（高分子化学与物理专业论文）嵌段共聚物pegpdma在基因及药物输送中的应用.pdf

摘要 药物载体可以使药物有效地到达病变组织，降低药物对细胞的毒害作用，同时使药 效持久，因此，开发适合于人体的药物输送系统，特别是基因治疗药物输送系统和抗癌 类药物输送系统，已成为目前国内外研究的热点。由于各嵌段性能不同，嵌段共聚物及 其聚集体可具备多种性能，在基因及药物输送方面具有很大的优势。本文着眼于聚乙二 醇一聚里基西燧酸三里氢基圣酯( p e g - p d m a ) 嵌段共聚物在药物，包括基因类药物的 输送及释放方面的研究与探索。 对一系列具有不同长度的p d m a 链段的两嵌段共聚物p e g p d m a 用作基因输送载 体的研究中发现：在p h = 7 2 的水溶液中，当聚合物与d n a 中的氮、磷元素物质量之 比( n p 比) 为2 ：1 时，p e g p d m a 可完全将d n a 包覆，形成纳米级的复合物粒子， p d m a 均聚物与d n a 复合则形成网状以及块状聚集体；在p e g 分子量一定的情况下， p d m a 的聚合度越大，p e g p d m a d n a 复合物粒子的粒径越大，而且，d n a 分子量不 同时，形成的p e g p d m a d n a 复合物粒子的大小不同：质粒f a s t - g f p ( 5 4k b ) 与 p e g p d m a 复合形成粒径1 0 0 1 5 0 n m 的复合物粒子，质粒b a c g f p ( 1 3 6 k b ) 与 p e g p d m a 复合则形成粒径1 0 - - 5 0 n m 的复合物粒子；p e g p d m a d n a 复合物的稳定 性优于p d m a d n a 复合物；聚合物与d n a 形成的聚离子复合物具有一定的抗酶切能 力，而且聚合物中p d m a 链的链长越长，复合物的抗酶切能力越强，但是p e g 的存在则 使得复合物的抗酶切能力减弱，所以p e g p d m a 对d n a 的保护能力弱于具有相同链长的 p d m a 均聚物，此外，随着n r p 比增大，复合物抗酶切能力增强； ) p e o p d m a l 4 2 d n a 复合物在转染s f 9 细胞系时具有最高的转染效率，这与其抗酶切能力相匹配；而且，随着 嵌段共聚物中p d m a 链链段的增长，复合物的转染效率有着很大幅度的提高，特别是 p e g p d m a l 4 2 ，它与质粒的复合物对s f 9 细胞系的转染效率为其他聚合物的5 倍以上； 随着n p 比的增加，转染效率也相应提高，当n p 比由l 增加到1 5 时，转染效率几乎增加 了8 倍。 以p e g p d m a 的自组装体为模板、以四甲基硅氧烷( t m o s ) 为硅源在环境条件 下进行仿生矿化制备了纳米杂化粒子，研究表明：在较低的聚合物浓度下，以聚合物 为模板进行仿生矿化可得到粒径5 0 - 1 2 0 n m 的杂化粒子；以p e g p d m a l 4 2 为模板制备 的纳米杂化粒子形态良好，以p d m a 均聚物为模板制备的纳米杂化粒子形态良好，但 是易聚集，而以具有短的p d m a 链的p e g p d m a 为模板制备的纳米杂化粒子结构疏松， 粒子形态不明显。当聚合物的浓度增大到一定的程度以后，以之为模板制备成的杂化 纳米粒子粒径变小，在1 0 - - 2 0 n m 之间，而且互相粘连在一起，形成疏松的空间立体结 构，浓度继续增大，则形成凝胶。当聚合物浓度较低时，增大t m o s 的用量对粒子形 态影响很小，但是粒子中s i 0 2 含量增大，当聚合物浓度较高时，增大t m o s 用量对粒 子形态的影响和增大聚合物浓度具有相同的效果。除了粒子形态以外，还形成一些同 杂化粒子混在一起的纳米杂化棒状结构，纳米棒具有多孔疏松的结构。增加t m o s 用量可提高杂化粒子中s i 0 2 的含量，但是t m o s 的转化率降低，增加反应时间可提高 t m o s 的转化率。 p e g p d m a 在8 9 l 的浓度下，加入t m o s 进行仿生矿化制备了杂化凝胶，其含水 量可达到9 7 以上，同时以a s p i r i n 为模型药物，研究了杂化凝胶的药物释放行为。研 究表明：初始加入的t m o s 增多，凝胶的含水量越低；以p e g p d m a 为模板制备 的杂化凝胶的含水量高于以p d m a 均聚物为模板制备的凝胶。在酸性条件下，杂化 凝胶释放a s p i r i n 的速率加快；提高聚合物中p e g 的含量和减少t m o s 的用量可使杂 化凝胶释放药物的速率加快，但是效果不明显。升高温度时，杂化凝胶释放药物的速 率明显加快。 