（病原生物学专业论文）hlab48：22新等位基因的发现和确认研究.pdf

。 t l 学位论文作者 导师 签 日期：h j 咖巾 日期：h 戽j 月j | 日 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的： 应用荧光微珠h l ap c r s s o 基因分型技术、h l a 基因测序分型技术和基 因克隆技术，对用直接测序方法不能确认结果、可能携带有未知h l a 等位基因 的样本，开展基因克隆技术分离单个等位基因、测序后获得未知h l a 等位基因 碱基序列的研究，以确认样本中可能携带的h l a 新等位基因。 方法： 本课题应用荧光微珠h l ap c r - s s o 基因分型技术、h l a 基因测序分型技术 和基因克隆技术，采用商品化试剂，对含有未知h l a 等位基因的1 2 6 0 5 号疑难 样本进行研究，获得单个h l a 等位基因序列；与i m g t 专业数据库进行序列比 对，将未知序列在g 锄b a n k 进行注册；向w h oh l a 因子命名委员会申报h l a 新等位基因。 结果： 1 在本实验室建立起用基因克隆技术分离单个h l a 等位基因的研究方法。 2 将单个未知h l a 等位基因的碱基序列，与i m g t 专业数据库比对仍为未 知序列。与最接近的h l a b 4 8 ：0 1 ：0 1 序列进行比对，在h l a b 位点第2 外显 子( e x o n 2 ) 出现3 个碱基替换。将未知序列上报w h oh l a 因子命名委员会。 结论： 获得的未知h l a 等位基因的碱基序列，已经在g c r m a n k 注册，注册号为 g u 5 7 0 4 2 9 ，于2 0 1 0 年1 月3 1 日被w h oh l a 因子命名委员会确认为h l a 新 等位基因，正式命名为h l a b 4 8 ：2 2 。 关键词：h l a 等位基因p c r s s o 基因克隆序列分析 i ? l - f ， r e s u l t s ( i ) c l o n i n ga n ds e q u e n c i n gt e c h n o l o g yw a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e dt o e s t a b l i s har e s e a r c hm e t h o dt os e p a r a t es i n g l eh l aa l l e l e ( 2 ) s e p a r a t es e q u e n c eo f t h eu i l k i l o w nh l aa l l e l ew a sa c c q u i r 。da n ds e q u e n c ea l i g n m e n tw a sc o m p l e t o di n t h ei m g tp r o f e s s i o n a ld a t a b a s e t h r e 昭b a s es u b s t i t u t i o na p p e a r e di nt h eh l a - b s e c o n dc x o n ( e x o n 2 ) s e q u e n c e c o m p a r e dw i t ht h en e a r e s th l a - b 幸4 8 ：0 1 ：0 1 s e q u e n c e t h et u l k n o w ns e q u e n c ew a ss u b m i t t e dt ow h o h l an o m e n c l a t u r e c o m m i t t e e c o n c l u s i o n ss c c l u c eo ft h eu n k n o w i lh l aa l l d ew a sr e g i s t e r e di n g e n b a n k t h ea c c e s s i o nn u m b e ri sg u 5 7 0 4 2 9 t h eu n k i l o w i ls e q u e n c eh a sb e e n o f f i c i a l l yn a m e dh l a b 4 8 ：2 2b yw h oh l an o m e n c l a t u r ec o m m i t t e e0 1 1 j a n u a r y3i ，2 0 1 0 k e y w o r d s ：h l a a l l e l ep c r s s o g c n ec l o n i n gs e q u e n c i n g 天津医科大学硕士学位论文 目录 中文摘要i a b s t r a c t “ 符号说明i v 前言“”一一”。