（作物遗传育种专业论文）番茄钙依赖型蛋白激酶LeCPK2基因克隆及表达分析.pdf

摘要 钙介导的信号转导是植物细胞中最广泛存在的信号转导途径之一，在植物对各 种环境刺激包括光、非生物胁迫( 冷、热、盐、干旱、机械伤害等) 、病原物感染、 激素以及内部发育信号响应过程中起着至关重要的作用。c d p k s ( c a l c i u m d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e s ) 作为一类钙感知蛋白，是处于钙信号转导通路上游的 一种重要组分。对c d p k s 基因进行鉴定和功能研究，是揭示钙信号转导机制及发现 植物在抗逆反应和激素调控中的靶分子关键所在。番茄( 伽邮j 门p s c z ，彻舌伽 所，d 是茄科番茄属的一年生或多年生植物，它是世界上最重要的果蔬两用作物之 一，同时又是种重要的模式植物，但对其c d p k s 的研究却十分有限。因此，研究 番茄钙依赖蛋自激酶的生物学功能，具有重要的理论意义和应用价值。 本研究以斯c d n a 序列为信息探针，通过电子克隆的方法，获得了一个 长1 9 8 2 b p 的钙依赖蛋白激酶基因三p 僦，对g 僦及其编码的蛋白结构以及该 基因的表达等特性做了分析，并对其功能进行了初步的研究，获得如下结果： 1 序列分析表明，该基因包含完整的阅读框，编码5 6 5 个氨基酸，推导的蛋白 分子量为6 6 8 王a 。该蛋白具有典型钙依赖型蛋白激酶的结构特征，即激酶区、自 抑制区和4 个e f 手型结构。该氨基酸序列与s t c p 、n t c p k 5 及n t c p k 4 具有很 高的同源性，分别为9 5 、9 0 和8 8 。进化树分析表明l e c p k 2 在进化上处于c p k 和c r k 之问。 2 半定量r 1 l p c r 结果显示：p c 尸愆在根、茎、叶、花、果中均有表达，但 具有组织差异性，p 僦在花中大量表达，叶和根次之，在茎和果中微量表达： 4 2 高温能够诱导上p c 2 基因的表达，而4 低温对三p 蚴的表达几乎没有影 购；机械伤害后叶片中如c 纠表达量显著增加；三p 僦能对乙烯、茉莉酸和水 杨酸刺激做出不同程度的响应。 4 为了进一步了解该蛋白激酶的生化特性，构建了原核表达载体p e t 3 0 a l e c p k 2 ，在大肠杆菌中表达获得了特异的表达蛋白，并对蛋白进行了纯化获得了有 活性的蛋白激酶。 5 构建了中间载体p a r t 7 l e c p k 2 和表达载体p 鲇玎2 7 l e c p k 2 ，通过根癌 农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草，经p c r 检测共获得了3 2 棵阳性植株。 6 初步分析表明，l e c p k 2 蛋白参与了乙烯、茉莉酸和水杨酸调节的信号途径， 并能对高温和伤害做出响应，因此，l e c p k 2 在番茄的生长发育过程中可能参与多 种具有调节途径。 关键词：钙依赖型蛋白激酶番茄激素表达分析 ab s t r a c t c a 2 + ，a ni m p o r t a n ts e c 伽dm e s s e n g e ri np l a n tc e l l ，i si n v o l v e di nm u l t i p l es t r e s s r e l a t e ds i g n a it r a n s d u c t i o n a m o n gm o s tc 1 1 j c i a lc a l c i u ms i g n a ls y s t e m s ，c a z 十( ：d p k p l a y se s s e m i a lr o l e si nr e s p o n d i n gt ov a r i o u sa b i o t i cs t r e s s ，l i g h tr e s p o n s e s ，p h y s i o l o g i c a l d e f e n c e s ，h o 姗o n es t i m u l a t i o n s a i l d d e v e l o p m e n tp r o c e s sr e g u l a t i o n s t b m a t o ( 五y 矽脚c 册嗍，拓刀加 渐柳，a 1 1a f l n u a lo rp e r e n n i a lp l a n tb e l o n g i n gt os o l a n a c e a e l y c o p e r s i c o n ，i so n eo f m o s tp o p u l a rv e g e t a b l e ( f m i t ) a no v 玎t h ew o r l da n di sam o d e l p l a n t ，h o w e v e r s t u d i e so n i t sc d p k s 、阮sr e l a t i v e l yl a c k s o ，i n v e s t i g a t i o n so n b i o l o g i c a l 凡n c t i o n so fc d p k si n t o m a t oi m p l ys i