关键词：非病毒基因输送载体；嵌段共聚物：仿生矿化；药物缓释 i t a b s t r a c t d r u gc a r r i e 稻c a ne f f e c t i v e l yd e l i v e rd r u gt ot a r g e tb i o l o g i c a lt i s s u e ，r e d u c et o x i c i t yt o c e l l sa n dg i v el a s t i n gp o t e n c y s t u d i e so nd r u gc a r r i e r s ，e s p e c i a l l yg e n e d r u gc a r r i e r s ，a l r e a d y b e c o m eaf o c u sa l lo v e rt h ew o r l d d i f f e r e n tb l o c k sp r o v i d ed i f f e r e n tn a t u r e s ，s ob l o c k c o p o l y m e r sa n di t sa g g r e g a t e ss h o wv a r i o u sn a t u r e ，a n dh o l dg r e a tp o t e n t i a lf o rg e n ea n dd r u g d e l i v e r y h e r e i n , w ef o c u so nu s i n gp o l y ( e t h y l e r i eg l y c 0 1 ) - b - p o l y 2 - ( d i m e t h y l a m i n o ) e t h y l m e t h a c r y l a t e 】( p e g p d m a ) d i b l o c kc o p o l y m e r sa sg e n ea n dd r u gc a r r i e ra n de v a l u a t i n gt h e d e p e n d e n c eo fg e n ea n dd r u gd e l i v e r ye f f i c i e n c yo nt h eb l o c kc o m p o s i t i o no fc o p o l y m e r s i nt h er e s e a r c ho fu s i n gas e r i e so fp e g p d m aa sg e n ed e l i v e r yc a r r i e r ，w ef o u n dt h a t ： a tp h = 7 2a n dan pr a t i oo f2 ：1 ，t h ep e g p d m a d ) n ac o m p l e x e sw e r er o u g h l y s p h e r i c a l i nc o m p a r i s o n ，p d m a d n ac o m p l e xf o r m e da g g r e g a t e dn e t w o r ks t r u c t u r e sa n d m a s s i v ea g g r e g a t e t h ed i a m e t e r so fp e g p d m a d n ac o m p l e x e si n c r e a s e dw i t ht h e i n c r e a s i n go fp d m ap o l y m e r i z a t i o nd e g r e e m o r e o v e r , t h ed i a m e t e r so fp e g p d m a d n a c o m p l e x e sa l s oa l t e r e dw i t ht h ea l t e r i n go fd n a s i z e ：w h e np l a s m i df a s t - g f pw a su s e d ，t h e c o m p l e xh a dad i a m e t e ro f10 0 15 0 n m ，w h e np l a s m i db a c - g f pw a su s e d ，t h ed i a m e t e r so f c o m p l e x d i s t r i b u t e df r o m10t o5 0 n m p e g - p d m a d n ac o m p l e x e sw e r em o r es t a b l et h a n p d m a d n ac o m p l e x p o l y m e r d n ac o m p l e x e sh a de n z y m er e s i s t e n c ea b i l i t y t h e e n z y m er e s i s t a n c ea b i l i t y o fc o m p l e x e sw a sd e p e n d e n to nt h ec o m p o s i t i o no fb l o c k c o p o l y m e r s ，t h eb l o c kc o p o l y m e rw i t hl o n g e s tp d m ab l o c k ( p e g p d m a l 4 2 ) i m p a r t e dt h e c o m p l e x e