（分析化学专业论文）共振瑞利散射光谱在多糖分析中的应用研究.pdf

四甬大字坝士字位论又 捅要 共振瑞利散射光谱在多糖分析中的 应用研究 分析化学专业硕士学位申请人王晓洲 指导教师罗红群教授 摘要 共振瑞利散射( i 氓s ) 是一门新兴的分析技术，因其高灵敏度和简易性而引起人们广泛关 注。i 汛s 法是利用生色团在生物大分子上的聚集作用和小分子之间静电引力、疏水作用力和 电荷转移作用形成的离子缔合物产生强烈的i 吣光谱来进行检测的，它已用于核酸、蛋白质 等生物大分子的研究，并用于痕量无机离子，有机物的测定。i 冰s 法具有很高的灵敏度，在 生命科学、环境科学以及纳米材料研究等方面都有良好的应用前景。 本论文分为两部分，第一部分是文献综述，主要介绍了共振瑞利散射技术及其发展和多 糖的药理作用和常用分析方法。第二部分是研究报告，报道了用共振瑞利散射光谱法分析和 测定两种多糖，主要内容如下： 一、共振瑞利散射光谱法测定葡聚糖硫酸钠 1 、碱性三苯甲烷染料乙基紫共振瑞利散射光谱法测定葡聚糖硫酸钠 在b r i t c o n r o b i i l s o n 缓冲介质0 h9 o 一1 0 5 ) 中，单独的乙基紫与葡聚糖硫酸钠的共振瑞利 散射都非常微弱，当二者反应形成粒子缔合物时将导致溶液共振瑞利散射明显增强，并产生 新的共振瑞利散射光谱，其三个明显的散射峰分别位于3 4 8 o 脚、5 0 9 8 砌和6 8 0 0n m 处，且 均可作为测定波长。以出值最高且线性关系较好的5 0 9 8 砌作为测定波长时，葡聚糖硫酸钠在 o 0 0 5 2 4 p g i n l - 1 范围内与共振瑞利散射强度成线性关系，检出限为3 2 5n g i n l _ 1 。讨论了溶 液酸度、乙基紫浓度、反应时间、温度、离子强度等实验条件，考察了共存物质对该体系测 定葡聚糖硫酸钠的影响。实验表明该方法有较高的灵敏度，应用于合成样品的测定，结果令 人满意。 2 、阳离子表面活性剂溴化十六烷基吡啶共振瑞利散射光谱法测定葡聚糖硫酸钠 两南大学硕+ 学位论文 摘要 在b r i 仕o n r o b i n s o n 缓冲介质( p h6 o ) 中，单独的葡聚糖硫酸钠和溴化十六烷基吡啶的共 振瑞利散射都非常微弱，但当两者反应形成离子缔合物后却导致鼬塔显著增强，并产生了新 的共振瑞利散射光谱，葡聚糖硫酸钠在o 0 1 2 8 陷m l 1 范围内与砒峪强度成线性关系，由 此建立了一种测定d s s 的新方法。该方法灵敏度高，检出限9 8 5 n g m l 一。本实验研究了适 宜的反应条件和影响因素，考察了共存物质的影响，结果表明该方法有高的灵敏度。 二、共振瑞利散射光谱法测定硫酸皮肤素 1 、硫酸皮肤素和某些吖啶染料缔合物微粒体系的共振瑞利光谱研究 在适宜p h 条件下，硫酸皮肤素可以和某些吖啶染料作用形成缔合物时将导致溶液共振 瑞利散射明显增强并产生新的峪光谱。以硫酸皮肤素一吖啶橙为研究体系，其最大散射峰 位于5 1 5 6 l n 处，硫酸皮肤素在0 0 1 6 o 甥n 以1 范围内与r r s 强度成正比。该方法灵敏度 高，检出限为8 7 n g m l 。研究了适宜的条件和影响因素，考察了共存物质的影响，应用于 合成样品的测定，结果令人满意。 2 、碱性吩噻嗪染料甲苯胺蓝共振瑞利散射光谱法测定硫酸皮肤素 在p h5 6 的实验条件下，甲苯胺蓝与硫酸皮肤素作用形成结合产物时将导致溶液共振瑞 利散射明显增强并产生新的r r s 光谱，其最大散射峰位于3 5 6 0 n m 处，研究了适宜的条件和 影响因素。硫酸皮肤素在o 1 4 o 腭m l - 1 范围内与峪强度成正比；检出限为8 5 1 0 五 喀m l _ 1 。考察了共存物质的影响，实验证明该方法有较好的选择性和灵敏度，应用于合成样 品的测定，结果令人满意。 关键词：共振瑞利散射葡聚糖硫酸钠硫酸皮肤素碱性染料表面活性剂 i i 西南大学硕十学位论文abstract s t u d vo nt h ea p l ) l i c a t i o no fr e s o n a n c e r a y l e i g hs c a t t e r i n 2s p e c t r ai n p o l v s a c c h a r i d ea n a l v s i s c a n d i d a t e ：x i a o z h o uv y r a n g s p e c i a l i 够：a n a l 如c a lc h e m i s t 巧 m e n t o r ：p r o fh o n g q u nl u o a b s t r a c t r e s o n a i l c er a y l e i 曲s c 甜e r i n g ( r r s ) h a sb e c o m eh o w n 矗wi t ss e n s i t i v 时a i l ds i i n p l i c 埘铺a n e wa n a l 州c a lt e c 王1 i l i q u e t h i sl n e m o di sb a s e d0 n 1 es 缸o n gi 