（化学专业论文）安石榴甙分子印迹聚合物的制备及其识别性能的研究.pdf

摘要 安石榴甙分子印迹聚合物的制备及其识别性能的研究 摘要 分子印迹技术( m i t ) 作为一种新型技术，正在受到越来越多的关注。 该技术是用来制备一种具有能够对特定分子进行较高特异性识别的聚合 物，该聚合物被称为分子印迹聚合物。其制备过程如下：( 1 ) 将模板分子 与带有特定功能基团的单体混合，单体在共价键或非共价键的作用排列在 功能单体周围；( 2 ) j h 入交联剂，功能单体和交联剂发生聚合；( 3 ) 聚合完 成后，将模板分子洗脱掉，聚合物中就会留下空穴，这种空穴从大小、形 状和功能基团上能很好的与模板分子互补，因此具有很好的特异性识别。 分子印迹技术在分离纯化、免疫测定、生物酶模拟、仿生传感器等方面具 有很大的应用潜力。 本文首先采用柱层析洗脱法对安石榴甙粗成品进行提纯，通过液相色 谱和质谱分析，提纯后的产物纯度和产率分别为8 5 3 和6 4 6 2 。而后以 提纯的安石榴甙为模板分子，丙烯酰胺为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸 酯( e d m a ) 为交联剂，乙腈( a c n ) 为溶剂，偶氮二异丁腈( a i b n ) 为引发剂 成功制备了安石榴甙分子印迹聚合物，并通过扫描电镜对聚合物表面形貌 进行表征。聚合物的平衡吸附实验表明，相比空白聚合物，印迹聚合物在 乙腈溶剂中对模板分子具有更好的吸附性能。通过s c a t c h a r d 分析并计算得 出在安石榴甙分子印迹聚合物中存在两类不同的结合位点，其中高结合位 点的平衡离解常数和最大表观结合量为5 1 0 4 1 t m o l m l ，2 4 2 6 2 9 m o l g ， 北京化工大学硕士学位论文 低结合位点的平衡离解常数和最大表观结合量为0 4 1 4 t m o l m l ， 3 5 1 0 6 p m o l g 。在研究浓度范围内，印迹聚合物的最大吸附量为 3 2 5 6 4 t a m o l g 。通过以安石榴甙为模板制备的印迹聚合物对双酚a 和安石 榴甙的对比吸附实验结果得出，印迹聚合物对安石榴甙模板分子具有更好 的选择性。 关键词：分子印迹技术，安石榴甙，选择性吸附，沉淀聚合 摘要 p r e p a r a t i o na n dr e c o g n i t i o np r o p e r t i e so fm o l e c u l a r l y i m p r i n t e dp o l y m e rf o rp u n i c a l a g i n a bs t r a c t a san o v e l t e c h n i q u e ，m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ( m i t ) i s b e c o m i n gm o r ea n dm o r ep o p u l a r m i ti su s e dt op r e p a r eak i n do fp o l y m e r c a l l e dm o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ( m i p ) w h i c hh a sp o w e r f u lr e c o g n i t i o n s i t e sf o rc e r t a i nm o l e c u l e s t h ep r o c e s so fp r e p a r a t i o ni sa sf o l l o w s ：( 1 ) t h e t e m p l a t em o l e c u l e sa r em i x e dw i t hm o n o m e r sw i t ha p p r o p r i a t ef u n c t i o n a l g r o u p s w h i c ha r ea r r a n g e da r o u n dt h e t e m p l a t eb y t h ec o v a l e n to r n o n - c o v a l e n ti n t e r a c t i o nb e t w e e nt h e m ( 2 ) f u n c t i o n a lm o n o m e r sa n d c r o s s li n k e r sa r ec o p o l y m e r i z e d ( 3 ) t h et e m p l a t em o l e c u l ei sr e m o v e db y e x t e n s i v er i n s i n ga f t e rp o l y m e r i z a t i o ns ot h a tt h ec a v i t i e sa r el e f ti n t ot h e p o l y m e r sw h i c ha r ec o m p l e m e n t a r yt ot h et