（病理学与病理生理学专业论文）yap在菲小细胞肺癌增殖侵袭中的作用研究.pdf

目录 i i i ii ii i t l l l u i i 1 1liiq y 18 9 3 4 18 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要9 二、英文缩略语1 9 三、论文 论文一 前言 200 0 0 刖舌 ” 实验材料与方法2 1 实验结果2 2 讨论o q ooq000 2 2 结论2 7 论文二 前言2 8日u 舌2 葛 实验材料与方法2 8 实验结果3 1 讨论o oo oo oo 3 8 结论q o o o oo o o0 s log 4 0 四、本研究创新性的自我评价4 1 五、参考文献4 2 六、附录 综j 苤4 5 在学期间科研成绩5 5 致谢5 6 个人简介5 7 中文论著摘要 y a p 在非小细胞肺癌增殖侵袭中的作用研究 刖昌 近年来肺癌发病率持续升高，在过去的3 0 年中，肺癌所导致的死亡已跃居 恶性肿瘤死因的第一位。而8 0 的肺癌患者死于肿瘤的复发和转移，因此寻找 调控肺癌侵袭、转移的关键靶点是提高肺癌患者生存率的关键。 y e sa s s o c i a t e dp r o t e i n ( y a p ) l 因其首先被发现能够与非受体酪氨酸激酶y e s 蛋 白结合而得名。最近研究发现y a p 是h i p p o 信号通路下游的效应分子，而h i p p o 通路是在进化过程中高度保守的调节细胞增殖和凋亡的关键信号通路。y a p 是一 个转录调节因子，它可以与具有p p x y 结构域的转录因子结合，包括e r b b 4 ，p 7 3 ， t e a d ，p 5 3 b p 2 ，r u n x 2 等，调节一系列与细胞增殖和凋亡相关的因子。在哺乳动 物中，h i p p o 通路可以使y a p 磷酸化，从而使其定位于细胞浆中，影响其与转录 因子的结合进而抑制其功能。在小鼠肝细胞中，y a p 能上调飚6 7 ，c m y c ，s o x 4 及a f p 的表达促进细胞增值，并上调b i r c 5 s u r v i v i n 的表达抑制细胞凋亡。 最近研究发现，y a p 在肿瘤发展过程中具有非常重要的作用。y a p 在肝癌，胃 癌，结肠癌，乳腺癌，卵巢癌等肿瘤中呈显著高表达；上调y a p 可抑制细胞间的 接触抑制作用；在乳腺上皮细胞m c f l 0 a 中上调y a p 可促进细胞的上皮间质转 化；在肝脏特异性高表达y a p 的转基因鼠中，y a p 可使肝脏体积明显增大并最终 发展成肝癌。 尽管越来越多的证据表明y a p 在肿瘤的发展中具有重要作用，但是y a p 在 非小细胞肺癌中的作用还不清楚。本研究目的旨在探讨y a p 在非小细胞肺癌中的 临床意义和生物学功能。 材料和方法 1 、组织来源 具有完整随访资料的9 2 例原发性非小细胞肺癌及相应正常肺组织标本均来 自1 9 9 5 年到2 0 0 3 年在中国医科大学附属第一医院实行手术的病人，组织经1 0 中性福尔马林固定、石蜡包埋。患者术前均未接受放化疗。组织学分类和分化程 度根据2 0 0 4 w h o 分类标准进行判定，按国际抗癌联盟的肺癌p - t n m 分期标准进 行病理分期。 2 、免疫组织化学染色 将石蜡组织块切成4 t x m 厚切片，脱蜡，脱水，在p h 6 柠檬酸钠缓冲液中高温 高压修复2 分钟。3 h 2 0 2 孵育2 0 分钟，5 山羊血清孵育3 0 分钟。抗y a p 的多 克隆抗体4 孵育过夜。以p b s 代替一抗作为阴性对照。采用e l i v i s i o n 试剂盒检 测抗体结合。d a b 显色，苏木素复染细胞核，封片。 3 、结果判定 y a p 免疫组化阳性信号定位于细胞浆与细胞核。我们根据免疫组化染色强度， 染色细胞百分比，核浆定位三个方面进行结果统计。我们将无染色的记为阴性。 对于浆着色，弱浆着色定为低表达，小于5 0 的强浆着色定为弱表达，大于5 0 的强浆着色定为强表达。对于细胞核染色，小于1 0 的核着色定义为y a p 弱表达， 大于1 0 的核着色定义为y a p 强表达。 4 、细胞培养 肺癌细胞系h 1 5 7 ，a 5 4 9 ( 购自a t c c ) 均用含1 0 热灭活新鲜小牛血清的 r p m l l 6 4 0 ( g i b c o ，u s a ) 、1 0 0 u m l 的青霉素、1 0 0 u m l 的链霉素的培养基，在3 7 c 、 5 c 0 2 的条件下培养。 5 、质粒和细胞转染 p c d n a 3 1 一h y a p 质粒由s u b h a mb a s u 教授( c a n c e rr e s e a r c hu k ，l o n d o n ，u k ) 惠赠。p c d n a 3 1 一h y a p 和对照p c d n a 3 1 质粒用a t t r a c t e n e 转染试剂根据说明 进行转染。