1 刚吾”“”“”“” 研究现状、成果6 研究目的、方法8 一、h l a b 4 8 ：2 2 新等位基因的发现9 1 1 对象和方法9 1 1 1 材料9 1 1 2 方法一”“1 0 1 1 3 数据的收集和分析软件1 1 1 2 结果”o o oooq “1 2 1 3 讨论一”1 8 二、基因克隆分离单个h l a b 4 8 ：2 2 新等位基因2 0 1 1 对象和方法2 0 1 1 1 材料“”“2 0 1 1 2 方法2 l 1 2 结果2 5 1 3 讨论”“2 9 结论“一”“o o o oooo oo mj oo 800 3 4 参考文献3 5 发表论文和参加科研情况说明3 8 综述”“3 9 综述参考文献0 00 4 5 致谢“”4 7 l l i g e ne _ b a n k e x o n i v 基因库 外显子 天津医科大学硕士学位论文 刖磊 h l a 概述 主要组织相容性复合体( m h c ，m a j o rh i s t o e o m p a f i b i l i t yc o m p l e x ) 是表达于 脊椎动物有核细胞表面的一类具有高度多态性，含有多个基因座位，并紧密连 锁的基因群，负责识别某一组织，是同源的予以接受，是外来的则加以排斥。 m h c 在不同物种中所处的染色体位置不同，其中小鼠的m h c 又称h 。2 复合体， 位于1 7 号染色体上；人类的m h c 又称h l a 复合体，与小鼠h 2 为同源结构， 位于第6 号染色体短臂6 p 2 1 3 1 上，其分布范围大约3 6 0 0 4 0 0 0k b ，利用分子生 物学的手段已经测得该区全部d n a 序列，按其编码产物的结构、表达方式、组 织分布与功能可将这些基因进行分类( 见图1 ) 。 1 1m a 复合体的分类 h l a i 类基因：在i 类基因区内，存在多达3 1 个i 类基因座位，已识别并 命名的有8 个基因座位，其中h l a a 、h l a b 、h l a c 为经典的h l a i 类基 因。 h l a 类基因：在类基因区包括约3 0 个基因座位，经典的类基因一般 指h l a - d r 、d p 和d o ，它们编码的产物均为双肽链( ) 分子。 h l a 类基因：免疫功能相关基因。现已发现h l a 类基因区至少有3 6 个基因座位。其中c 2 、c 4 a 、c 4 b 、b f 座位编码相应的补体成分，另外包括2 1 羟化酶基因( c y p 2 1 a 、b ) 、肿瘤坏死因子基因( t n fa 、b ) 以及热休克蛋白 7 0 ( h e a ts h o c kp r o t e i n 7 0 ，h s p 7 0 ) 基因等。 非h l a 基因：近年来，还发现了一些位于i i 类基因区的新基因座位，其中 部分基因的产物及功能已清楚，它们包括： a 肽链转运蛋白基因( 即t a p l 和r i = a p 2 ) ，其产物与细胞内的肽转运有关， 已被命名为抗原处理相关的转运蛋白( t a p ) 或抗原肽链转运肽( t r a n s p o r t e ro f a n t i g e np e p t i d e ) 。 b 蛋白酶体相关基因( p r o t e a s o m e - r e l a t e dg e n e ) 即l m p 2 和l m p 7 ，其产物 参与内源性抗原处理和递呈，已被命名为低分子量多肽( l ) 或巨大多功能 蛋白酶。 天津医科大学硕士学位论文 人类h l a 复合体( 第6 号染色体) ： d pd nd ml m pt a p d od q d r m h c - c 4 瞰c 2t n fbceagf l 1 一jl 1 一 m h c m h c i 图1 人 - e , a 复合体基因在染色体上的分布 1 2 等位基因与复等位基因 等位基因是在一对同源染色体上，占有相同座位的一对基因，它控制一对 相对性状。