e m p l a t ei nt e r m so fs i z e ，s h a p e ， a n df u n c t i o n a l g r o u p s t h e s ec a v i t i e s e x h i b i ta ne f f e c to fs p e c i a l i z e d r e c o g n i t i o n m i tn o wh a sag r e a ta p p l i e dp o t e n t i a li ns e p a r a t i o n ，p u r i f i c a t i o n ， i m m u n o a s s a y ，e n z y m em i m i c ，b i o - m i m i cs e n s o ra n do t h e rf i e l d s i nt h i s p a p e r ，t h ep u r i f i c a t i o n o f p u n i c a l a g i nu s i n g c o l u m n c h r o m a t o g r a p h yw a ss t u d i e d t h ep u r i f i e dp r o d u c tw a sc h a r a c t e r i z e db y h p l ca n dm s ；t h ep u n i c a l a g i np u r i t ya n dy i e l do ft h ee x t r a c ta r e8 5 3 a n d 6 4 6 2 r e s p e c t i v e l y m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ( m i p s ) f o rp u n i c a l a g i n 北京化工大学硕士学位论文 w e r es u c c e s s f u l l yp r e p a r e db yp r e c i p i t a t i o np o l y m e r i z a t i o nu s i n gt h ep u r if i e d p u n i c a l a g i na st e m p l a t e ，a c r y l a m i d e ( a m ) a sf u n c t i o n a lm o n o m e r , e t h y l e n e d i m e t h a c r y l a t e ( e d m a ) a st h ec r o s s l i n k e r , a c e t o n i t r i l e ( a c n ) a ss o l v e n t ， a z o i s o b u t y r o n i t r i l e( a i b n ) a si n i t i a t o r t h e m o l e c u l a r l yi m p r i n t e d p o l y m e rw a sc h a r a c t e r i z e db ys c a n n i n ge l e c t r o n i cm i c r o s c o p y t h er e s u l t o fe q u i l i b r i u ma d s o r p t i o ne x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h em l p sc a na d s o r bt h e t e m p l a t em o l e c u l es e l e c t i v e l y ，a n dh a v eah i g ha f f i n i t yt ot h et e m p l a t ei n c o m p a r i s o nw i t ht h eb l a n kp o l y m e r s ( b p s ) a c c o r d i n gt os c a t c h a r da n a l y s i si t i ss h o w e dt h a tt w ok i n d so fb i n d i n gs i t e sw e r ef o r m e di nt h em i p s f o rt h e h i g ha f f i n i t ys i t e s ，t h ed i s s o c i a t i o nc o n t e n t 磁la n dt h ea p p a r e n tm a x i m u m b i n d i n gc a p a c i t yq m 缸ia l e5 10 4 p m o l m l ，2 4 2 6 2 9 p m o l g ，a n df o rt h el o w a f f i n i t ys i t e s ，t h ed i s s o c i a t i o n c o n t e n tka n dt h ea p p a