大肠杆菌抗原基因faeG、fedF在大肠杆菌中的表达及对小鼠免疫效果的研究硕士论文

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Q 三三 U D C ： 硕士学位论文 | | | I I II r II I I I I IIII l l lIII Y 1713 5 7 6 密级： 研究生学号：2 0 51 7 0 0 5 大肠杆菌抗原基因f a e G 、f e d F 在大肠杆菌中的 表蚴小鼠免疫效果的研究 指 导老 师： ( 姓名、职称及单位) ( 姓名、职称及单位) 金堡臼塑喧嚣 逝望盘堂鱼盘叠堂堑壅堑 佥堡坦已型坠坳 逝鎏盔查塾簦堡鲎墨鱼 金_ 型壹j 塾塑瞳L 受逝婆盘堂鱼盘壁茎堡塞盟 论文答辩日期： 答辩委员会主席： ( 姓名、职称及单位) 答辩委员会委员： ( 姓名、职称及单位) 墨塑堡L 童氆坠鉴堑逝望查丝蔓匿鲎墨鱼 堕丝坠量数一 逝望盘堂塑堑盘堂堂堕 浙江大学 中国- 杭州 D i s s e r t a t i o nf o rt he D e g r e eo fM a s t e r s t u d y 。nE s c h e 霸c h i ac o l ia n t i g e ng e n ef a e Ga n df e d F e x p r e s s e d i nE s c h e r i c h i ac o l i a n dt h e i ri m m u n e e f f e c ti nm i c e S u b m i t t e dt o T h eG r a d u a t e S c h 。l 。f Z h e j i a n gU n i v e r s i t y C a n d i d a t e ：G a oY a n A d v i s o r ：R e s e a r c h e rL iW e iF e n M a j o r ：A n i m a lN u t r i t i o na n d F e e dS c i e n c e C o l l e g eo fA n i m a lS c i e c e Z h e j i a n gU n i v e r s i t y H a n g z h o u ，C h i n a J a n ，2 0 0 8 目录 中文摘要 目录 A B S T R A C T 第1 章文献综述 l U I l l 仔猪腹泻的病因分析与传统防治1 1 1 仔猪腹泻的流行病学调查l 1 2 仔猪腹泻的病因分析与鉴别诊断2 2 产肠毒素大肠杆菌主要致病因子及其致病机理的研究进展7 2 1E T E C 粘附素( a d h e s i o n ) 8 2 2 耐热性肠毒素( h e a t s t a b l ee n t e r o t o x i n S T ) 1 0 2 3 不耐热性肠毒素( h e a t 1 a b i l ee n t e r o t o x i n L T ) 1 1 2 4E T E C 的致病机理一1 3 3K 8 8 菌毛及其蛋白亚基的研究进展1 6 3 1K 8 8 粘附素1 6 3 2F a e G 在防治仔猪腹泻中的应用性研究进展1 8 4F 1 8 菌毛及其蛋白亚基的研究进展2 0 4 1F l8 的发现及一般特性2 l 4 2F 1 8 亚单位及其基因控制2 1 4 3F 1 8 菌毛的受体2 2 4 4F 1 8 菌毛与类毒素和血清型的关系2 3 4 5F 1 8 菌毛的研究近况2 3 5 本章小结与展望2 5 6 本研究的目的与意义2 6 第2 章大肠杆菌f a e G 、f e d F 基因的克隆及序列分析2 7 l 试验材料2 7 2 试验方法2 8 3 结果与分析3 2 3 1f a e G 、f e d F 基因的P C R 扩增3 2 目录 3 2 阳性克隆子的筛选与鉴定3 3 3 3K 8 8 f a e G 基因、F I8 f e d F 基因序列的测定3 4 4 本章小结3 8 第3 章大肠杆菌f a e G 、f e d F 基因在大肠杆菌中的表达3 9 1 试验材料3 9 2 试验方法4 0 3 结果与分析4 3 3 1 含有酶切位点的f a e G 、f e d F 基因片段的P C R 扩增4 3 3 2 阳性重组子的筛选与表达4 4 3 3 重组基因工程菌的蛋白质电泳4 6 4 小结与讨论4 6 第4 章大肠杆菌表达产物对小鼠免疫保护实验4 7 l 试验材料4 7 2 试验方法4 7 2 1 大肠杆菌对小鼠半数致死量( L D 5 0 ) 的测定4 7 2 2 免疫方案4 8 2 3 攻毒保护试验4 8 3 结果与分析4 9 3 1 半数致死量4 9 3 2 免疫保护效果5 0 4 小结与讨论5 0 小结 参考文献 中英文缩略词 5 l 5 2 6 2 附录一p G E M T 载体6 3 附录二p E T 一3 0 a ( + ) 载体一6 4 致谢 中英文摘要 中文摘要 仔猪腹泻一直是困扰养猪业的难题之一，每年给畜牧生产带来巨大的经济损失。 