g n i f i c a n c ei nt h e o r e t i c a ls t u d ya n d p r a c t i c a la p p l i c a t i o n i nt h i ss t u d y w i t hn t c p k 5c d n as e q u e n c ea si n f 0 瑚a t i o np r o b e ，w ea c q u i r e da l9 8 2 b pl o n gc d p kn a m e dl e c p k 2b yh o m o l o g o u ss 髓r c h 、 s e q u e n c ea l i g n m e n t a n d i u - p c ri d e n t i 母i nt h et o m a t oe s t ( 1 a t a b a n k s u b s e q u e n t l y i t sp r o t e i ns t l l j c t u r ea n d e x p r e s sp r o f i l ew e r ea n a l y z e d t h er e s u l ts h o w s ： 1 s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w st h a t 三p ( - 3 ：k 2i n c l u d sa 如l lo p e nr e a d i n gf j - a m e 、v h i c h e n c o d e s5 6 5a m i n oa c i d sw i t hap u t a t i v ep r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h to f6 6 8 k d a f o r p r o t e i ns t r u c t u r e ，i tc o n t a i n st y p i c a lc o n s e a t i v ed o m a i n so fc d p k s ，n a m e l yk i n a s e d o m a i n ，a u t o i n h i b i t o d rr e g i o na n df o u re fh a n d s 砧i g n m e mw i t ha m i n oa c i ds e q u e n c e o fs t c p k i ，n t c p k 5a n dn t c p k 4s h o w s 9 5 ，9 0 粕d8 8 i d e m i t yr c s p e c t i v e l y a n a l y s i so fp h y i o g e n e t i ct r e e r e 、，e a i e dt h a tl e c p l ( 2i sb e “旧e nc p ka n dc r ki n p h y l o g e n e s i s 2 t h r o u g hl m p c ra n a i y s i s ，p c p ，2w a sd e t e c t e di nr 0 0 t ，s t e m ，i e a fa n df m i to f t o m a t o 、v i t ht h eh i 曲e s tl e v e l i nf l o w e r ，h i g h e ri nl e a fa n dr 0 0 t 锄dl o w e s ti ns t e ma n d6 1 j i t 。 三p ( = ：l 明固i sr e s p o n s e dt ot e m p e r a t u r ew h e nt r e a t e da t4 2 0 cb u tn o tt 0a t4 0 c 舢s o ， 三p c 隧2i sa c c u m u l a t e dr e m a r k a b l yb ym e c h a n i c a lw o u n da n d 括r e s p o n d e dt ov a r i o u s h o r m o n e ss u c ha se t | l ，j as aw i t hd i f r e r e n ti n t e n s i t y 4 f o rm n h e r i n v e s t i g a t i o n o nb i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i co fl e c p i 2 ，a r e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rp e t 3 0 a l e c p k 2w a sc o n s t m c t e da n dt 啪s f o r m e di n t o e c d 厅s t r a i nr o s e t t a2 ( d e 3 ) r e c o m b i n a mp r o t e i nw a se x p r e s s e d ，p u f i e da n df 0 1 l o w e d b ye n z y m a t i ca c