（果树学专业论文）苹果DELLA相关基因的克隆及功能初步鉴定.pdf

摘要 柱型苹果作为苹果生产中的丰产树型之一，是苹果高度密植栽培的理想品种决定柱型苹果 遗传特性的柱型基因c 矗与调控树型发育的重要内源激素赤霉素( g a ) 之间的关系是苹果柱 型突变分子机制研究的热点问题 本试验以柱型苹果“威赛克”及非柱型苹果。旭”为试材，利用苹果d e l l a 相关基因的序 列信息设计了特异引物，通过p c r 扩增克隆目的基因将目的基因插入至p c a m b i a l 3 0 5 1 植物 表达载体中。农杆菌e h a l 0 5 介导的叶盘法转化本生烟，并通过p c r 、r t - p c r 以及g u s 染色法 检测转基因植株；将目的基因插入至g f i 瞬时表达载体p e , z - n l 中，通过基因枪法，转入洋葱表 皮细胞，在激光共聚焦显微镜下观察目的基因蛋白的亚细胞定位试验结果如下： 1 从苹果。威赛克”和。旭”中克隆了2 个与d e i j a 相关的基因- - m d r g 知，m d r g l 2 a ， 长度分别为1 9 2 0 b p 、1 7 4 3 b p 经d n a m a n 软件分析，威赛克，旭的m d r g l l a ，威赛克、旭的 m d r g l 2 a 核苷酸序列同源性为1 0 0 ；所推测的氨基酸序列均含有d e l l a 蛋白家族所特有的结 构区域初步表明这两个基因在苹果不同品种间高度同源，与苹果威赛克的柱型突变无关 2 构建了植物表达载体p r g l l a - g u s 、p r g l 2 a - g u s ，m d r g l i a ，m d r g l 2 a 转基因植株分 别经潮霉素筛选，以及p c r 、r t - p c r 检测、g u s 染色验证m d r g l l a ，m d r g l 2 a 基因成功转入 烟草植株中 3 构建得到g b p 瞬时表达载体p r g l l a - - g f p 、p r g l 2 a - - g f p ，荧光定位初步确定m d r g l l a 和m d r g l 2 a 蛋白主要定位在细胞核上 关键词t 柱型苹果，d e l l a 蛋白，表达，亚细胞定位 a b s t r a c t t h et r e es l l l l e t u t eo fo o l n m n a ta p p l e si so o fp r o d u a i v ct t c cf o r m si n c li si d e a lf o rh i g hd e m i t y p l a n t i n go fn e c si na p p l ei n o d u e t i 0 1 3 t h er c l a t i o m l a i pb e t w e e n t l a cc o l u m n a rg e n t ，r a e r a n gt ot h c e o l u m l l a rt r a i ti na p p l e , 柚dt h ei m p o r t a n te n d o g e n o u sh o l m o n cg i b b e r e l l i n ( g 舡) ，i t c g l l l a l i n gt h e d e v e l o p m e n to fi l r e cm c l a i t e e t t m , i si th o tt o p i co ft l a cm o l c e t t l a rm e e h n l i s mo fe o h m m a rm u t a t i o ni n a p p l e t h ec o l u m n a rt y p e w 5 c 址a n di t sw i l dt y l 弦m e i n t o s h m ”u s e dt od o n et h ed e l l a - l i k eg e n e s t l l o u g l l p c ra m p l i f i c a t i o n w i t h t h e 印蒯p f j 删d e s i g n e d f r o m t h e t w o d e l i a e d n a q i l 嘴i n t h ec l 啪b a n k mi n t e r e s tg e n e sw e 血既t c di n t oj , c a m b i a l 3 0 5 1v e c t o r t h eo o n s t n l e t sw i n t r o d u c e di n t oa g r o b a c t e r u mn u n e f a c e n se i t a l 0 5a n dt o b a c c oo v c o a , m 口缸h l 蝴) w 鹬 i t a l l s f o r m e du s i n gl e a fd i s km e t h o d p c i l , r t - p c ra n a l y s i sl n