（植物学专业论文）防风体细胞胚发生发育的研究.pdf

防风体细胞胚发生发育的研究 乔琦 摘要：体细胞胚发生途径是细胞全能性表达的最完全方式，深入研究体细胞 胚的发生发育过程对于揭示细胞分化、发育、形态发生与合子胚发育等重大理论 问题的机制阻及真核细胞中基因表达与调节控制等具有十分重要的意义。 防风( s a p o s h n i k o v i a d i v a r i c a t af t u r c z ) s c h i s c h k ，) 系伞形科多年生草本植物， 为国家重点保护的野生药材之一。药用部位是植物的干燥根，具有解热、镇痛、 镇静、抗炎等作用。目前关于防风体细胞胚发生发育的研究主要集中于超微结构 以及核型分析等方面，关于组织培养中畸形胚的发生与控制、体细胞胚发生发育 的生化基础以及基因表达和调控等方面尚未见相关报道。 本论文在组织培养的基础上首次探讨了防风畸形胚的发生和控制；观察到罕 见的多年生植株组培苗的开花现象和畸形胚形成果实的现象，并初步探讨了其发 生机制：研究了防风体细胞胚发生发育过程中抗氧化代谢系统、多糖等物质的含 量动态变化：淀粉粒、蛋白体和脂体等后含物的动态分布等，为防风种质资源的 保护以及体细胞胚的研究提供基础资料。 本实验以降低畸形胚的发生率为目的优化了防风的组织培养体系。研究发现 防风体细胞胚的培养过程需要较复杂的培养基顺序变化。生长素是诱导胚性细胞 发生的关键因素，细胞分裂素起协同作用a b a 能有效控制防风畸形胚的发生。分 化培养基中的蔗糖浓度适当提高至4 5 可增加渗透势，能减少玻璃化胚的发 生和抑制早熟萌发的趋势。减少接种密度并将愈伤组织按其颗粒的自然状态分割 成较小的块，或采用将愈伤组织悬浮培养2 4 h 后再转入固体培养基中，均能降低 畸形胚的发生率。 长期继代培养使防风染色体数目发生变异，但是通过体细胞胚发生途径形成 的再生植株仍大多是二倍体，说明染色体组的相对完整性是体细胞胚发生潜力实 现的重要基础。 利用连续石蜡切片技术研究了防风体细胞胚发生发育的显微结构。发现体细 胞胚与合子胚不同的是，胚柄分化不明显，说明该结构在体细胞胚发育中并非不 可代替，推测离体培养条件与细胞的相互作用代替了胚柄与胚之间的相互作用， 也可能是造成畸形体细胞胚的发生率远高于合子胚的原因之一。在发育过程中， 体细胞胚始终与周围细胞存在明显界限，体细胞的壁显著加厚，而周围细胞处于 半解体和解体状态。 利用半薄切片技术能较清楚的观察到细胞内淀粉粒、蛋白体和脂体等后台物 的变化。在组织培养中淀粉粒的出现是胚性细胞开始分化的个标汜，淀粉的代 谢为蛋白质代谢提供中间产物，进一步合成生长发育所需要的结构蛋白、贮藏蛋 白和酶蛋白等。脂体的出现则是在细胞发育成熟以后，并且总是围绕在淀粉粒的 周围，推测脂类物质作为能源的贮藏形式，是来自糖类的转化。 本实验探讨了多糖在在体细胞胚发生和发育过程中的动态变化，发现多糖含 量最高的时期是培养在0 4 蔗糖浓度的培养基中的胚性愈伤时期，含量甚至略高 予药用部位，表明多糖合成和积累的高峰是在胚性愈伤组织的分化之前。而胚性 愈伤组织的大规模培养也可以成为提取多糖的途径之一。 本实验研究了s o d 、p o d 等抗氧化酶的动态变化，发现二者协同调节胚性细胞 的分化和发育，推测较高水平的氧化胁迫可以诱导植物体细胞胚发生中相关基因 的表达，从而诱导和促进细胞分化。 关键词：防风；体细胞胚发生；畸形胚：多糖；抗氧化酶 i l s t u d y o nt h es o m a t i c e m b r y o g e n e s i sa n dd e v e l o p m e n to f s a p o s h n i k o v i a d i v a r i c a t a q i a o q i a b s t r a c t ：t h ew a yo fs o m a t i c e m b r y o g e n e s i si s t h eb e s t e x p r e s s i o no fc e l l t o t i p o t e n c y s t u d yo n t h es o m a t i ce m b r y o g e n e s i sa n d d e v e l o p m e n to fs a p o s h n i k o v i a d i v a r i c a t ai s s i g n i f i c a n t f o rt h eb e s t u n d e r s t a n d i n g o fm e c h a n i s mo ft h e d i f f e r e n t i a t i o n ，d e v e l o p m e n t ，o c c u r r e n c eo fm o r p h o l o g y , z y g o t ee m b r y o g e n e s i s ，t h e t h e o r yo f g e n em o d u l a t i o n a n d e x p r e s s i o na sw e l l ， s a p c s h n i k o v i ad i v a r i c a t a ( t