r e n tm a x i m u m b i n d i n gc a p a c i t yq m a x 2a l e0 4 14 1 t m o l m l ，35 10 6 1 t m o l g ，r e s p e c t i v e l y t h e m a x a d s o r p t i o no f m i p si s3 2 5 6 4 1 x r n o l 恒u n d e rt h es t u d i e dc o n c e n t r a t i o n t h e s e l e c t i vea d s o r p t i o ne x p e r i m e n ti n f e r r e dt h a tm i p sh a v eah i g h e rs e l e c t i v i t y f o rp u n i c a l a g i nt h a nf o rb i s p h e n o l - a k e yw o r d s ：m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ，p u n i c a l a g i n ，s e l e c t i v e a d s o r p t i o n ，p r e c i p i t a t i o np o l y m e r i z a t i o n 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。 作者签名：丝灸 日期： 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规 定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大 学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可 以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上一年解密后适用本授 权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名： 导师签名： 日期： 2 坐象因i 垒 醐：型弘 第一章绪论 1 1 石榴及石榴皮概述 1 1 1 石榴概述 第一章绪论 石榴( p u n i c ag r a n a t u ml ) 是落叶灌木或小乔木，别名安石榴、若榴、丹若、金罂、 金庞、涂林、天浆。主要分布在亚热带及温带地区，在我国南北各地区均有石榴种植。 石榴性温、味甘酸涩，入肺、肾、大肠经；具有生津止渴，收敛固涩，止泻止血的功 效；亦可用来主治津亏口燥咽干，烦渴，久泻，久痢，便血，崩漏等病症。 1 1 2 石榴皮概述 干燥的石榴皮呈不规则形或半圆形的碎片状，厚2 - 一3 毫米。外表面暗红色或棕 红色，粗糙，具白色小凸点；顶端具残存的宿萼；基部有果柄。内面鲜黄色或棕黄色， 并有隆起呈网状的果蒂残痕。质脆而坚，易折断。气微弱，味涩。以皮厚实、色红褐 者为佳。石榴皮在细菌性痢疾，阿米巴痢疾等多种感染性炎症有很好治疗效果。有文 献报道【l j ，新鲜石榴皮含鞣花单宁1 0 4 - 2 1 3 ，树脂4 5 ，甘露醇1 8 ，没食子酸 4 ，糖2 7 ，树胶3 2 ，蜡0 8 等。但因为生产地不同，石榴皮成分的含量也各有 不同。 鞣花单宁的成分一般为：石榴皮亭a ( g a n a t i na ) 、石榴皮亭b ( g r a n a t i nb ) 、鞣云 实精( c o r i l a g i n ) 、鞣花酸( e l l a g i ca c i d ) 、安石榴林( p u n i c a l i n ) 、安石榴甙( p u n i e a l a g i n ) 、 没食子酸( g a l l i ca c i d ) 、木麻黄宁( c a s u r a n i n ) 等【2 】。其中安石榴甙( p u n i c a l a g i n ) 又是石榴 皮鞣花单宁的主要成分，它具有很强的生物活性，其强氧化性和抗癌作用的研究也越 来越多，在医疗保健，化妆品，功能性食品等行业有很好的应用前景。 1 1 2 1 安石榴甙概述 安石榴甙为石榴科植物石榴的皮提取物，属于石榴皮中鞣花单宁的一种，为鞣花 单宁的主要成分。 安石榴甙分子式为c 4 8 h 2 7 0 3 0 ，棕褐色粉末，易溶于水，甲醇，乙醇，乙腈等。 它遇酸碱、高温即依次逐步降解为安石榴林，没食子酸，鞣花酸，其降解过程如图1 1 所示【3 1 。由此图也可知安石榴甙结构为多羟基的大分子化合物。 北京化工大学硕士学位论文 o p u a l c _ l i n 2 畦，正7 肆” 丰 千 图1 - 1 安石榴甙的结构及其转化 f i g 1 - 1t h es t r u c t u r ea n dc o n v e r s i o no f p u n i c a l a g i n 1 1 2 2 发展现状及应用前景 安石榴甙的研究是近几年才慢慢开始受到关注，对其的研究才发展起来，而且国 外研究比国内要早，但从总体上说，其研究还是比较少，而且不够充分。