m r n a 表达水平4 8 小时后通过r e a l t i m ep c r 检测，蛋白水平7 2 小 时后通过w e s t e mb l o t t i n g 检测。 6 、s i r n a 干扰 o n t a r g e t p l u ss m a r t p o o ls i r n af o ry a p 与o n - t a r g e t p l u ss i c o n t r o l 均购自 d h a r m a c o n 。转染前2 4 小时将细胞按5 0 密度接种于2 4 孔板，采用d h a r m a f e c t 1 转染试剂进行转染，转染后使用p c r 和w e s t e mb l o t 检测干扰效率。 2 7 、r e a l t i m ei m p c r 对于培养细胞采用r n e a s yp l u sm i n ik i tf r o m ( q i a g e n ) 提取总r n a 。采用 a b i h i g hc a p a c i t yc d n a r tk i t ( a p p l i e db i o s y s t e m s ) 进行反转录。p c r 采用s y b r g r e e n 染料法，使用a b l 7 9 0 0 实时定量p c r 仪，按照以下程序进行反应：5 0 ( 22 分钟，9 5 l o 分钟，9 5 c1 5 秒，6 0 。c 6 0 秒共4 0 个循环。为了证明扩增产物的特 异性引物都进行了融解曲线分析。b e t a - a c t i n 作为内参，采用相对定量法进行结果 分析，a c t = c t 基因一c t 内参，基因的相对表达量由2 也q 计算。实验都重复三次， 取平均值。 8 、w e s t e mb l o t 法检测蛋白表达 收集细胞加入裂解液充分裂解，低温高速离心( 4 ，1 2 0 0 0 转m i n ，3 0 m i n ) ， 提取上清为总蛋白。上样蛋白量为6 0 u g 。电泳( 1 2 s d s p a g e 凝胶) 、转印 ( 5 0 v , 1 2 0 m i n ) 、5 正常小牛血清封闭，一抗4 孵育过夜，分别与对应的二抗室 温孵育2 h ，e c l 显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪( c h e m ii m a g e r5 5 0 0 ，a l p h a i n n o t e c h , u s a ) 采集，进行灰度值测定。 9 、m t t 法检测细胞增殖及集落形成实验 将单个细胞悬液接种子9 6 孔培养板中，每孔体积2 0 0 u l 含1 0 3 个细胞，培养 2 4 h r ，每孔加入m t t 溶液继续培养4 h r ，吸去上清液，加入1 5 0 u l d m s o ( s i g m a ， u s a ) ，振荡l o m i n ，4 9 0 n m 波长下测定各孔光吸收值，以不含细胞的等体积培 养基作对照。绘制细胞生长曲线。 集落形成实验在转染或干扰y a p 4 8 小时后接种10 0 0 个细胞于6 c m 培养皿中， 2 周后用g i e m s a 染色。 1 0 、细胞迁移和侵袭能力检测 迁移实验用无血清r p m l l 6 4 0 培养基重悬细胞，调至2 5 x 1 0 5 个m l 细胞，取 1 0 0 u l 加入上室中( 孔径8 u m ，c o s t a r , u s a ) ，下室加入6 0 0 u l 含1 0 小牛血清 r p m l l 6 4 0 培养基。3 7 、5 c 0 2 孵箱中培养6 h r 后吸尽培养基，p b s 清洗后， 甲醇室温固定1 5 m i n ，用棉签轻擦掉上表面的细胞，苏木素染色，室温干燥过夜。 取下聚碳酸酯微孔膜，置载玻片上，镜下观察。细胞侵袭能力的测定用预冷的无 血清r p m l l 6 4 0 培养基以1 ：3 稀释m a t r i g e l ( b db i o s c i e n c e s ，u s a ) j i 入上室1 0 0 u l ， 3 在室温下放置3 h r 。使用前用培养基重新水化并吸净，其他与迁移实验相同，培养 1 8 h r 后观察结果。 l l 、免疫共沉淀 收集的新鲜培养的细胞中加入裂解液，充分裂解后，每管分别加入1 0 0 u l 磁珠 ( m i l t e n y ib i o t e c ，g e r m a n y ) 和2 0 u l y a p 抗体，使终体积为l m l ，4 。c 孵育3 0 m i n ，用 蛋白裂解液冲洗u 柱( m i l t e n y ib i o t e c ，g e r m a n y ) ，将蛋白样加入u 柱，加入2 0 u l 的9 5 预热上样缓冲液，孵育5 m i n ，用5 0 u l 的9 5 预热上样缓冲液冲洗，收集 液体，做w e s t e r nb l o t ，重复三次，取平均值。 