u r c z ，) s c h i s c h k b e l o n g st ou m b e l l i f e r a e ，p e r e n n i a l h e r b a c e o u s ，i ti so n eo f m o s tc r i t i c a ln a t u r a lm e d i c i n e si nc h i n a i t sr o o tc a nb eu s e d t or e l i e v ep a i na n dc o l d ，a n dh a st h ea b i l i t yo f a n t i b a c t e r i a l ，a n t i a l l e r g ya sw e l la s t r a n q u i l i z e r c u r r e n t r e s e a r c ho nt h es o m a t i c e m b r y o g e n e s i s o fs a p o s h n i k o v i a d i v a r i c a t ah a sb e e nf o c u s e do nt h eu l t r a s t m c t u r ea n dt h es t a b i l i t yo fc h r o m o s o m e b o t ht h ep r o b l e mo fo c c u r r e n c ea n dc o n t r o lo fa b n o r m a le m b r y oi nt i s s u e c u l t u r e ， m e c h a n i s mo f t h eb i o c h e m i c a la n dm o l e c u l a rh a v e n tb e e ns t u d i e da n d r e p o r t e d t h ea i mo ft h i sp a p e ri s 幻s t u d yt h eo c c u l t e n c ea n dg r o w t ho f a b n o r m a ls o m a t i c e m b r y o s ，a n dt oo b s e r v ea n dd i s c u s st h er a r ep h e n o m e n ao fb l o o m i n ga n db e a r i n g f r u i ti nt h ea b n o r m a ls o m a t i ce m b r y oo fp e r e n n i a lh e r b a c e o u s t h ea c t i v i t i e so f s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，p e r o x i d a s e ( p o d ) ，p o l y o s e sh a v eb e e ns t u d i e di nt h i s t h e s i s ，a n dt h ed i s t r i b u t i o no fe r g a s t i cs u b s t a n c es u c ha ss t a r c h ，p r o t e i na n do i lh a v e a l s ob e e ne x p l o r e dh e r e t h e s es t u d i e sj u s ta i ma tk e e p i n gt h eg e r m p l a s mr e s o u r c e s o f s a p o s h n i k o v i a d i v a r i c a t aa n dp r o v i d i n gt h ea c a d e m i cd a t af o rt h ef i e l do fs o m a t i c e m b r y o g e n e s i s t h e r e g e n e r a t i o no f t i s s u ec u l t u r ei so p t i m i z e di no r d e rt oc o n t r o lt h eo c c u t t c n c e o fa b n o r m a ls o m a t i ce m b r y o sa tf i r s t t h es t u d ys h o w st h a ti ti sn e c e s s a r yt oa d j u s t t h ec o m p l e x p r o c e d u r e o f t i s s u ec u l t u r ea n dt os e e kt h eb e s tc o m b i n a t i o no f m e d i u m s a u x i ni s k e yf a c t o rf o ri n i t i a t i n ge m b r y o g e n i cc e l l ，a n dc