产肠毒素性大肠杆菌( E n t e r o t o x i g e n i cE s c h e r i c h i ac o l i ，E T E C ) 和产v e r o 细胞毒素性 大肠杆菌( V o t o x i g e n i cE s c h e r & h i ac o l i ，V T E C ) 是引起仔猪腹泻和水肿病的两种重 要的大肠杆菌，其致病性主要与粘附素和所产生的肠毒素有关。K 8 8 和F 1 8 是引起 仔猪腹泻的两个重要的菌毛抗原。K 8 8 由f a e 基因簇编码的蛋白贬基构成，F a e G 是 K 8 8 菌毛蛋白中具有粘附功能的蛋白亚基；F 1 8 则有f e d 基因簇编码的蛋白亚基构 成，F e d F 是F 1 8 菌毛蛋白中具有粘附功能的蛋白亚基。本研究在克隆f a e G 基因和 f e d F 基因的基础上，在大肠杆菌中分别表达了F a e G 和F e d F 蛋白，并将表达产物免 疫小鼠，观察其免疫活性，获得了如下主要结果： ( 1 ) 根据G e n B a n k 上f a e G 基因序列( M 2 5 3 0 2 ) 和f e d F 基因序Y S J ( A Y 9 7 0 8 1 8 ) ， 设计了两对克隆引物5 P i n F 4 、3 P i n F 4 和5 P i n F l 8 、3 P i n F l 8 。分别以大肠杆菌K 8 8 和F i g 菌株为模板，采用P C R 方法扩增得到f a e G 和f e d F 全长基因片段，并将其与 克隆载体连接，获得重组克隆质粒p G E M f a e G 和p G E M f e d F 。测序结果表明：f a e G 成熟肽基因全长8 5 2 b p ，其中N 端前2 0 个氨基酸为信号肽，成熟肽由2 6 4 个氨基酸 残基组成，所得f a e G 基因核甘酸序列与M 2 5 3 0 2 同源性为9 9 ，氨基酸序列同源性 为9 8 ；f e d F 成熟肽基因全长9 0 8 b p ，其中N 端前2 0 个氨基酸为信号肽，成熟肽 由2 8 2 个氨基酸残基组成，所得f e d F 基因核甘酸序列与A Y 9 7 0 8 1 8 同源性为9 8 ， 氨基酸序列同源性为9 7 。 ( 2 ) 在克隆的基础上，分别将f a e G 和f e d F 基因定向插入到大肠杆菌B L 2 1 融 合表达载体p E T - 3 0 a ( + ) 中，经转化和筛选分别获得了含重组表达质粒p E T f a e G 和p E T f e d F 的阳性表达菌E c o l i p E T f a e G 】和E c o l i p E T f e d F 。S D S P A G E 电泳显 示，F a e G 和F e d F 蛋白在大肠杆菌中成功表达。 ( 3 ) 将4 0 只B A L B c 小鼠分成4 个组，每组1 0 只，分别在试验第l 、2 、3d 和第2 0 、2 1 、2 2d 进行口服免疫P B S 、E c o l i p E T 、E c o l i p E T - f a e G 、E c o l i p E T - f e d F ， 第5 组用E c o l i p E T - f e d F 免疫l O 只I C R 小鼠。第4 0d 用大肠杆菌进行攻毒试验以 评价活重组菌的免疫保护效果。结果表明：E c o l i p E T f a e G 、E c o l i p E T f e d F 、I C R 鼠的存活率分别为7 5 、6 2 5 、7 5 ，而对照组小鼠的存活率仅为2 0 。以上结 I _ _ _ 一一一一一一一 j 型塑 果表明，表达抗原对小鼠具有较好的免疫保护效果。 以上研究结果为预防仔猪腹泻提供了新的思路。 关键词：仔猪腹泻；大肠杆菌；f a e G 基 ；庇d F 基因；免疫活性 中英文摘要 A B S T R A C T P o s t w e a n i n gd i a r r h e a i s a l w a y s o n eo ft h e m a j o rp r o b l e m sh i n d e r i n gt h e d e v e l o p m e n to fb r e e d i n gp i g sa n dc a u s e sg r e a te c o n o m i cl o s st of a r m i n gp r o d u c t i o n E n t e r o t o x i g e n i cE s c h e r i c h i ac o l ia n dV o t o x i g e n i cE s c h