d ( 3 i j $ s t a i n i n gw c i eu s e dt ot e s tt h e p o s i t i v ep l a n t s t h ei n t e r e s tg e n e sv e l r ea l s oi n s e r t e di n t op e 7 _ s - n lv e c t o r , 蛆dt h ec o n s t n l e l sw c i e d e l i v e r e di n t oo n i o na l l i u mc e p a ) e p i d e r m a lc e l l sb yp a r t i c l eb o m b a r d m e n ti m a g e sw c 他c a p t u r e dw i t h - c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i a 积娜f o rs u b e e l l u l a ri o c l l l i t 刊o ro f 也c g e n e s t h er e s u l t s 眦勰 f o l l o w s ： 1 t w o d e i j a - l i k e g c l a e s m d r g l l aa n d m d r g l 2 a ， 砖b o t hc l o n e d f r o m 聊盘a n d m e i n t o r d l t h ee d n a s e q u e n o f m d r g l l a h a sal c 柚i g t ho f1 9 2 0 b p dm d r g l 2 a1 7 4 3 b p b yt h ea l i g l l m e mo f d n a m a n s o f t w a r e , t h e ys h o w e d1 0 0 h o m o l o g yi nn u e l e o t i d e q i l e i n w b c 血a n d m e h l t o s l a t h cd e d u c e dm 曲a d ds e q u e n c e so ft l a c s eg e n e ss h a r e dt h eh i g h l yc o n s e r v e dr e g i o n so f1 ) e i d l a p r o t e i n s t h i sp r e l i m i n a r yr e s u l ts h o w e dt h a tt h cg e n e sm d r ( t l l aa n dm d r ( t l 2 a 黜m 鲥y h o m o l o g o u sa m o n gd i f f e r e n tz t p p l ev a r i e t i e s , a n dt h u st h ee o l u m m u t a t i o no f w i j e , l t m a yn o tb e ca u s e db y 山鹤cg e n e s 2 p r g l l a 4 3 i i s a n dp r g i 2 a 4 3 u sw 雠e o m t r u e t e dt ot e s tt h e s eg e n e sc 秘i o ni np l a n t t h o s e t r a m g e n i c t o b a c c o s w e r e l c c i e d w i t h l a y g r o m y e i n 0 1 1 h c m s m e d i a a n d t e s t e d b y p 旺n m p l i t i e a t i o n , r t - p c ra n a l y s i s a n d ( 3 1 j $ s t a i n 姆t i l e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t b o t h o f g e n c s m d r ( t l l aa n d m d r ( t l 2 a w 锄t t a n s f e l l r e d 嗣k 蠲蛐i nt h e p l a n t s 3 m m 岫i c t 妯s o f p r o x 1 a - - g f i a n d p r g i 2 a - 4 3 f p w e r e u s e d t o l o c a l i z e t l a c f u s i o n p r o t e i n s o f r g l l a - g f i a n d r g i 2 a - g f i i n t l a e c e l l t h e p r e l i m i n a l y r e , l i t i n d i c a t e d t h a t m d l t g l l a a n d m d r g l 2 ap r o t e i n s 