s w i t hi m p r o v e de n z y m er e s i s t e n c ea b i l i t y , b u tt h ei n t r o d u c e dp e gb l o c kd e c r e a s e d t h ea b i l i t yo fe n z y m er e s i s t e n c e m o r e o v e r , e n z y m er e s i s t e n c ea b i l i t yo b v i o u s l y i m p r o v e db y i n c r e a s i n gn pr a t i o p e g - p d m a l 4 2 d n ac o m p l e xh a st h eh i g h e s tt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y , w h i c hw a si na g r e e m e n tw i mi t se n z y m er e s i s t e n c ea b i l i t y i na d d i t i o n ，b yi n c r e a s i n g p o l y m e r i z a t i o nd e g r e eo fp d m ab l o c k s ，p e g p d m a d n ac o m p l e x e ss h o w e dh i g h e r t r a n s f e c t i o ne f f e c t , e s p e c i a l l yp e g - p d m a l 4 2 d n ac o m p l e xs h o w e dat r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y o fm o r et h a n5t i m e st h a no t h e rc o m p l e x e s b yi n c r e a s i n gn pr a t i o ，t h et r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c yi m p r o v e d w h e nn pr a t i oi n c r e a s e df r o m1t 015 ，t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c ya l m o s t i n c r e a s e d8t i m e s i i i u s e dp e g - p d m a a g g r e g a t e sa st e m p l a t e s ，t e t r a m e t h y lo r t h o s i l i c a t e ( t m o s ) a sr e s o u r c e o fs i l i c a , w es y n t h e s i z e dh y b r i dp a r t i c l e sa te n v i r o n m e n tc o n d i t i o nb yb i o n i cm i n e r a l i z a t i o n t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t ：i nal o wp o l y m e rc o n c e n t r a t i o n , h y b r i dn r n o p a r t i c l e sw i t h d i a m e t e r so f5 0 12 0 n mw a ss y n t h e s i z e d t h ep a r t i c l e ss y n t h e s i z e db yu s i n gp e g p d m a l 4 2 a st e m p l a t eh a dab e t t e rm o r p h o l o g yt h a no t h e r s w h i l es y n t h e s i z ep a r t i c l e sb yu s i n g p e g p d m aw i t hs h o r t e rp d m ac h a i n 嬲t e m p l a t e ，t h eg e n e r a t e dp a r t i c l e sh a dag o o d m o r p h o l o g yb u ta d h e s i o nt oe a c ho t h e r ( a 参w h e np o l y m e rc o n c e n t r a t i o nw a sh i g h ，t h ep r o d u c t o fb i o n i cm i n e r a l i z a t i o nw a sh y b r i dp a r t i c l e sw i t had i a