汰ss i g n a lp r o d u c e db yn l er e a c t i o 璐 s u c h销m e a g g r e g a t i o no fc l w o m o p h o r e o ns o m e b i 0 1 0 舀c a lm a c r o m 0 1 e c u l e s a n d吐l e i o n - a s s o c i a t i o nr e a c t i o n s ，w h i c ha r ef o 脚1 e db ye l e c t l _ o s t a t i cf o r c e ，h y d r o p h o b i cf o r c e 孤dc h 鹕e 仃a n s f e ri n t e r a c t i o nb e t w e e ns i m nm o l e c u l e s nh a sb e e nu s e dt 0 i i e s t i g a t es o m eb i o l o 舀c a l m a c r o m 0 1 e c u l e ss u c h 觞n u c l e i ca c i d sa n dp r o t e i n s ，觚da l s ou s e dt om ed e t e m l i i l a t i o no fs o m e 仃a c ei i l o 唱a n i c 锄do 玛砌cs u b s 锄c e s 1 i l er r sm e dh a s1 1 i 班s c 璐心毋锄dl l a s 缸c i i i a t 崦 f o r e 伊o u n di i ll i f es c i e n c e s ，e n v i r o 加m e n t a ls c i e n c e sa n dn a n 0 - m e t e rm a t e r i a l s n l i sa n i c l ec o l l s i s t so ft 、) l ，op a r t s h lt l l ef i r s tp a nt l l ed e v e l o p m e n to fr e s o n a n c er a y l e i g l l s c a t c e n ga i l a l y s i sa l l d t l l ep h a l l m c o l o g i c a la c t i o 嬲o fs a c c h 撕d ea i l di t sc o 删：1 1 0 n 锄a l y t i c a l m e t h o d sh a v eb e e nb r i e f l yg u m m 抓z e d ；i i lm es e c o n dp a n 也er e s o r 删er a y l e i g hs c a 妣r i n g m e t h o d sf o rm ed e t e r i 】 1 i n a t i o no ft w os a c c h 撕d e sh v eb e e nr e p o r t e d t h em a i nc o n t e n t sa r el i s t e d 2 l sf o l l o w s ： 1 d e t e 册i n a t i o no fd e x 妇ns u l f a t es o d i 啪b yr e s o n a l l c er 丑y l e i 咖s c a 位e 血gs p e c 妇 1 1d e t e 锄i 1 1 a t i o no fd e x 廿觚s u l f a t es o d i u m 、加吐lb 弱i ct r i p h e n y l m e m a l l ed y ce m y lv i o l e tb y r e s o r l a 】er a y l e i g hs c a n e 咖g h lt h eb r i t t o nr o b i i l s o nb u f f e rm e d i u m0 h9 肛1o 5 ) ，b o t l ld e x 仃a ns u l f a t es o d i u m ( d s s ) 锄d b a s i ct r i p h e n y l - m e t l l a i l ed y ee m y lv i o l e t ( e v ) h a dv e r yf a i l l tr e s o r 啪c er a y l e i 曲s c 甜嘶n g ( 峪) s i g n a i h o w e v e r ，w h e nd s s 锄de vw e r em i ) 【e dt o g e m e r m ei 1 1 t e r a c t i o nb e 似e e nd s s 锄de v t o f o 肌c o m p l e xb yv i r t u eo fe l e c 协o s t a t i ca n dh y d r o p h o b i cf - 0 r c e so