近年来，研 究发现，安石榴甙被人体吸收后，在人体酶的作用下，可以分解为鞣花酸，而且 其具有优良的抗氧化性，已被用作食品抗氧化剂，现在日本和法国多将其用于化 妆品方面，同鞣花酸相比，安石榴甙水溶性较好，可用于饮料，而容易被人体吸 收，但不易合成，而且不能从其他植物中提取。同鞣花酸一样，安石榴甙也具有 抗变异原性和抑制癌细胞增殖的作用。 因为石榴皮提取物具有多种生物活性成分，其提取物已被用于食品添加剂中 h j 。对石榴皮成分的提取过程直接影响着石榴皮的抗氧化活性，因此急需找到一 2 第一章绪论 种提取方法，能让石榴皮中提取的抗氧化物具有高含量。尽管目前已有不同溶剂 对石榴皮的提纯的影响的报道【5 6 】，但是这些提纯方法的探讨结果并不很理想， 并没有从根本上改变提纯效果。在过去几年内，对石榴皮成分，尤其是安石榴甙 的提纯，并测定其抗氧化活性以及对石榴皮其他成分的研究也成为热点。 由于安石榴甙在石榴皮提取物中具有同分异构体，而且还有很多同类化合物 与其结构相似，目前，高效液相色谱法仍是安石榴甙主要的检测方法。j i n g j i n g l 【7 s 】等人对安石榴甙的检测和提纯手段进行了详细的研究，采用高速逆流色谱对 安石榴甙进行提纯，得到了较高的纯度，为我们提供了一种制备高纯度安石榴甙 的方法。n s e e r a m 3 】等人在对石榴皮多酚进行提纯时，利用大孔吸附树脂作为提 纯方法，采用液质联用进行鉴定，分离得到安石榴甙含量较高的产品，但其提纯 成本昂贵。目前安石榴试的标准品( 9 8 ) 市场价已达到1 6 0 0 元2 0 m g ，而且很 难购买。 随着对安石榴甙的研究逐渐深入，对其抗癌和抗氧化活性的关注越来越高，安石 榴甙在医疗、化妆品、保健等领域的发展空间也越来越大。 1 2 分子印迹技术 1 2 1 概述 分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p f i n t m gt e c h n i q u e ，m i t ) 是指制备这样一种聚合物，它 对一种特定的目标分子有着特定的选择性吸附，由此制备的聚合物成为分子印迹聚合 物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ，m i p ) ，分子印迹技术在很多方面常常具有重要的作 用，比如固相萃取，分离、催化以及生物化学过程等等。 分子印迹这一概念，是在1 9 4 9 年由d i c k e y 首先提出的，但并没有引起人们的重 视。直到1 9 7 2 年w u l 停9 1 领导的研究小组首次成功合成出分子印迹聚合物来，使得分 子印迹技术的研究取得了突破进展。1 9 9 3 年m o s b a c h i 加】等人在n a t u r e 上发表茶碱印 迹聚合物受体论文，这时候，才引起了人们的兴趣，使得该技术在生物传感器、人工 抗体模拟及色谱固相分离等方面有了新的发展，并由此使其成为化学和生物学交叉的 新兴领域之一。 1 2 2 分子印迹技术的原理 分子印迹技术是将要分离的目标分子作为模板分子，与功能单体相互作用形成超 分子复合物，在交联剂的作用下形成聚合物，然后通过一定的化学手段除去掉模板分 子，便得到具有与模板分子空间结构互补的具备多重作用的空穴的分子印迹聚合物 3 北京化i 大学碰学位论! ( m 讲) 其识别原理由图1 - 2 示意。这样的空穴对模扳分子具有特定选择性，可以特定 的吸附待分离混合物中的目标分子，从而达到分离或纯化的目的。 分子印迹聚合物具有以下三大特点：预定性( p r e d e t e r m i n a t i o n ) ，即它可以根据不 同的需要制备不同的分子印迹聚合物，以满足各种不同的目的： 特定选择性( s p e c i f i c s e l e c t i o n ) ，即分子印迹聚合物是按照模板分子定做的，可专一地识别模扳分子： 实 用性( p r a c t i c a b i l i t y ) ，即它可以与生物分子识别系统帽比拟，比如抗原与抗体、酶与底 物、受体与激素，但由于它是通过化学合成方法制备得到，因此又有天然分子识别系 统所不具备的抗恶劣环境的能力从而表现出矗好的稳定性和很长的使用寿命。 根据功能单体与印迹分子的作用机理，分子印迹聚合物的制备原理可分为共价法 和非共价法。 破鲁客 图1 - 2 分子印迹过程示意图 f 培1 2 , h e m a t i c i l l u s t r a t i o n o f t h e m d 睇u k i m p r i n t i n g 12 21 共价法 共价法，又称为顸组织法0 r 喈删枷i o n ) ，主要是i 妇w u l 剧、组创立吼该方法是， 利用模板分子与功能单体间可逆的共价作用让横板分子先与单体结合，然后通过交 联荆发生聚合反应，聚合后再通过一定的化学途径使共价键断裂。从而去除模板分子。 常用的共价结合作用的单体包括硼酸酯、缩醛酮、醅、席夫碱和螯合物等。其中，硼 酸醅最具代表性。 利用共价法合成分子印迹聚合物，其优点存于聚合过程中，横板分子与功能单体 的化学计量关系可以确定，且两者之问的作用力强，可以形稳定的复合物，获得的空 问作用位点均匀、精确、排列固定，从而使得聚合物对模扳分予选择性电比较高。