m e t e r so f10 - 2 0 n m ，a n da d h e s i o nt o e a c ho t h e r , f o r m e dl o o s es p a t i a ls t r u c t u r e c o n t i n u e dt o i n c r e a s ep o l y m e rc o n c e n t r a t i o n , h y d r o g e lw a sf o r m e d w h e np o l y m e rc o n c e n t r a t i o nw a sl o w , u s i n gm o r et m o sh a d l i t t l e e f f e c to nm o 印h o l o g i e so fp a r t i c l e s ，b u to n l yi n c r e a s e ds i 0 2c o n t e n ti np a r t i c l e s w h e n p o l y m e rc o n c e n t r a t i o nw a sh i 曲，u s i n gm o r et m o sh a dt h es a m ee f f e c t a su s i n gh i g l l c o n c e n t r a t i o np o l y m e r ( 亘) b e s i d e sp a r t i c l e s ，w ea l s of o u n ds o m ep o r o u sn a n o m e t e rh y b r i d r o d l i k es t r u c t u r e u s i n gm o r et m o sr e s u l t e di nh i g h e rs i 0 2c o n t e n ti nh y b r i dp a r t i c l e s ， b u tt m o sc o n v e r s i o nd e c r e a s e d ，p r o l o n g i n gr e a c t i o nt i m el e a dt oh i g h e rc o n v e r s i o n a tt h ec o n c e n t r a t i o no f8 9 l ，p e g p d m ar e a c t e dw i t ht m o st op r o d u c th y b r i d h y d r o g e l ，a n di t sw a t e rc o n t e n tc o u l de x c e e d9 7 u s e da s p i r i na sm o d e ld r u g , w ee v a l u a t e d t h ed r u gr e l e a s i n gb e h a v eo fh y b r i dh y d r o g e l ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：q t h el e s st m o s u s e d ，t h el o w e rw a t e rc o n t e n ti nh y d r o g e l h r d r o g e ls y n t h e s i z e db yp e g p d m ah a da h i g h e rw a t e rc o n t e n tt h a nh y d r o g e ls y n t h e s i z e db yp d m a i na c i d i cm e d i u m ，d r u g r e l e a s i n gw a sa c c e l e r a t e d i n c r e a s i n gp e gc o n t e n to fp o l y m e ra n dr e d u c i n gt m o s f e e d s l i g h t l ya c c e l e r a t e dd r u gr e l e a s i n g ( 曼) d r u gr e l e a s i n gw a ss i g n i f i c a n t l ya c c e l e r a t e db yr a i s i n g t e m p e r a t u r e k e y w o r d ：n o n r i v a lg e n ec a r d e r , b l o c kc o p o l y m e r , b i o n i cm i n e r a l i z a t i o n ，d r u gr e l e a s e i v 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名：寸名司极 日期：0 v t ，5 年占月p 日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允 许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名：寸k , 4 牛天 日期：1 w 芍石。