可陀l m a i n l yl o c a l i z e di nt h ea 出n u e l e t t s x 碍w o r d s ：c o l u m a r a i s l e , d e i d a p r o t e i n s , e 】甲s i o 呜s u b e e l l u l a r1 o c a l i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所傲的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意 研究生签名：；多名本时间：如亏年多月r x 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 矽硷肆 名：辛乞睇 泊 坩 刖 月 幻 6于衅 一吖 吼 阃 啡 时 第一章前言 1 d e l l a 蛋白家族研究进展 赤霉素( g i b b e r e u i n , g a ) 属于一种四环双萜类植物激素，是控制植物生长并作用于植物整个生 命周期的一种激素，参与调节植物生长与发育的许多复杂过程，影响种子的萌发、茎的伸长，花 的诱导和种子的形成，而这些过程又依赖于植株中活性g a 的水平与细胞感受g a 的能力( 石琰瑗， 2 0 0 6 ) 。 2 0 世纪8 0 年代以来，随着气相色谱胡i 谱联用技术( g - c - m s ) 和同位素示踪技术的应用，对赤霉 素的种类、结构、合成途径和信号传导等获得了较深入的了解( i n g r a mtj ，1 9 8 4 ) 2 0 世纪 9 0 年代以来，应用分子生物技术对这些矮化品种深入研究揭示了植物矮化的分子机理，绿色革命 中所应用的小麦和水稻半矮秆形状的基因已经鉴定和克隆，g a s 的生物合成和代谢途径已经研究 清楚，并克隆了这些途径中的基因。并且已经分离得到了许多相关激素的生物合成、信号传递突 变体( 刘洁，2 0 0 5 ) 。 最近几年，开始研究内源植物激素如何调控植物的生长及发育，即探讨植物激素分子( 信号) 引起植物发育过程( 信号转导途径) 的分子机理。研究表明，当植物细胞接收胞外的信号后，通过 跨膜的受体传到体内，经过一系列的中介，产生一系列的生化反应，并导致植株产生正常的生理 现象( s t e p h e nms ，1 9 9 6 ) 。所经过的中介就是这个信号转导途径中的组成元件。当这个途径中 的组成元件的基因发生突变后，就会造成植株产生新的表现型，如矮化。目前，在研究赤霉素信 号转导时，主要是利用遗传突变或反向遗传学的方法，通过筛选自发和人工的各类突变体，分析 其表型及生理特性，如突变体对不同浓度g a s 的响应情况，n 淀粉酶的分泌以及g a s 合成途径中 主要酶的表达量，由此来确定是否与赤霉素信号转导相关；而后利用图位克隆或t d n a 插入等 方法克隆这些基因，并结合功能基因组学和蛋白质组学中的新方法，对它们的功能进行分析。并 将这些突变体杂交，进一步确定各组成元件之间的上下游关系，最终得出g a s 的信号转导途径( 李 晓波，2 0 0 4 ) 1 1d e l l a 蛋白家族 许多对外源g a 响应发生改变的突变体按表型可分成两类：一类是矮化的突变体，如拟南芥 中的g a i ( p e n gj r ，1 9 9 7 ) ，玉米中的d 8 ( w i n l d e r r g ，1 9 9 4 ) ，小麦中的r h t ( b o r n e r a ，1 9 9 6 ) ， 以及最近在水稻中发现的耐( s a s a k ia ，2 0 0 1 ) 这类突变体与g a s 缺陷型突变体有类似的表现： 种子发芽率低，叶片呈暗绿色，有的花期延迟并有不正常的花发育。在用外源g a s 处理这些突变 体后，以上缺陷不能完全克服；测定内源g a s 的含量，突变体要比野生型高出1 0 0 倍，甚至更高。 另一类细高的突变体，如在拟南芥中的s p y ( j a c o b s e ns e ，1 9 9 3 ) ，大麦中的s i n ( g u b l e r f ，2 0 0 2 ) 和水稻中的s i r ( i k o d a a ，2 0 0 1 ) 这类突变体表现为对g a s 合成途径中的阻断剂多效唑有抗性。 在无外源g a s 时，种子仍能发芽以及分泌m 淀粉酶；在其生长过程中，与野生型相比，具有较长 的穗和茎，叶子呈浅绿色，结实率较低，其内源g a s 的含量较低。如果将野生型用过量的g a s 不 中嗣农业大学硕十学位论文第一章前言 断处理，可以得到这类突变体，因此，也称为g a s 过度剂量表现型。根据上述表型分析，推测这 些基因介入了g a s 信号转导途径。 p e n g 和s o n g 分别克隆了拟南芥中的g a i ( p e n gj r ，1 9 9 9 ) 和r g a ( s i l b e r s t o n e a l ，1 9 9 7 b ) ， 比较其序列，两者有8 2 的同源性。其后p e i l g 又根据其保守序列分别克隆了“绿色革命”基因，小 麦中的地痢玉米中的镌；以及近年来在水稻中的s l r ? 基因。