮酸经过磷酸烯酵丙酮酸羧化酶( p e p c ) 催化 山东农业大学硕士学位论文 生成草酰乙酸，草酰乙酸经n a d - 苹果酸脱氢酶( n a d - m d h ) 催化生成 苹果酸。一部分苹果酸进入线粒体三羧酸循环，经过电子传递和氧化磷酸 化最终生成a t p ，为其它代谢途径提供能量；一部分苹果酸做为生物合成 的前体物质；也有一部分苹果酸储存在液泡中，液泡膜上的质子泵为苹果 酸等有机酸的跨膜运输提供驱动力( ln t g c ，1 9 9 3 ) 。 1 3 苹果果实酸低酸性状遗传研究 普遍认为苹果果实中苹果酸含量由多个基因控制，但酸低酸性状由一 对主效基因控制。n y b o m 、v i s s e r 、李宝江、刘志、姚玉新等一致认为苹 果果实含酸量由一对主效基因( m a m a ) 和其它多基因控制，主要受基因 的加性效应控制，隐性纯合体( m a m a ) 表现为低酸，但对m a m a 之间的显 性程度观点不一致。目前，对苹果果实酸度性状遗传的研究主要是通过果 实含酸量的表型值来迸行分析，一部分人认为m a 对m 口表现为完全显性， 显性纯合体和杂台体表现为高酸或中酸是受加性多基因作用的结果 ( m a n g a n a d sc ta l ，1 9 9 4 ：m a r k u s s e ne ta l ，1 9 9 5 ) ：也有人认为m a 对m a 不完全显性，显性纯合体表现为高酸，杂合体表现为中酸，在同一酸型内 株系间表现出的连续性的酸度差异，则是多基因控制的结果( c h e n g ，1 9 9 6 ) 。 因为早期p h 指示器稳定性和实用性比较差，依据表型得出的结论并不可 靠( v i s s e ra n dv e r h a e g h ，1 9 7 8 ) 。在分子水平上，m a l i e p a a r d 等利用p r i l n a 9 和f i e s t a 的杂交后代将m a 基因在遗传连锁图谱上进行了定位。姚玉新 ( 2 0 0 6 ) 利用9 l 株东光和富士的正反交f l 代群体测定了果实不同发 育阶段苹果酸含量，从表型上分析了苹果酸的遗传规律；并利用1 4 0 对共 显性遗传的s s r 引物对高酸和低酸群体进行标记分析。 其它物种上的研究表明果实的低酸性状由一个主效基因控制，如番茄 ( s t e v e n s ，1 9 7 2 ) 、$ e ( y o s h i d a ，1 9 7 0 ) 、葡萄( b o u b a l s ，1 9 7 1 ) 、柚子( c a m e r o n a n ds o o s t ，1 9 7 7 ) 等。虽然它们积累有机酸的种类和模式各不相同，但每一 种有机酸的低酸性状都由一个主效基因控制( s t e v e n s ，1 9 7 2 ；f a n g ，1 9 9 7 ； m a l i e p a a r d ，1 9 9 8 ) 。在番茄上尽管苹果酸和柠檬酸都是多基因控制，但低 酸性状却分别由一个主效基因控制，并且这两个主效基因相连锁( f u l t o n ， 2 0 0 0 ；s a l i b a - c o l o m b a n i ，2 0 0 1 ) 在苹果( v i s s e ra n dv e r h a e g h ，1 9 7 8 ； m a l i e p a a r d ，1 9 9 8 ) 和柑橘类果实( f a n g ，1 9 9 7 ) 上，低酸性状是隐性性状， 9 苹果果实中苹果酸代谢关键酶基因的克隆和表达分析 而在桃子上低酸性状却是显性性状( m o n e t ，1 9 7 9 ) ，可见不同物种酸度调 控的机制并不相同。 1 4 苹果酸代谢关键酶研究进展 1 4 1 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶( p e p c ) 研究进展 1 4 1 1 植物p e p c 的分类与功能 p e p c 存在于所有光合生物中，包括高等植物、绿藻、蓝细菌和光合 细菌，但动物、真菌和酵母中不存在此酶( k a i ，2 0 0 3 ) 高等植物中p e p c 由多基因家族编码( b i a s i n g ，2 0 0 2 ) ，存在多种同 工酶( t o h ，1 9 9 4 ) ：c 光合型、c 3 光合型、c a m 型及非绿色型等( i z u i ， 1 9 8 6 ；m a t s u k o ，1 9 8 9 ；h u d s p e t h ，1 9 8 9 ；k a w a m u r a ，1 9 9 0 ；k a w a m u r a ， 1 9 9 2 ) 。