c c u r r e d ，w i l i c hg 陀a t l ye n l l a m c e d t l l er r si n t e l l s 时a 1 1 dan e wr r ss p e c 饥吼f o rm ed s s - e vs y s t e ma p p e a r e dw 池t l l r e eo b v i o u s i i i 两南大学硕士学位论文 a b s t r a c t s c a t t e r i n gw a v e l e n g n l sa t3 4 8 o1 1 i i l ，5 0 9 8 砌a n d6 8 0 0 蚴t h er r si n t e l l s 埘w a sd i r e c n y p r o p o r t i o n a l t ot h ec o n c e n t r a t i o no fd s s i l lm e 啪g eo f 0 0 0 5 2 4 肛g m l ，1 ，甜l dt h ed e t e c t i o nl i m i t w a s3 2 5n g 。旷t 1 1 ec h 撇c t e s t i c so fr r sa i l da b s o i p t i o ns p e c 吼o f 雠d s s - e vs y s t e mw e r e s t u d i e d 1 ke 恐c t so fe x p 舐m e n t a lc o n d i t i o l l ss u c h 雏a c i d 时，也ec o n c e n 跏i o no fe v ，r c a c t i o n t i m e ，t e n l p e r a t u r ea i l di o i l i cs 仃e n g t l lo nm es y s t e mh a db e e nd i s c u s s e d ma d d i t i o n ，m ei 1 1 n u e n c eo f c o e x i s t e n ts u b s t a n c e so nt l l es y s t e 皿h 硒b e e ns t u d i e d 1 1 h em e m o dh a dh i 曲s e n s i t i v 埘a l l dh a sb e e i l 印p l i e dt ot h ed e t e 彻i n a t i o no fd s sms y i m l e t i cs 锄p l e sw i ms a t i s f a c t o r yr e s u l t s an e wm e m o df 0 r t h ed e t e 锄i n a t i o no f 衄c ea m o u n t so fd s sb 豁e do nm ei 氓sm e m o dh a sb e e nd e v e l o p e d 1 2d e t e m l i i l a t i o no fd e x 缸锄s u l f a t es o d i u m 、) i ，i mc a t i o m cs l l r f a c t a i l tc e t y l p 妒d “u mb r o l t l i d eb y r e s o n a n c er a 姐e i 曲s c a t t e m g 1 1 1p h6 ob r i t t o nr o b 缸o nb u f f e rm e d i 啪，m er e s o n a n c er a y l e 诎s c 撒出gi 1 1 t e n s 时o fs o l e d e x t r a ns u l f a t es o d i 啪o rc a t i o i l i cs u r f a c t a n tc e t y l p 妒d i n i 啪b r 0 1 1 1 i d ew 雒v e r yf a i n t h o w e v e r ， w h e nt h e yr e a c t e dw i me a c ho t l l e rt 0f 0 衄i o l l i c - 雒s o c i a t i o nc o m p l e x e s ，m ei i l t e i l s i t yo fr e s o n a i l c e r a y l e i 曲s c a t t e m g c a i lb eg r e a t l ye i l l l a i l c e da l t l l o u 曲t l l ec h a i l g eo fa b s o f p t i o ns p e c t u i i lw 淞f a m a n e wr r ss p e c t m mo ft h ed s s c p bs y s t e m 印p e a r e dw i t ht h em a x i m u m s c a t t e r i n gp e a ka t31 2 衄。 