这些基因同d e l l a 有很高的同源性， 因此将它们归为d e l l a 蛋白家族。从蛋白结构特点上来讲，d e l l a 蛋白家族属于植物特有的 g r a s ( 指g a i r g a s c a r e c r o w ) 蛋白家族中的一个亚族( p y s hld ，1 9 9 9 ) 。它们有g r a s 家 族成员都具有的高度保守的中心区v h i i d 和c 末端的r v e r 结构。在这些蛋白的n 端，有d e l l a 区 域，该区域在亚族不同的成员中是有所变化的。此外，这类蛋白中还确- n l s 区以及推断的s h 2 区。 已经知道：n l s 区是转录因子的明显标志，含有这个区域的蛋白可以从胞质中定位到核中s h 2 ( s r e h o m o l o g y 2 ) 则是s t a t ( 信号转录子和转录激活子) 这类转录因子家族中所具有的( r i e h a r d sd e ， 2 0 0 0 ) 。在动物中，当有生长激素作用时，这类转录因子同受体酪氮酸激酶结合后被激活。被激 活的s t a t s 可以到核中调节特定的基因表达，对生长激素信号产生响应，因此，从结构功能域的 角度也说明了这类蛋白是信号转导中的元件( 图1 1 ) 。 图1 - 1d e l l a 蛋白家族序列特点 f i g i - 1 s c h e m e so f d e l l a f a m i l y 对于半矮类型的突变体中d e l l a 蛋白家族而言。g a i 基因缺失了含有一个开放阅读框的5 1 个碱基，其蛋白产物在d e l l a 区中少了1 7 个氨基酸；小麦的r h t - b l b 和r h t - d l b 的d e l l a 结 构域有碱基替换。编码不能接受g a 信号的d e l l a 蛋白( p e n ge ta l 。1 9 9 9 ) ；大麦的s l n l d 突变体 中d e l l a e 代替了野生型的d e l l a g ( c h a n d l e re ta 1 。2 0 0 2 ) ：类似的，勰和砌f 在d e u a 区有 不同程度的缺失或突变( p e n gji 乙1 9 9 9 ) 。 在给定g a s i f j 量条件下，将含缺失程度不同的d e l l a 的g a i 基因在水稻中表达，则可产生矮 化程度不同的表型以及对g a s 不同程度的敏感性( d i l la ，2 0 0 1 ) 。由此说明，d e l l a 区域中的 缺失是引起植株矮化的直接原因，而且这个区域是这些蛋白功能的关键调节域，是调节这些蛋白 的活性而响应g a s 信号所必需的。 从上述的半矮突变体中认识了这个蛋白的调节功能，同时从一个相对高的水稻突变体曲中则 可以认识这个蛋白的另一功能抑制功能( i t o h h ，2 0 0 2 ) 。在野生型中，没有g a s 时，可以 检测到s u l 蛋白；当有外源g a s 信号时，s l r 逐渐消失，暗示这个蛋白是信号转导途径中的抑制 子。在s 欣变体中，其n 端的d e l l a 区是完整的，但在n l s 区中有一个单碱基缺失，造成该蛋白 抑制功能的丧失。拟南芥中的d e l l a 蛋白在水稻( f u x ，2 0 0 1 ) 、烟草( h y n e s l w ，2 0 0 3 ：彭世 清等，2 0 0 5 ) 中过量表达，随着表达量水平的不同导致了不同的矮化表现型。 为了更详细的确定该蛋白不同区域中的功能，克隆s l r 基因，然后将这个基因的不同区域进 行不同程度的缺失，重新拼接，利用g f p 进行融合蛋白在体内表达，分析植株的表型，以此来精 细确定该蛋白中未知区域的功能。利用这个方法，可以证明d e l l a 的周围区域( t v r n r 帅) 也对 2 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 g a s 响应起到辅助作用；而亮氨酸拉链( l z ) 区域则是形成二体的必需构件不能形成二体的蛋白， 其功能是很弱的。在c 末端终止密码子的上游1 6 个核苷酸处由一个核苷酸的替代可提前形成终 止密码子，由此产生的蛋白缺少c 端，其功能完全丧失，使植株表现曲的表型。当这个蛋白中 的l z ，n l s ，l w e r 和v l 玎d 区域发生突变后，植株都会表现s i r 表型( i t o hh ，2 0 0 2 ) 1 2d e l l a 信号转导模型 根据双突变体的表型分析，可以确定了各个组成元件之间的上下游关系。在g i d s l r 双突变体， 其表型是s ，表型，这表明g 1 d 作用于s l r 的上游；将s p y 和g a i 这两个突变体杂交获得的双突 变体为g a i 的表型，说明s p y 作用于g a i 的上游。结合上述己克隆g a 信号转导中的基因的产物 特征分析，可以推出它们在信号转导中的作用。该蛋白是不可去除阻遏的抑制生长，因此g a i 是 一个功能获得突变。 