但 其缺点是印迹过程比较复杂，共价键的能量较大，键的形成与断裂需要高能量模板 分子与功能单体的结台和模板分子在聚合物生成后的脱去比较困难，过程耗时较长 对于许多要求快速反应的聚舍反应以及热稳定性不好的模板分子来说是不利的。受制 第一章绪论 于此，共价法应用范围较窄，发展也较缓慢。 1 2 2 2 非共价法 非共价法，又称为自组装法( s e l f - a s s e m b l i n g ) ，由m o s b a c h 及其同事在2 0 世纪8 0 年 代末期创立，他们最早将分子自组装方法用于分子印迹聚合物的合成【1 0 】。在该实验中， 他们以茶碱为模板分子，甲基丙烯酸( m a i ) 为功能单体，将两者置于惰性溶剂中，利 用两者间的氢键作用形成配合物。用偶氮二异丁腈( a i b n ) 作为引发剂，在乙二醇二甲 基丙烯酸酯( e d m a ) 的交联作用下，进行自由基聚合，形成聚合物。在反复洗去模板 分子后，在聚合物中形成对茶碱有特异性选择的空间识别位点。 在此方法中，模板分子与功能单体之间通过非共价作用力相互作用，形成多重空 间作用位点，然后进行聚合，再通过一定的物理化学手段将模板分子脱除。常用的非 共价作用有氢键、静电引力、金属螫合、兀_ 7 【共轭、电荷转移、疏水作用以及范德华力 等，其中应用最多的是氢键。非共价法的特点是，印迹过程简单，功能单体的用量相 对于模板分子过量，因而结合基团有很多呈现没有规则的分布，但不会对模板分子的 分离过程有很大的影响，并且模板分子的除掉可以在较温和的条件下进行，其印迹过 程类似于自然界的生物识别系统，比如生物酶和底物的作用。但通过该方法得到的聚 合物的识别位点对模板分子的识别度不高。 1 2 3 分子印迹聚合物的制备方法 近几年分子印迹聚合物的制备方法有了很大发展，从聚合物形态上来说，已经有 了整体柱、无定型粉末、球形和膜等多种形态。相比其他的聚合物合成，分子印迹聚 合物具有自己的特点，功能单体必须带有能和模板分子相互作用的功能基团，而且单 体必须可以高度交联，从而保证聚合后产生的结合位点有足够的稳定性，因而在确定 单体和交联剂的情况下，聚合方法就很重要了。分子印迹聚合物的方法有很多，常用 的有本体聚合、分散聚合、沉淀聚合、悬浮聚合、表面印迹法等技术。 1 2 3 1 本体聚合 本体聚合，又称为封管聚合，早期分子印迹聚合物的合成研究多是采用该聚合方 法。其工艺过程是，将模板分子、功能单体、交联剂，引发剂按照需要的比例溶解在 有机惰性溶剂( 通常是甲苯或氯仿) 中，除氧密封于试管加热，或紫外照射，发生聚合 反应。采用此种方法得到的往往是紧密的块状聚合物，必须经过粉碎、研磨、然后筛 选得到大小合适的颗粒状聚合物，最后洗脱模板分子，干燥，备用。该法得到的聚合 物记忆性较好，对模板分子的选择识别性较高。而且合成条件容易控制，实验所需装 置比较简单，使用普及。目前仍为主要的聚合方法。但其具有一定的缺点，后处理过 5 北京化工大学硕士学位论文 程繁杂，研磨过程不可避免的产生一些不规则形状的颗粒，以及容易破坏一定量的识 别位点，导致最终产率偏低，而且可用聚合物的利用率低。 1 2 3 2 悬浮聚合 悬浮聚合的原理是将功能单体和引发剂溶解于有机溶剂中，稳定剂溶于水相( 分 散剂) 中，将两者混合，经过高速搅拌，形成悬浊液。自由基引发聚合在每一个小的 有机液滴中进行，伴随着高速搅拌，最终可获得粒径均一的球形分子印迹聚合物。该 印迹微球在作为填料时，可使色谱图峰宽变小、峰形不对称和脱尾现象减少，结果重 现性也较好。 由于悬浮聚合是在水溶液中进行的，所得印迹聚合物可应用于极性环境，能够满 足酶模拟等实际应用环境的要求，同时产物的规整性和单分散性也很好，将其填充到 色谱柱中可以用于分离手性异构体。m a t s u i 等i n 采用悬浮聚合法，以阿特拉津为印迹 分子制备出了聚合物，由于该模板分子难溶于水，同时和功能单体甲基丙烯酸的离子 作用很强，受到水相的影响很小，取得了很好的印迹效果，在将该聚合物用于水中结 构相近的西玛津的固相萃取时，富集因子可达5 6 ，回收率可达9 1 。m o s b a c h 1 2 1 等采 用与般有机溶剂皆不互溶的全氟烃为分散介质，聚氧乙烯基的高分子为聚合物表面 活性剂，混合两者，形成乳化稳定剂，加入聚合反应中，得到粒度范围分布窄，形态 规则的聚合物颗粒。该方法只需改变乳化稳定剂的用量就可以控n s l 化液中反应液滴 的大小，从而控制合成聚合物微球的粒径。但该法最后产物仍为具有高度交联的凝胶 形态，其结合位点的实用性及印迹分子的回收仍然不理想。另外该法虽使得微孔大小 和粒径分布可控，但聚合物的结构和交联密度仍然难以控制，这样不利于印迹分子的 重新结合。与无定型材料相比，此方法对聚合物的物理性能没有明显改进。此外全氟 烃虽然无毒，易处理，但是易燃，价格昂贵，因此不适于工业应用。 1 2 3 3 乳液聚合 乳液聚合将印迹分子、功能单体、交联剂溶于有机溶剂，然后将此溶液转入溶有 一定量乳化剂的水中，搅拌使其乳化，加入引发剂交联聚合后就可得到粒径较为均匀 的球形聚合物。