在一个群体内，同源染色体的某个相同座位上的等位基因超过2 个 以上时，就称作复等位基因。对某一个体来说一个基因座只有一对等位基因， 复等位基因是群体的概念。如乙a 复合体类和类基因位点多为复等位基因。 1 3 皿a 的特异性与命名 根据不同等位基因编码的h l a 分子在抗原特异性上的差异，用血清学和细 胞学方法，检出了大量的抗原型( 表型) ，将之命名为h l a 特异性或称为型。 根据不同等位基因之间的d n a 序列的差异，用各种d n a 分型技术可以直接确 定等位基因。由于许多等位基因可以表现出同一种抗原特异性，因此等位基因 水平的多态性比抗原水平要高得多，等位基因的命名也是与它所属的抗原型联 系在一起的。 w h o 甩a 因子命名委员会于2 0 1 0 年4 月1 日公布了 玎l a 系统等位基因 的最新命名原则。对卸乙a 系统基因的命名，星号( 木) 前为基因座位，星号后 为等位基因( 见图2 ) 。卸l a 命名委员会指出，所有等位基因的命名至少4 位数， 6 位和8 位数的名字只在必要时指定，冒号代表分隔号。图2 中“0 2 ”描述基因组， 2 天津医科大学硕士学位论文 即血清抗原型别；“1 0 1 代表特异性的h l a 蛋白，即亚型；“0 1 描述等位基 因在编码区同义替换不同的核苷酸；接下来的“0 2 ”指定内含子序列多态性， 内含子或外显子5 ，3 非编码区的不刚1 】；后缀“n 用于注释表达的变化。 图2 h l a 命名 如一a 抗原的命名由w h o 卸二a 因子命名委员会确定，每个特异性抗原均以 其基因位点的字头附以适当的数字( 按抗原被发现或正式命名的顺序) 表示。 标有w ( w o r k s h o p ) 的为暂用名，得到认可后将其去掉；1 9 9 1 年决定：新特异 性的申报要有明确的d n a 顺序，并根据d n a 间关系命名，故取消w ；现在所 保留的w 已非当初实验室暂定名的含义，例如保留c w 以示与补体缩写区别， 保留d w 和d p w 以示其用细胞学方法检测。后面带括弧的表示该特异性由括弧 内的特异性分解而来，括弧内为早期确认的抗原，包含多个特异性。表中d 抗 原不是独立基因位点的编码产物，而是与d r 和d q 广泛相关，是用细胞学方法 检测的抗原。 2 一a 新等位基因的发现进程 在实验室常规h l a 分型中，如检测d n a 样本与多余的探针、引物反应，为 额外反应：与相应的引物或探针未全部发生反应为短反应：或二者兼有之为共同 反应。在此基础上再进行测序，克隆等，有可能发现新的等位基因。h l a 等位 基因数量明显增加与技术发展是密不可分的，截止2 0 1 0 年5 月，共有46 3 3 个 3 天津医科大学硕士学位论文 h l a 等位基因被发现【2 】( 表1 ) ，其中h l a i 类基因的b 位点包括本实验室所发 现的h l a b 4 8 ：2 2 在内，共有16 0 5 个等位基因( 表2 ) 。 表1 i m g t h l a 数据库对h l a 等位基因的数量统计 等位基因数量 h l a - i 类 h l a 类 h l a 基因 其它非h l a 基因 保密基因 34 1 1 12 2 2 46 3 3 1 1 0 0 表2 h l a i 类各基因座位等位基因的发现 早期分型技术以血清学为主，基因分型应用技术主要是p c r - s s c p 、 p c r i 强l p ，测序非常复杂，加之其它原因，所以1 9 6 8 1 9 9 0 年，h l a 等位基因数 量呈增长缓慢；1 9 8 9 1 9 9 7 年h l a i i 类的新等位基因发现速度高于h l a - i 类， 此阶段h l a 类基因分型技术已广泛应用于临床和科研，常用方法为 p c r s s p 、p c r s s o 测序：1 9 9 8 2 0 0 7 年，h l a i 类新等位基因的数目快速增长， 最高时为发现的h l a i i 类的2 倍，这主要归功于h l a i 类基因分型技术的广泛 应用和测序技术的快速发展。从1 9 8 7 1 9 9 7 年，人们用近1 0 年的时间发现h l a 等位基因约10 0 0 个，而1 9 9 7 2 0 0 7 年1 0 年间，新发现了20 0 0 多个等位基因，绝 大部分是在2 0 0 5 2 0 0 7 年发现的，这基于世界各国骨髓库的发展、经济的发展及 相关科技的进步口】( 见图3 ) 。 