t i v i t ya s s a y 5 t r a n s g 朗i ct o b a c c o sw e r eo b t a i n e db yl e a f d i s c st r a n s f o r m a t i o nw i t hi n t e r m e d i a t e v e c t o rp a r t 7 一l e c p k 2a n de x p r e s s i o nv e c t o rp a j t t 2 7 一l e c p k 2a n di d e n t i n e db y p c r 6 b a s e d0 n0 b t a i n e dr e s u l t s ，w bp r e d i c t e dt h a tl e c p k 2i si m p l i c a t e di ns i g n a l p a t h w a y sr e g u l a t e db ye t ，j 八s aa n dr e s p o n d s t ow o u n ds t r e s s h o 他v e li ti s n e c e s s a 哆t oi n v e s t i g a t ep h y s i o l o g i c a l 如n c i o n so fl e c p k 2i nt o m a t om n h e r k e yw o r d s ：c a l c i u m d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ，t o m a t o ，h o 肌o n e ，e x p r e s s i o n ，a n a l y s i s i v 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所吊交的学位论文，是本人在导师的指导f ，独立进行研究j j _ ：作所取 得的成果。除文中已经注明引h j 的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名：芬峻笪 日期：2 ，p 孑年舌月岁日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南人学关_ 丁收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印什和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南人 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海 南入学。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名：苏欢兰 日期：) 础年月主日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学何论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论 文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可 权蕊。回意i 金文握交后滥丘；口：匕笙；口二玺：宜二笙友盔。 论文作者签名：彩、必钍 日期：2 砌暮年多月j 日 按“章程”中规定享受相关 导师 日期签始协 ：认矿6 其6 b 1 前言 1 1 植物c p k 超家族蛋白激酶 植物在其生长过程中持续地受到外界环境的影响，并对外界刺激产生应答。c a 2 + 信号转导途径中的钙调蛋白激酶是一类研究较为透彻的蛋白激酶，其中的c p k 超家 族蛋白参与植物对外界生物和非生物胁迫的应答反应，在植物生长和发育过程中发 挥重要的作用。 1 1 1 植物c p k 超家族蛋白激酶的分类和结构特征 c p k 超家族是由四类蛋白激酶构成( h a r m o n 等，2 0 0 0 ) ，包括钙依赖型蛋白激酶 c d p k ( c a l c i u m d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ) 或钙调素结构域蛋白激酶c p k ( c a l m o d u l i n d o m a i np r o t e i ni 【i n a s e ) 、钙调素依赖型蛋白激酶c 小 ( c a l m o d u j i n d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ) 、嵌合型钙钙调素依赖型蛋白激酶c c a m k ( c a l c i u ma n dc a l m o d u l i n d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ) 和c p k 相关蛋白激酶c r k ( c p k 。r e l a t e dp r o t e i nk i n a s e ) 。这四类蛋白的分子结构特征见下图： n c d p k a i i t o i n l l l l ) il o r crk 躏囊圜照癌圈喇、匠卫髓 一d e q e n e r a l e d c c a m k 曩舞蹬嘲嘲嬲嘲二匠腰i 哪 一v l s i n i n 1 i k e camk 囊嘲嘲融匿韪圆懋嘲。”