e r i c h i ac o l ia r et w oi m p o r t a n t p a t h o g e n sw h i c hc a u s e dd i a r r h e aa n de d e m ao fw e a n e dp i g l e t s ，t h ep a t h o g e n i c i t ym a i n l y a t t r i b u t e st ot h ea d h e s i o n sa n de n t e r o t o x i n s K 8 8f i m b r i a ea n dF18f i m b r i a ea l et w o i m p o r t a n ta n t i g e n sa s s o c i a t i n gw i t hn e o n a t a ld i a r r h e ai np i g l e t K 8 8i se n c o d e db yf a e g e n ec l u s t e r s ，F a e Oi st h em a j o rf i m b f i a lp r o t e i ns u b u n i ta n dc a r r i e st h ea d h e s i v e p r o p e r t i e so ft h eK 8 8f i m b r i a e ；F18i se n c o d e db yf e dg e n ec l u s t e r s ，F e d Fi st h em a jo r f i m b r i a lp r o t e i ns u b u n i ta n dc a r r i e st h ea d h e s i v ep r o p e r t i e so ft h eF 18f i m b r i a e O nt h e b a s i so fc l o n i n gf a e Gg e n ea n df e d Fg e n e , t h eF a e Ga n dF e d Fp r o t e i n sw e r ee x p r e s s e di n E s c h e r i c h i ac o l ir e s p e c t i v e l y ，t h e nt h es m a l lm i c ew e r ei m m u n e dw i t ht h er e c o m b i n a n t E s c h e r i c h i ac o l is t r a i n sa n do b s e r v e di t s i m m u n o c o m p e t e n c e ( i m m u n er e s p o n s e ) T h e r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) T oc l o n ef a e Gg e n ea n df e d Fg e n e ，p r i m e r s5 P i n F 4 ，3 P i n F 4w h i c hc o n t a i nB a m H I a n dS a Ir e s t r i c t i o ne n z y m es i t e sa n d5 P i n F l8 ，3 P i n F l8w h i c hc o n t a i nE c o R Ia n dS a I r e s t r i c t i o ne n z y m es i t e sw e r ed e s i g n e d T h ef a e Ga n df e d FD N Af r a g m e n t sw e r e a m p l i f i e db yP C Ru s i n gt h eg e n o m eo fK 8 8a n dF 18a st e m p l a t er e s p e c t i v e l y T h eD N A f r a g m e n t so b t a i n e dw e r ec l o n e di n t op G E M TE a s y V e c t o rt o g e n e r a t e t h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dp G E M f a e Ga n dp G E M - f e d F D N As e q u e n c i n gr e s u l t s s h o w e dt h a tt h ef u l ll e n g t ho ff a e Gw a s8 5 2b p ，e n c o d i n g2 6 2a m i n