该法得到的印迹聚合物微球的粒径通常为5 0 5 0 0 n t o ，由于粒径分布在 纳米级，使得分子印迹微球的比表面更大，吸附能力更强，常用于金属离子的印迹聚 合物制备。但其在色谱中的应用受到了限制。 u e z u 等【1 3 】报道了一种水油水乳液体系制备微球的方法。该聚合体系需要使用一 种具有两性的功能单体，既带有可与客体形成配合物的端基，又可聚合的表面活性剂 单体，这种功能性单体能与印迹分子在乳浊液的界面上形成配合物，并且在反应过程 中保持稳定。经过反复试验他们以带有两个长链烷基为疏水端的二烯基磷酸为单体， 二乙烯苯为交联剂制备了z n 2 + 印迹微球，粒子的粒度可控制在1 0 1 0 0 t m ，与非印迹 6 第一章绪论 聚合物相比，选择性提高1 0 0 0 倍，在工业应用上很有价值。此外，乳液聚合应用于分 子印迹技术的最成功之处在于有效解决了水溶性分子的印迹问题，有研究表明该法能 够设计和制各出形态和尺寸适宜的分子印迹聚合物分离介质h 】。 1 2 3 4 分散聚合 分散聚合是一种介于本体聚合和悬浮聚合之间的聚合方法。反应开始，将模板分 子、单体、引发剂、分散剂、交联剂等都溶于分散介质中，该体系为均相体系，分散 剂的大分子链舒展在溶剂中，引发剂分解产生自由基后引发聚合。当反应进行一定程 度，高分子链生长到一定的长度，就相互缠接，伴随着不断搅拌，逐渐形成球形的核， 随着反应的进行，不断有高分子链在已形成的核上生长并缠接，至最后形成微球并从 聚合相中析出。目前，关于分散聚合稳定机理还没有统一的说法，吸附理论和接枝理 论是其中较为认同的两种。前者认为分散剂分子被吸附到粒子表面上，形成表面水化 层，使粒子不易聚合而稳定悬浮在介质中；后者认为分散剂分子接枝到粒子中的大分 子链上，分散剂的支链伸向水相，靠空间位阻使体系稳定。曹同玉等n 射通过对本体聚 合法和分散聚合法制备的聚合物微球稳定性对比，并采用漫反射红外分析，认为接枝 理论是聚合物稳定的主导因素，但吸附理论也有一定贡献。 分散聚合经过几- f 年的发展，已经较为成熟，国内外许多学者发表了许多研究性 的论文，详细讨论了不同体系下用分散聚合法制得的聚合物微球的影响因素，如分散 剂、单体、溶剂、引发剂、反应温度等。分散聚合已渐渐显露出其在制备聚合物微球 方面的特点：传统的聚合物微球的合成方法是采用乳液聚合和悬浮聚合，但乳液聚合 所得微球粒径不到一个微米，悬浮聚合制得的颗粒是1 1 0 0 0 微米的多分散颗粒，而分 散聚合法和上面两种聚合法相比，具有简单的工艺，散热问题得到合理的解决，适用 于分子印迹技术中的各种功能单体，且能制备不同粒径级别的单分散性聚合物微球。 但这种方法制备出的分子印迹聚合物的交联度较低，表面活性剂及分散剂的选择也会 影响到聚合物的性能是否良好。 1 2 3 5 沉淀聚合 分散聚合虽然印迹效果很好，但其分散剂的制备过程非常复杂，且所需的惰性分 散介质非常昂贵，因而难以推广。y e 等【i6 】在原有的技术基础之上，采用一种制备手 段简便、低成本、产率高和印迹效果不错的沉淀聚合法，应用这种方法成功地在极性 溶剂乙腈中印迹了茶碱和1 7 d 雌二醇，得到平均粒径为0 3 岬的分子印迹聚合物微球。 他们在研究中发现，反应体系的浓度将对微球的形貌有重大影响，模板分子的性质也 将影响聚合产物的微观形貌。 沉淀聚合又称非均相溶液聚合，其原理是利用聚合物的刚性表面使其能够分散在 特定的溶剂中，从而形成具有均匀粒径、高交联度的聚合物微球。将该方法应用于分 7 北京化工大学硕士学位论文 子印迹技术中，与分散聚合法相比，不需要在反应体系中另外加入分散剂，组分也比 较简单，得到的聚合物微球表面干净、粒径均匀，可以避免分散剂对模板分子的非选 择性吸附的影响，而且与本体聚合制备的聚合物相比，由沉淀聚合制得的聚合物具有 更高的特异识别能力。 虽然用沉淀聚合制备分子印迹聚合物微球，有着方法简便、成本低、产率高，印 迹效果好的优点，但是反应溶剂的粘性对整个反应有很重要的影响，只有溶剂粘性较 小，使得单体分子和低聚物在反应中的流动性较大，从而避免它们过度聚集，得到的 聚合物粒径分布才比较理想。 1 2 3 6 表面印迹聚合 由上述几种方法制备分子印迹聚合物，其识别位点大都在聚合物微球的内部，而 聚合物颗粒内部存在的扩散阻力会增大模板分子与识别位点结合的困难，从而使得结 合效率低。于是，近些年出现了一种被称为表面印迹聚合的印迹方法，顾名思义，此 方法就是在聚合物表面建立识别位点。 表面印迹聚合的原理很简单，在聚合过程中，让模板分子与功能单体在乳液界面 处结合，形成的结合物就留在反应界面。具体过程是，让模板分子与金属离子形成配 合物，再让功能单体与该金属离子配位形成配合物，然后将此配合物共聚到球形聚合 物的表面，将模板分子除去，该球形聚合物的表面就留下了识别位点。y o s h i d a 等【l 7 j 以中孔的硅胶树脂为基质，二9 十八烯基磷酸为功能单体，二乙烯基苯为交联剂，聚 乙烯醇为乳化剂，制备了z n 2 + 分子印迹聚合物微球，实验表明此微球对z n 2 + 的选择性 远远超过对c u 2 十的选择性。 表面印迹聚合通过对聚合物微球表面进行修饰来制备分子印迹聚合物材料，其最 大的优点是利用聚合物微球的稳定性，并且可以通过调节微球本身性能来适应不同的 应用需要。