4 天津医科大学硕士学位论文 igilgg lli l 一一一一一一一一一一一 -n nnn n 几几几n y e i r0 s 旺m a r 嘲o i ，l o 图3 1 9 6 8 年2 0 1 0 年4 月h l a 新等位基因发现的趋势图 3 目前申报h l a 新等位基因的条件川： ( 1 ) 必须进行正向、反向双向测序。 ( 2 ) 源自c d n a 的序列和p c r 产物被克隆，应选择多个克隆产物测序。 ( 3 ) p c r 扩增产物直接测序，须用来自于2 个不同p c r 反应的产物进行测序。 ( 4 ) 对于杂合子，若其中一个等位基因可能是新等位基因，则这个新等位基因 必须与另一个已知等位基因分离后进行测序。因此，那些由直接测序得出的杂 合序列不能成为正式命名h l a 新等位基因的依据。 ( 5 ) 扩增用的引物序列不应被加入提呈命名的序列中。 5 姗 珊 珊 姗 姗 砌 黼 跚 硼 姗 姗 姗 脚 姗 啪 鲫 枷 抛 。 天津医科大学硕士学位论文 ( 6 ) 有时新序列应该用诸如p c r s s o 或者p c r - s s p 的基因分型方法，这个新序 列或者包含一个新的变异，或者存在个原来没有发现的核苷酸序列组合( 序列 模序) ，这些须用d n a 分型技术证实，需要应用新设计的探针或者引物以便能扩 增新变异的序列，这些新设计的探针或者引物同样被要求呈递。 ( 7 ) 必须向如下三个数据库之一提交未知序列，获取1 个准入号码，序列可以 由下面给出的地址在线提交。 e m b l ：h t t p ：| w w w c b i a c u k s u b m i s s i o n s i n d e x h t m l g c n b a n k ：h t t p ：l w w w n c b i n k n n i h g o v g e n b a n k | i n d e x h t m l d d b j ：h t t p ：| w w w d d b j n i g a c 。j p | s u b 2 e h t m l ( 8 ) 如果有条件，以呈递全长基因序列为佳，提呈序列的基本要求是：对于 h l a i 类序列至少要提供第2 和第3 外显子序列，h l a i i 类至少要提供第2 外 显子序列。 ( 9 ) 如果该新序列在内含子或者是基因非编码区，那么必须呈递全长序列，必 须包括编码区和非编码区：如果与新等位基因最接近的等位基因序列缺少全长 基因序列，在新基因被命名之前这个相近基因同样需要被测序并呈递。 ( 1 0 ) 关于描述新等位基因的文章应该发表，文章的手稿可以用e m a i l 呈递给 数据库( i m g t h l ac o n t a c td e t a i l s ) 。 ( 1 1 ) d n a 或者其它材料，最好是细胞株，如果可能，保存于一个公开的可被获 取的库中，最少应保存在原始实验室中，相关文件应该保存在w h o 命名委员会。 ( 1 2 ) 向命名委员会申报h l a 新等位基因需要应用h t t p ：帆c b i a c u k i m g t 小l a s u b s s u b m i t h t m l 提供的在线工具，研究人员需要提供新等位基因序列 的相关信息、新等位基因序列和已知最接近的等位基因序列的比对结果，假如不 能用在线网页提供的工具呈递序列，可直接联系i m g t h l a 获取其它呈递序列 的方法。目前，如果所提呈的资料和数据完全符合以上要求，新等位基因将很快 获得正式命名。 研究现状、成果： 目前，确认h l a 新等位基因主要有三条途径：1 直接测序2 基因克隆后测 序3 使用单倍型特异性分离方法分离单倍型特异性d n a 后测序。本研究所在实 验室有1 个疑难标本( 1 2 6 0 5 号标本) ，在完成p c r s s o 中低分辨基因分型和高 分辨直接测序后均不能确定结果。中低分辨不能给出确切分型结果，测序结果 6 天津医科大学硕士学位论文 显示有不可调碱基替换，与i m g t 专业数据库比对后发现有可能存在h l a 新等 位基因。这种情况下直接测序的应用受到局限，可选择后两条途径之一对h l a 新等位基因进行确认研究。其中第3 条途径需要由一套自动化的专业设备来完 成单倍型特异性的d n a 的提取，本研究所在实验室还不具备这种条件。另外， w h oh l a 命名委员会规定，命名h l a 新等位基因序列的条件之一就是：对于 带有杂合基因的个体，得到两个基因的序列应该是独立的；两个杂合基因的序 列在一起分不开的情况下，所得到的基因序列不能作为正式命名h l a 新等位基 因的依据。