1 2 、统计分析 采用s p s s l 3 0 ( s p s s ，c h i c a g o ，i l ，u s a ) 统计分析软件，对y a p 表达和临床病理 因素的关系用卡方检验；生存分析采用k a p l a n m e i e r 法，用l o g - r a n k 检验判断差异 性；其他实验结果采用t 检验进行数据分析，用均值4 - 标准差表示，p 0 0 5 为差异 有意义。 实验结果 1 、y a p 在非小细胞肺癌中过表达 我们采用免疫组化的方法检测了y a p 蛋白在9 2 例肺癌及2 0 例癌旁正常肺组 织中的表达情况。在9 2 例非小细胞肺癌中y a p 阳性表达为6 1 例，阳性率为6 6 。 其中3 0 例为强阳性表达，3 1 例为弱阳性表达。阳性信号主要表达于肿瘤细胞的 细胞核中。在2 0 例正常支气管上皮中y a p 在3 例中有强表达并且阳性信号定位 在i i 型肺泡上皮细胞。 2 、y a p 在非小细胞肺癌中与临床病理因素相关 对y a p 表达与临床病理因素相关性进行统计分析，我们发现y a p 的阳性表 达与年龄、性别、分化、肿瘤大小无显著关系。y a p 蛋白在腺癌中的表达阳性率 明显高于鳞癌，有统计学意义( p = 0 0 1 9 9 ) 。y a p 的阳性表达与肺癌患者的淋巴结转 移( p 卸0 0 9 3 ) ，p - t n m 分期( p = 0 0 0 3 7 ) 有着显著关系。分析y a p 与生存时间我 们发现y a p 表达阳性的患者生存时间明显小于y a p 阴性患者的生存时间 ( p = 0 0 0 4 7 2 ) 。c o x 多因素分析发现淋巴结转移是一个独立的预后因素( 表2 ) 。 4 3 、y a p 促进肺癌细胞的增殖和侵袭 我们使用实时定量p c r 筛选了肺癌细胞系中的y a p 的表达含量，我们发现 h 1 5 7 细胞中y a p 含量较高而a 5 4 9 细胞中y a p 含量较低，于是我们在h 1 5 7 细胞 中干扰y a p ，在a 5 4 9 细胞中转染y a p 并观察肺癌细胞增殖的变化。我们首先验 证了干扰和转染的效率，并使用m t t 和集落形成实验检测y a p 变化对细胞增殖 的影响。我们发现转染y a p 能够促进肺癌细胞增殖而干扰y a p 抑制细胞生长速 度。同时我们使用t r a n s w e l l 实验检测y a p 对肺癌细胞侵袭的作用，我们发现y a p 能够促进细胞侵袭能力而干扰y a p 抑制其侵袭力。 4 、y a p 并非通过促进肺癌细胞e m t 来介导侵袭作用 有研究显示y a p 在m c f l 0 a 中通过e m t 介导细胞侵袭，为了在肺癌细胞中 验证这一现象是否存在，我们使用r e a l t i m e p c r 和w e s t e r nb l o t 检测转染或干扰 y a p 后，e m t 相关基因的表达改变。我们检测了e c a d h e r i n 、n c a d h e r i n 、v i m e n t i n 、 t g f b e t a l 、t g f b e t a 2 的表达，发现这些指标没有发生明显的变化。此外，我们 检测了侵袭相关蛋白m m p 2 和m m p 9 的表达水平，我们发现转染或干扰y a p 对 m m p 2 的m r n a 和蛋白水平没有显著影响，此外，干扰y a p 轻微下调了m m p 9 的m r n a 和蛋白水平。 5 、y a p 通过与t e a d 结合调控p 2 1 和p 2 7 作用调节细胞周期和 增殖 我们研究发现，y a p 能够调节细胞周期，上调y a p 可以促进细胞从g 1 期进 入到s 期，下调y a p 则相反，能够阻滞细胞于g 1 期。我们检测了与细胞周期相 关的g 1 s 期调控元件的表达情况( p 2 1 、p 2 7 、p 5 3 、p 1 6 、c y c l i n e 、c y c l i n d l 、 c y c l i n d 3 、c d k 2 、c d k 4 和c d k 6 ) ，我们发现上调y a p 可以使肺癌a 5 4 9 细胞 表达p 2 1 和p 2 7m r n a 下降，干扰y a p 得到了相反的结果，即p 2 1 和p 2 7 m r n a 表达上调由于y a p 不具有直接调控转录的功能，y a p 能够与转录因子t e a d l 相 结合，而转录因子t e a d i 具有抑制某些基因转录的功能，我们推测y a p 能够结 合t e a d l 从而增强t e a d l 对p 2 1 和p 2 7 的转录抑制作用。我们首先使用免疫共 沉淀检测了y a p 与t e a l ) 能够直接作用。使用用y a p 抗体沉淀a 5 4 9 细胞总蛋白 后我们用t e a d l 抗体检测蛋白发现5 2 k d 处出现条带，同样我们使用t e a d l 抗 5 体沉淀a 5 4 9 蛋白并用y a p 抗体检测在7 5 k d 得到蛋白条带。以上结果证明y a p 能够与t e a d l 直接结合。