p e n g 等0 9 9 7 ) 提出了解释g a 调节d e l l a 蛋白抑制作用的“g a - 可去抑制的抑制子模型” ( g ad e - r e p r e s s i b l er e p r e s s o rm o d e l ) 后来大量的研究结果都支持这一遗传学模型，即：在没有g a 情况下，d e l l a 蛋白阻遏植物生长发育( 如图1 - 2 ) 在g a 野生型中，当d e l l a 蛋白上的g a 信号感知区接收到g a 信号后，这种蛋白的阻遏作用被解除，植株表现出正常的g a 反应和生长 发育。在g a 缺陷型中，g a 合成途径发生突变，植株内缺少g a s 。这时d e l l a 蛋白是正常的， 但因为没有充足的g a s 与d e l l a 蛋白相互作用，g a s 的信号转导途径始终处于阻遏状态，植株 表现矮型，应用外源g a s 处理就可以克服这种现象。而对于g a i 来讲，由于g a i 蛋白末端缺少了 1 7 个氨基酸，蛋白构象发生变化，d e l l a 的缺失造成这些蛋白对g a s 的降解作用不敏感，即使 植株有很高浓度的g a s ，也不能与d e l l a 蛋白相互作用；应用外源的g a s 处理，矮化现象也不 能逆转。在s l r 中，则是另一种情况，d e l l a 区是完整的而它的c 末端的抑制作用区发生突变， 不能对g a s 信号传导途径起到有效的阻遏作用，因此即使没有g a s 信号，植株仍表现生长，它 是一个功能缺失突变。 图1 - 2g a l 的作用机理 f i g 1 - 2t h e m e c h a n i s mo f g a lf u n c t i o n 通过对g a 信号转导途径中的元件的研究，以及它们之间的上下游关系后，总结得到：在这 中国农业大学硕十学位论文第一章前言 个途径中，d e l l a 是g a s 信号转导途径中的抑制子，这些抑制子的抑制作用使g a s 信号传导途径 处于阻遏状态。当有g a s 信号时，这些抑制子被降解，从而解除t g a s 信号转导途径中的阻遏状 态，由g a s 诱导的与生长相关的基因才得以表达( n e i lo ，2 0 0 2 ) 。如图1 3 所示。 在g a s 缺陷型的突变体或没有g a 信号的野生型细胞里，跨膜的g a 受体是没有活性的或者没 有被g a 信号所激活，在这种条件下，s p y 是有活性的o g t ，s p y f i l 以修饰或激活在没有g a s 时的 r g a 和g a i 。它对g a i 或r g a 进行修饰使它们成为活性的g a i 和r g a 。而活性的r g a 和g a i 的作 用可能就是抑制转录( 抑制子) ，直接或间接的抑制由g a s 诱导的相关生长的基因表达( s u ntp ， 2 0 0 0 ) 。 在有g a 信号时，细胞上的跨膜受体被激活，也可以通过g 蛋白或其他中介( 第二信使) ，将信 号传至胞内。g a 信号会抑f e i s p y 的活性，被抑制的s p y 是没有o g t 功能的，它不能修饰或激活r g a 和g a i ，因此d e l l a 失去抑制活性；同时，g a 信号又激活g i d ，活性g i d 会募集其它蛋白成为蛋 白复合体去降解r g a g a i 蛋白家族成员。r g a 和g a i 被降解后，则完全解除了对g a s 转导途 径的抑制作用，从而受g a s 控制的基因得以转录表达。 固1 - 3g a 信号转导模型 f i g i - 3 t h em o d e lo f o as i g n a l i n gm m s d u c t i o a ：激活一：抑制 目前, g a s 的信号转导模式主要是以在拟南芥和水稻中有关d e l l a 蛋白的研究为基础的。 g a i r a g 蛋白家族则是g a s 信号中的负调节子，对这个途径起到阻抑作用。s p y 作为一个o g t ， 它可以激活r g a 和g a i 来抑制g a s 诱导基因的表达，也是负调节子；g i d n 是这个途径中的正调 节子，降解d e l l a 蛋白，从而完全解除这个途径的抑制状态，允许g a 相关的基因表达，植株产 生正常的生长和发育。 2 果树矮化相关基因的研究进展 矮化栽培具有早果、丰产，质优、便于管理、寿命短，更新快、效益高等优点，是世界果树 生产的总趋势。树型矮化主要表现矮生、节间短、枝条短、枝角开张、顶端优势弱、树冠紧凑等 方面。目前关于果树矮化的研究主要集中在生物学特性、生理生化分析、形态遗传分析和分子标 记等方面，获得了相当的信息，但还没有克隆到与矮化突变相关的基因，对该突变的分子机制及 对苹果树型的调控模式还不清晰。对于分子遗传研究相对滞后的苹果基因组，依据生物信息学的 4 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 理论，分析模式植物中相关突变体的基因序列、e d n a 序列、e s t s 数据库信息，挖掘果树矮化突 变的相关基因，克隆并进行功能分析，获得可改良树型的基因，可以进一步研究基因对树型的调 控行为，具有重要的理论价值和生产应用前景。目前果树矮化相关的基因的研究主要集中在以下 几个方面。 