同一种植物的不同组织中p e p c 就可能属于不同的类型，如c 4 光 合型p e p c 主要在叶肉细胞中表达，并且受光照调控，具有组织特异性 ( w b s t h o f f , 1 9 9 7 ) 根据序列特征和功能结构，植物p e p c 被划分成三个亚族( s c h a f f n e r ， 1 9 9 2 ) ：c 4 型主要在叶片中表达；c 3 1 型主要在黄化叶片、茎等多个部位表 达；c 3 - 2 型主要在根组织中特异表达，也称为根型。不同的p e p c 基因家 族成员分别位于不同的染色体上，如玉米中c 4 型p e p c 位于第9 号染色 体上，c 3 1 型p e p c 位于第7 号染色体上，c 3 - 2 型p e p c 有两个拷贝，分 别位于第4 和5 号染色体上，每一种成员编码一定的异构体，并各自在生 理学反应中担当特定的角色。 在c 4 和c a m 光合途径中，p e p c 的主要负责碳的初始同化( c h o l l e t ， 1 9 9 6 ；n i m m o ，2 0 0 0 ；l e p i n i e c ，1 9 9 4 ；r a j a g o p a l a n ，1 9 9 4 ) ，以r 或 m 矿作为辅因子，催化p e p 不可逆羧化反应形成草酰乙酸和无机磷酸。 p e p c 晶体结构研究表明其活性中心位于d - 桶状结构的c 末端。k a i ( 1 9 9 9 ) 等提出了p e p c 催化反应的详细机制：首先，m n 2 + 或m 矿结合在第5 和第 6 - p 折叠的c 末端保守氨基酸残基g l u 5 6 6 和a s p 6 0 3 的羧基基团的氧原子上； 然后，聊进入该酶活性中心，与m n 2 + 或m 矿r 及周围的r 4 5 6 、r 7 5 9 、7 7 3 r 相互作用，形成离子p e p 中间复合物；接着h c 0 3 - j i 匣过琢s 1 7 7 和a s p 6 4 7 之间的空隙进入活性中心，h i s 7 侧链基团对h c 0 3 - 发动亲核攻击，使磷 酸基团质子化；最后，在t r p 2 髓、l o j 5 6 4 、m e t 5 3 8 的侧链所形成的空隙中发 山东农业大学硕士学位论文 生羧化反应( k a i ，1 9 9 9 ：m a t s u m u r a ，1 9 9 9 ：m a t s u m u r a ，1 9 9 9 ；m a t s u m u r a ， 2 0 0 2 ) 。 p e p c 不仅在c 4 和c a m 光合作用中发挥重要作用，而且其它非光合 型同工酶还参与了碳骨架的填补反应，保持p h 和渗透平衡，重新固定呼 吸所释放的c 0 2 ，促进种子的形成和萌发、果实的成熟等( l e e g o o d ，1 9 9 0 ) 。 此外，p e p c 在气孔开闭和豆科植物根瘤固氮过程中也有特殊作用 ( o u t l a w ，2 0 0 2 ：l a t z _ k o ，1 9 8 3 ) 在c 3 植物中p e p c 同样通过不可逆的羧化反应对细胞进行代谢调控 细胞质中p e p c 催化p e p 和h c 0 3 - 发生羧化反应，生成的o a a 又被还原 为苹果酸( m a d 。苹果酸是p e p c 的别构抑制剂( k j = lm m ) ，生成的苹 果酸及时运输到液泡中，通过区域化保证细胞质中苹果酸浓度低于p e p c 的磁值，并且使细胞质p h 保持稳定( 夏朝晖，1 9 9 8 ) d a v i e s 等( 1 9 8 6 ) 认为n a d p - m e 和p e p c 共同来维持细胞内p h 值，当p h 值较低时 n a d p - m e 催化苹果酸脱羧，细胞酸度降低；当p s 值较高时p e p ( 2 促进 苹果酸的合成，增加细胞酸度。 在c 3 植物果实和种子的某些特定组织中，p e p c 可以俘获呼吸过程中 释放的c 0 2 ，这些组织中p e p c 活性也相对比较高。此外，p e p c 在气孔 运动中也发挥着重要作用，气孔开放时保卫细胞中k + 的量增加，与此相偶 联的质子外流导致细胞质中p h 值迅速升高，而p e p c 催化苹果酸合成来 维持细胞质酸度。a s a i 等研究发现p