为了验证y a p 依赖t e a d l 调控p 2 1 和p 2 7 转录，我 们首先在a 5 4 9 细胞中干扰t e a d l 的表达水平，我们发现在干扰t e a d l 之后， p 2 1 和p 2 7 的m r n a 水平出现了上调，这提示t e a d l 能够抑制p 2 1 和p 2 7 的转 录。然后我们使用干扰t e a d l 的a 5 4 9 细胞系转染或干扰y a p 观察p 2 1 和p 2 7 转录的变化。我们发现在干扰了内源性t e a d l 的a 5 4 9 细胞系中，转染y a p 并 不能明显下调p 2 1 和p 2 7 的m r n a 含量，同样在干扰了t e a d l 的a 5 4 9 中继续 干扰y a p 只能够轻微上调p 2 1 和p 2 7 的含量。以上结果证明了y a p 对p 2 1 和p 2 7 的调控作用是依赖于t e a d l 而存在的。 6 、y a p 通过与t e a d l 结合调控t i m p l 的表达从而调控肺癌细 胞侵袭能力 对侵袭相关蛋白m m p 系列蛋白m m p l 2 3 7 9 使用p c r 进行检测后我们发现 转染和干扰y a p 后m m p 的转录水平未见明显变化。使用w e s t e r nb l o t 检测转染 和干扰y a p 后m m p 2 、9 蛋白水平我们发现干扰y a p 轻微下调了m m p 9 的蛋白 含量我们采用明胶酶谱法检测了活性m m p 2 ，9 和总m m p 2 ，9 的含量，我们发现转 染y a p 后，总m m p 2 和9 的变化不明显，但是活性m m p 9 的含量有一定程度的 上升。以上结果提示y a p 能够促进m m p 9 的活化，t i m p l 是m m p 9 活化的重要 抑制因子。我们检测了转染y a p 之后m m p 抑制蛋白t i m p l 的变化，发现转染 y a p 后t i m p l 的含量明显下调。因此y a p 可以通过调控t i m p l 转录从而调节 m m p 9 的活化水平。从而促进细胞侵袭能力。 讨论 y a p 在许多肿瘤中存在过表达，其与肿瘤发生进展的关系越来越被关注。但 是在肺癌中关于y a p 的研究非常有限。在本研究中，我们证实了y a p 在非小细 胞肺癌中过表达，其过表达与肺癌的p t n m 分期和淋巴结转移相关，并且能够提 示肺癌患者的不良预后。此外，y a p 能够促进肺癌细胞的增殖和侵袭能力。 之前有研究发现，y a p 在肝癌，前列腺癌，结肠癌和乳腺癌中的表达升高并 定位于细胞核。s t e i n h a r d t 等使用组织芯片用组化研究发现y a p 在5 4 的非小细 胞肺癌中过表达。在1 7 7 例肝癌的临床研究中发现y a p 与低度组织分化，血清 6 a f p 水平和肿瘤复发成正相关，并且是患者生存预后的独立影响因素。与先前的 研究相似，我们发现y a p 在非小细胞肺癌中过表达，并且主要定位于细胞核。我 们发现y a p 的阳性表达与年龄、性别、分化、肿瘤大小无显著关系。y a p 蛋白在 腺癌中的表达阳性率明显高于鳞癌( p = 0 0 1 9 9 ) 。y a p 的阳性表达与肺癌患者的淋 巴结转移( p = o 0 0 9 3 ) ，p t n m 分期( p = 0 0 0 3 7 ) 有着显著关系。分析y a p 与生存 时间我们发现y a p 表达阳性的患者生存时间明显小于y a p 阴性患者的生存时间 ( p = 0 0 0 4 7 2 ) 。 作为一个潜在的肿瘤基因，y a p 能够调控细胞增殖速度，在肝细胞中过表达 y a p 能够显著增加肝脏肿瘤并最终导致肝癌发生。y a p 能够减弱细胞之间的接触 抑制并增强细胞增殖速度。为了研究y a p 对肺癌细胞增殖的影响，我们在肺癌细 胞系中干扰转染y a p ，我们发现转染y a p 能够显著促进细胞增殖速度，干扰y a p 能够抑制细胞增殖速度，此外，转染y a p 后的肺癌细胞系a 5 4 9 达到细胞融合后 仍然继续生长，其饱和密度大于为未转染y a p 的细胞。 y a p 是如何促进细胞增殖速度的呢，我们采用流式细胞周期检测发现y a p 能 够促进细胞进入s 期，干扰y a p 能够阻滞细胞在g 1 期。我们使用p c r 对于g 1 s 期调控相关蛋白进行检测发现转染y a p 之后p 2 1 和p 2 7 表达下降，而干扰y a p 之后p 2 1 和p 2 7 表达上升。p 2 1 和p 2 7 能够阻滞细胞于g 1 期的功能，在肿瘤细 胞的增殖调控中有重要功能。因此我们认为在肺癌细胞中y a p 通过对p 2 1 ，p 2 7 的调节来控制肿瘤增殖。由于y a p 不具有直接调控转录的功能，y a p 能够与转录 因子t e a d l 相结合，而转录因子t e a d l 具有抑制某些基因转录的功能，我们推 测y a p 能够结合t e a d l 从而增强t e a d l 对p 2 1 和p 2 7 的转录抑制作用。我们 使用免疫共沉淀检测了y a p 与t e a d 能够直接作用。