oa c i d sw i t l la s i g n a l p e p t i d eo f 2 0a m i n oa c i d s ，t h es e q u e n c eh o m o l o g yw i t hM 2 53 0 2W a s9 9 a tn u c l e i ca c i d l e v e la n d9 8 a ta m i n oa c i dl e v e l ；t h ef u l ll e n g t ho ff e d FW a s9 0 8b p ，e n c o d i n g2 8 2 a m i n oa c i d sw i t has i g n a lp e p t i d eo f2 0a m i n oa c i d s ，t h es e q u e n c eh o m o l o g yw i m A Y 9 7 0 818W a s9 8 a tn u c l e i ca c i dl e v e la n d9 7 a ta m i n oa c i dl e v e l ( 2 ) T h ea i m e df r a g m e n t sw e r ei n s e r t e di n t ot h em u l t ic l o n es i t eo fp E T - 3 0 a ( + ) v e c t o ra n dt r a n s f o r m e di nE s c h e r i c h i ac o l iB L 21 r e s p e c t i v e l y T h er e c o m b i n a n ts t r a i n s c o n t a i n i n gt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp E T - f a e Ga n dp E T - f e d Fw e r es e l e c t e da n dn a m e da s E c o l i p E T - f a e G 】a n dE c o l i p E T - f e d F S D S P A G Ed e m o n s t r a t e dt h a tt h eF a e Ga n d 中英文摘要 F e d Fp r o t e i n sw e r ee x p r e s s e di nE c o l is u c c e s s f u l l y ( 3 ) T h e4 0B A L B cm i c ew e r ed i v i d e d i n t of o u rg r o u p sa n di m m u n i z e db y i n t r a g a s t r i c a d m i n i s t r a t i o nw i t h P B S ( c o n t r 0 1 ) 、E c o l i p E T 】、E c o l i p E T - f a e G 】、 E c o l i p E T f e d F 】a n dt h ef i f t hg r o u pu s i n g10I C Rm i c ei m m n u i z e db yE c o l i p E T f e d F 】 a td a y s l s t , 2 n d , 3 r a , 2 0 t l l ，21 啦a n d2 2 加T h e s em i c ew e r ec h a l l e n g e dw i t hE s c h e r i c h i ac o l ia t d a y4 0 m R e s u l t ss h o w e dt h a t7 5 、6 2 5 、7 5 & m i c ei m m u n i z e dw i t h p E T f a e G 、 E c o l i p E T f e d F 】a n dt h e10I C R m i c es u r v i v e d ，w h e r e a s2 0 i nc o n t r o lg r o u p K e yW o r d s ：P o s t w e a n i n gd i a r r h e a ；E s c h e r i c h i ac o l i ；f a e Gg e n e ；f e d Fg e n e ； i m m u n o c o m p e t e n c e 第一章文献综述 第1 章文献综述 l 仔猪腹泻的病因分析与传统防治 1 1 仔猪腹泻的流行病学调查 1 1 1 仔猪腹泻的流行与危害 近几年来，我国猪病的流行呈上升趋势。首先，从流行季节上看，流行规律有 较大变化，以往冬春季节多发，而近几年夏季也多流行。