t h es u i t a b l er e a c t i o nc o n d i t i o n sa n de f - f e c tf a c t o r s 、) l ，e r es t u d i e d t h er r si 1 1 t e i l s i 够w 觞d i r e c t l y p r 叩o n i o n a l t ot h ec o n c e i i 吼t i o no fd s si i lt l l e 姗g eo fo 0 1 2 8 gn 1 i 1 ，孤dm ed e t e c t i o nl i i i l i t w a s9 8 5n gm l 一t 1 1 ei n n u e n c eo ff o r e 咖s u b s t a i l c e so nm es y s t 锄w 雒m e s t i g a t e d t h em e m o d w a ss e n s i t i v ea n ds e l e c t i v e 2 d e t e m l i n a t i o no fd e 加a _ t a ns u l f a i eb yr e s o i m l c e 砌【y l e i g l ls c a n e r i i l gs p e c 妇 2 1d e t e n l l i i m t i o no f d e n l l a t a l ls u l 伽e 耐ma c d d i n ed y c sb yr e s o 啪c er a y l e i 曲s c a t t e 血喀 u n d e rs u i 协l ec o n d i t i o n s ，也ei i l t e n s 姆o fr e s o n a n c er a y l e i g l ls c a t t e 衄gr e s u l t i i l g 舶m i n t e r a c t i o nb e t 、e e nd e m l a t a i ls u l f a t e ( d s ) a n da c r i d i i l ed y e sc o u l db eg r e a t l ye i l l l a i l c e d h lt l l e d e m l a t a i ls u l f a c ea 1 1 da c r i d i n eo 啪g e ( a 0 ) s y s t e m ，n l en e wr r ss p e c t r i 肋o fm ed s - a os y s t e m 印p e a r e d w i t l lt l l em a x i m 啪s c a t t e 血gp e a ka t5 1 5 6i l i i l ，m el 己r si i l t e 眦i t ) ，w a sd i r e c t l y p r o p o n i o n a lt ot h ec o n c e l l 缸乱i o no fd si i lt h em 1 1 9 eo f0 0 l 一6 0 鹇r n l 一，a i l dt h ed e t e c t i o nl i 础 w a s8 7 n g m l _ 1 t h em e t l l o dw 骶s e i l s i t i v ea l l dh a l sb e e n 印p l i e dt 0 吐l ed e t e m l i n a t i o no fd si i l s y n t h e t i cs a i l l p l e sw i ms a t i s f a c t o r yr e s u l t s 2 2d e t e 眦i m t i o no fd e n i l a t a i ls u l f a t e 谢mt 0 1 u i eb l u eb yr e s o n a 工l c er 丑y l e 磅s c a t t e r i n g t h ec o n l b i n a t i o no fd e 彻a 切妇s u l 矗l t e 喇t 1 1t o l u i d m eb l u e ( t b ) ，ab 笛i cp i l e i l o l l l i 蛔幢d y e ，l l a s b e e ns t l l d i e db ym e a n so fr e s o n a n c er a y l e i 曲s c a t t e 咖g t h er e s u l t ss h o w e dm a tu n d e r l es u i t a b l e c o n d i t i o i l s ，t 1 1 eb i n d i n go fd sw i m1 1 3c o u l dr e s u l ti l las i 鲥f i c a n t 砌l a 】e m e mo fm er r si i l t e n s i t ) ，- an e w 峪s p e c t n l mo ft h ed s - t bs y s t e