为了验证y a p 依赖t e a d l 调控p 2 1 和p 2 7 转录，我们首先在a 5 4 9 细胞中干扰t e a d l 的表达水平，我们发 现在干扰t e a d l 之后，p 2 1 和p 2 7 的m r n a 水平出现了上调，这提示t e a d l 能够抑制p 2 1 和p 2 7 的转录。然后我们使用干扰t e a d l 的a 5 4 9 细胞系转染或干 扰y a p 观察p 2 1 和p 2 7 转录的变化。我们发现在干扰了内源性t e a d l 的a 5 4 9 细胞系中，转染y a p 并不能明显下调p 2 1 和p 2 7 的m r n a 含量，同样在干扰了 t e a d i 的a 5 4 9 中继续干扰y a p 只能够轻微上调p 2 1 和p 2 7 的含量。以上结果证 7 明了y a p 对p 2 1 和p 2 7 的调控作用是依赖于t e a d l 而存在的。 除了y a p 对增殖的影响之外，我们还发现了y a p 对肺癌侵袭能力的促进作 用。由于先前y a p 促进e m t 的报道，我们首先检测了e m t 相关基因的变化。然 而，我们发现在肺癌细胞系中y a p 并不能调控e c a d h e r i n ，n c a d h e r i n ，v i m e n t i n 等e m t 基因。此外，我们检测了与侵袭关系密切的m m p 2 和9 的基因蛋白水平， 我们采用明胶酶谱发现了m m p 9 的活性蛋白水平在转染y a p 后升高，m m p 9 的 蛋白在干扰y a p 后有轻微下调，这提示y a p 可能调控m m p 9 活性，进一步检测 m m p 抑制物发现转染y a p 下调了m m p 9 抑制蛋白t i m p l 。因此y a p 可能是通 过下调t i m p l ，从而增加m m p 9 活性，促进细胞侵袭能力。我们猜测y a p 可能 通过与t e a d l 相结合从而抑制t i m p l 转录，在干扰t e a d l 后，我们在a 5 4 9 中 转染y a p ，发现转染y a p 和未转染y a p 的细胞t i m p l 的区别不明显，y a p 只是 轻微下调了t i m p l 删 矾a 。以上结果提示y a p 对t i m p l 的调控作用同样依赖其 与t e a d l 的相互作用。综上所述，y a p 在肺癌中过表达，对肺癌增殖和侵袭具 有重要的调控作用，可能成为肺癌诊断和治疗的新靶点。 结论 1 、y a p 在非小细胞肺癌组织中高表达，并且核表达明显升高。y a p 高表达与 淋巴结转移、病理分期和不良预后成正相关。 2 、y a p 可通过与t e a d l 结合调控p 2 1 和p 2 7 转录，调节细胞周期促进细胞 增殖。 3 、y a p 可通过与t e a d l 结合抑制t i m p l 转录，增加m m p 9 活性，促进细 胞侵袭。 关键词 y a p ：肺癌；增殖；侵袭 8 英文论著摘要 i n v o l v e m e n to fy a pi np r o l i f e r a t i o na ndi n v a s i o no f n o n - s m a l lc e l ll u n gc a n c e r i n t r o d u c t i o n l u n gc a n c e ri so n eo f t h el e a d i n gc a u s e so fm a l i g n a n c y r e l a t e dd e a t h s n o n - s m a l l c e l ll u n gc a l e e r ( n s c l c ) a c c o u n t sf o ru pt o8 0 o fa l ll u n gc a n c e rc a s e s d e s p i t e p r o g r e s s e sm a d ei nt h ep a s td e c a d e s ，t h e5 - y e a rs u r v i v a lr a t ef o rl u n gc a n c e rr e m a i n s u n d e r15 r e c e n ts t u d i e ss u g g e s tt h a tc o n v e n t i o n a lt h e r a p i e sm a yh a v er e a c h e da t h e r a p e u t i cp l a t e a u ，s ot h ed e m a n d i n gt a s k sa r et oe l u c i d a t et h em e c h a n i s m so ft u m o r b i o l o g ya n dt oi d e n t i f yn e wt h e r a p e u t i ct a r g e t s t h eh i p p os i g n a l i n gp a t h w a y , i n i t i a l l yi d e n t i f i