其次，从发病猪群上看， 各年龄、生理状况的猪都有发生，一般以仔猪发病率和病死率为最高。仔猪腹泻通 常是指5 0 日龄以内的由各种病因引起的以腹泻为主要临床症状的高发性疾病，是兽 医临床常见的疾病之一。 在养猪生产中，为了提高母猪生产力和畜舍利用率，可以对仔猪实行早期断奶， 增加经济效益。然而，断奶过早给仔猪带来一系列的不良影响，如食欲差、消化不 良、生长缓慢、抗病力下降，甚至出现腹泻和水肿等病理现象。据调查，仔猪因腹 泻死亡占仔猪死亡总数的3 9 8 。 近年来，我国仔猪腹泻十分普遍。据有关报道，3 0 k g 以下的仔猪，全年平均腹 泻发病率为4 6 5 ，死亡率高达1 0 3 ( 张代等，2 0 0 4 ) 。在养猪业较发达的国家如 美国，仔猪断奶前死亡率约1 5 5 ，荷兰1 1 5 1 4 2 ( 王红宁，2 0 0 6 ) 。仔猪腹泻 常导致饲料报酬低、仔猪成活率下降、生长缓慢、生长发育停滞成为僵猪，甚至引 起仔猪大量死亡，给养猪业带来巨大的经济损失。 1 1 2 仔猪腹泻的临床症状 腹泻是指排粪次数增多和粪便的性状发生变化，如数量增多且稀薄、不成固有 形状而可能呈稀粥状甚至水样，并伴有粘膜、血液、脓汁等异常物和未消化的食物 等。猪肛门周围粘有稀粪，猪舍地面也可见到稀粪。仔猪腹泻后不久即可见到脱水 症状，如眼窝下陷，骨突出部清晰可见，皮肤干燥、颜色发绀，像羊皮纸，指压后 保持牵拉状态。重症者主要表现为突然休克死亡，死前没有任何症状或仅有短期发 病史，耳和腹部常呈蓝红色，病死者常为群内营养良好的仔猪。慢性病例临床表现 为采食量下降、绿黄色水样腹泻、尾部震颤、脱水、精神萎靡，但直肠温度正常。 尸检可见发绀和脱水、小肠膨胀、水肿和空肠后段充血。轻度腹泻常导致仔猪营养 脱水、酸中毒和腹泻性水肿，变成僵猪甚至 第一章文献综述 1 1 3 仔猪腹泻的发病规律 仔猪腹泻的发病规律通常表现为：初生2 3 天的仔猪因对环境条件的突变不适应 或受不良品质初乳的影响出现水样粪便；1 0 1 2 天因补料不当，胃肠适应功能不足引 起的饲料抗原过敏或饲料中营养抑制因子影响排稀便或粥样便；出生2 0 天左右由产 毒素型大肠杆菌引起的乳白色或灰白色稀便或软便；断奶后7 天内由于断奶应激和断 奶后限饲不当引起的稀便或粥样粪便等。 1 2 仔猪腹泻的病因分析与鉴别诊断 仔猪因肠道内尚未建立稳定的微生态体系，自身抵抗力较低，对外界刺激敏感， 易受各种病原微生物的侵袭和各种应激因素的影响。哺乳仔猪以传染性腹泻较为常 见，而保育仔猪以日粮抗原过敏、断奶、饲料突然更换、寒冷、环境应激等非传染 性因素引起的腹泻为主。两种因素间的关系十分密切，既相互影响，又互为因果。 因此，在生产实践中，仔猪腹泻往往是多种因素相互作用的结果，常呈多重感染或 交叉混合感染。引起仔猪腹泻的病因有很多，主要可分为非传染性因素和传染性因 素两种。 1 - 2 1 非传染性因素 1 2 1 1 仔猪自身的生理因素 断奶仔猪新陈代谢旺盛，生长发育迅速，但其消化器官、消化机能、机体免疫 能力、神经系统等发育尚不完善，容易诱发腹泻。 l 211 1 早期断奶仔猪的免疫能力较弱 体况良好的母猪所产初乳中乳球蛋白( 主要是免疫球蛋白) 含量高达7 以上， 新生仔猪可完全吸收初乳中的免疫球蛋白而获得被动免疫。而常乳中乳球蛋白含量 仅0 5 左右，此时仔猪很难再从母乳中获得足够的母源抗体保护，只能依靠主动免 疫。由于断奶前抗体数量很少，断奶后仔猪母源抗体来源终止，而自身免疫系统尚 不健全，循环抗体水平降低，细胞免疫受到抑制，抗病力较差，是造成断奶仔猪腹 泻的原因之一。 1 2 1 1 2 仔猪神经系统发育不完善 仔猪的大脑皮层机能发育不完善，此时的神经调节主要靠非条件反射来进行， 而非条件反射仅在外界环境保持稳定的情况下才能确保机体的平衡性，这说明仔猪 对外界环境的适应性很差，所以在断奶、换料、分群等条件下易诱发消化道疾病( 王 2 第一奄文献综述 冉，1 9 9 9 ) 。 1 2 1 1 3 仔猪消化道内消化酶活性较低 仔猪出生后最初几周胃腺的分泌十分有限，一般要到8 周龄以后才具有较为完 善的分泌功能。初生数天的仔猪胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、蔗糖酶、麦芽糖 酶、淀粉酶等的活性均很低，一般在3 - 4 周以后才迅速上升。这种变化势必严重影 响仔猪8 周龄前对日粮的消化吸收。另外，仔猪断奶前吃的母乳以乳糖、乳脂、乳 蛋白等液体为主，易于消化，此时仔猪体内乳糖酶分泌量很高。断奶后仔猪主要以 干饲料为主，此时，仔猪主要需要淀粉酶，但体内的淀粉酶活性不足。从食母乳到 转食干饲料，淀粉酶和胃蛋白酶活性的不足都会影响仔猪对饲料的消化。 1 2 1 1 4 仔猪消化道内胃酸不足，p H 偏高 一般成年猪正常的p H 值为2 3 5 ，是胃蛋白酶发生效力的最佳范围。成年猪主 要通过胃底细胞分泌盐酸来调节p H 值，而仔猪分泌盐酸的能力很弱。