y t o k i n i ni sc o o p e r a t i n g a b ac a nc o n t r o la b n o r m a ls o m a t i ce m b r y o s e f f i c i e n t l y 4 一5 s u c r o s ec a nb eu s e d t o h e i g h t e n o s m o t i c p r e s s u r e a n dd e c r e a s et h er a t eo fv i t r i f i c a t i o n e m b r y o a n d p r e c o c i o u s n e s s i na d d i t i o n ，l o w e rt h ed e n s i t yo f i n o c u l a t i o na n dd i v i d et h ec a l l u si n t o g r a n u l e sa c c o r d i n gn a t u r a lf o r m ，o ru t i l i z es u s p e n s i o nc u l t u r ef o r2 4 h a l lc a nd e c r e a s e t h er a t eo fa b n o r m a le m b r y o s t h o u g hl o n g - t e r ms u b c u l t u r ew i l lc a u s ec h r o m o s o m ev a r i a t i o n ，d i p l o i dp l a n ti st h e i t i m a j o r i t y i nt h e r e g e n e r m i o n o f s a p o s h n i k o v i a d i v a r i c a t a t h ei n t a c t n e s so f c h r o m o s o m ei st h eb a s i st od e v e l o pp l a n t l e t t h ep a r a f f i ns l i c ei su s e dt or e s e a r c ha n a t o m ys t r u c t u r eo fs o m a t i ce m b r y o g e n e s i s a n dd e v e l o p m e n t t h ed i f i e r e n c eb e t w e e nz y g o t ee m b r y oa n ds o m a t i ce m b r y oe x i s t i nd i s t i n c ts u s p e n s o ra n de n d o s p e r m i ti sc o n f e r r e dt h a tt h e s es t r u c t u r ei nt h el a t t e r a r es u b s t i t u t eb yt h em e d i u mt op r o v i d en u t r i t i o n ，a n di ti s r e g a r d e da so n eo ft h e r e a s o n st oc a u s ea b n o r m a le m b r y o 。t h e r ea r eo b v i o u sb o u n d a r yb e t w e e ns o m a t i c e m b r y oa n ds u r r o u n d i n gc e l l s t h e c e l lw a l lo fs o m a t i cc e l li s t h i c k e n i n g a n d s u r r o u n d i n g c e l l sa r eb r o k e nu p g r a d u a l l y t h ed i s t r i b u t i o no f e r g a s t i cs u b s t a n c es u c h a ss t a r c h ，p r o t e i na n do i lc a nb ec l e a r l y o b s e r v e db ys e m i t h i ns e c t i o n t h ea p p e a r a n c eo f s t a r c hi st h eo n eo f t h es i g n a l so f t h e i n d u c t i o no f e m b r y oc e l l s ，t h em e t a b o l i s m o fs t a r c hc a np r o v i d em e t a b o l i s m p r o d u c t s f o r p r o t e i n t o s y n t h e s i z ee n z y m e ，h o a r d i n gp r o t e i