e di nd r o s o p h i l a , i sah i g h l y c o n s e r v e dp o t e n tr e g u l a t o ro fc e l lg r o w t ha n da p o p t o s i s a c t i n gd o w n s t r e a mo ft h e h i p p op a t h w a y , y a pf u n c t i o n sa sat r a n s c r i p t i o nc o - a c t i v a t o r w h i c hi n t e r a c t sw i t ht h e p p x y - m o t i f - c o n t a i n i n gt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ，i n c l u d i n ge r b b 4 ，p 7 3 ，t e a d ，p 5 3 b p - 2 a n dr u n x 2 i nm a m m a l s ，t h eh i p p op a t h w a yk i n a s ec a s c a d ep h o s p h o r y l a t e sy a pa n d i n d u c e si t sc y t o p l a s m i ct r a n s l o c a t i o n ，t h u sa t t e n u a t e si t si n t e r a c t i o nw i t ht h en u c l e a r b i n d i n gp a r t n e r sa n di n h i b i t s i t sf u n c t i o n y a pi sak e yr e g u l a t o ro fo r g a ns i z eb y o r c h e s t r a t i n gc e l lp r o l i f e r a t i o na n dd e a t h y a pi n d u c e dt h et r a n s c r i p t i o no fg e n e st h a t p r o m o t ep r o l i f e r a t i o ni nm u r i n el i v e r si n c l u d i n gk i 6 7 ，c - m y c ，s o x 4 ，a n da f e a tt h e s a m et i m e ，i ti n d u c e de x p r e s s i o no fn e g a t i v er e g u l a t o r so fa p o p t o s i s ，s u c ha st h ei a p f a m i l ym e m b e r sb i r c 5 s u r v i v i na n db i r c 2 c l a p1 ，a n dt h eb c l 2f a m i l yg e n em c l 1 i na d d i t i o n , y a pi sv i t a l l yr e q u i r e df o rd e v e l o p m e n ta sm i c ed e f i c i e n ti ny a ph a v ea n e m b r y o n i cl e t h a lp h e n o t y p e r e c e n t l y , y a ph a sb e e ns h o w nac a n d i d a t eo n c o g e n ei nt h eh u m a nc h r o m o s o m e 1lq 2 2a m p l i c o n y a pe x p r e s s i o na n dn u c l e a rl o c a l i z a t i o nw a sf o u n dt ob ee l e v a t e di n h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a , p r o s t a t ec a n c e r , c o l o nc a n c e r , o v a r yc a n c e ra n d b r e a s tc a n c e r m o r e o v e r , s o m es t u d i e sf u r t h e rc o n f i r m e dt h eo n c o g e n i cf u n c t i o no fy a pi nv i v oa n d i nv i t r o y a po v e r e x p r e s s i o nw a sa b l et oo v e r c o m ec e l lc o n t a c ti n h i b i t