ma p p e a r e d 埘m 吐l em a x i l i l u ms c 舭r i n gp e a ka t3 5 6 o 姗 t h eo p t i m u mc o n d i t i o i l so f 廿l er e a c t i o n ，n l ei n n u e n c i n gf a c t o r sa n d 也er e l a t i o i l s h i pb e 觚e e nm e 西南大学硕七学位论文 a b s t r a c t r r si n t e n s i t 、，a n dt l l ec o n c e m r a t i o no fd sh 硒b e e ns t u d i e d t h cr r si i l t e i l s i t ) ，w 觞d i r e c t l y p r o p o n i o n a lt om ec o n c e n 仃a t i o no fd si i l 恤舢g e o fo 1 4 o 嵋n f l t l l em e l o de ) 【l l i b i t e dl l i 曲 s e i l s i t i v i t ya i l d l ed e t e c t i o n1 i i i l i tw 豁8 5 1o 一2p g - i i l ：l - 1 i tl 琊b e e na p p l i e dt on l ed e t e 肿i 眦t i o no f d si ns y n t h e t i cs a m p l e sw i ms a t i s f a c t o r yr e s u l t s 。 k e y w o r d s ：r e s o n a l l c er a y l e i g hs c a n e 血g ； d e x h 锄s u l 饥es o d i u m ；d e n m l c a l ls u l f 狐；b 弱i c d y e ；c a t i o i l i cs u r f a c t a i l t v 独创性声明 学位论文题目：基拯瑞到邀盟龙道查垒揎佥堑生数应用珏究 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 、1 学位论文作者：爱矗氆卅 签字日期：渺3 年c | 【月加日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口 保密期限至年月止) 。 学位论文作者鲐籼导师鲐、尹不巧 签字日期：捌8 年| 【1 月加日签字日期：年月 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：堕川塞堡堂睦 电话： 通讯地址：堕川塞堡堂瞳邮编： 0 818 2 7 6 0 7 4 9 6 3 5 0 0 0 两南大学硕十学位论文 第一部分文献综述 第一部分文献综述 共振瑞利散射作为门新兴的分析技术，因其简便、快速和高灵敏度引起人们 的广泛关注，在分析化学中发展十分迅速。多糖是一类重要的生物大分子，是一切 有生命的有机体必不可少的成分，它在许多生物学、生理学和病理学过程中起着 重要作用，已引起世界医药界的广泛关注，许多先进的仪器、分析方法和生物技术 己被应用到多糖的分析中来。 文献综述分两部分，分别介绍共振瑞利散射技术及其发展和多糖的药理作用 和常用的分析方法。 1 1 共振瑞利散射技术及其发展 1 1 1 光散射现象 光散射是一种常见的自然现象，广泛存在于光与粒子的作用过程中，它是指 当光通过介质时，在入射光方向以外的各个方向观察到的光辐射现象。它源于光 电磁波的电场振动而导致的分子中电子产生的受迫振动所形成的偶极振子。根据 电磁理论，振动着的偶极振子是一个二次波源，它向各个方向发射的电磁波就是 散射波 1 1 。它是一种常见的自然现象，许多通常不被看作散射的光现象，如光的 衍射、折射与反射，归根到底都是散射的结果。 光散射与介质的不均匀性密切相关。除了真空以外的其它所有介质都有一定 程度的不均匀性，从而产生散射光，只是由于介质不均匀小区域不同，产生不同 种类的散射。有光入射时，每个小区域成为散射中心，向四面八方发出相同频率 的次波，这些次波间无固定相位关系，它们在某方向上的非相干叠加形成了该方 向上的散射光。理论上说，各项均匀的纯物质的气体或者液体的散射光强度应为 零，因为在其中任意选定一个小的散射体积元，总可以找到另一个相对应的散射 体积元，使得两者在观察点的散射电场恰好因干涉而完全抵消。然而，事实上， 由于分子处于不停的无规则运动状态，纯物质的气体或液体的内部各种性质总是 围绕着其平衡值随时间和空间涨落，所以我们可以观察到纯物质气体或液体的散 射。以光波波长( 1 0 巧c m ) 为尺度衡量，纯气体、液体和固体都可以看作均匀介 质，因为在光波波长范围内这些介质折光指数相差较大，则产生的诱导偶极矩不 同，次级辐射波不能抵消，这就出现光散射现象。在均相介质中，如果分子热运 动引起密度或浓度的局部涨落，将使折光指数或介电常数也发生局部变化，则次 级波不能抵消，也会出现光散射，大分子溶液的光散射就是这个原因。