因此，本课题针对h l a 命名委员会的上述要求及实验室现有的科研 条件，拟对该疑难样本采用基因克隆后测序进行h l a 新等位基因的确认研究。 通过建立用基因克隆技术分离单个h l a 等位基因来研究未知h l a 等位基因的 研究体系，获得碱基序列，确认h l a 新等位基因。 以往申报h l a 新等位基因的基本要求是：h l a i 类序列要提供第2 和3 外 显子序列，h l a i i 类要提供第2 外显子序列，这有可能造成模棱两可、难以命 名的情况：同时，近年来发现新的h l a 等位基因出现在基因的非编码区有逐渐 增多的趋势，在我国目前发现的h l a 新等位基因中约1 0 出现在基因的非编码 区，随着研究工作的深入开展，这种编码区与非编码区的比例将倒置，故要准备 好提供全长序列技术，建立h l a 新等位基因的细胞株非常重要，以便为今后的 研究做好“铺垫 ，如对全长序列分析后有可能提出新的等位基因等【3 j 。目前大 部分实验室测序局限于片段测序和某位点的基因组测序、或某等位基因的片段 测序，克隆技术也常为基因片段克隆测序，全长e d n a 测序较少，这也相对制约 了我国发现h l a 新等位基因的步伐，如果有条件可在大的h l a 室建立全长基 因测序或e d n a 测序。 本研究所在实验室早在2 0 0 6 年发现了2 个h l a 新等位基因，被世界卫生 组织w h oh l a 命名委员会正式命名为b 1 5 ：1 1 8 ( 2 0 0 6 8 公布) 、b 5 4 ：1 1 ( 2 0 0 6 1 2 公布) 。到目前为止，包括本课题发现的h l a b 4 8 ：2 2 在内，本实验 室已累计发现1 0 个h l a 新等位基因。 随着科技的发展，高通量测序、e d n a 测序广泛应用、新技术的开发与应用、 样本量的不断增加，特别是中华骨髓库少数民族入库量增加，以及我国发现h l a 新等位基因的经验越来越丰富、研究的越来越深入，有关对所发现的新等位基因 的数量、对发现h l a 新等位基因的思路，将会有长足进展。同时也会推动与 h l a 密切相关的干细胞移植、器官移植、与h l a 相关疾病、人类学等多领域的 7 比对 所含 8 一一_ 天津医科大学硕士学位论文一、h l a - b * 4 8 ：2 2 新等位基因的发现 一、h l a - b * 4 8 ：2 2 新等位基因的发现 s s o ( s e q u c e s p e c i f i co l i g o n u c l e o t i d ch y b r i d i z a t i o nt y p i n g ) 、 s s p ( s c q u e n c e s p e c i f i cp r i m e rt y p i n g ) 和s b t ( s e q u e n c i n g b a s e dt y p i n g ) 是国际主 要相容性组织委员会( m w g ，i n t e r n a t i o n a lh i s t o e o m p a t i b i l t yw o r k i n gg r o u p ) 所 推荐的三种标准h l a 基因分型方法隋1 。目前，国内普遍采用的h l a 分型方法是 前两者。p c r s s p 分型操作简便快速，但不适于批量操作，易出现结果不易判 读现象。流式反向s s o 技术将流式细胞技术与传统s s o 技术相结合，并在此基 础上加以改进，具有高效、快速、准确的优点。我们采用p c r s s p 和流式反向 s s o 技术对中华骨髓库天津分库的捐献者标本进行h l a 中低分辨基因分型，不 能确定结果的疑难标本进行测序，确认分型结果，寻找、发现h l a 新等位基因。 首先经d n a 快速抽提试剂盒抽提样本基因组d n a ，p c r 扩增h l a o a ，b ，d r 基因外显子，使用流式反向s s o 技术检测各基因位点，发现1 2 6 0 5 号标本h l a - b 位点不能给出确切结果，可能存在新的等位基因。w h o 要求命名新的h l a 基 因型时，必须提供d n a 测序结果。我们随后进行测序，以期得到确切结果。 1 1 材料和方法 1 1 1 材料造血干细胞捐献者静脉血标本1 例，使用5 ( w n ) e d t a - k 2 抗凝剂0 5 m l 采集患者肘静脉血5 m l ，摇匀，编号1 2 6 0 5 ，备用。 