i o n ，t h e r e f o r e p r o v i d i n g a g r o w t ha d v a n t a g e f o r y a p o v e r e x p r e s s i n g c a n c e r c e l l s ；y a p 9 o v e r e x p r e s s i o ni nm c f 10 ac e l l si n d u c e de p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a lt r a n s i t i o n ( e m d ， w h i c hi so f t e na s s o c i a t e d 、 ，i t l lc a n c e rm e t a s t a s i s ；t r a n s g e n i cm i c e 、j ，i t l ll i v e r - s p e c i f i c y a po v e r e x p r e s s i o ns h o w e dad r a m a t i ci n c r e a s ei nl i v e rs i z ea n de v e n t u a l l yd e v e l o p t u n l o r s d e s p i t et h eg r o w i n ge v i d e n c e so fy a p a sac r u c i a lr e g u l a t o ro fh u m a nc a n c e r s ，i t s i n v o l v e m e n ti nn s c l cr e m a i n st ob ec l a r i f i e d i nt h ep r e s e n ts t u d y , w ee v a l u a t e dt h e e x p r e s s i o np a a e m s a n dc l i n i c a l s i g n i f i c a n c eo fy a pi nn s c l c m o r e o v e r , w e o v e r e x p r e s s e da n dk n o c k e dd o w ny a p i nn s c l cc e l ll i n e st oi n v e s t i g a t ei t se f f e c t so n c a n c e rc e l lp r o l i f e r a t i o na n di n v a s i o n m a t e r i a l sa n d m e t h o d s t i s s u es a m p l e s ：at o t a lo f9 2c a s e so fn s c l ca n d2 0c a s e so fn o r m a lc o n t r o l p a r a f f m - e m b e d e dt i s s u ew e r er e t r i e v e df r o mt h ep a t h o l o g ya r c h i v eo fc h i n am e d i c a l u n i v e r s i t yf r o m19 9 5t o2 0 0 3 t h eh i s t o l o g i c a ld i a g n o s i sa n dg r a d eo fd i f f e r e n t i a t i o n w e r ee v a l u a t e db yt w oi n d e p e n d e n tp a t h o l o g i s t s ，x s q a n dq f z ，a c c o r d i n g t o t h e w o r l dh e a l t h o r g n a n i z a t i o n ( w h o ) g u i d e l i n e s o f c l a s s i f i c a t i o n ( 2 0 0 4 ) c l i n i c o p a t h o l o g i c a li n f o r m a t i o no ft h ep a t i e n t sw a so b t a i n e df r o mp a t i e n tr e c o r d s ，a n d s u m m a r i z e di nt a b l e1 a l lo ft h ee n r o l l e dp a t i e n t su n d e r w e n tc u r a t i v es u r g i c a l r e s e c t i o nw i t h o u th a v i n gp r i o rc h e m o t h e r a p yo rr a d i a t i o nt h e r a p y t