n a n ds t r u c t u r a l p r o t e i n t h e a p p e a r a n c eo f o i li si nt h el a s tp h a s ea f t e rm a t u r a t i o no fc e l l ，a n da l w a y ss u r r o u n d s t h es t a r c h i ti sc o n f e r r e dt h a tt h eo i li sc h a n g e df r o ms t a r c ha st h es o u r c eo f e n e r g y t h ec h a n g eo fp o l y o s e si sa l s os t u d i e di nt h ep r o c e s so fs o m a t i ce m b r y o g e n e s i s a n dd e v e l o p m e n ti ts h o w st h a tt h eh i g h e s tp h a s eo fc o n t e n ti si nt h ec a l l u si no 4 s u c r o s em e d i u m a n di ti sh i g h e rt h a nr o o t s ot h ec a l l u si n0 4 s u c y o s em e d i u m i s r e c o m m e n d e dt op r o d u c ep o l y o s e sc o s m i c a l l y s o da n dp o da r es t u d i e da so x i d a t i o nr e s i s t a n c es y s t e m t h e ya r ec o o p e r a t i n gt o a a j u s ts o m a t i ce m b r y o g e n e s i sa n dd e v e l o p m e n t i t i sc o n d u d e dt h a tt h eh i g hl e v e lo f o x i d a t i o na d v e r s i t yc a na c c e l e r a t et h ec e l ld i f f e r e n t i a t i o na n dg e n ee x p r e s s i o n k e yw o r d s ：s a p o s h n i k o v i a d i v a r i c a t a ( t u r c z ) s c h i s c h k ，s o m a t i ce m b r y o g e n e s i s a b n o r m a le m b r y o ，p o l y o s e s v 学位论文独创性声明 y 7 2 8 4 1 6 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表 或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作 了明确说明并表示谢意。 ， 作者签名：鱼! 竺i日期：坦 ! 学位论文使用授权声明 本人完全了解陕西师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学 位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学 位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 保密的学位论文在解密后适用本规定。 ，1 著 作者签名： ：i ! ：i 日期 l 前言 植物是人类赖以生存的食物和药品的重要来源，已知的3 万多种天然产物中 有8 0 来自于高等植物【l j 。就药物而言，在美国药方中1 4 的药品来源于植物1 2 1 。 天然药用植物资源是自然界留给人类的宝贵财富，是人类赖以生存的物质基础。 在长期演化的自然过程中，纷繁复杂的药用植物品种形成了多样的遗传性状和天 然的基因库，一方面丰富了生物界的物种资源，另一方面也为人类的繁衍生息做 出了巨大的贡献。但是随着人口的增长和人类对药用植物需求的增加人类对野 生植物资源进行了掠夺性开发，造成许多植物资源面临枯竭的局面。因此，深入 研究天然药用植物并通过对细胞、组织或器官进行培养以满足人类对天然产物的 巨大需求，已经成为植物生物技术领域的研究热点之一。 高等植物的构造无论多么复杂，其发育过程的基本环节仍可以归结为细胞的 生长和分化。在植物组织培养技术中，离体培养细胞形态发生的研究是发育生物 学的首要课题。植物的一生能从分生组织分化形成各种器官和组织，特别是在离 体培养条件下，体细胞可以通过器官发生途径或者体细胞胚发生途径形成再生植 株。其中体细胞胚发生途径是细胞全能性表达的最完全方式，它不仅表明植物体 细胞具有全套遗传信息，而且重演了合子胚形态发生的进程，为此深入地研究体 细胞胚发生发育的机制对于揭示细胞分化、发育、形态发生与合子胚发育等重大 理论问题的机制以及真核细胞中基因表达与调节控制等具有十分重要的意义。