? 亡= 二= 二二 一 a s s o c i a t i o n d o m a i n 再面诏五万p 酉司苫蕊确 图1 一l ：c p k 超家族成员地结构特征( 引白h a r m o n 等，2 0 0 0 ) 。 1 1 钙依赖型蛋白激酶 钙依赖型蛋白激酶( c a l c i u m d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e c d p k ) 或钙调素结构域蛋 白激酶( c a l m o d u l i n - d o m a i np r o t e i nk i n a s e c p k ) ，这一类蛋白激酶的典型结构特征在 于其c 端具有高度类似于c a m 结构的结构域。在没有c a 2 + 存在的情况下，位于激 酶区和钙调素相似区之问的自抑制区结合到激酶区的活性位点上，抑制激酶的活性。 而c a 2 + 结合可以导致钙调素相似区构像发生变化，从而使自抑制区从激酶区的活性 位点上释放而使激酶活化( h u a n ge t 扣 ，1 9 9 6 ) 。拟南芥基因组中存在3 4 个c d p k 编 码基因( ( c h e n ge ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 c d p k 是植物中研究最广泛的钙调蛋白激酶( ( c h e n ge ta 1 ，2 0 0 3 ) 。其中分子中包 括三个高度保守的结构域：激酶区( 1 ( i n a s ed o m a i n ) 、自抑制区( a u t o i n h i b i t o 呵r e g i o n ， 也称连接区j u n c t i o nd o m a i n ) 和钙调素相似结构域( c a m 1 i k ed o m a i n ，也称c a 2 + 结合 区c a 2 + - b i n d i n gd o m a i n ) ( h a r p e r e ta 1 ，1 9 9 l ；h 舢o ne ta 1 ，2 0 0 0 ；h r a b a l c ，2 0 0 0 ) 。 激酶区是真核生物蛋白激酶所共有的高度保守的区域，由1 1 个亚结构域组成，其中 的几个氨基酸残基具有高度保守性，在所有的蛋白激酶区都是一致的。激酶区域都 含有激酶活化位点和舡p 结合位点，是保证c d p k 做为一个蛋白激酶的基本结构区 域。此外，c d p k 的n 端可变区的序列高度变异，有很多研究表明这一区域与蛋白 质的亚细胞定位有很大的关系0 a n i n 和b u s c o n i ，2 0 0 0 ；r m s c h m a 衄e ta 1 ，2 0 0 2 ； l h i c e se t 甜，2 0 0 3 ；d a m m a n ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 1 1 1 。2 钙调素依赖型蛋白激酶 ， 钙调素依赖型蛋白激酶( c a m d 印e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ，c a s ) ，在动物中研究 的较为充分( 如c 糊i ，池c k ) 。目前只在少数几种植物中得到了分离，其中具有 代表性的c 出是从苹果中分离鉴定的c b l ( w a t i l l o ne ta 1 ，1 9 9 2 ；1 9 9 3 ；1 9 9 5 ) 和 从烟草中分离出来的n t c 棚 1 ( m ae ta j ，2 0 0 4 ) 。拟南芥中不存在c 心( m a b a ke t a 1 ，2 0 0 3 ) 。植物c 舢( 序列与动物c 小氨基酸序列并不十分同源，而与植物的 c c a m x 序列相似性较高。这类蛋白激酶有一个典型的c a m 结合区域，但不存在c 端的c a m 相似区域，因此不能结合c a 2 + 。其激酶活性通过外源的c a m 结合到位于 c 端的自抑制区而活化。 1 1 1 3 嵌合型钙钙调素依赖型蛋白激酶 钙钙调素依赖型蛋白激酶( c a 2 + c a m d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ，c c 小) ，首先从 百合中得到鉴定( ( p a t i le ta 1 ，1 9 9 5 ) ，在烟草( “ue ta 1 ，1 9 9 8 ) ，水稻以及苔藓植物 p h y s c o m i t r e l l a ( j e 妇胁ye ta 1 ，2 0 0 4 ) 等少数植物中发现也有存在( p a t he ta 1 ，1 9 9 5 ； l i ue ta 1 ，1 9 9 8 ) 。而在拟南芥中不存在c c 舢( 。生化鉴定表明该激酶也可以被外源 c a m 所活化。其c 末端的调节区域和神经视锥结构( ( 3 个e f h a n d ) 非常相似，分子 结构明显区别于已知的c p k 。 1 1 1 4 钙依赖型蛋白激酶相关蛋白激酶 钙依赖性蛋白激酶相关蛋白激酶( c p k s r e l a t e dp r o t e i nk i n a s e s ，c r k s ) 是一类同 c p k s 非常类似的蛋白激酶( h r a b a ke ta 1 ，2 0 0 3 ) 。