因此，粒 西南大学硕十学位论文 第一部分文献综述 子尺度与光波波长相比的不均匀性是散射光产生的原因。 根据与光子相互作用的微粒尺寸大小( d ) 和入射光波长( 入) ，可把光散射 分为：m i e 散射( d 入) ，耻d a l l 散射( o 0 5 入 d 九) ，r a y l e i 曲散射( d o 0 5 入) 。按入射光和散射光波长的异同，光散射又可分为弹性光散射、非弹性光散射 和准弹性光散射。其中弹性光散射又称为经典散射或静态散射，它是指散射光波 长与入射光波长相等的散射，r a y l e i 曲散射是d 冬2 0 入。的弹性散射，浑浊介质的 研d a n 散射和透明介质的分子散射也都是弹性散射。光与散射质点作用时有能量 增加或损失的散射即产生频率位移的散射是非弹性散射，如：r 眦a n 散射是光与 分子振动交换能量的非弹性散射，而b m l o u i n 散射是由于热声波引起的非弹性散 射。准弹性散射也称为动态光散射。是指散射质点不停地作布朗运动而引起 d o p p l e r 效应导致的散射光波长与入射光波长有微小差别的散射。 在三类散射中，研究最深入、应用最广泛的是作为非弹性散射的拉曼散射， 其次是作为弹性散射的瑞利散射。 1 1 2 瑞利散射 瑞利散射( r a y l e i 曲s c a t t e 咖g ，r s ) 是指散射光波长等于入射光波长，而且散 射粒子( 分子) 远小于入射光波长的散射。由英国物理学家瑞利提出而得名。瑞 利散射是一种没有能量转移的弹性光散射，即仅研究散射光强度及其角度依赖型 的光散射。 1 8 7 1 年，为了解释天空为什么呈现蓝色这个长期令人不解的问题，瑞利在经 过反复研究，反复计算的基础上，提出了著名的瑞利散射公式，当光线入射到不 均匀的介质中，如乳状液、胶体溶液等，介质就因折射率不均匀而产生散射光。 瑞利研究表明，即使均匀介质，由于介质中分子质点不停的热运动，破坏了分子 间固定的位置关系，从而也产生一种分子散射，这就是瑞利散射。瑞利经过计算 认为，分子散射光的强度与入射光的频率有关，即四次幂的瑞利定律【2 】： ，2 4 石s ，：f ，以卜，l ；1 2 ， 扛万一【孺j “ 其中卜散射光强度，厉一入射光强度，九一入射光和散射光波长，n 一单位体积 内粒子数目，v 一一个粒子的体积，n 1 一散射相的折射率，i l o 一介质的折射率。 由该公式可知：( 1 ) 散射光强度与入射光波长的四次方( 九4 ) 成反比，波长越短， 散射越强：( 2 ) 散射光强度与粒子的体积的平方( 、，2 ) 成正比，这说明粒子的尺 2 两南大学硕七学位论文第一部分文献综述 度对光散射的重要性；( 3 ) 射光强度与单位体积的内的粒子数( n ) 成正比，这 是定量分析的基础；( 4 ) 分散相粒子与分散介质的折射率相差越大，散射作用越 强。 瑞利散射自发现至今已经经历了一百三十多年的发展与完善，建立了较完善 的理论体系并在物理学、生物学、天文掣3 1 、气象学和化学中得到了广泛的应用。 其中与化学有关的应用是：分子量的测定、分子回转半径、形状和大小的测定【4 】， 缔合聚合反应过程动态行为的研究以及一些物理化学参数的测定等。 尽管瑞利散射技术已得到广泛的应用并为研究工作提供了大量的信息，但该 技术存在两大不足：( 1 ) 信号水平低，一般仅有入射光强度的千分之一左右；( 2 ) 选择性低，不同物质均遵守k 1 九4 的瑞利定律，无特征峰，因此限制了它的应用。 若在散射实验中，选择入射光波长接近待测物质的吸收带时，该物质的散射 会大大增强，而且会出现新的散射特征，这就是共振瑞利散射，它的出现大大弥 补了瑞利散射的不足，并使散射技术得到了新的研究和应用。 1 1 3 共振瑞利散射 共振瑞利散射( r e s o n a n c er a y l e i 曲s c a t t e 血g ，r r s ) 是指当瑞利散射位于或 接近于分子吸收带时，由于电子吸收电磁波频率与散射频率相同，电子因共振而 强烈吸收光的能量并产生再次散射，其散射强度能比单纯的瑞利散射提高几个数 量级，并且不再遵守i o c l 舻的瑞利定律，这种吸收一再散射过程称为共振瑞利散 射或共振增强瑞利散射5 1 。 共振瑞利散射光强度可如下表示： k 厶竿 等+ 器掀限 由该公式可知：( 1 ) 其它条件一定时，共振瑞利散射的强度与溶液的物质的量浓 度( c ) 成正比，这是共振瑞利散射作为物质浓度测定方法的定量基础。( 2 ) 共振 瑞利散射强度与分子的摩尔吸光系数密切相关，摩尔吸光系数越高，共振瑞利散 射越强。( 3 ) 当散射分子具有荧光时，此时的共振瑞利散射也可视作共振荧光， 或九= 0 m 时的一种特殊的同步荧光。 共振瑞利散射与瑞利散射相比，具有以下优点：( 1 ) 有更高的灵敏度，其信 号水平可比瑞利散射提高几个数量级，可以用于更稀的溶液的研究。( 2 ) 检测更 为方便，并可研究i 汛s 光谱特征。