1 1 1 1 仪器l u m i n e x1 0 0i s 分析系统( 美国l u m i n c x 公司) ，a b i 一3 1 0 0 a 序 列分析仪( 美国a b i 应用生物公司) ，高速低温离心机( 德国h e r a u s 公司) ，p e 9 6 0 0 p c r 扩增仪( 美国p e 公司) ，核酸检测仪( 美国b e c k m a n 公司) ，净化台( 苏净 集团安泰公司) ，m i l l i q 超级纯水器( 日本m i l i p o r e 公司) ，水浴摇床、气浴摇床、 干燥箱( 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司) ，加样器，( 法国g i l l s o n 公司) 。 1 1 1 2 实验耗材9 6 孔上样反应板( 美国a b i 应用生物公司) ，各种量度的吸 头，8 联扩增反应管，1 5 m l ，1 5 m l ，5 0 m l 离心管( 美国q s p 公司) ，快速纯化 柱( 德国p r o t r a n s 公司) 。 1 1 。1 3 试剂 1 - 1 1 3 1d n a 抽提试剂：购自天根生物技术公司。 1 1 1 3 2s s o 分型试剂盒：购自美国o n e l a m b d a 公司 1 1 1 3 3 测序试剂：购自德国p r o t r a n s 公司。 9 天津医科大学硕士学位论文 一、h l a b 4 8 ：2 2 新等位基因的发现 1 1 1 3 4p o p 6 胶、含e d t a 的1 0 倍测序电泳缓冲液：购自美国a b i 公司。 1 1 2 方法 1 。1 2 1 基因组d n a 的抽提：将6 0 0 1 t d 全血加入2 0 m l 微量离心管中，加8 0 0 p 1 红细胞裂解液，震荡混匀至透明， 1 05 0 0r p m 离心2 r a i n ，弃上清，共裂解2 次， 管底可见白色微带红色的沉淀物；分别加入2 0 0 1 a lg s ，g b 溶液，2 3 i _ t l 含蛋白酶 k 的核裂解液，混匀后放入5 6 。c 水浴1 5m i n ，在此期间混匀2 - 3 次，使沉淀完 全溶解。取出后加入2 8 0 i a 冷无水乙醇，轻轻颠倒试管6 1 0 次，d n a 絮状沉 淀析出，将所得溶液和絮状沉淀转入放有吸附柱c b 3 的收集管中，1 20 0 0r p m 离心3 0s ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱c b 3 放回收集管中，加入5 0 0 i d 缓 冲液g d ，1 20 0 0 r p m 离心3 0 s ，同样倒掉废液，再加入7 0 0 i _ t l 漂洗液p w ，1 20 0 0 r p m 离心3 0 s ，倒废液，将吸附柱c b 3 放回收集管中，1 20 0 0 r p m 离心2 r a i n ，室温晾 干吸附柱残余漂洗液，将吸附柱c b 3 转入干净离心管中，悬空滴加1 2 0 i - d 预温 的m i l l i q 纯水，室温放置5 r a i n ，1 20 0 0 r p m 离心l m i n ，将溶液收集到离心管中。 用前4 保存，用后8 0 冻存。 1 1 2 。2d n a 纯度( o d 2 6 0 o d 2 8 0 ) 及浓度( ug m 1 ) 测定：取7 山基因组d n a ，用 b e c k m a n 核酸检测仪测定2 3 0 r i m 、2 6 0 r i m 、2 8 0 r i m 和3 2 0 r i m 的吸光度值，纯度 一般为1 6 1 8 ，浓度约1 0 0 p g m l 。 1 1 2 3 流式反向s s o 法基因分型：将样本d n a ( 稀释至2 0 - 4 0 n g l a l ) 、含有 d n t p 的缓冲液、t a q 酶、引物混合，加入扩增板。p c r 反应循环参数为：9 6 。c 3m i n 9 6 2 0 s 、6 0 2 0 s 、7 2 2 0 s5 个循环9 6 l o s 、6 0 1 5 s 、7 2 2 0 s 3 0 个循环一7 2 1 0m 证_ 4 保存。