l 指导教师签名： 镑圳乏 日期： 第一章文献综述 第一章文献综述 随着现代医学的迅速发展，人们对药物应用的要求也越来越高，提高药物效率、降 低药物毒性、延长药物作用时间成为科研工作者的追求目标。药物载体可以使药物有效 地到达病变组织，降低药物对细胞的毒害作用，同时使药效持久【l 】，因此，开发适合于 人体的药物输送系统，特别是基因治疗药物输送系统和抗癌类药物输送系统，已成为目 前国内外研究的热点。随着医疗保健越来越受到人们的重视以及医药市场的迅速发展， 药物输送载体的应用也越来越广泛。 与药物赋形剂不同，药物载体的用途是在生物体内运输药物，同时保护药物免遭 酶的降解，以及缓、控释药物f 2 】。药物载体可以是天然的或人工合成的，将药物包埋进 高分子制成的微粒载体后，可降低药物的毒副作用并可控释或具靶向作用。嵌段共聚物 是目前药物载体及相关研究的热点，并被认为最有潜力成为实用药物载体。它们可通过 各种方式制成微球、纳米粒、凝胶、薄膜、液晶等，都可作为药物的运输载体和缓、控 释材料。 由于基因治疗的需要，设计并合成运载d n a 的非病毒载体成为众多科研工作者竞 相研究的课题。由于d n a 在生理条件下带负电，因此，生物可降解的阳离子型高聚物 成为合适的选择【3 l ，如聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯等，它们在 生理条件下带正电，可以自发地与d n a 结合并将其包裹【4 】，阻止酶降解d n a ；由于过 量正电荷地缘故，它们与呈电负性的细胞膜有较高的亲合性，有助于d n a 进入细胞。 嵌段共聚物是一种颇受关注的人工合成药物载体，可分为a b 型两嵌段、a b a 型三嵌段、a b c 型三嵌段、( a b ) n 型多嵌段共聚物等。它的各嵌段性能不同，使嵌 段共聚物及其聚集体具备多种性能。例如两亲性嵌段共聚物各嵌段由于热力学不相容， 当嵌段共聚物的浓度高于c m c 时，嵌段共聚物在水溶液中趋向于自组装成疏水嵌段在 内、亲水嵌段在外的核壳结构，即胶束【5 】。难溶性的药物可被增溶进胶束疏水的内核中， 或者与嵌段共聚物进行化学结合，或者通过静电作用与胶束结合。除胶束以外，嵌段共 聚物也可以通过各种途径制成微球、纳米球、凝胶等形态。药物可以包裹在微球和纳米 粒中或吸附在它们的表面在生物体内运输，通过控制组成微球和纳米球的嵌段共聚物各 嵌段的组成比例或其他方式可控制微球和纳米球释放药物的速度。凝胶具有网状结构， 湖北大学硕十学位论文 可用于药物的缓、控释，由生物可降解嵌段共聚物制成的凝胶具有良好的生物相容性和 生物可降解性，具有良好的应用前景”l 。 1 1 基因类药物输送载体 1l _ 1 基因类药物输送载体研究背景 随着重组技术为代表的现代分子生物学技术的发展，人类对疾病认识的不断深入， 现代医学及相关研究越来越清楚地证明，多种疾病与基因的结构或功能改变密切相关。 现代基因技术和人类基因组工程图谱的完成为采用基因分子生物学方法治疗各类疾病 提供了必要的手段以及广阔的前景，基因治疗应运而生。所谓基因治疗是将人的正常基 因或有治疗作用的基因作为治疗药物通过一定方式导八人体靶细胞，以纠正基因的缺陷 或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术【7 】。广义上说基因治疗 也可咀包括采取基因技术治疗某些疾病的措施和新技术。基因治疗主要包括：( 1 ) 基因 置换( g o n er e l p a c e m e n t ) ，用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的 基因完全恢复j 下常状态。( 2 ) 基因修复( g e n ec o r r e c t i o n ) 将致病基因的突变碱基序列 纠】下，而正常部分予以保留。( 3 ) 基因修饰( g e n ea u g m e n t a t i o n ) 又称基因增补将e l 的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有 的某些功能得到增强( 4 ) 基凼失活( g e n ei n a c t i v a t i o n ) ，利用反义技术能特异地封闭基因表 达特性，抑制。些有害基因的表达，以达到治疗疾病的目的。如利用反义r n a 、核酸 或肽核酸等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖诱导肿瘤细胞的分化免疫调 图1 - 1 结合了酶的 质粒d n a 的a f m 酗( 左) 以及平行双链d n a 的s t m 图像( 右) 第一章文献综述 节，将抗体、抗原或细胞因子的基因导入人体内，改变病人免疫状态，达到预防和治疗 疾病的目的。目前，基因治疗的研究已经深入医学研究的各个领域，成为当今最活跃的 生物高技术领域之一。 通常质粒被引入病人细胞中，表达治疗所需的蛋白质，质粒为环型双螺旋结构，尺 寸大约为5 0 0 n m ( 女n 图1 1 ) ，核酸在水相中传递时，易被核酸酶水解且由于带大量负电 荷而不容易被细胞内吞，在主要器官中只能实现低层次的表达。