序列比较发现，c r k s 同c p k s 的 催化区域的同源性最高并具有激酶保守区域。但是c r k s 上没有典型的c a 2 + 结合区， 仅有四个已退化的同e f 手型结构相类似的结构域，不能和钙结合。其分子中与c p k 连接区的对应序列，保守性有所降低，一些c i 蛋白的这一区域还可以结合c a m 。 2 1 1 2 植物钙依赖型蛋白激酶的研究进展 活性依赖于c a 2 + 而不依赖于c a m 的蛋白激酶于1 9 8 2 年在豌豆中首次发现 ( h e t h e r i n 群o n 和1 r e w a v a s ，1 9 8 2 ) ，并于1 9 8 7 年从大豆中纯化了第一个c p k ( h a r m o n e ta 1 ，1 9 8 7 ) 。迄今为止，植物界从绿藻到被子植物都发现了c p k ( h r a b a k ，2 0 0 0 ； h a r m o ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在动物中，c p k 只在一些原生动物中存在，而在酵母，线虫， 果蝇以及人中明显的不存在c p k 基因。拟南芥基因组全序列的测定，为c p k 基因 家族序列的分析提供了方便。拟南芥全基因组中含有3 4 个c p k 基因分布于所有5 条染色体上( c h e n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) ，序列同源性分析可以将这3 4 个基因分为四个亚家 族。序列进化树分析表明，c p k 与c p k 相关蛋白激酶c r k 可能是由同一个激酶序 列进化而来( c h e n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。拟南芥c p k 第1 v 亚家族成员包括a t c p k l 6 ， a t c p k l 8 和a t c p k 2 8 。从进化上讲，这一亚家族序列与拟南芥c r k 同源性最高， 其在进化关系上处于c p k 与c r k 之间的过渡。另外，还有一个从土豆中分离的 s t c p k i ( l a l ( a t o se ta 1 ，1 9 9 8 ) ，它不仅与c p k 有较高的同源性，同时也与c r k 有较 高的同源性，因此，与拟南芥c p v 亚家族成员一样，在进化上它也介于c p k 与 c r k 之间。 1 1 2 1 钙依赖型蛋白激酶的生化特性 c d p k 的c 末端类似于c 蝴的调节区，与c a m 有约4 0 的同源性，由四个 e f 手型结构组成，能与四个c a 2 + 进行结合：中间为s e r 玎 l r 激酶催化区，能使底物特 定部位的s e r t h r 磷酸化；在激酶区和调节区之间为自主抑制区，由大约31 个氨基 酸残基组成( h 锄o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。当不存在c a 2 十时，自抑制区结合到激酶的活化 位点上从而抑制酶活性。当c a 2 + 与c p k 的调节区结合后，其分子内发生构象变化， 激酶的c 端调节区折叠过来与上游的自主抑制区相结合，从而破坏自主抑制，c p k 被激活( h a 印e re ta 1 ，1 9 9 1 ) 。不同的c p k 在不同的c a 2 + 浓度下被激活，大豆的三种 c p k 亚型a ，p ，y 达到最大酶活所需要的c a 2 + 浓度差别超过了两个数量级( ( l e ee t a 1 ，2 0 0 0 ) 。近来有研究表明c p k 对c a 2 十的敏感度还受到了其蛋白底物的影响，底 物的存在能有效提高c p k 对c a 2 + 的亲合力( h a r m o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。此外，一些脂类、 多肽以及1 4 3 3 蛋白也会影响c p k s 的活性( s c h a l l e re ta 1 ，1 9 9 2 ；h a r p e re ta 1 ，1 9 9 3 ； b i n d e re ta 1 ，1 9 9 4 ；f a r m e r 和c h o i ，1 9 9 9 ；c a m o i l ie ta 1 ，1 9 9 8 ) 。虽然c p k s 的活性 不受钙调素激活，但却受到c a m 拮抗剂如w 7 、氯丙嗦、三氟拉嗦、c a l m i d a z o l i n 等抑制，但c 洲拮抗剂抑制c p k s 的浓度要比抑制c 撇依赖型酶的浓度大 ( p u t n a n e v a n se ta 1 ，19 9 0 ) 。 1 1 2 2 钙依赖型蛋白激酶的生理功能及调控 与c d p k 的生物化学特性研究相比，人们对c d p k 的生理功能了解还不够系统 和完善的。越来越多的研究证据表明，不同亚型的c d p k 可能行使不同的功能。尽 管c d p k 可能作为许多信号转导通路的生化调节因子，但在c a 2 + 信号转导中的对应 于每一个单独事件的确切的c p k 亚型以及其准确的生物学功能还知之甚少。