此 外，体细胞胚发生还为种质保存、作物品种改良、转基因受体和突变体筛选等提 供了良好的无性繁殖的实验体系【3 l 。 据不完全统计，全世界约有1 0 0 0 多种高等植物可以进行离体培养，其中具有体 细胞胚发生能力的种子植物近2 0 0 种，约分属于3 5 科，7 6 属。很多研究表明，组 织培养中通过体细胞胚发生途径形成再生体系已经是普遍的现象，因为植物的体 细胞具有潜在的像有性生殖过程产生合子胚一样的全能性，这种全能性可以在最 适宜的培养条件下被诱导表现出来【4 “。 1 1 植物体细胞胚的研究进展 1 1 1 体细胞胚的形态发生 所谓形态发生是指在生物个体的发育或再生过程中，机体及其器官形态结构 的形成过程。通过研究形态发生中有关分化、对称、极性和相关性等现象的外界 条件因子、内在生理生化以及遗传基础。从而了解其机制以达到控制目的的一门 学科。植物组织或细胞离体培养中的形态发生包括器官发生和体细胞胚发生两种 途径，其最后结果均是形成发育成熟的完整植株，这两种途径均表明植物的细胞 具有全能性。从2 0 世纪5 0 年代末s t e w a r d 【7 l 和r e i n e r t 8 1 发现胡萝b 根细胞离体培 养可通过体细胞胚发生途径形成再生植株以来，人们在大量植物的组织培养，单 细胞悬浮培养，原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚或花粉胚的发生。 体细胞胚或花粉胚都是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发育形 成的胚状体结构，二者在组织培养中统称为胚状体。体细胞胚发生途径的显著特 点是：l 、体细胞胚是植物细胞离体培养的产物，仅限于在组织培养范围内使用， 区别于无融合生殖的胚；2 、体细胞胚起源于非合子细胞，区别于合子胚；3 、体 细胞胚的形成经历胚胎发育过程，区别于组织培养的器官发生中芽和根的分化吼 体细胞胚发生和器官发生相比较有显著的不同结构特征：1 、具有两极性：在 体细胞胚发生早期就具有胚芽和胚根两极，胚性细胞第一次分裂多为不均等分裂， 形成顶细胞和基细胞，其后由较小的顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，而较大的 基细胞进行少数几次分裂形成胚柄部分或者退化，在形态上具有明显的极性。2 、 存在生理隔离：体细胞胚形成后与母体植物或外植体的维管束系统联系较少，在 开始分裂时，就形成明显的细胞界限，到= 细胞至多细胞原胚期，细胞壁加厚， 与其它细胞隔开，而且随着体细胞胚的发育，周围细胞处于解体状态很容易与 原组织分离。体细胞胚可以通过根端或类似胚柄的结构从外植体或愈伤组织吸取 营养，在适宜条件下长成独立的植株。以上特征表明体细胞胚与合子胚相似，从 一开始便是一个完整植物体的雏形，它处于相对独立状态以便于细胞分化和全能 性表达。3 、遗传性相对稳定：通过体细胞胚形成的再生植株的变异性小于器官发 生途径的再生植株，因为只有未经过畸变或变异较少的细胞才能形成体细胚，实 现全能性表达。因此可将体细胞胚进行包装，制作人工种子，加速繁殖并保持后 代的优良种质的遗传稳定性。4 、重演受精卵形态发生的特性：植物组织培养中形 态发生的几种方式，虽然都是植物细胞全能性的具体表现，但只有体细胞胚发生 途径是细胞全能性表达最完全的一种方式。 从起源上看，绝大多数体细胞胚起源于单细胞。从多种植物中观察到单个胚 性细胞，有不均等分裂的二细胞原胚和均等分裂的二细胞原胚、多细胞原胚、球 形胚直到成熟胚。在单细胞悬浮培养中也能观察到体细胞胚的形成，单个胚性细 胞具有明显极性，第一次分裂多为不等分裂，顶细胞继续分裂形成多细胞原胚， 基细胞进行少数几次分裂形成胚柄。 一些学者观察到体细胞胚是来源于多细胞组成的胚性细胞复合体，如果用同 位素脉冲标记实验即可证明这些细胞团也是由一个单细胞连续分裂而形成的。该 细胞团再进一步分化和分裂形成不同发育时期的体细胞胚，因而这些体细胞胚实 质也可能是起源于单细胞。当然也不排除有些植物的体细胞胚的确起源于多细胞 的，这有待深入研究【l 。 2 1 1 2 影响体细胞胚发生发育的各种因子 1 1 2 1 生长素和细胞分裂素对体细胞胚发生发育的调控作用 体细胞转化为胚性细胞的重要前提是这些细胞必须脱离整体的约束，因此离 体培养是胚性细胞发生的必要条件，但并非是充分条件。因为这一转化过程的分 子基础是基因表达的结果，基因差别表达需要定的内外条件的诱导，也就是说 细胞分化必须具有相应的诱导因子。组织培养中影响细胞分化的因素很多，但其 中最重要的是激素的调节作用。植物激素有内源激素和外源激素之分，内源激素 是由植物体自身特定的部位产生的，外源激素指的是由人工合成的具有与内源激 素相似的生理活性或可影响内源激素合成、运输、代谢或生理作用的一类物质。 通常将植物的内源激素和终源激索统称为植物激素。目前公认的植物激素有五大 类：生长素类、赤霉素类、细胞分裂素类、脱落酸和乙烯。植物体内存在的油菜 素甾体类、多胺类和茉莉酸类等也具有近似激素的特性。 