因此具有高效安全和组 织特异性的基因输送载体的研制成为制约基因治疗发展的瓶颈问题之一，随着基因治疗 研究的不断深入，尤其是伴随着基因治疗临床试治肿瘤、感染性疾病、遗传性疾病的广 泛开展，人们越来越认识到选择合适的载体，使目的基因靶向、可控并有效的表达，是 基因治疗成功的关键【8 1 2 1 。 1 1 2 基因输送载体的分类 1 1 2 1 病毒基因输送载体 目前，用于基因治疗的载体主要有病毒载体一( v i r a l v e c t o r ) 和非病毒载体( n o n - v i r a l v e c t 0 0 。常用的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疤疹病毒等。病毒载体 由于充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄生特性，因而在多数情况下，病毒载体 具有较高的转染效率：但目前研究和应用的病毒载体存在许多不足，如免疫原性高、毒 性大、目的基因容量小、靶向特异性差、制备较复杂及费用较高等，限制了其在临床治 疗中的应用【b 】。特别是1 9 9 8 年美国宾洲大学人类基因治疗中心发生一例使用腺病毒基 因治疗导致死亡的病例后，人们对人体内使用病毒载体的安全性提出了质疑。 1 1 2 2 非病毒基因输送载体 非病毒基因输送载体在基因治疗应用实验中较病毒载体晚，但其研究应用的历史却 比病毒载体要长。相比较病毒基因载体而言，非病毒基因载体具有以下优点：( 1 ) 相对 安全、易于制造，( 2 ) 对载体大小及核酸类型限制较小，可以携带的基因从2 0 b p 的寡 聚核昔酸到1 0 0 k b 的质粒，甚至更大的d n a 。( 3 ) 免疫原性小、急性毒性小、对受者 比较安全、可以容易地结合其他物质、使治疗基因的传递具有靶向特异性等，但是具有 不利的生物分布、无效的胞内运转以及导致活性基因转染率低等缺点【1 4 1 。目前，常用的 非病毒载体包括裸d n a 、脂质体和聚合物等。 3 湖北大学硕士学位论文 ( 1 ) 裸d n a 将目的基因连接在表达的质粒或噬菌体中直接注射而不依赖其它物质的介导，是最 简单的非病毒载体系统。已知皮肤细胞、某些肿瘤细胞及免疫细胞对裸d n a 较为敏感。 肌内注射后可直接诱导相应的免疫反应，也可检测到d n a 的明显表达。电穿孔 ( e l e c t r o p o r a t i o n ) 技术和微粒子轰击法( m i c r o p a r t i c l eb o m b a r d m e n t ，此法也称作基因枪) 的出现，大大提高了裸d n a 的转染效率，而且使d n a 可直接到达细胞核，避免了各种 酶对d n a 的降解。目前使用的d n a 疫苗，就是用编码病毒抗原的质粒直接肌内注射， 可获得有效的抗病毒免疫。虽然将裸d n a 直接用于病变组织是可行的基因转移策略，但 是，对于解剖学上不能进入的部位如器官里的实体瘤，显然给予裸d n a 是无效的。 ( 2 ) 脂质体 脂质体是具有双层膜的封闭粒子，其介导基因转染已有2 0 多年的历史。它是由脂双 分子层组成的颗粒，可介导基因穿过细胞膜。通过脂质体介导比利用病毒转导进行基因 转移具有以下明显的优势：脂质体与基因的复合过程比较容易；易于大量生产； 脂质体是非病毒性载体，与细胞膜融合将目的基因导入细胞后，脂质即被降解，无毒， 无免疫原性；d n a 或r n a 可得到保护，不被灭活或被核酸酶降解；脂质体携带的基 因可能转运至特定部位；体外和体内试验都表明，接近染色体大小的d n a 片段也能被 转运至宿主基因组中并增长；转染过程方便易行，重现性好。 介导基因输送的脂质体有阳离子脂质体【1 5 1 、阴离子脂质体、p h 敏感型脂质体而阳 离子脂质体是目前最常用的脂质体，主要由带电荷的脂类和中性辅助脂类组成。用于基 因输送的阳离子脂类品种很多，目前已有商品化的培养细胞基因转染用的试剂盒 l i p o f e c t i n 面市，由合成的阳离子脂质n - 1 - ( 2 ，3 一二油酰氯) 丙基】- n ，n ，n 氯化三甲胺 ( d o t m a ) 和二油酰基磷酸酰乙醇胺( d o p e ) 以等摩尔比混合而成。所有阳离子脂类都具 有极性胺基和疏水性基团，胺基与d n a 通过静电作用浓缩d n a ，疏水性基团有利于阳 离子脂类自组装形成双层囊泡结构，而中性脂类有利于基因载体穿透细胞膜屏障。通常 形成的脂质体复合物大小在5 0 n m 1 m m ，这与基因输送载体制备过程中脂质体d n a 比 例、加入的先后顺序、温度、超声程度等密切相关【16 1 。r a d l e r 等人【1 7 】发现阳离子脂质体 并不是将基因包裹在脂质双分子层中，而是包裹在脂质与脂质之间形成片层状。“等 人【1 8 】将阳离子脂质载体暴露于小鼠血清中，发现大小明显增加且相互聚集，通过阳离子 脂质载体d n a 组装体表面的聚乙二醇( p e g ) 修饰，可防止基因输送载体的聚集，减少与 4 第一章文献综述 血液成分的相互接触，从而延长复合物的体内循环时间，提高基因转染率，但由于制备 的不稳定、对靶细胞的毒性和试剂价格较贵等原因，阳离子脂质体在基因输送载体中的 应用受到一定限制。 ( 3 ) 阳离子聚合物 阳离子聚合物与d n a 的结合主要是通过电荷作用，当d n a 与一种适宜的阳离子 聚合物分子结合时，带负电荷的d n a 分子被缩合成浓聚的、有序的、直径为5 0 - - - - 2 0 0 衄 的纳米粒子。研究表明，高分子阳离子聚合物与d n a 复合形成纳米复合物时，d n a 的 二、三级结构发生改变，而一级结构保持不变。此复合物能保护d n a 不受酶解，并能 有效地运载d n a 到达靶细胞【1 9 】。图1 2 显示的是几种常用作基因输送载体的阳离子 聚合物。 常用的阳离子聚合物基因载体主要有： 多聚赖氨酸( p o l y ( l - l y s i n e ) ，p l l ) 是较早用于基因导入的阳离子聚合物纳米材料， 许多研究已成功地将p l l 缩合d n a 形成的纳米粒用于基因导入。p l l 的一个显著优势 在于它易于化学修饰，能与配体结合而用于受体介导的特异性基因导入，用于修饰p l l 的材料较应用较多的是聚乙烯二醇( p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，p e g ) 。p e g 是一种可降解的的 高分子材料，既溶于水又溶于多种有机溶剂，具有经济、易得、独特的端基 ， n h 2 p l l h 洲n 彳洲2 c 。苓h n 、 h 2 n 洲 讯n h 2 图1 2 几种常用的阳离子聚合物基因载体 5 n h 2 p a g a 0 歹p 厂 既厂 、 篙 r f c 湖北大学硕士学位论文 反应性和可修饰性以及很好的稳定性和没有免疫原性等优点。p e g 修饰p l l 后屏蔽 p l l d n a 复合物的部分表面电荷，并增加复合物的水溶性，使复合物更适宜用于体内 基因转导。w a r d 掣2 0 】用p e g 表面修饰p l l d n a 复合物后，发现修饰前后复合物的形 态相似、修饰后的复合物表面电荷减少，与血液中的细胞和血浆蛋白的非特异结合受到 抑制，而水溶性增高。鼠经静脉注射p e g 修饰复合物3 0 m i n 后，血液中检测到的d n a 水平是单纯应用p l l d n a 复合物后的2 0 0 0 倍，可见p e g 修饰后的p l l d n a 复合物 在体内非常稳定，有利于体内基因转导。杨子刚等合成了三嵌段共聚物p l l - p e g p l l ， 发现其能够有效包覆d n a 避免其被核酶降解，不使用氯喹直接转染昆虫细胞系获得成 功，对哺乳细胞的转染有待进一步研究【2 1 之5 1 。 聚乙烯亚胺( p o l y e t h y l e n e i m i n e ，p e i ) 也属阳离子聚合物，目前的研究表明，p e i 比 p l l 性能更佳，在体内外均有较高的转导效率。p e i 的高转导效率与它的缓冲能力强 大有关，p e i 可抑制溶酶体在吞噬泡酸性环境中的质子化，对d n a 提供更大的保护作 用，p e i 还能促发一股巨大的c l _ 流而引起吞噬泡膨胀并破裂，进而释出d n a 到细胞质 中，并能进一步进行核定向进入细胞【2 6 , 2 7 1 。p e i 的转染效率还与p e i 的氮原子与d n a 磷酸基因的电荷比率相关【2 引。然而，p e i 因为是有机聚合物，不容易被细胞内的酶代谢， 易于在核内聚集而引起细胞毒性。因此，学者们对如何进一步增强p e i 的转染效率并减 轻其毒性作用需作进步研究。p e g 同样也可用于修饰p e i d n a 复合物。p e i 也可与 内皮生长因子( e g f ) 、乳糖、r g d 肽等配体结合而增强载体的靶向功能【2 9 一0 1 。近年来， 有学者将p e i 与超顺磁性的氧化铁纳米颗粒结合后，通过外加磁场来靶向基因导入，并 证实是一种有效的体内、体外的基因转导方法【3 1 】。 以甲基丙烯酸脂为主体的胺类化合物也是研究得比较多的阳离子型非病毒基因载 体，其中，聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯( p d m a ) 研究得最为广泛，它是一种具有温度 和p h 敏感性的高分子，其分子结构单元中同时存在亲水性的叔胺基、羰基和疏水性的 烷基基团，两类基团在空间结构上互相匹配。当体系温度改变时，可造成氢键的形成与 破坏，使p d m a 在水中的溶解性随温度的升高而降低。当温度超过某一临界点即低临 界溶液温度( l c s t ) 时，聚合物在水溶液中由相对舒展的无规线团状态转变为非水溶性颗 粒，出现相分离。在溶液中其侧链上的氨基部分质子化【3 2 1 ，在不同p h 条件下质子化程 度不同，p h = 7 2 时质子化的程度为5 0 。质子化程度随p h 值变化导致p d m a 亲水 亲油平衡及相转变温度随p h 而改变。p d m a 的这些性质使得它具有了成为一种优良的 基因输送载体的潜质。而且，有研究表明，p d m a 与d n a 复合时，可以有效地压缩 6 第一章文献综述 d n a 3 3 】，r u n g s a r d t h o n g 以及他的同事发现p d m a 与d n a 复合时形成8 0 一1 0 0 r i m 的粒 子并成功地转染了a 5 4 9 细胞。