缺少亚 型特异的抑制剂和显性缺失突变的构建，以及c d p k 基因家族的功能冗余，都使得 研究c d p k 的生物学功能显得较为困难。尽管如此，功能研究还是取得了很多重要 的进展( 杨洪强等，2 0 0 3 ) 。 1 1 2 2 1 激素应答 许多激素均可改变胞内钙的浓度。c d p k 可能作为钙受体在激素信号转导途径 中起重要作用。用g a 处理水稻种子后，发现g a 明显提高了c d p k 的活性( a b o e l s a a d 毗a 1 ，1 9 9 5 ) 。油菜素内酷处理水稻叶片也可提高c d p k 活性( y a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 在体内，c d p k 可以活化激素应答反应基因。如拟南芥a t c p k l o 和a t c p k 3 0 可活 化大麦a b a 应答反应的启动子( s h e e ne ta l ，1 9 9 6 ) ，c d p k 还可以通过激素调控转录 水平。g a 、a b a 、生长素和细胞分裂素可以引起离体烟草叶片n t c d p k l i n 】 a 的 表达( y 0 0 ne ta 1 ，1 9 9 9 ；切l a n a ta n dj a y a b s k a r a n 2 0 0 2 ； d a v l e t o v ae ta l ，2 0 0 1 ) ，而吲哚 3 一乙酸能刺激首稽砌叼嬲鞭打w ，d a v l e t o v ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 培养细胞和绿豆( g n a f a d i a t e b o t e l l ae ta 1 ，1 9 9 6 ) 中特异的c p k 基因的表达。用j a ( 茉莉酸) 对马铃薯进行 研究发现，高浓度的j a 加入m s 培养基对马铃薯组培苗进行长期处理后，叶片亚 细胞受影响，过氧化物酶体大小和数量均增加，高浓度激素启动了自体吞噬过程， c d p k 活性被抑制了8 0 ，转到无激素的培养基上，c d p k 的活性抑制作用被解除 l l o ae ta l ，2 0 0 2 ) ，这表明植物激素j a 对c d p k 的活性及c d p k 的表达起负调节作 用。在蚕豆细胞中存在着一个5 3 k d 的钙依赖蛋白激酶，具c 洲类似结构，可被 a b a 诱导或激活。a b o e 1 s 龃d 和w u 发现水稻原生质膜c d p k 可被g a 诱导 ( a b o e j - s a a de ta l ，1 9 9 5 ) 。 最新研究还表明，d i k 可能直接参与了激素的合成代谢途径。植物中a c s ( 1 a m i n o c y c l o p r o p a n e l c a r b o x y l a t e s y n t h a s e ，氨基环丙烷梭基合酶或a c c 合酶) 催 化乙烯合成中的关键步骤，有证据表明该酶的稳定性依赖于可逆磷酸化的调节。体 外实验中，根据番茄a c s 基因l e a c s ) 中已知的磷酸化位点合成的多肤能够被几种 c d p k 所磷酸化，但不能被s n f ，相关蛋白和油菜素内酷信号途径中受体样蛋白激 酶b r i ，所磷酸化，暗示a c c 合酶可能是c d p k 的直接底物( h e m a n d e ze t 羽，2 0 0 4 ) 。 1 1 2 2 2 生长和发育调控 植物在生长发育过程中同样受钙离子浓度变化及蛋白激酶的表达调控f e v a n se t a 1 ，2 0 0 l ；h e p l e re ta 1 ，2 0 0 1 ) 。一个典型的例子是，玉米花粉管特异的c p k 基因仅 局限于花粉发育的晚期表达，在花粉培养过程中施加些c 删的拮抗剂、c p k 抑 制剂以及针对c p km r n a 的多聚体核普酸序列都会对花粉的萌发和花粉管的生长 产生抑制( e 熨r u c he ta 1 ，1 9 9 4 ) 。此外，在百莲子伞形花序中，区域内胞质钙离子浓 度升高会导致花粉管转向，也会导致c d p k 活性升高。一个烟草花粉管c d p k 能够 4 磷酸化柱头上的自我不亲和l 喇a s e ，这说明c d p k 在自我不亲和调节中也发挥作用 ( e v a n se ta 1 ，2 0 0 l ；h e p l e re ta j ，2 0 0 l ；k u n ze ta 1 ，1 9 9 6 ；m o u t i n h oe t 甜，1 9 9 8 ) 。 另有实验表明，从烟草花粉管中克隆到的一种c p k 能磷酸化花柱自交不亲和 s r n a s e ，暗二j ；c p k 可能调控花粉自交不亲和( k u n z ，1 9 9 6 ) 。将大豆c p k 单克隆抗 体荧光标记后孵育到紫露草的花粉管中，发现其与肌动蛋白共分布，说明c p k 可能 通过与细胞骨架的相互作用参与花粉管生长的信号转导过程，但其作用机制尚不清 楚( p u t n a m e v a n se ta 1 ，1 9 9 0 ) 。