尽管这种能 力随日龄在不断增加，但一般仔猪胃p H 值在8 1 0 周龄才达到成年水平，到1 2 周 龄胃酸分泌量才充足。早期断奶仔猪的胃p H 值偏高，不利于蛋白质的消化。同时， 过高的胃肠p H 值会给病原菌的存活提供较适宜的条件，病原菌的最适p H 值一般为 6 - 8 ，在p h i 4 时才能失活。病原菌的繁殖会导致吸收不良、炎症、拉稀等疾病的产 生( 汤喜林等，2 0 0 6 ) 。 1 2 1 2 仔猪饲料及饲料中大豆蛋白水平的影响 来自饲料方面的原因很多，如哺乳母猪料的营养品质和卫生指标是否合格，猪 料是否含有大量抗营养因子及过敏原，是否含有破坏肠道微生物平衡的物质，是否 含有大量不易消化的物质( 如小麦、高粱、菜籽饼、棉籽饼等) ，肠道内有益微生 物赖以生存的营养成分是否充足。脂肪类物质是否变质或过量，导致脂肪性拉稀； 玉米类碳水化合物是否含量过高，导致消化不良性拉稀；饲料的适口性、营养指标、 饲料配方的变化是否很大，饲料中是否含有霉变原料或霉菌毒素，都会引起仔猪断 奶后的腹泻。 饲料中大豆蛋白抗原过敏的影响尤为突出。大豆蛋白是长期以来猪饲料中的主 要蛋白源，大豆蛋白的氨基酸组成非常好，但大豆中含有多种抗营养因子，如抗胰 蛋白因子、植物凝集素等，其中影响仔猪消化的是一种蛋白质碳水化合物致敏因子， 这种物质经高温处理尚不能完全消除其致敏作用，它可以引起早期断奶仔猪短暂过 第一章文献综述 敏反应，使肠绒毛大量脱落，隐窝加深，降低消化面积，导致肠道营养物质吸收不 良、绒毛萎缩和腹泻。 1 2 1 3 仔猪的断奶应激 仔猪从出生到断奶一直是在母猪身边吮吸母乳的，到断奶时突然由液体饲料或 部分干料转为全部干料来饲喂，母猪也突然离开，仔猪适应力较差，易发生应激。 仔猪的断奶应激分为心理应激、环境应激和营养应激，其中营养应激常常造成仔猪 血糖、胰岛素、生长激素水平下降、肝糖原降低、胃p H 和游离脂肪酸水平升高， 表现为生长缓慢、采食量少、肝糖原和体脂动用以维持生存等( 吴昌标，2 0 0 3 ) 。 1 2 1 4 胃肠道微生物菌群的变化 仔猪胃内p H 7 0 ) ，室温或3 7 0 放置2r a i n 。 8 ) 1 20 0 0r p m 室温离心lm i n ，离心管中的液体即为回收的D N A 片断，可立即使 用或保存于2 0 C 备用。 2 5D N A 片段的连接 目的D N A 片段与p G E M TE a s yV e c t o r 连接体系。P C R 产物经电泳( 1 l O V ，1 0 0m A ，5 0m i n ) 割胶回收后，然后与p G E M TE a s yV e c t o r 连接。 连接反应体系如下： P C R 回收产物 7 0l x l 2 x T 4 D N A 连接酶缓冲液 p G E M - TV e c t o r T 4 D N A 连接酶 共计 1 0r t l 1 0 斗l 1 0I x l 1 0 0g l 混匀离心，4 C 放置过夜( 以上均在冰上操作) 2 6 感受态细胞的制备与转化 2 6 1 感受态细胞的制备 1 ) 取8 0 0 C 冻存( 在含2 0 甘油的L B 中) 的菌株Ec o l iT o p l 0 ，划线于L B 平板上，3 7 培养过夜。 2 ) 挑取单菌落接种于5m lL B 液体培养基，3 7 0 ，1 8 0r m i n 振荡培养1 2h 左右。 3 ) 取5 0g lL B 培养液转入5m lL B 中，3 7 0 下l8 0r m i n 振荡培养1 5h 左右 至O D 6 0 0 约为0 6 ，将培养液放于冰上。 4 ) 吸取培养液约5m l 于离心管中，4 0 下5 0 0 0r m i n 离心2r a i n ，弃尽上清。 5 ) 加入lm l 预冷的0 1m o l LC a C l 2 溶液，充分重悬菌液。 6 ) 4 0 0 0r m i n 离心4m i n ，弃尽上清。 第2 章大肠杆菌f a e G 、f e d F 基因的克隆与序列分析 7 ) 加入2 0 0g l 预冷的O 1m o l LC a C l 2 溶液，重新轻轻悬浮细菌，即成感受 态细胞。若要保存，则加入终浓度为l5 的灭菌甘油，混匀后于8 0 C 保 存。 2 6 2 感受态细胞的转化 1 ) 取连接产物5p l 加于2 0 0l a l 感受态细胞中，冰浴3 0m i n ，同时设对照， 将标准质粒D N A 导入感受态细胞中。 2 ) 4 2 C 下热激9 0s ，立即放回冰浴中5r a i n 。 3 ) 加入L B 液体8 0 0g l ，3 7 C 下1 5 0r m i n 培养1h ，使细胞复苏。 4 ) 取2 0 0g l 转化的细菌液涂于含有A m p 的L B 平板上( 已经涂过X g a l 和I P T G ) ， 于3 7 ( 2 培养1 2 1 6h ，观察平板上的细菌密度并通过显色反应( 白斑) 初步确定 含有重组质粒的阳性克隆，通过质粒D N A 的提取以鉴定重组子。 