各类植物激素的生理作用虽具有相对的专一性，如生长素促进细胞体积扩大， 赤霉素促进茎伸长生长，细胞分裂素促进细胞分裂，脱落酸促进休眠以及乙烯促 进果实成熟等，但每一种生理现象的控制因素都是极其复杂的，而各类激素专一 性作用又是相对的。也就是说植物的各种生理效应是不同种类激素之间的相互 作用的综合表现植物细胞通过离体培养诱导脱分化和再分化过程更非是某类激 素单独作用的结果。 在多数植物组织培养中，外源生长索和细胞分裂素是细胞离体培养所必须的 激素，两者不同浓度及比例或者先后配合应用不但可以诱导细胞分裂和生长，而 且能控制细胞分化的形态建成。应用组织培养技术在培养介质中添加不同种类和 不同浓度的外源激素诱导形态发生己受到广泛重视，然而在实质上更为关键的是 组织内部的和体细胞胚发生部位的内源激素的代谢动态和平衡。例如内源i a a 在 体细胞胚发生的诱导过程中起着关键作用，在水稻细胞培养中胚性细胞的出现是 由于2 ，4 - 1 3 促进了细胞内源i a a 含量的提高从而诱导胚性细胞的形成，并认为内 源i a a 含量上升或维持在较高水平是胚性细胞出现的一个共同标志。但是对于这 两种激素的作用机制仍了解甚少，现在的多数实验致力于研究它们的最初作用部 位、激素的信息传递途径和作用机制等，仅就目前的研究工作表明，其作用可能 是直接作为反式作用因子或者间接地激活内源激素和蛋白质，而后调节基因的表 达，或者通过细胞第二信使发挥作用等i l i _ b j 。 1 1 2 2a b a 对植物体细胞胚发生发育的调控作用 a b a 又称胁迫激素，在抗旱、寒冷、盐渍等不同逆境下，a b a 含量都会急剧 地上升。一些研究结果表明，a b a 对植物体细胞胚的发生与发育具有重要作用。 对某些植物体细胞胚发生的特异基因表达起调控作用，能够激活相关基因的表达， 大量合成贮藏蛋白、晚期胚胎丰富蛋白和少量胚胎发生特异性蛋白。崔凯荣等1 1 4 】 在建立的枸杞体细胞胚发生体系的基础上，研究了体细胞胚发生与发育过程中内 源a b a 的含量变化和外源a b a 的作用。结果表明，当枸杞愈伤组织转入分化培 养后的第1 天，内源a b a 含量显著升高，并迅速形成第一个峰值，也是最高值。 这时正是胚性细胞启动分化期，胚性细胞大量形成，并有相应的3 5 k d a 蛋白出现。 分化培养后的第1 5 天，内源a b a 达到第二个峰值，这时正是球形胚形成期，而 3 5 k d a 蛋白组分含量也在此时达到最大值。实验结果还表明，在激素间的相互关系 上，脱落酸对生长素和细胞分裂素起拮抗和平衡作用。 a b a 浓度适宜时，能抑制多种异常体细胞胚的发生，一些研究表明，外源a b a 和内源a b a 对体细胞胚发生起到相互调节和促进的作用，补加适量的外源a b a 可以明显提高体细胞胚发生的频率和质量【l 5 ，”j 。 1 1 2 3 其它影响因子 在体细胞胚发生中，还有些理化因子，如渗透胁迫、氧化胁迫、干化作用、 外源脯氨酸、谷氨酚胺、氮化合物、p e g 和甘露醇等对体细胞胚发生中的基因表 达、内源激素的积累有明显作用f 1 7 ”j 。 1 1 3 体细胞胚发生的生化基础 a t p 酶活性和分布的动态变化表明，在胚性细胞分化和分裂过程中进行着旺 盛的物质主动吸收和活跃的新陈代谢过程。在多数植物的体细胞胚发生中，过氧 化物酶的活性与同工酶的种类都高于对照，并且有明显的动态变化，可以作为体 细胞胚发生的标志酶。胚性愈伤组织的可溶性蛋白含量与组分远高于非胚性愈伤 组织，大多数材料都存在4 5 k d 5 5 k d 的胚胎发生特异性成分。体细胞胚发生中不 仅有蛋白质含量的变化，而且有特异的胚性蛋白质合成，推测这些胚性蛋白质既 可作为调控因子，又可作为结构蛋白、贮藏蛋白和酶蛋白起作用。而且如果加入 蛋白质或核酸合成抑制剂后，体细胞胚发生中蛋白质和核酸代谢的规律性变化被 破坏，可以抑制体细胞胚的发生和发育，由此表明，蛋白质和核酸的合成为体细 胞胚的分化和发育提供物质基础【”。l 。 1 1 4 体细胞胚发生的基因表达和调控 随着体细胞胚发育的进程，d n a 和r n a 的合成速率远高于非胚性愈伤组织。 在体细胞胚发生与发育过程中不仅r n a 合成速率远高于非胚性愈伤组织，而且 m r n a 种类极其丰富，在不同发育时期，m r n a 种类不同，因而转译形成多种蛋 白质。在白云杉( p i c e ag l a y c av o s s ) 中还鉴定并克隆了三个热激蛋白 ( h e a t s h o c k p r o t e i n s ，h s p ) 基因。这三个基因的c d n a 具有同源序列，不仅对热 4 胁迫反应敏感且a b a 和聚乙二醇等因子也能诱导该基因表达，在胚性愈伤组织 中有两种h s p 的基因表达是随羞体细胞胚的发育而增加，但到再生苗形成时则检 测不到这两神基因表达，因此推测这两种h s p 的基因韵表达与体细胞胚的发生和 发育有关。 s c n g u p t a 等早在2 0 世纪8 0 年代初就发现，胡萝h 体细胞胚发生中，r n a 合 成始于胚性培养的第2 0 h ，两天后细胞分裂加快，总r n a 和蛋白质含量增加，且 在胚性细胞中主要合成p o l y ( a ) + m r n a ，并认为它的出现是体细胞胚分化的重 要遗传信息。