另外有研究证明，在转染o v c a r - 3 以及c o s 7 细胞时， p d m a 表现出比p l l 更高效的转染效率【3 4 1 。 树枝状聚合物( d e n d r i m e r ) 用于基因转染的研究最早见于9 0 年代初，s z o k a 等人使 用热降解的多聚物进行了基因转染的探讨，通过对两个报告基因，荧光素酶( 1 u c i f e r a s e ) 和p 半乳糖苷酶( p g a l a c t o s i d a s e ) 基因在多种贴壁或悬浮培养哺乳类细胞的转导与表达 的观察，开创了以纳米材料为载体介导基因转移的先河【3 5 1 ，结果显示，树枝状聚合物可 介导上述基因在多种细胞进行高效基因转移和转基因的表达。在这之后，多个研究小组 对树枝状聚合物及其介导的体内外基因转移进行了广泛的探索，包括树枝状聚合物与 d n a 的相互作用，复合物的形成与特点，电荷对复合物形成的影响，树枝状聚合物介 导d n a 进入细胞的机制，以及树枝状聚合物介导各种外源基因的体内外基因转移与表 达等。其中，聚酰胺胺型( p o l y a m i d o a m i n e ，p a m a m ) 树枝状聚合物是研究最多的一种 树枝状聚合物分子。其家族成员与许多重要蛋白质和生物组装分子的大小及形状很匹 配，这种生物界中存在的大小和形状比例关系可用来解释g 7 g 1 0p a m a m 树枝状聚 合物d n a 复合物的高稳定性，并且与较低代数( g 1 一g 5 ) 的聚合物相比，它们可增强基 因表达的效率【3 6 】。此外，树枝状聚合物还具有保护反义寡核苷酸等核酸序列不被血清或 组织细胞中各种酶降解的作用。 p l l 、p e i 、p d m a 等阳离子聚合物与d n a 形成的纳米基因导入载体系统，由于 安全、低毒、制备容易等优点，而引起越来越多关注，而且对改善其低转导效率和体内 稳定性等问题的研究方面已取得了重大进展【3 1 1 。但由于对这些载体系统的形态、结构 与转导效率间的明确关系，载体与d n a 形成纳米颗粒的确切机制等问题的认识尚不够。 这些载体系统的转导效率、体内稳定性、毒性等关键问题的解决尚待更为深入的研究。 1 1 3 基因传递的过程中需要克服的屏障 治疗基因作用的发挥需要克服基因传递过程的各种障碍，才能获得较高的转染效 率。根据障碍所处的不同区域，可分为胞外屏障和胞内屏障。 ( 1 ) 胞外屏障：主要是指注射载体后在到达靶细胞之间的影响因素，其中主要包括调 理素( o p s i n i n s ，如血清抗体、补体等) 、吞噬系统、胞外基质、降解酶等。其中调理素 能与载体及其靶基因结合从而使基因和载体失活吞噬系统，如肝和脾中网状内皮系统， 能捕获、内吞及消化载体系统。胞外基质则指细胞间具有保护靶细胞膜作用的多聚化蛋 7 湖北大学硕士学位论文 白和糖类的存在区域，从而使相对较大的传递体系难以逾越，降解酶则能迅速消化未被 保护的分子。提高基因输送载体的生物相容性，延长基因输送载体在体内的循环时间， 从而克服上述一系列屏障，基因输送载体才能充分到达靶向细胞。 图1 - - 3 基因传递地胞内屏障 ( 2 ) 胞内屏障：当基因输送载体到达靶向位后，传递过程如下：细胞内吞( c e l lu p t a k e ) 、 逃离溶酶体( e s c a p ef r o ml o p o s o m e ) 、基因d n a 解离并进攻细胞核( n u c l e a r t a r g e t i n g e n t r y ) ，其过程如图1 3 所示。 细胞内吞 一般复合物很难通过扩散作用进入细胞膜，而是通过细胞内吞作用。细胞内吞机理 概括为三种：流体相内吞、吸附内吞、受体介导内吞。由于细胞膜表面带负电，带负电 的分子不利于与细胞膜的吸附，通过与载体作用形成表面带正电荷的基因输送载体，有 利于细胞的吸附内吞作用。另外对于特定的靶向细胞，其细胞膜表面含有很多特定的受 体分子，通过在传递体系中引入与之相匹配的配体或抗体分子，可提高基因输送载体的 靶向性，有利于细胞的受体介导内吞。 逃离溶酶体 。 基因输送载体缔合体的内吞是一个复杂过程，包括结合、内在化、形成内涵体、 ( e d s o m e ) ，随后与溶酶体融合。溶酶体中p h 值很低且含有大量核酸酶，易使分子水 解，基因载体必须尽快逃离溶酶体，才能提高基因的转染效率。选用敏感型脂质体、具 有“质子海绵效应”的聚乙烯亚胺、聚酞胺胺树形聚合物( 树枝状聚合物) 在组装体中 8 第一章文献综述 加入抑制溶酶体的药物( 如氯哇) 均可以促进基因输送载体从溶酶体中的逃逸。 基因d n a 进攻细胞核 基因输送载体复合物逃离溶酶体后，进入细胞液。在胞液中复合物解离、释放出并 进攻细胞核，从而实现基因的转染。胞浆扩散并跨越核膜是限制基因输送载体的巨大的 障碍。通过设计带有核定位信号肤的载体有利于基因载体跨越核膜。可以把单一的核定 位多肤与一个报告基因共价结合，使基因的表达提高数倍。理想的基因输送载体要求在 体内循环中保持稳定，有效到达靶向细胞并被吞饮，实现在靶向细胞内的高效表达。基 因输送载体只有克