2 7 重组质粒的提取与鉴定 1 ) 挑白色单菌落于含有适量A m p 的L B 液体培养基中，3 7 C1 5 0r m i n 培养 过夜。 2 ) 吸取菌液1 5m l ，1 0 0 0 0g 离心2r a i n ，弃尽上清。 3 ) 加入1 0 0g lS o l u t i o nI ，用枪头或振荡器使细菌充分悬浮。 4 ) 加入2 0 0l a l 的S o l u t i o nI I ，立即温和混匀，使细菌裂解，室温放置2m i n ， 此时溶液应该变为澄清。 5 ) 加入3 5 0g l 的S o l u t i o nI I I ，立即上下颠倒5 一1 0 次使之充分混匀，室温放 置2m i n 。 6 ) 1 20 0 0r p m 离心5m i n ，若无沉淀则再离心1 5r a i n 。 7 ) 将步骤6 中上清转移到2 0m l 收集管内的U N I Q 柱中，80 0 0r p m 室温离 心15s 。 8 ) 弃收集管中的废液，将U N I Q 柱放入同支收集管中，吸取5 0 0 肛lW a s h S o l u t i o n 到U N I Q 柱，1 00 0 0r p m 室温离心3 0s 。 9 ) 重复步骤8 。 1 0 ) 弃收集管中的废液，将U N I Q 柱放入同一支收集管中，1 00 0 0r p m 室温离心3 0 s 以彻底去除W a s hS o l u t i o n 。 1 1 ) 将U N I Q 柱放入新的洁净1 5m l 离心管中，加5 0r t lE l u t i o nB u f f e r ，室温放置2 第2 章大肠杆菌f a e G ，f e d F 基因的克隆与序列分析 r a i n 后，1 00 0 0r p m 室温离心lr a i n ，离心管中的溶液即为所抽提的质粒D N A 。 1 2 ) P C R 扩增鉴定：除用质粒代替基因组作为模板外，P C R 反应体系和反应条件与 基因克隆相同，之后电泳检测。 2 8f a e G 、f e d F 基因的序列测定 f a e G 、f e d F 基因的阳性菌送上海生物工程有限公司进行序列测定。 2 9 同源性比较 采用C l u s t a lW 软件进行同源性比较。 3 结果与分析 3 1f a e G 、f e d F 基因的 P C R ：j I J 增 以K 8 8 和F 1 8 菌液为模板，5 P i n F 4 、3 P i n F 4 和5 P i n F l 8 、3 P i n F l 8 为引物扩增 f a e G 、f e d F 基因。经琼脂糖凝胶电泳检测，f a e G 和f e d F 的目的条带大小均与预期 结果相符( 见图1 2 ) 。 -K 8 8f a e G 基因的P C 动。增结果 後，五奢一，；。群、； + r 一转、也一一 ；图1K 8 8f a e G 基因P C R 扩增产物电泳图 ? 。?MD N AM a r k e r ；1 阴性对照 ，。，赡 2k 8 8f a e G 基因P C R 扩增产物 ：； 磺F i g 1P C Ra m p l i t 砌e a t i o no fK 8 8f a e Gg e n e ；MD N A M a r k e r ，j l N e g a t i v e ； 2P C Rp r o d u c to fK 8 8f a e Gg e n e ； ：，墨 3 2 第2 章大肠杆菌f a e G 、f e d F 基因的克隆与序列分析 9 0 12 b p F 1 8f e d F 基因的P C R 扩增结果 图2F 1 8f e d F 基因P C R 扩增产物电泳图 MD N AM a r k e r 1 阴性对照 2F 1 8f e d F 基因P C R 扩增产物 F i g 2P C Ra m p l i f i c a t i o no f F l 8f e d Fg e u e MD N AM a r k e r 1 N e g a t i v e 2P C R p r o d u c to f F 1 8f e d Fg e n e 3 2 阳性克隆子的筛选与鉴定 P C R 产物经割胶回收与p G E M T 载体连接，连接产物转化感受态大肠杆 菌T o p l 0 并涂L B 平板( 涂有I P T G 和X g a l ，含A m p ) 过夜培养。挑取白斑 于L B 培养基中，3 7 C 培养1 2 1 4h ，提取质粒进行P C R 鉴定，结果表明重组 质粒含有f a e G 、f e d F 基因( 见图3 ) ，将含有f a e G 、f e d F 基因的重组质粒分 别命名为p G E M f a e G 和p G E M f e d F 。 f e d F 一 “2 t 一7 豫 b p “。