采用表面印迹聚合方法制备聚合物，可很大程度的便于洗脱印迹分子以及 大大提高分子印迹聚合物的结合容量，缩短识别吸附达到平衡所需的时间。表面印迹 聚合是一种非常有发展前途的印迹技术。不过该聚合方法对所用到的配合物稳定常数 要求比较苛刻，这在一定程度上也限制了其应用。 1 2 4 分子印迹聚合物的表征 目前还没有一个统一的理论描述分子印迹聚合物性质的综合表征，主要因为分子 印迹聚合物的应用范围比较广，表征方法可以有不同。再者，为了能在不同领域获得 应用，采用不同的模板分子和研究不同的聚合方法来制备分子印迹聚合物这一方面被 关注较多，以至于对分子印迹聚合物的表征方法缺乏定量和系统的研究，使得模板分 子和功能单体相互作用的机理尚未清楚，因此该技术的进一步发展也受到了限制。 8 第一章绪论 1 2 4 1 分子印迹聚合物的结构表征 有关分子印迹聚合物微球的结构表征方法，仍采用传统聚合物微球的表征手段。 通常是通过吸附实验，测定微球的比表面积、体积、粒径大小、粒径分布、形状，以 及采用静态吸附法表征分子印迹聚合物微球的吸附性能。这两项指标是影响分子印迹 微球吸附性能的重要因素。此外，粒径的大小和分布也是描述印迹聚合物微球性质最 基本的指标，可以用扫描电子显微镜或者透射电子显微镜观察，也可以用激光粒度分 析仪等光学仪器测试。 1 2 4 2 分子印迹聚合物的性能表征 ( 1 ) 紫外分光度法 紫外分光光度法作为一种常用的分析检测方法，其优点在于灵敏度较高，因为很 多物质在1 - - - 2 0 e v 内都能发生电子跃迁，基于这种普遍性，在分子印迹技术中，吸附 振荡结合紫外光谱检测来表征印迹聚合物的亲和力和选择性也是比较常用的手段。在 紫外检测操作中，通过采用在紫外光区有较强吸收的物质作为模板分子，利用合成的 分子印迹聚合物对模板分子进行吸附实验，通过测定吸附前后模板分子在溶液中吸光 度的变化来表征分子印迹聚合物的吸附及选择性能。此外，也可以通过检测吸附前后 分子印迹聚合物的溶液所产生的紫外吸光强度的变化来表征分子印迹聚合物的性能， 该方法主要适于印迹分子与功能单体作用后吸收谱带发生变化的体系，但其谱带比较 简单，识别位点很难确定。 ( 2 ) 色谱法 高效液相色谱法( h p l c ) 是目前测试分子印迹聚合物微球识别性能应用最广泛的 方法。该法是将制备出的一定范围的粒径分布的分子印迹聚合物微球作为液相色谱的 固定相装入色谱柱中，用流动相洗脱，然后将含有模板分子与参照物质的混合物注入 色谱柱内，由于聚合物微球的结构和化学基团与模板分子和参照物质的不同匹配而使 这些物质在色谱柱中的保留时间不同，可由色谱图来分析聚合物对模板分子是否具有 特异性选择以及这种选择性能的高低。r a m s t r o e m 等【l8 】采用1 1 种不同的液体作为流动 相来处理模板印迹分子，确定了不同流动相液体对分子印迹聚合物对模板分子吸附性 能的影响。 ( 3 ) 电势测定法 m o s b a c h 等【l9 】在1 9 8 8 年提出这种检测方法，利用的是流动电位原理。当液体沿固 体表面流动时会产生一种流动电位，其大小受液体浓度的变化的影响，根据所测流动 电位的变化，可以推出液体浓度的变化。于是在一定条件下，可以确定液体溶质和固 相之间亲和力的大小。应用到分子印迹技术中，其具体操作过程为，将合成的分子印 迹聚合物装入流通池，用含有模板分子或者其他参照物质的溶液进行洗涤，由流通池 9 北京化工大学硕士学位论文 两端相连的电位计读数就可以推算出印迹聚合物对模板分子的识别性能。电势测定法 相比其他的测定方法具有更宽的适用范围，它能测定某些色谱法和紫外分光度法都无 法测定的物质。 ( 4 ) 傅立叶变换红外光谱和核磁共振法 这两种方法可以确定在去除模板分子后，识别位点是否留有与模板分子相互作用 的基团。但其局限性就在于不能确定印迹聚合物对模板分子是否有识别选择性。目前 这两种方法主要应用在表征印迹聚合物的分子结构信息，由于其提供的信息量大，准 确度高，可以确定印迹聚合物的识别位点和强度。 ( 5 ) 荧光测试法 此方法是近年来出现的一种全新的测试分子印迹聚合物性能的分析方法，应用条 件是制备出的印迹聚合物本身具有荧光性或者含有模板分子的溶液具有荧光性，如果 印迹聚合物本身具有荧光性，则可以利用模板分子和其他参考物质对印迹聚合物的猝 灭的不同来确定聚合物的选择吸附性能【2 0 】。如若是后者，则可以利用聚合物加入溶液 前后，溶液的荧光强度的变化来确定分子印迹聚合物的吸附性能【2 l 】。 1 2 5 分子印迹技术的应用 分子印迹聚合物具有制作简单、成本低廉且坚固耐用、功能可设计、适用范围广、 抗恶劣环境等优点而被誉为“万能的分子识别材料。过去一段时期，分子印迹聚 合物的应用研究主要集中在生物分离、抗体结合模拟、酶模拟及生物模拟传感器上。 但近几年来，科学家们已开始探索分子印迹聚合物微球的一些新的应用领域，其中在 痕量分析物的富集、反应过程平衡转移的控制、反应产物的分离提纯和组合化学库的 筛选等方面已取得了一定的进步。 1 2 5 1 色谱分析 分子印迹聚合物对模板分子的高度选择、面对高温、高压有机等恶劣环境的优秀 的承受能力使其在分离提纯领域得到广泛应用【2 2 。2 5 1 。分子印迹色谱分离技术中主要是 用分子印迹聚合物作为色谱分离中的固定相，以建立高效液相色谱、毛细管电泳分析 法进行手性物质的分离，也可以用于样品的预处理。