由于r r s 有很高的信号水平，因而可用在紫 西南大学硕十学付论文第一部分文献综述 外可见光区发射连续光谱的灯等普通光源代替价格昂贵且波长单一的激光作为 光源，而这种光源可通过单色器提供连续波长的入射光，并通过普通荧光分光光 度计同步扫描而得到完整地r r s 光谱，为研究r r s 光谱特征创造了更好的条件， 使用廉价的仪器也加快了这一技术的普及和推广。( 3 ) 有更好的选择性。由于r r s 强度不再与矿成正比，其散射光谱特征直接受到吸收光谱的影响，具有不同吸收 光谱的分子会出现彼此不同的r r s 光谱特征和相应的峪峰，因此较单一的瑞 利散射具有更好的选择性。( 4 ) 共振瑞利散射对于大分子非键作用，如缔合、聚 集、偶极偶极作用和长距离组装等非常敏锐，对于生物大分子的测定、表征及反 应历程的研究极为有利，同时静电作用、疏水作用以及电荷转移作用对于i 汛s 强 度和光谱特征有重要的影响，这就为通过离子缔合反应应用r r s 技术测定痕量金 属、非金属、有机化合物和药物等奠定了基础。 1 1 4 共振瑞利散射的分析应用及其发展前景 2 0 世纪3 0 年代，p l a z e k 在预测共振r 锄a 1 1 散射的同时预测了有共振r a y l e i 曲 散射现象的存在。但到1 9 7 5 年才由b a u e r 等人发现并用于研究二苯基卟啉。8 0 年代以后m i l l e r 利用宏观波动理论对其进行了理论研究。而a n g h s t e r 等人对该理 论进行了修正，使共振瑞利散射理论进一步得到完善。1 9 9 3 年p a s t 锄a c k 等首次 在荧光分光光度计建立了共振光散射技术，并用该技术研究卟啉类化合物在核酸 分子上的j 型堆积，率先此技术用于核酸的研究和检测1 6 】，随后的研究显示出该 方法在生物大分子的识别、组装、超分子排列【_ 卜9 】以及多个分析领域的应用前景很 好，激起国内分析工作者的浓厚兴趣和广泛关注。 在我国，刘绍璞教授等率先研究小分子之间静电引力、疏水作用和电荷转移 作用形成离子缔合物而产生的强烈共振瑞利散射信号，从另一角度丰富和拓展了 研究内容。目前，共振瑞利散射技术已成功的应用于生物大分子，如蛋白质【1 0 。1 4 j ， 核酸 1 5 - 2 0 1 的研究；测定了十几种金属离子【2 l - 2 4 1 和非金属离子【2 5 - 2 7 】；药物，维生素 抗生素2 9 3 0 1 ，( 如v b l 等) 和一些天然药物【3 1 3 2 1 的分析应用；以及表面活性剂和 有机物分析；也可用于液相纳米粒子【3 3 - 3 7 】的分析和表征以及某些物理化学参数 【3 8 3 9 】的测定。 自1 9 9 3 年以来，共振瑞利散射技术由于灵敏度高、仪器简单便宜，已得到了 广泛的应用，荧光仪和别的分析仪器的联用也得到了较好的发展，如：共振散射 技术与流动注射联合使用分析测定肝素；共振散射技术和高效液相色谱和毛细管 电泳仪的联用。随着科学研究和分析技术的不断发展，目前所使用的仪器，在狭 缝过宽的情况下，共振瑞利散射光谱中存在动态的成分，且不利于光谱精细结构 4 西南大学硕士学何论文 第一部分文献综述 的研究。如果狭缝过窄，虽然可能得到较为纯净的共振瑞利散射增强信号，但由 于氙灯发出的能量小，检测器检测到信号较弱，影响分析方法的灵敏度。在激光 技术进一步发展后，有望采用大些功率的激光光源进行光谱精细结构研究，并进 一步提高检测的灵敏度。同时，虽然共振瑞利散射技术得到了广泛的应用，但对 其产生机理的研究还有很多不够清楚的地方，一些实验现象和结果还不能得到很 好的解释，因此，该技术要得到进一步的完善和成熟，就必须还有很多工作要做， 相信在这些未知领域能得到更清楚的认识后，共振瑞利散射技术会更加完善并得 到更为广泛的应用。 1 2 多糖的药理作用和常用分析方法 1 2 1 多糖的药理作用 糖类是绿色植物光合作用的产物，是动植物所需能量的重要来源。根据其能 否水解以及水解产物的多少，可以分为单糖、二糖和多糖等几类h 引。多糖是存在 于自然界的醛糖和( 或) 酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物( 一般1 0 个以上) 。它 一般都是天然高分子化合物，是一切有生命的有机体必不可少的成分。多糖包括 活性多糖和膳食纤维两大类。活性多糖专指具有某种特殊生物活性的多糖化合物， 如真菌多糖、植物多糖和壳聚糖等，从2 0 世纪6 0 年代以来人们发现多糖对肿瘤、 肝炎、心血管、抗衰老等方面有独特的生物活性，且细胞毒性极低h 。越来越多 的研究证明：多糖不但能治疗机体免疫系统受到严重损伤的肿瘤，还能治疗多种 免疫缺损疾病如慢性病毒性肝炎和某些耐药细菌或病毒引起的慢性疾病等。有的 多糖可诱生干扰素。众多天然药物的药理活性与糖及其衍生物关系密切，尤其是 很多多糖、糖与非糖物质结合的苷类等具有明显的生理活性h 羽。 自然界中糖和糖苷类有效成分不胜枚举，如：茶叶、芦荟、山药、当归、黄 芪等均含有大量糖类h 州引。抗肿瘤多糖结构研究表明，从菌体中提取的活性多糖一 般由葡萄糖组成，而且葡萄糖链上的q l ，3 苷键和支链上的b 一1 ，6 苷键是抗肿瘤 所必需的。如从猪苓菌种的菌体中分离得到多种多糖级分，其抗肿瘤活性部分是带 1 呻6 支链的p ( 1 ，3 ) - d 葡聚糖h 别；从香菇中提取到的抗肿瘤多糖，也是由p 1 ，3 苷键 结合的直链葡聚糖构成。