接着有学者对胡萝h 体细胞发生中表达的p o l y ( a ) + m r n a 的互补 e d n a 进行了分子克隆，建立了胡萝h 体细胞胚c d n a 文库，分离到一些胡萝h 体细胞胚表达的基因，其中一些基因是在胚胎发生早期，如多细胞原胚和球形胚 中表达。 以红豆草( o n o b r y c h i sv i c i a e f o l i as c o p ) 无菌苗胚轴为外植体诱导愈伤组织， 在此基础上建立了“胚性细胞系”和“非胚性细胞系”。前者是指具有胚胎发生能 力的悬浮培养物，后者是指具有增殖能力，但无胚胎发生能力的培养物。应用3 h 一 胸苷( 3 h d t ) 标记，放射自显影方法研究了这两种细胞系的d n a 合成动态，结 果表明，当愈伤组织转入“胚发生培养”后4 h ，就可见到少量薄壁细胞被标记， 接着标记的细胞数和标记量增加，表明d n a 合成十分活跃，且d n a 合成只限于 核大、圆形的胚性细胞和胚性细胞团，到球形胚时d n a 合成速率达到最高峰，而 周围的细胞中很少见到3 h ，胸营的掺入。 在小麦的体细胞胚发生中采用3 h 胸苷放射性同位素液体闪烁计数方法，并在 不同时期加入核酸合成抑制剂的处理作为对照，分析了d n a 合成的动态，发现该 定量分析的结果与红豆草中定位测定的结果是完全一致的，也是随着体细胞胚发 育的进程，d n a 合成量明显增加。d n a 合成动态正好与胚性愈伤组织生长盐线相 一致，加入抑制剂后不仅抑制了d n a 的复制，同时也抑制了胚性愈伤组织的增殖 殖而且抑制剂加入时间愈早。影响愈严重。由此也表明d n a 的复制为细胞分裂增 殖奠定了物质基础，也为细胞分化提供了条件i 2 3 , 2 4 】。 植物体细胞胚的发生是细胞内胚性发生相关基因差别表达的结果，之所以有 基因的差别表达是因为细胞内外存在许多调控因子的调控作用；基因表达的调节 有转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后修饰水平等多层次调控。对绝大多 数基因来讲转录水平的调控是最主要的，只有转录水平的调控可确保没有多余的 中间体形成。 总之植物体细胞胚的发生、发育过程是在细胞内外多种因子的调控下，各种 因子的影响最终都是从转录、翻译、翻译后加工等水平上调节胚胎发生，因此需 要对调控因子和调控分子机理等进行更深入的研究以期最终揭示体细胞胚发生 这一特定细胞分化过程的本质【2 5 正鄹。 1 2 中药防风的研究现状 1 2 1 防风的生物学特征和生态学特性 防风( s a p o s h n i k o v i ad i v a r i c a t a ( t u r c z ) s c h i s e h k ) 属伞形科( u m b e l l i f e r a e ) ，脂 胶芹族( l a s e r p i t e a ed r u d e ) 防风亚族( s i l e r i n a e ) ，防风属( s a p o s h n i k o v i a ) ，为国家 重点傈护野生药材之。生物学特征是：多年生草本，株高3 0 8 0 厘米，全体无 毛。茎直立，多分枝，表面具细纵棱，稍呈“元”字弯曲，圆柱形。主根圆柱形， 粗壮，外皮灰棕色：根状茎短圆柱形，外面密被棕褐色纤维状老叶残茎。基生时 多数簇生，2 3 回羽状分裂，终裂片披针形，具长柄与叶鞘：叶片轮廓为披针形 或卵状披针形；茎生叶与基生叶相似，但较小与简化。具极简化的叶片或无叶片。 复伞形花序多数，生于茎和分枝，顶端花序梗长2 5 c m ，伞幅5 7 c r r t ，长3 5 c m ， 无毛，小伞形花序有花4 1 0 ；花瓣倒卵形，白色；双悬果狭圆形或椭圆形，幼时 有疣状突起，成熟时渐平滑，棱槽内通常有油管1 ，合生面油管2 ，胚乳腹面平坦。 花期7 8 月，果期9 月。药用部位是未抽花茎植株的干燥根。根呈圆柱形或长圆 锥形，长1 5 3 0 c m ，直径o 5 2 c m 。表面灰棕色，有纵槽，并有横向皮孔及点状 根痕。根头部密集环节，上有棕褐色毛状残存叶基。体轻质松，断面不平坦，皮 部深棕色，有裂隙、木部浅黄色。气特异，昧微甘。防风主要分布于黑龙江、吉 林、陕西、辽宁、内蒙古、河北、山东等地的干旱草原地区，具有抗寒、耐旱、 耐碱、耐疮薄、适应性强等生态学习性【”圳。 1 2 2 防风的中医学研究 防风是风药，其色黄、味甘、性柔和，“故叶天士用补中益气汤，每嫌升麻太 过，多以防风代之”。至于痛泻要方之用防风，其用意也在于升健脾阳。防风有发 汗、止汗的双相功能。发汗、辛温等解表剂中常用它，因其有辛温发散之功，向 有“风药中之润剂”的称誉，代表方如大家熟知的荆防败毒散、五虎汤( 荆芥、防风、 羌活、苏叶、白芷) ，防风汤等。此外亦多用于风寒湿痹，如千金方独活寄生 汤有防风。止汗，则早见于宋人方书，如易简方用防风、川芎、人参为末， 治“睡中盗汗”；仁斋直指龙胆散用龙胆草、防风为末，治“盗汗有热”，李时珍 本草纲目用防风为末，每服二钱煎汤送服，或防风用麦麸炒过，猪皮煎汤 下。并治“自汗不止”，皆可为例证。也正因防风有止汗的功效，所以“玉屏风散” 中以防风与黄芪、自术相配，用以治疗自汗l j 2 ，”j 。 1 2 3 防风的研究进展 1 2 3 1 防风体细胞胚的研究进展 6 目前关于防风体细胞胚发生的研究主要集中于超微结构及核型分析等方面。 