按操作说明进行杂交、染色和读板，取2 5 m d n a 扩增产物，加入1 5 i t l 变性缓冲液，室温孵育1 0 r a i n ，再加入2 5 m 中和缓 冲液，吹打混匀，颜色由紫色变为浅黄色，加入1 9 1 x l 包被寡核苷酸探针的磁珠 进行p c r 杂交，6 0 ( 21 5 m i n ，用洗涤缓冲液洗3 遍后，加入2 5 ml x s a p e 荧光 缓冲液，p c r 仪6 0 c1 5 m i n 进行标记反应，再置入l t t m i n e x 流式仪自动检测、 读取数据，由l a b t o o l s 软件分析结果，获得h l a 人b ，d r 的特异性。 1 1 2 4 直接测序分型： 1 1 2 4 1p c r 扩增反应：在1 5 m l 的离心管内加入2 8 0 i - dp c r 反应缓冲液p s d 和3 0 mt a q 金酶，取出1 5 山作阴性对照，在其余的混合液中加入2 0 m 浓度在 5 0 1 0 0 n g i d 的基因组d n a ，混匀后加入到各个反应孔中进行p c r 扩增。p c r 反应循环参数为：9 5 2 r a i n - - - , 9 6 4 0 s 、6 4 l m i n 、7 2 2m i n1 5 个循环一9 6 1 0 中，3 7 1 5 r a i n ，降解残余引物和d n t p s ，然后8 0 1 5 r a i n 灭活酶，冷却至4 备用。 1 1 2 4 4d n a 测序反应：使用商品化的h l a bs e q u e n c i n gk i t s 进行测序反应。 实验在冰浴条件下进行，反应管中加入2 mb i g d y e 染料混合液，6 山测序反应引 物，2 山p c r 纯化产物，总体积1 0 山。封盖后放入p e 9 6 0 0p c r 扩增仪上进行测 序反应，9 6 l m i n _ 9 6 1 0 s 、5 0 5 s2 5 个循环一6 0 4 m i n - - - 4 c 保存。 1 1 2 4 5 纯化测序反应产物：使用葡聚糖凝胶s e p h a d e xg 5 0m e d i u m 和 p r o t r a n sd y e p u r 纯化柱。 1 1 2 4 5 1 制胶和制柱：按1 9 葡聚糖凝胶加1 2 m l 水可分配给1 6 个离心柱计 算，根据测序反应孔数，取适量的葡聚糖凝胶和水加入到带盖的1 5 “或5 0 m l 的 离心管中，放置3 0 r a i n ，期间摇晃数次。然后将d y e p u r 纯化柱置入2 m l 接收管 上，把制备好的胶分装到柱中，每只柱加至约3 4 处，51 0 0r p m 离心2 r a i n ，去 掉柱中水分。弃掉滤液，保留接收管以备再用。 1 1 2 4 5 2 测序反应产物的纯化：按照测序反应的顺序标记1 5 m l 的反应管， 把纯化柱放在管上，依次将测序产物加到纯化柱葡聚糖凝胶的斜面上，35 0 0r p m 离心2 5m i n ，洗脱液就是纯化的测序产物，避光保存，用于d n a 测序仪上样。 1 1 2 5 运行测序仪进行毛细管电泳： 1 1 2 5 1 在9 6 孔反应板中，每孔先加入1 8 m1 8 2 兆欧m i l l i q 纯水，然后按照 测序反应格局依次加入2 m 纯化测序产物，密封反应板，组装反应架，放入测序 仪的自动加样器中。 1 1 2 5 2 设置毛细管电泳条件：毛细管长3 6 e r a p o p 一6 胶含e d t a 的1 缓冲液 荧光染料组e 电泳温度5 0 电泳电压1 2 2k v 注入电压2k v 进样时间3 s 或 1 0 s ，根据荧光信号强度调节进样时间。 1 1 3 数据的收集和分析软件： 点无结果。 1 2 2 直接测序分型： 1 2 21 组特异性引物扩增产物电泳图谱( 见图4 ) ：结果显示1 组，1 5 组阳性， 参照p r o t r a n s s e q u e n c i n g 试剂组特异性引物表( 见表3 ) ，1 2 6 0 5 号标本的两个等 位基因恰巧同在第一组。 1 2 22d n a 序列分析：将第1 孔和1 5 孔产物纯化后，分别进行第2 外显子反 向和第3 外显子正向测序，仍没有得出确切的分型结果。测序软件的碱基注释 图谱显示，多数为蓝色，说明碱基识别的可信度高，实验成功( 图5 - 8 ) 。h l a s e q e n e ep i l o tv 2 2h l a 分型软件列出了多组可能的分型结果，其中包括：当只 有第2 外显子的第2 4 位碱基发生替换时，结果接近于b * 0 7 ：2 9 和b , 4 8 ：0 1 ：0 1 ； 当第2 外显子的第2 4 、3 0 ，3 3 位共3 处发生碱基替换时，结果接近于b * 0 7 ：0 2 ：0 1 和b , 4 8 ：0 1 ：0 1 ( 见图9 ，1 0 ) 。 