铹 f a e G 一t 0 一5 0 0 二 。t 图31 a e G 、f e d F 基因阳性克隆子P ( 疆鉴定电泳图 l f a e G 基因阳性质粒的P C R 扩增产物 2f e d F 基因阳性质粒的P C R 扩增产物 MD N A M a r k e r F i g 3P C Ra m p l i f i c a t i o no ff a e G 、f e d Fg e n e r ： l 1 0 0i 2 f e R F 、f a e G 基因的P c R 鉴定结果 it， 一； 。 ，馥 w i t hp G E M - TV e c t o ra st e m p l a t e P C R p r o d u c to ff a e Gg e n e P C Rp r o d u c to f f e d Fg e n e MD N AM a r k e r 3 3 第2 章大肠杆菌f a e G 、f c d F 基因的克隆与序列分析 3 3K 8 8 f h e G 基因、F 1 8 f e d F 基因序列的测定 测序结果表明：克隆的f a e G 基因全长8 5 2 b p ，其中N 端前2 0 个氨基酸为信号 肽，成熟肽由2 6 4 个氨基酸残基组成：克隆的f e d F 基因全长9 0 8 b p ，其中N 端前 2 0 个氨基酸为信号肽，成熟肽由2 8 2 个氨基酸残基组成。采用C l u s t a lW 软件将f a e G 基因和f e d F 基因序列分别与G e n e b a n k 上M 2 5 3 0 2 基因和A Y 9 7 0 8 18 基因的D N A 序 列和氨基酸序列进行同源性比较。结果表明，f a e G 基因核甘酸序列与M 2 5 3 0 2 仅有 4 个碱基的不同，同源性为9 9 ( 见图4 ) ，氨基酸序列同源性为9 8 ( 见图5 ) ： f e d F 基因核甘酸序列与A Y 9 7 0 8 1 8 的同源性为9 8 ( 见图6 ) ，氨基酸序列同源性 为9 7 ( 见图7 ) 。 K 8 8 f a e G A T G A A A A A G A C T C T G A T T C - C A C T G G C A A T T G C T G C A T C T G C I G C A T C T G G T A T C , G C A C A T ( 信号肽序列) I l1 1l | I II | l lI I I I l I II | I l | il l | lI I I | I l l | l | Il l M 2 5 3 0 2A T G M A A G A c T c T G G C A C T G G C 从T T G c T G c A T c T G C T G c A T C T G G T A T O G c A c A T ( 信号肽序列) K 8 8 f a e Gl 1 4 2 5 3 0 24 6 8 K 8 8 f a e G6 1 M 2 5 3 0 25 2 8 嗍峨G 椒Q 吼G 峨弧c K 矾郦C g 矾C G 讯躲C Q 吼Q 殴峨 幔C 撼翼G c G 气6 Q | ll Il l I I I I l II lI II lI l | Il ll | I II ll lI l I I l Il l l ll I | Il Il Il lI | l | l G c c T G G A T G A c 瑚T G A T T T C A A T G G T T G G G T c G A T A T C G G T G G T A G T A T c A c 删A T5 2 7 G m 般C 吼C 畸嗵矾谳K 矾瞒K 潲嗨1 阮h G 帆m K 讯G G 冰n 湖K 啉吼氏 I l | II | I I | | l | I II I | II II | Il I | II Il J | II l I Il I I II Il Il l G A T T A T C G T C A G 从A T G G G A A T G G A A A G T T G G T A C A G G T C T T 从T G G A T l v r G G T A A T G T A K 8 8 f a e O1 2 1T T G M T G A c C T G A c c A A T G G T G G M C C A 从c T G A c c A T T A C T G T T A C T G G T A A T A A G c c I | | I I | I | l | | I | II l | | I | | | I I | II ll f | If II I I l | | I | I I | ll I I II 1 4 2 5 3 0 25 8 8T T G T G A C C T G A o C A A T