在这些应用中，分子印迹聚合物 的作用类似于免疫色谱中的免疫吸附剂。目前已在氨基酸及其衍生物、多肽及手性拆 分、单糖和酸有较好的应用。在这方面瑞典的l u n d 大学的m o s b a c h 及其合作者的工作 最有代表性【2 6 1 。 1 2 5 2 固相萃取 传统固相萃取( s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 的目标物与吸附剂之间的作用力是非 l o 第一章绪论 特异性的，通常需对萃取和洗脱条件进行仔细选择，而且对不同分析物与基质的分离 需要选择不同的柱填料，从而限制了s p e 的进一步发展。为了提高柱效与重现性、扩 大其应用领域，新型高选择性识别能力填料基质的开发研制是非常重要的，m i p s 独特 的选择性和亲和力适应了这一发展要求。由于模板选择的多样性，使得m i p s 能广泛应 用于物质的分离与分析过程，将分子印迹聚合物微球作为吸附剂用于固相萃取，这种 方法可用于医药、食品和环境分析样品的制备以及利用分子印迹聚合物微球选择性富 集目标分析物，它对于目标物质的高度选择性也是普通s p e 所不能比拟的【2 h 2 1 。 1 2 5 3 天然抗体模拟物 分子印迹聚合物模拟天然抗体具有很大的优越性，相比天然抗体，它不需经过动 物实验和免疫技术，能耐酸、碱有机溶剂及高温、高压环境，并可回收利用【4 3 4 丌。从 应用的角度来说，将分子印迹聚合物作为抗体模拟材料具有快速、稳定、廉价、耐用 的优点。m o s b a c h 等【l o 】用m i p 代替抗体在r i a 测定中检测药物中的吗啡、茶碱等，取得 了与单抗相似的交叉反应。抗茶碱分子印迹聚合物用于检测病人血浆样品中茶碱的含 量是完全符合医学检测要求的。这证明印迹聚合物抗体和受体完全可以作为生物抗体 的理想替代品和有益的补充。a n d e r s s o n 等 4 s 】成功地制备了删) 呻i n e 和e n k 印h a l i n 分子 印迹聚合物，该聚合物可以作为人t o p i o i d 受体，这些抗吗啡印迹聚合物在有机溶剂 和水相中均能有效的完成识别过程，只是在水相中检测极限下降了1 0 倍。 1 2 5 4 传感器 生物传感器虽然具有极高的灵敏度和特异性，但由于用作分子识别元件的生物活 性组分极易变性失活，传感器制作成本高，可供使用的生物活性组分的种类有限，从 而限制了其大规模的应用。如果能将m p 用作分子识别元件就会使传感器在保持较高 的选择性和灵敏度的同时，耐受性提高，寿命延长【4 9 】。分子印迹聚合物制成的传感器 已经用于除草剂、糖类、核酸和氨基酸及其衍生物、医药、毒素、溶剂和蒸气等的检 测蚓。s h i m i z u 4 9 1 等基于分子印迹研制的比色法阵列传感器可以同时识别7 种不同的芳 香胺。 1 2 6 分子印迹技术的展望 分子印迹技术在不断深入发展，其应用领域也变得更加广泛，但该技术仍存在许 多问题需要解决。 第一，人们对分子印迹聚合物识别位点的作用方式仍没有完全了解，无法对其进 行系统的完全定量描述，对其从分子水平上的探讨还不够深入； 第二，目前分子印迹聚合过程大多只能在有机相中进行，而自然的分子识别系统 北京化工大学硕士学位论文 比如生物酶、天然抗体等的作用环境却是水溶液，如何实现印迹聚合过程的环境从有 机溶剂到水溶液的转变也是需要解决的问题； 第三，目前的聚合方法不能完全满足以大分子、高分子为模板的分子印迹聚合反 应。 由此，我们可以预期今后分子印迹技术的发展趋势如下： 第一，分子印迹聚合物的制备和识别过程会逐渐从分子水平上真正得到解释； 第二，从功能单体和交联剂入手，发展出新的聚合方法，从而为聚合环境从有机 相到水相的转变成为可能，同时也使得以大分子、高分子作为模板分子的分子印迹聚 合的效果更上一个台阶。 分子印迹聚合物作为一种具有分子识别能力的新型高分子材料，其应用领域必将 随着研究工作的深入变得越来越广泛。 1 3 本论文研究的内容和意义 对我国而言，植物提取从整体上还是一个新兴行业，但其近几年的发展迅速，其 国际市场空间变得越来越广阔，产业化势头也越来越明显。作为众多植物提取中的一 种，石榴皮的植物提取也受到越来越多的关注。安石榴甙作为石榴皮提取物中的一种 活性成分，其分离纯化成本较高。而分子印迹技术作为一种日趋火热的技术，其三大 特性在色谱分离和固相萃取上也展现出很好的应用前景。把分子印迹技术与植物提取 中的分离纯化相结合，无疑将为植物提取提供一种新的、很有发展前景的途径。 因此，基于以上想法，本实验利用m i p 优良的分子识别性能，稳定的物理和化学 性能以及制备简便的特性，期望制备出以安石榴甙为模板分子的分子印迹聚合物，为 石榴皮提取物中安石榴甙的分离提纯提供高选择性的分离材料。 本实验首先通过柱层析对石榴皮粗成品进行了提纯，获得了纯度较高的安石榴 甙，并以此为模板分子原料，再采用丙烯酰胺为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯 ( e d m a ) 为交联剂，偶氮二异丁腈( a i b n ) 为引发剂，乙腈为溶剂，使用沉淀聚合法