图4 1 2 6 0 5 样本应用p r o t r a n sh l a s 4 试剂进行直接测序时目的片段扩增产物电泳图 m a r k e rd n a 分子量标准是1 0 0b p 、2 5 0b p 、5 0 0b p 、7 5 0b p 、1 0 0 0b p 、2 0 0 0b p 1 2 2 $ 4 8 2 0 8 ，4 2 13 0 0 3 $ 4 8 3 1 3 10 0 0 4 $ 4 8 4 1 5 ，4 5 ，4 6 ，4 9 ，5 0 18 0 0 5 $ 4 8 5 1 8 ，3 7 12 0 0 6 $ 4 8 6 2 7 ，4 0 0 2 g r u p p e ，4 7 ，8 2 0 1 12 0 0 7 $ 4 8 7 3 5 ，4 8 0 2 ，5 1 ，5 2 ，5 3 ，5 6 0 6 ， 14 0 0 5 8 ，7 8 8 $ 4 8 8 1 4 ，3 8 ，3 9 ，6 7 0 1 11 0 0 9 $ 4 8 94 0 0 1 g r u p p e ，4 1 9 0 0 1 0 $ 4 8 1 0 4 1 13 0 0 1 1s 4 8 1 1 4 2 4 2 0 2 13 0 0 1 2s 4 8 1 2 4 4 ，8 3 0 1 4 4 1 5 ，4 4 1 8 9 5 0 1 3 $ 4 8 1 3 5 4 ，5 5 ，5 6 ，5 9 0 1 5 6 0 6 15 0 0 1 4 $ 4 8 1 4 5 7 9 5 0 1 5 $ 4 8 1 5 a l lh l a b 21 0 0 1 6 $ 4 8 1 6 一 塑竺翌璺 三竺一一一 1 3 天津医科大学硕士学位论文一、h l a b 4 8 ：2 2 新等位基因的发现 。i i l i i illli i l l l l l l l l li l l l l l l l l li l l l l l l l l ll l l l l l l l l li l l l l l l l l li i i i l l l l1 1 i , , l l l 。i i l l l l1 1 1 i , l li l l l l l l l l li l l i l l l l l i l 川l l l l i 嘲l i l i i i l i i i i i i i i 嘲i i i i i l l i m | l i i i l i j j j l | i i j j i | i l | i i i i i l i i i i j im | l l i i j i j i j i i i | i i i j l l “：i i j l l i i l 虬：脚州l r w 吖f 仃胛仃胛胁阿f c r 踟c 6 跚咄c1 c i c g e l i gc c 6 c g ? c cl c 跚c c l 咖泓6 c 踟cc c g c 6 6 c c g g 哪龇脚册2 8 0 i i i j i j i i i ti i i i m i i im i i i i i i ii i i i i i i k li i l m l i 2 8 l删吣礅6 f 6 6 6 i 卿脚6 1 6 6 i 6 6 6 6 c 础c c i3 2 8 。i i i i i i i i i ii i i i ih i i i i i i i i , i i i i i ii i i i i i i i i ii i i i i i i i i ih i i i i i i i ii i i i i i i i i ii i i i i , , ii i i i i i i i i ii i i i i i i i i ii i i i i i i i i ii i i i i i i i i i lt i 啊m i fr ”眦盯佗比胛比胛丌l r l r r mr l 阻盯i 啊i c g g c t g c g ic 脚c c 66 l c 6 6 6 c 6 c c ? c c c c g c g gg c 必c c i g1 i c c l c t i c 6i c 6 6 c a i 啦耵l c 砸6 f c 黜c 髓6 6l 舶 l i i i i i i i i