2 1d w 基因 1 9 9 1 年内蒙古呼伦贝尔盟农科所发现一株普通山定子皱叶矮生突变株，植株极矮，节间短， 叶片近圆形，多皱褶，叶缘锯齿大，呈叶丛状，定名为扎矮7 6 。用其作父本或母本的杂交后代均 表现普通株与矮生株i ：t 分离，且无中间类型。进一步研究发现。该矮生性状由显性矮生主基因 d w 控制( c o n n e r e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。以寒富( 富士x 东光) 为母本，以扎矮7 6 为父本进行杂交后代群体。 采用集群分析法共筛选7 3 0 个o p e r o n 随机引物或引物组合，获得2 o w - 基因连锁的r a p d 标记，分 别为f 0 4 8 0 0 和f 0 3 1 1 5 0 ，且与瞒因的连锁距离分别为1 4 o c m 和2 5 5 c m ( 张开春等，1 9 9 9 ) ， 以及与西德因的连锁距离为0 6 9 c m 的r a p d 标记o p e l 5 1 0 0 1 ( 毕晓颖等，2 0 0 2 ) 2 2c o 基因 柱型苹果起源于普通型苹果品种旭( m c t m o s h ) 的芽变( t o l ：m u 1 9 8 5 ) ，自问世以来由于其独 特的树型、高萌芽率的特点引起了各国苹果育种者的重视。柱型苹果在自然生长条件下独干、高 萌芽率、极短枝、极紧凑的苹果品种，树冠体积小，近似于圆柱体，是苹果生产上超高密度栽培 ( 株行距为0 6 m x l m ) 、集约化生产的理想株型。是果树实现“绿色革命”的重要基因资源经典的 遗传学研究证明苹果柱型生长习性是由一个单显性c o 基因控制的质量性状，一个或几个修饰因子 影响了c o 基因的表达( l a p i m 。1 9 7 6 ；b l a z e k , 1 9 9 2 ：m e u l e n b r o d k ，1 9 9 9 ) 。 以“富士舞姿”为作图群体，获得了与柱型基因紧密连锁的r a p d 标记并转化为s c a r c 0 8 5 0 ( 赵玉军，1 9 9 9 ) 、a f l p 标记( 王涛等，2 0 0 1 ) 及一个由a f l p 标记转化为s c a r 标记( 王彩虹等， 2 0 0 1 ) 和两个i s s r 标记u b c 8 1 8 1 m 和u b c 8 3 4 l m ( 朱元娣，2 0 0 2 ) 以“富士舞乐”为作图群体， 获得了一个s c b 8 2 6 7 0 的标记，与c d 基因连锁距离为1 8 c m ( k i m 等，2 0 0 3 ) 。但对苹果复杂的基因组 而言，所获得的标记与c o 基因的遗传连锁距离比较远，不能满足基因克隆的需要及更深入的遗传 研究 关于柱型基因突变的机制，研究多集中在内源激素水平与树型的关系。一些研究认为柱型突 变品种内细胞分裂素( c 1 1 ( ) 含量高而赤霉素( g a s ) 含量低，与柱型基因突变密不可分 ( l o o n e y ，1 9 8 8 ：朱元娣等，1 9 9 9 ) ，但也有的研究认为高的内源c t k 含量是导致树体柱型生长的 主要原因( 李春雨，2 0 0 4 w a t a n a b e 等。2 0 0 4 ) 。 2 3m d r g l 基因 t o s h i f o s t e r 等在苹果e s t 库中搜索到6 条d e l l a 蛋白相关的e s t 序列，通过r a c e 的方法，从 嘎拉苹果中分别获得这6 个基因的全长，m d r g l l a b , m d r g l 2 a b , a n d m d r g l 3 a b 。6 t - 基因序列 5 中国农业大学硕十学位论文第一章前言 推测蛋e t m d d e l l a s 的同源性为3 7 9 3 ，而与拟南芥d e l l a 蛋白的同源性达4 4 - 6 5 。且 m d d e l l a sg r a s 家族含有高度保守的中心区v h i i d 和c 末端的r v e r 结构，n 端d e l l a 和 t v h y n p ，还有g r a s 家族高度保守的l h r i 区，n l s 区、l x x l l 区、p f y r e 区，s a w 区 通过定量实时p c r 的方法，发现三组基因m r n a s 在新枝顶稍和叶芽中表达量最高。将 肠艘g 三知转入拟南芥中表达发现，转基因拟南芥与对照相比，叶片小，节间短，花期晚，并且对 外源g a 3 反应不敏感( t o s h if o s t e r ，2 0 0 6 ) 。 2 4 v v g a i 基因 p a u lk 等发现酿酒葡萄p i n o tm e u n i e r 的突变体，植株矮化，在长枝上卷须正常形成的部位形 成了花序，且种子发芽率低。施用外源g a 时，突变体不能恢复正常，内源g a l 的含量是l 2 植株( 正 常植株) 的4 倍，g a 4 的含量是l 2 植株的1 2 倍，初步认为该突变体是矮化的突变体，与拟南芥中 的g a i ，玉米中的d 8 ，小麦中的r h t ，以及水稻中的g i d 突变体类似。 