在土豆( 勋j ： 聊删纫施m 鳃删) 块茎形成的早期， s t c d p k l 的m r n a 积累会发生时空变化，同时c p k 激酶活性也会相应发生变化 ( m a c i n t o s he ta 1 ，1 9 9 6 ：r a i c e se ta 1 ，2 0 0 1 ) ，在植物瘤的形成上，发现c p k 能够在 体外磷酸化瘤特异表达的蛋白n o d u i i n 一2 6 和n o d u l i n 一1 0 0 ( w ，e a v e r 和r - o b e n s ，1 9 9 2 ； z h a n g 和c h o l l 吒1 9 9 7 ) 。此外，c d p k 可能还参与调节其它一些发育过程，如种子 的形成和萌发过程( a j l i le ta 1 2 0 0 l a ) 。檀香木( s a n t a l u ma l b u m ) 胚胎发育、种子形成 及萌发过程被发现有c d p k 参与，并且有不同的时空积累和活性( a n i le ta 1 2 0 0 0 ) ； 个种子发育特异性的水溶性s s l ( d 的c d p k 得到了纯化和鉴定( a n i le t a 1 2 0 0 l b1 。水稻两个c d p k 同系物o s c d p k 2 和o s c d p k l l 在种子发育过程中的表 达模式不同：o s c d p k 2 在种子的发育早期表达水平低，随后增加到高水平并保持 到种子发育后期( 受精2 0 d 后) ；与此相反，o s c d p k l l 在种子发育早期表达水平高， 但从受精1 0 d 后迅速降低( f r a t t i n ie ta 1 1 9 9 9 ) 。其它c d p k 还可能参与性器官的发 育( n i s h i y a m ae ta 1 1 9 9 9 ) 。 1 1 2 2 3 非生物胁迫 许多胁迫信号，如伤害、冷、高盐分和干旱在引起胞质钙离子水平的波动的同 时，也引起蛋白磷酸化的变化( b u s h ，1 9 9 5 ；t r e 、阮v a s ，1 9 9 9 ；k n i 曲t 和k n i g h t ，2 0 0 1 ) 。 c p k 可能参与介导非生物胁迫信号的传递。玉米原生质体c d p k l 和c d p k l a 能激 活可被干早和高盐胁迫诱导的启动子，而去除c d p k l 激酶区的突变体对胁迫和 a b a 刺激没有应答( ( s h e e n ，1 9 9 6 ) 。从拟南芥中分离了2 个编码c d p k 的基因， n o 劬e mb 1 0 t 分析表明在干早和高盐胁迫下，这两个基因的m r n a 迅速被诱导，在 胁迫下，c d p k 的酶活性也增强。以o 2m o l ln a c l 对玉米根尖进行盐胁迫，质膜 的一种受钙激活的蛋白激酶( 表现为c p k 的特性) 的活性迅速增加( 陈武和陈枷， 1 9 9 8 ) 。从冰叶日中花( 红舳聊6 ，弘删妇p 棚姗，删胁堋，) 中分离的c p k ( m c c d p k l ) 是盐和干早诱导的( p a t h a r k a r 和c u s h m a n ，2 0 0 0 ) 。水稻中4 5 k d 的c d p k 受冷胁迫 的抑制，但可被用5 u m o l a b a 逆转而解除抑制，这个结果表明，内源a b a 可能参 与调控c d p k 对冷胁迫的反应( k o m a l s u 或a 1 ，2 0 0 1 ) 。相反，水稻中一个5 6 k d 的与 膜结合的c d p k 在冷处理中被激活，免疫杂交分析发现，冷处理后，c d p k 激酶水 平与对照相似，但是处理后激酶活性和自磷酸化活性均大幅度提高，c d p k 在冷处 理1 2 一1 8 小时后才被激活，这表明，在低温处理的最初阶段c d p k 不参与，但参与 s 在恶劣环境下的适应过程，c d p k 是在低温胁迫的后转录水平被激活的( m a f t i nt a l ，2 0 0 1 ) 。水稻中的另一种c d p k 基因o s c d p k 7 是由冷和盐胁迫诱导的，水稻耐冷 和盐干旱胁迫的程度与仇a ，豚7 的表达水平密切相关：o s c d p k 7 的过量表达加速 了盐干旱但不是冷胁迫应答基因的诱导( s 卸oe ta 1 ，2 0 0 0 ：2 0 0 1 ) 。这些都说明c p k s 可能在干早和盐胁迫信号中起着正调节因子的作用，促进植物相关胁迫应答基因的 表达。 1 1 2 2 4 抵抗病源侵害 在植物中对病原系统的广泛研究表明，胞内钙在病原诱导的信号转导过程中增 加是重要的导期作用( x u 和h e a t 札1 9 9 8 ：b l u m ee ta 1 ，2 0 0 0 ；f e l l b 订c he ta 1 ，2 0 0 0 ； g f 柏tc ta 1 ，2 0 0 0 ；n i l r n b e r g e r 和s c h e e l ，2 0 0 l ；r u d d 和f r a n k l i n t 0 n g ，2 0 0 1 ) 。病原体 所编码的引发蛋白( 如a 9 ) 与相应的植物所编码的某种感受蛋白( 如c 9 ) 问发生相 互作用，从而引发由病原菌所诱导的信号通路。最近发现，除了c f 舢相互作 用可诱发这种病原菌反应。在c f l 9 转基因烟草中c d p k s 也可诱发这种反应，说明 了诱导性抵御反应中c d p k s 是重要的钙信号感受器( r o m e i se ta 1 ，2 0 0 0 ，2 0 0 1 ) 。