慈忠玲等研究了从单细胞到球形胚发生的显微及超微结构的变化，并对防风进行 核型分析。结果显示：防风悬浮细胞的圆球体和液泡蛋白体等超微结构随体细胞 胚发生过程两变化。在胚牲细胞团阶段细胞内出现周质内质网，它的出现可能与 细胞团向原胚过渡时的特殊代谢相联系。从单细胞至原胚各阶段细胞内均含有圆 球体，到原胚时数量大增，而且其中央电子致密的基质变小变浅，周边部分扩大 并更加透明，暗示圆球体在胚胎发生早期起着贮藏蛋白或脂蛋白的作用，后来消 耗于原胚的建成而衍生为脂滴。球形胚阶段，在很多细胞的液泡中出现团块状的 液泡蛋白。此外还观察到，悬浮培养时单细胞的聚集能促进体细胞胚的发生【3 43 5 】。 此外对防风的染色体进行了大量观察弗进行核型分析，结果表明防风正常的体细 胞为2 n = 1 6 染色体组总长度4 4 9 5 9 i n ，染色体绝对长度变幅为4 1 9 5 8 6 ，相对长度 变幅为1 0 1 7 1 4 3 0 ，臂比变幅为1 8 6 2 8 3 ，其核型类型属于2 a 型【3 6 j 。进 一步利用m s + 0 5 m g ，l 2 ，4 - 1 2 同时作为诱导培养基和分化培养基对防风的胚性愈伤 组织进行长期继代培养，结果发现防风体细胞在继代培养过程中染色体变异显著， 有亚倍体、超倍体、单倍体、多倍体和微核细胞出现。并发生染色体的形态变异。 培养半年以上亚倍体和微核细胞出现并开始增多，超倍体和多倍体细胞极少，随 着培养时间的延长，亚倍体和微核细胞消失，而多倍体和超倍体细胞显著增多。 认为长期使用单一的培养基导致防风的染色体变异频率升高和积累，同时推测 2 , 4 一d 作为强效生长素，导致染色体畸变的积累。关于组织培养中畸形胚的发生与 控制、体细胞胚发生的生化基础以及基因表达和调控方面尚未见相关报道。 1 2 3 2 防风的资源利用现状及其可持续利用研究 随着中国中医药事业的发展和人类“回归自然”呼声的高涨，我国的医疗保 健用药需求在不断地日益扩大，使得对中药材的需求量逐年增加。防风多年来畅 销不衰，价格一直稳定，入世后出口量更是加大。由于防风存在着自然分布少、 生境特殊、再生能力差、自然繁殖率低，生长周期相对较长等特点：其野生资源 早已难以满足日益增长的市场需要，而多年的野生防风资源已经造成产量下降及 品质退化以及供求市场失衡。由于野生防风生长于半干旱的荒漠地带，本身就具 有防风固沙、保持水土等生态学价值，盲目开采防风已经进一步造成生态环境的 破坏。 通过调查我国1 7 个省市的防风使用情况，查明目前这些地区大多使用伞形科 植物防风未抽花茎植株的干燥报。防风的常见商品有三种，分别是：关防风( 东 防风、北防风) ，主产于东北三省：西防风( 别名口防风) ，原植物为华山前胡 ( p e u c e d a n u ml e d e b o u r i e l l o i d e s ) 主产于内蒙、陕西、甘肃；水防风，原植物为宽 萼岩防风( l i b a n o t i sl a t i c a l y c i n a ) 主产于河南、陕西、甘肃。其中野生关防风质量 最优，其次为西防风。东北地区从1 9 5 6 年就开始进行防风野生变家植的研究工作， 先后采取了翻地平播，翻地整平后起垄、垄作耕种、耙荒撒播、半野生半家种等 多种方法，基本摸清了防风生长发育规律和最佳栽培技术。防风的商品田以半野 生半家种方法为最佳，并证明春夏秋三季均可播种，但以伏播为宜。防风适应性 强，耐寒、抗旱性强，只要保证全苗，在生长期间管理相对简单。滕治杰等分别对 黑龙江省的关防风野生转家种进行了研究，认为生长期8 年以上的栽培品与野生 品质量相近，并将栽培品与野生品的品质进行了比较证明栽培品虽外形上有所 变化，但在化学成分、药理作用等方面与野生品基本相同。在种植基地中应选择 有野生防风生长的草场或荒地以轻度碳酸盐黄沙土或黑沙土为宜，忌在重度盐 碱土、白浆土、重粘土和低洼地上种植。如果在人工幼林地行间种植。形成林药 间种，经济效益更佳 3 7 , 3 8 j 。 1 2 3 3 化学成分 王建华等用反相高效液棚色谱法分离并测定了防风主要药性成分4 种色原酮 的含量，显示其含量具下列规律：升麻苷 5 o 甲基维斯阿米醇苷 升麻素 亥茅酚 苷。比较防风与母防风( 防风抽花茎植株的根) 的色原酮古量差别，结果表明母防风 中的含量较低。在防风的根茎甲醇提取物中分离了1 1 个结晶。由防风果实挥发油 中已经分折鉴定出6 6 种化学成分，其中，萜类化合物是其主要成分，与防风根的 挥发油中主要成分的种类以及含量差别很大。此外，在防风水煎物中合有多糖等 药性成分，被认定为三种均一多糖，其分子量为5 4 0 0 0 , 2 8 0 0 0 0 ，1 3 2 0 0 0 3 9 , 4 0 i 。 1 2 3 4 生药鉴定 许多文献对我国的主要商品防风进行了形态组织学研究，并编写了各种防风 的性状与显微特征检索表。可以通过薄层层析配以紫外检测法和高效液相色谱法 进行舫风的理化鉴定，已有效地应用于中药材和中成药中防风的鉴别，其优点是 方法简便，特异性强【4 “。防风原植物关防风的染色体核型研究也有报道，其核型 为2 a 型，为鉴别防风真伪提供了有效工具m 娜j 。 1 2 3 5 药理研究和现