通过设计简并引物，提取突变体未成熟花序的r n a ，进行r t - p c r ，通过r a c e 的方法，获得 了v v g a l f v g a i 基因序列，n g 的氨基酸序列与g a i 氨基酸序列同源性达7 2 ，并发现g r a s 蛋白 家族特有的d e l l a 区域，同时发现突变体v v g a i 氨基酸序列在d e l l a n 域第二个l 突变成h ，从而 导致植株矮化( p a u lk ，2 0 0 2 ) 。 3 研究意义 柱型苹果威赛克( 也称威赛克旭) ，是果树生理，果树育种及果树分子生物学研究的珍贵试 材多年来，围绕柱型苹果的研究一直没有停止过，在柱型性状、生物学特性、生理生化分析、 形态遗传分析和分子标记等方面获得了相当的信息对于该突变体分子机理及及对苹果树型的调 控模式还不清晰。 柱型苹果节间极短、枝条短、枝角开张、树冠紧凑，萌芽率特高，成短枝力强，叶片大而厚， 叶色深，叶片栅栏组织发达，光合性能强。外源g a 3 处理柱型苹果，生长增加显著( l e ea n d l o o n e y ， 1 9 7 7 ；k e l s e y a n d b r o w n ，1 9 9 2 ) 。威赛克的极性g a s 水平明显低于旭，但非极性g a s 水平无差异， 而g a l 9 是g a l 的前提，g a l 转变为生理上非活性代谢产物的过程很快。威赛克中极性g a s 类物质 活性显著降低，反应了总g a s 合成水平的减少，导致了威赛克新梢生长减少和节间变短( l o o n e y e t a l ，1 9 8 8 ) 。低的内源g a s 水平被认为是柱型突变体的节间紧凑的原因( l o o n e y a n d l a n c ，1 9 8 4 ； k e l s e ya n db r o w n 1 9 9 2 ) 。 依据柱型苹果特殊的表型及低内源g a s 水平的特性。结合已知的苹果m d d e l l a s 相关信息， 可以推测d e l l a 蛋白家族在调控苹果树型方面起着重要的作用。本实验以柱型苹果威赛克 ( w i j c i k ) 及其野生型苹果旭( m c i n t o s h ) 为试材，通过p c r f f 增，克隆d e l l a 相关基因，首先 从核苷酸序列水平上看是否存在突变；然后构建植物表达载体，通过农杆菌介导法将克隆到的基 因转入烟草中，得到转基因再生植株，研究d e l l a 相关蛋白的功能；同时构建g f p 瞬时表达载体， 通过基因枪的方法，将克隆到的基因转入洋葱表皮细胞，激光共聚焦显微镜下观察，研究目的基 因蛋白的亚细胞定位。 6 1 材料与方法 1 1 材料 第二章目的基因的克隆 1 1 1 植物材料 威赛克( w i j c i k ) 、旭( m c i n t o s h ) 新梢上幼嫩叶片。 1 1 2菌株和质粒载体 d h 5 a 购自天为时代公司，p m d l 8 - t 载体购自t a k a r a 生物公司。 1 1 3 酶及主要分子生物学和生物化学试剂 i p t g 、x - g a l 、氨苄青霉素为t a k a r a 生物公司产品：p f u 为上海生工产品；t a g 酶、d n t p 、 质粒提取试剂盒、d n a 快速回收纯化试剂盒为天为时代公司产品；其余化学试剂购自鼎国 1 1 4 主要仪器设备 台式高速离心机、水浴锅、摇床、p c r 仪、恒温箱、电泳仪、扫胶仪。 引物由上海生工生物公司合成，测序由上海英骏公司完成。 1 2d n a 提取 i 2 1 植物材科的准备 取威赛克、旭新梢刚长出的嫩尖及幼嫩叶片，在液氮中速冻保存，带回实验室，部分叶片直 接提取d n a ，部分放在- 7 0 冰箱，保存备用。 1 2 ，2 c t a b 小量法提取苹果基因组d n a 1 c t a b 核酸分离缓冲液( 3 c t a b ；1 4 m n a c i ；2 0 m m e d t a ( p h 8 o ) ：1 0 0 m m t r i s - h c l ( p h 8 o ) ；2 p v p ) ，6 5 恒温水浴中预热3 0 m i n ； 2 取o 5 9 左右叶片液氮速冻后，迅速研成白色粉末状； 3 将叶片粉末小心转移至1 5 m l 离心管中，加入6 0 0 1 1 1c t a b 缓冲液，加入l o u l1 3 - 巯基乙醇， 混匀； 4 在6 5 水浴中保温l h ，每1 0 r a i n 混匀一次； 5 取出离心管放在冰上，同时加入8 0 9 l 预冷的嘶s 饱和酚和5 2 0 1 x l 氯仿异戊醇( 2 4 ：i ) ， 充分混匀后放置1 0 m i n ，待蛋白质变性后，1 0 0 0 0 t p m 离心1 5 m i n ： 6 将上清液用去尖的黄枪头吸出至新的无菌的离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ： 1 ) 抽提，混匀放置1 0 m i n ，1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 r a i n ； 7 将上清液用去尖的黄枪头吸出至新的无菌的离心管中，加入2 3 体积的冷异丙醇，混匀， - 2 0 3 2 冰箱放置l h ： 8 将絮状沉淀用枪头挑出至新的离心管中，加入5 0 0 9 l7 0 7 - , 醇，洗两次； 9 低速离心后弃上清，在超净台上吹干； 7 中国农业大学硕士学位论文第二章目的摹困的克隆 l o 用2 0 0 i _ t ld d h 2 0 溶解，加入1 0 i j t lr n a s e ，3 7 3 3 水浴l h ： 1 1 取2 山琼脂糖凝聚电泳检测，样品- 2 0 3 3 保存备用。 