一些多糖的活性与其中是否含有某些化学基团有密切的 关系，而这些化学基团可通过人为的化学反应来添加和消除。所以，多糖的结构修 饰已成为提高多糖的活性和研究多糖构效关系的有力手段。将多糖进行衍生化，如 降解、硫酸化、磺酰化、棕榈化、二乙基氨基乙基化、碘化、氨化等在多糖分子 修饰中也有运用h 。多糖常因分子质量大、粘度高、溶解度低等影响其应用。多 糖降解是解决这一问题的有效途径。多糖降解多用酸、过碘氧化水解等化学方法。 两南大学硕士学位论文第一部分文献综述 多糖分支与活性的关系并不是一种线性关系，分支度适中的多糖往往具有较高的 活性，而分支度过高或过低的多糖其活性都有限。活性很强的裂褶菌多糖和香菇多 糖仅在c 一6 上有分支，分支度为o 3 3 。另一些活性多糖的分支度分布为o 7 5 o 0 4 ， 变化范围较大。由此可见，分支度大小与多糖生物活性紧密相关，分支度过大或过 小都无法使多糖生物活性达到理想状态。多糖生物活性与化学结构关系的深入研 究发现，二者不仅是建立在多糖分子的一级结构基础上，且还与多糖分子的超级结 构即空间构象有关。研究结果表明：高分子质量的p 1 ，3 d 葡萄糖的高度有序结构 ( 三股螺旋) ，对于免疫调节活性至关重要。只有分子质量大于9 1 0 4 的分子才能形 成三股螺旋。三股螺旋结构靠b 一葡萄糖苷的分支来稳定。低分子质量( 小于5 1 0 4 ) 的裂褶菌多糖既无三股螺旋也无抗肿瘤活性。 尽管人们在1 9 世纪就已认识到糖是生物体中最重要的成分之一，但由于其结 构的复杂性和研究手段的局限性，使糖的研究远滞后于蛋白质和核酸。主要反映在 多糖的结构与功能的关系还不清楚，多糖在体内的作用机理大多未知。多糖作为一 类重要的生物活性物质，到目前为止，虽然只有云芝多糖、猪苓多糖、香菇多糖、 裂褶多糖、茯苓多糖等少数应用于临床，但它们在肮肿瘤、抗凝血、抗突变、降血 脂、抗衰老、抗病毒等h 9 5 1 3 疑难病症的治疗方面已显示了诱人的前景。近些年来， 我国科技工作者在多糖的研究中，特别是真菌多糖和传统的中药多糖研究中取得 可喜的成果。但是，国内多糖的研究一般仅限于分离纯化、化学组成、生物活性和 免疫药理研究，糖结构的分析和多糖的检测手段都没有得到很大突破。 1 2 2 多糖的常用分析方法 用于糖含量常规检测的方法有很多，早在上世纪4 0 5 0 年代，对糖含量测定 方法已进行了众多的研究。目前最常用的中性糖含量测定是利用多糖在强酸性条 件下脱水生成糠醛或其衍生物，然后再与酚类或胺类化合物缩合，生成有特殊颜 色的物质的这一性质进行测定，这类方法有地衣酚一硫酸法、苯酚硫酸法和葸酮一 硫酸法。苯酚一硫酸法是用得较多的方法，苯酚一硫酸试剂可与游离的寡糖、多糖 中的己糖、糖醛酸起显色反应，己糖在4 9 0n m 处有最大吸收值，吸收值与糖含量 呈线性关系。此法是先用标准糖制作标准曲线后，再通过糖的显色反应测定吸光 度，然后根据其在曲线上的位置推算出糖的浓度从而推算其含量。此法操作简单、 快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅需制作一条标准曲线。葸酮一硫酸法是另一种 常用的方法，其原理是利用糖类遇浓硫酸脱水后生成糖醛或其衍生物，可与葸酮 试剂缩合，反应后溶液呈蓝绿色，于6 2 0 啪处有最大吸收，显色深度与多糖的含 量呈线性关系。但这些方法在实际测多糖的工作中，特别是在测定天然产物中的 6 两南大学硕十学位论文 第一部分文献综述 多糖含量时，发现测得结果常常与实际情况不符晡别。 糖胺聚糖( g a g ) 是多糖中的重要的组成，它是一类由重复的二糖结构单元组 成的带有负电荷的长链大分子隅3 鲫。作为蛋白聚糖的一部分，广泛存在于脊椎动物 组织的细胞外基质中。常见的g a g 有透明质酸( h a ) 、硫酸软骨素( c s ) 、硫酸皮 肤素( d s ) 、硫酸角质素( k e p s ) 和肝素及硫酸乙酰肝素( h 印) 6 种。研究表明：糖 胺聚糖具有许多方面的生物活性，多数无毒，是比较理想的药物喳溯1 ，比如：肝素具 有抗凝血作用，在血渗析和体外血循环中起到防止血液凝固的作用，还可防止血栓 生成。硫酸软骨素具有特殊的免疫抑制作用，还可防止动脉粥状硬化，并在临床上 用于治疗风湿痛、关节炎、神经痛及腰痛。透明质酸可增加关节间的润滑性，在剧 烈运动时起减震作用，使关节免受伤害。近年来，糖胺聚糖( g a g ) 的功能研究取得 了长足的进步，同时也对糖类分析测定提出了新的挑战。对糖胺聚糖的分析测定方 面的研究进展如下： 1 分子光谱法 分子光谱法由于其仪器简便、易操作、能够对分子结构进行表征而成为研究 小分子与大分子结合反应及对生物大分子进行定量分析的重要手段。由于糖类分 子中既没有吸光基团也没有发光基团，给直接利用分子光谱法测定糖类带来了困 难，普遍采用的是向缺乏明显的光学性质的体系中加入光谱探针( 如染料) ，令体系 具有某种光学性质，继而可以采用分子光谱法进行研究。由于有机染料较易得，而 且稳定、廉价，因此染料结合法成为分子光谱研究多糖的首选方法，并在实际应用 中取得了很大成功。 1 1 荧光分析法( f 1