当 烟草从病源的非诱导形式转化为诱导形式之后，c p k 的酶活性可以提高1 0 到2 0 0 倍。采用病毒介导n t c d p k 2 和n t c d p k 3 基因沉默之后，6 册玩聊砌叼显示出病 源侵害超敏反映的降低和延迟，并伴随萎蔫的表型；实验发现c d p 酗对于介导植 物中由c f 9 a ：9 所诱导的超敏反应起着重要作用( r o m e i se ta 1 2 0 0 1 ) 。在植物对 于病源侵害的早期应答中，c p k 的确切功能还不清楚，但是，由于c a 2 + 流动和c p k 活化是抗性信号转导途径的早期事件，因此，c p k 可能还调节着其他的早期过程。 例如，n a d h p 氧化酶可以受到c a 2 + 和磷酸化的调控( m e h d y 1 9 9 4 ； 债a 1 1 _ te ta 1 ， 2 0 0 0 ； k e l l ee ta 1 ，1 9 9 8 ) ，并且c 小c p k 的拮抗剂能够抑制磷酸化和胞质复合体 的跨膜定位以及阻止活性氧化合物的形成( ( n ge ta 1 ，1 9 9 7 ：l b m e i se ta 1 ；2 0 0 0 ) ， 因此，推测c p k 可能介导这一间接的钙调控途径。病源诱导的活化的c p k 还可能 调节胞质内其它的离子流动。例如，c p k 可能通过改变h + 流动而以c a 2 + 和磷酸化 依赖的方式调节质膜的一a t p a s e ( s c h a l l e r 和s u s s m a n ，l9 8 8 ：s c h a l l e re ta 1 ， 1 9 9 2 ；c a m o i l ie ta 1 ，1 9 9 8 ；l i n oe t 址。，1 9 9 8 ；d en i s ie ta l 。，1 9 9 9 ； s c h a i l e 和o e d d i n g 1 9 9 9 ) 。 1 1 2 2 5 参与糖氮代谢 植物为了适应环境和生长发育，植物需要调整氮碳代谢。受c d p k 调节的碳代 谢的主要酶是蔗糖合成酶( s u s y ) 、蔗糖磷酸合成酶( s p s ) 和硝酸还原酶( n i t ) 。其中 s u s y 和s p s 分别催化蔗糖裂解与蔗糖合成m u b e re ta 1 1 9 9 6 ) ，而n r 是从硝酸盐同 化氮素的限速酶。对几种植物s u s y 的体外实验表明，c d p k 的主要磷酸化位点是 位于氮端第l1 到1 5 残基之间的苏氨酸残基，由于该苏氨酸残基不能被异源的s u s v 蛋白激酶( 哺乳动物蛋白激酶a ) 所磷酸化，因此对该苏氨酸残基的磷酸化是c d p k 6 所特有的( z h a n ge t 以1 9 9 9 ；l 0 0 9e a 1 2 0 0 0 ) 。在几个物种当中( 包括拟南芥) 这个s e r 和周围需要c d p k 磷酸化的位点是高度保守的，这表明蔗糖合成酶的磷酸化对蔗糖 代谢的调控是重要的，这个磷酸化作用减少了与膜结合的作用，增加了胞内蔗糖合 成酶的数量。磷酸化引起的生理上的重大变化仍不清楚，但对于通过专一生物合成 途径指导水解产物可能非常重要( h a 硼o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 在体外能够磷酸化s p s 和氮代谢限速酶硝酸还原酶( n r ) 的特异激酶有重叠， 它们都是在黑暗中磷酸化而受到抑制的：s p s 是通过s e r l 5 3 的磷酸化直接被抑制的； 而n r 是通过一个两步反应机制即s 郎4 3 的磷酸化和1 4 - 3 - 3 蛋白与该磷酸化位点的 结合而被抑制的( c h u n ge ta 1 1 9 9 9 ) 。这两种酶的调节位点的磷酸化可能是由种 c d p k 完成的。这表明c d p k 可能在协调植物界的氮碳代谢中起枢纽的作用。c d p k 都能够使s p s 和n r 磷酸化，n r 还能够由第二个c d p k 同一个位点进行磷酸化而 失活，而c d p k 对s p s 几乎没有作用。最重要的是，根据细胞的需要，这些不同的 蛋白激酶可能使得s p s 和n r 的活性相互协同或分别受到调节( i ( a i s e re ta 1 2 0 0 l ； m a c i n t o s he ta 1 2 0 0 1 ) 。因此氮碳代谢可以受到相似的或不同的调节。 1 1 2 2 6 保卫细胞和气孔运动 气孔运动需要c a 2 十振荡调控保卫细胞的离子流( 舡s m a n n 和w a n g ，2 0 0 1 ) 。在 a b a 诱导的气孔关闭的过程中，c a 2 + 通过直接抑制质膜内向k + 通道而增加k + 外流。 ( a s s m a n n 和w a n g ，2 0 0 l ；s c h r o e d e re ta 1 ，2 0 0 l a ；2 0 0 1 b ) 。蚕豆保卫细胞c d p k 在体外能以钙依赖方式磷酸化拟南芥保卫细胞中的电压门控内向k + 通道k a t l ，这 种磷酸化需要k a t l 与膜的结合，表明在体内可能也存在这种调控( l ie t 甜，l9 9 8 ) 。 王喜庆等利用膜片钳全细胞记录方法研究初步证明，c p k 能够通过参与a b a 信号 转导而介导钙离子调节保卫细胞内向钾离子通道。胞内钙离子浓度升高