1 2 3 改进的c t a b 大量法提取苹果基因组d n a 1 c t a b 核酸分离缓冲液配制 药品称取量终浓度 c t a b 2 9 2 n a c i 8 1 8 1 6 9 1 4 m e d t a 0 7 4 4 4 9 2 0 m m t r i s 1 2 1 1 9 1 0 0 m m p v p 2 9 2 混合后。定容至1 0 0 m l ，高压灭菌，4 3 3 保存备用。 2 取灭过菌的5 0 r a l 离心管，加入1 5 m l c t a b 分离缓冲液，6 5 恒温水浴中预热3 0 m i r a 3 取2 9 左右叶片液氮速冻后，迅速研成白色粉末状； 4 将叶片粉末小心转移至1 5 m l 离心管中，加入6 0 0 p ic t a b 缓冲液，加入2 0 0 9 l8 巯基乙 醇，混匀； 5 在6 5 水浴中保温l h ，每1 0 m i n 混匀一次； 6 取出离心管放在冰上，同时加入2 m l 预冷的t r i a 饱和酚和1 3 m l 氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ， 充分混匀后放置1 0 m i n ，待蛋白质变性后，1 0 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n i 7 视情况，如蛋白未去干净，可用氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 再抽提一次； 8 将上清液用去尖的黄枪头吸出至新的无菌的离心管中，加入2 3 体积的冷异丙醇，混匀， 2 0 冰箱放置l h ； 9 将絮状沉淀用枪头挑出至新的离心管中，加入1 0 m l7 0 乙醇( 含有1 0 m m 乙酸铵) ，洗 两次； 1 0 低速离心后弃上清，在超净台上吹干； 1 1 用0 5 m ld d h 2 0 溶解，加入2 0 0 9 lr n a s e ，3 7 3 3 水浴l h ： 1 2 分装至1 5 m l 离心管中，- 2 0 保存； 1 3 取2 p , 1 琼脂糖凝聚电泳检测，5 1 a l 进行纯度检测。 1 2 4d n a 质量检测 取5 9 l d n a 溶液，稀释2 0 0 倍，用紫外分光光度计分别测定2 6 0 n m ，2 3 0 r i m ，2 8 0 n m 波长是 的o d 值，通过计算可得出d n a 浓度： d n a 样品浓度( 蚓m ) = o d 2 稀释倍数x 5 0 1 0 0 0 一般样品较纯的d n a ：o d 2 o d 2 1 8 ( 1 9 ，表明有r n a 污染； 1 6 ，表明有蛋白质、 酚等污染) ；o d 2 o d 2 6 0 卸4 加。5 ( 过高有残余的盐存在) 。 1 3 威赛克和旭m d r g l l a 、m d r g l 2 a 的克隆 1 3 1 m d r g l l a m d r g l 2 a 开放阅读框序列引物的设计 根据n c b i 上公布的苹果m d r g l l a ，m d r g l 2 a 基因全序列，利用d n a m a n 软件，设计全 中国农业大学硕士学位论文第二章目的基因的克隆 长扩增引物： m d r g l l a 正向弓i 物( 1 8 + ) ； ：r g a a a a g g g a g c a c c a g a c t m d r g l l a 反向引物( 1 a ) ：c i a c i g a c t l ) 3 g t g a g c c a m d r g l 2 a 正向引物( 2 升) ：a 1 b a a g a ( 认g 从c a c r ( 屺c a l l a g c m d r g l 2 a 反向引物( 2 a - ) ：t c a c i c g 丌g a g c t c g c 1 3 2 m d r g l l a ，朋积g l 2 a 基因序列的扩增 p c r 反应体系： 枷2 03 4 r t l 威赛克，旭d n a2 u l l o xp f ub u f f e r 5 r t l d r c r l , ( 2 5 r e t o o l l ) 5 u l p l i n l e l l a + p r i m e r 2 a + ( 1 0 1 a m o l l ) 1 5 m p r i m 口l a - p r i m e r2 a - 0 0 p m o l l ) 1 5 山 总体积5 0 m p c = r 反应条件： 9 5 5 r n i n 9 5 5 0