h es t u d yh a sb e e n a p p r o v e db yt h eh o s p i t a le t h i c a lc o m m i r e e c e l lc u l t u r e ：h u m a nn s c l cc e l ll i n e sa 5 4 9a n dn c i - h 15 7 ( h i5 7 ) w e r ec u l t u r e d i nr p m l 6 4 0 ( g i b c o ，i n v i t r o g e n ) s u p p l e m e n t e d 、) l ，i t h10 f e t a lb o v i n es e r u ma t3 7 。ci n 5 c 0 2 f o rt r a n s f e c t i o n s c e l l sw e r es e e d e di na6 w e l lp l a t e2 4hb e f o r et h e e x p e r i m e n t i m m u n o c h e m i s t r y ：4 i l - t h i c kp a r a f f i n e m b e d d e ds e c t i o n so np o l y l y s i n e - c o a t e d s l i d e sw e r eu s e df o rs t a i n i n g i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yf o ry a pw a sp e r f o r m e da s f o l l o w s ：s l i d e sw e r ed e p a r a f f m i z e di nx y l e n ea n dr e h y d r a t e di nag r a d e da l c o h o ls e r i e s a n t i g e nr e t r i e v a lw a sa c h i e v e db ym i c r o w a v i n gi n l0 m m o l lo fs o d i u m c i t r a t eb u f f e ra t p h 6f o r10m i n u t e s p e r o x i d a s ew a sb l o c k e dw i t h3 h y d r o g e np e r o x i d ei nm e t h a n o l ， a n dn o n s p e c i f i cp r o t e i nb i n d i n gw a sb l o c k e dw i m5 g o a ts e r u m t h ep r i m a r y a n t i b o d yf o ry a p ( c e l ls i g n a l i n gt e c hi n c ，d a n v e r s ，m a ) w a sd i l u t e d ( 1 ：10 0 ) 谢m p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n ea n da p p l i e do v e r n i g h ti nah u m i d i t yc h a m b e ra t4 。c 1 0 w eg r a d e dt h ey a pe x p r e s s i o na c c o r d i n gt ot h ed i s t r i b u t i o n ，t h ei n t e n s i t ya n dt h e p e r c e n t a g eo fp o s i t i v ec e l l sa sd e s c r i b e dp r e v i o u s l y a b s e n c eo fr e a c t i v i t yw a sg r a d e d a s n e g a t i v e f o rt h ec y t o p l a s m i cd i s t r i b u t i o n , w e a kc y t o p l a s m i cr e a c t i v i t yw a s c o n s i d e r e da sl o we x p r e s s i o nr e g a r d l e s so fe x t e n t s t r o n gc y t o p l a s m i cr e a c t i v i t yw i t h l e s st h a n5 0 p o s i t i v ec e l l sw a sg r a d e da sl o we x p r e s s i o n , o t h e r w i s ei tw a sg r a d e da s 1 1 i 曲e x p r e s s i o n