（高分子化学与物理专业论文）类风湿关节炎免疫吸附的制备及性能研究.pdf

南开大学顿士研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制备及rt 能研究 ab s t r a c t r h e u m a t o i d a rt h r i t i s ( r a ) i s a k in d o f a u t o i m m u n e d i s e a s e w h o s e p a t h o l o g y a n d m e c h a n i s m r e m a i n u n c l e a r . s e l e c t i v e r e m o v a l o f r h e u m a t o i d f a c t o r s ( r f ) b y i m m u n o a d s o r p t i o n t h r o u g h h e m o p e r f u s i o n i s p r o v e d t o b e a n e f f e c t i v e t h e r a p y f o r r a . t h e p r e s e n t w o r k i s a i m e d a t p r e p a r a t i o n o f n e w i m m u n o a d s o r b e n t s f o r r a . t h e a g a r g e l - c a r r i e r i m m u n o a d s o r b e n t , w h i c h i s a c t i v a t e d b y e p i c h l o r o h y d r i n , c o u p l e s l - p h e a n d l - t 甲as l i g a n d s . e l i s a i s u s e d t o d e t e c t a b s o r b in g r a t e f o r i g g r f , i g mr f a n d i g a r f . t h e r e s u l t s o f r e s e a r c h s h o w t h a t , t h e o p t i m a l a c t i v a t i n g c o n d i t i o n f o r 2 0 - 4 0 m e s h a g a r g e l - c a r r i e r i s l o o g a g a r g e l t o r e a c t w it h l m l e p i c h l o r o h y d r i n a n d 2 m l 1 .2 5 m n a o h s o l u t i o n s f o r 3 h o u r s a t 3 0 0c . t h e o p t i m a l a c t i v a t i n g c o n d i t i o n f o r a g a r g e l - c a r r i e r w h i c h i s s m a l l e r t h a n 4 0 m e s h i s l o o g a g a r g e l t o r e a c t w i t h 2 m l e p i c h l o r o h y d r i n a n d 3 m 1 2 m n a o h s o l u t i o n s f o r 3 h o u r s a t 3 0 0c. t h e o p t im a l a c t i v a t i n g c o n d i t io n f o r a c t i v a t e d c a r r i e r t o c o u p l e l - p h e a n d l - t r p i s l o o g a c t i v a t e d c a r r i e r t o r e a c t w i t h 4 m l l - p h e / l - t r p s o lu t i o n s w h o s e p h i s 1 0 . 8 7 a n d c o n c e n t r a t i o n i s l o g / 1 f o r 5 h o u r s a t 7 0 0c . u n d e r t h e o p t i m a l a c t i v a t i n g a n d c o u p l in g c o n d i t i o n s , t h e a b s o r b i n g r a t e s o f l - p h e - l i g a n d - a d s o r b e n t f o r i g g r f , i g mr f a n d i g a r f i s a r o u n d 7 0 % , 4 0 % , 7 0 % r e s p e c t i v e ly . f o r l - t r p - l i g a n d - a d s o r b e n t , t h e s e a b s o r b in g r a t e s i s a r o u n d 6 0 % ,4 5 % , 5 0 % r e s p e c t i v e l y . t h e r e s e a r c h a l s o s h o w s t h a t , t h e d e s i c c a t e d i m m u n o a d s o r b e n t s h a v e s i m i l a r a b s o r b i n g r a t e s f o r r a w h e n s w e l l e d b y s o l v e n t . k e y w o r d s : i mmu n o a d s o r b e n t l - p h e n y l a l a n i n e rh e u ma t o i d ar t h r i t i sr h e u ma t o i d f a c t o r s l - t ry p t o p h a na g a r g e l 南开大学硕 卜 研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制备及性能研究 第一章 前言 第一节类风湿关节炎及类风湿因子 一、自身免疫疾病 自身免疫疾病是指以自身免疫反应导致组织器官损伤和相应功能障碍为主要发病 机制的一类疾病， 他的确切病因还不很清楚。 通常高等动物的免疫系统具有识别“ 自己” 和 “ 非己”抗原物质的能力，机体对非己抗原发生免疫排斥，对自 身抗原呈自身耐受。 自身耐受是由免疫系统通过多种机制主动调节来维持的， 以保证身组织细胞成分不致遭 受免疫反应的攻击而造成损伤。在某些情况下，自身耐受性遭到破坏，免疫系统对自 身 组织成分产生了明显的免疫应答， 即在自 身体内产生了针对自 身组织成分的抗体或致敏 淋巴 细胞， 称为自 身免疫。自 身免疫在很多情况下是属于生理性的，因为在一定限度内 的的自 身免疫反应有助于清除体内衰老蜕变或畸形的自身细胞成分， 并且对免疫应答反 应起着调节作用。 但在自身免疫反应超越了生理的极限或持续过久， 就会造成自身组织 损伤和相应的功能障碍。导致疾病发生。 根据自 身免疫反应对组织器官造成损伤的范围， 通常将自身免疫疾病划分为 “ 器官 特征姓” 和 “ 非器官特征性 ( 全身性) ” 两大类 ( 表1 . 1 0 ) o 自 身免疫疾病作为一类独立的 疾病临 床诊断具有下列的共同 特点z 7 , 1 .患者体内经常出现高滴度的自身抗体和( 或) 能与自 身组织成分起反应的致 敏淋巴细胞。 2 .组织器官的病理性质损失和相应的功能障碍。 3自 身免疫疾病常可在动物中复制出类似的疾病模型， 或者通过患者血清或淋 巴细胞注入正常动物而引起相应的疾病表现。 4 .除少数继发行自身免疫疾病( 如药物所致的免疫性溶血性贫血和血小板减少 症，某些慢性活动性肝炎)外，大多数自 身免疫疾病的病因不明。 5 . 自 身免疫反应的强度与自 身免疫疾病的病情密切相关。 6 . 自 身免疫疾病的临床过程经常呈现反复发作和慢性迁移的过程。 7 . 发病率女性高于男性，有一定的遗传倾向性。 南开大学硕 l 研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制各及性能研究 原和抗体之间的识别作用，吸附清除致病的抗原或抗体。 根据吸附剂和被吸附物质之间的作用原理， 可将吸附剂分为两大类: 一类为生物亲 合吸附剂， 主要包括抗原固定型、 抗体固定型、 c l q 型和蛋白a型等 ( 表1 .4 ) ;另一 类 为物理化学亲合吸附剂，主要包括静电结合型和疏水结合型等 ( 表1 .5 ) 。生物亲合吸附 剂依赖于固定的免疫特异性配体，具有特异性高、吸附容量大等优点。但容易失活，与 血液接触可能产生副作用。 物化型亲合吸附剂的选择性相对较差， 但使用安全性高、 可 灭菌、能稳定储存。 表 1 .4生物亲合型吸附剂 吸附剂类型吸附剂应用 抗原固定型 p e t纤维固定d n a治疗系统性红斑狼疮2 5 1 血 小 板 第 九 因 子 ix - s e p h a r o s e 6 b 治疗血友病2 6 1 抗体固定性 抗猪l d l抗体 - s e p h a r o s e c l 4 b 治疗家族性高胆固醇血 症2 7 1 但克隆抗 i g e 抗体 - s e p h a r o s e c l 4 b 治疗哮喘病2 8 1 补体固定型 c l q - v t 清除系统性红斑狼疮 血 清中 免 疫复 合 物2 9 1 蛋白a型 a蛋白 一 s e p h a r o s e c l 4 b 治疗系统性红斑狼疮 和 肿瘤 3 0 1 s p a 一 火棉胶一 活性炭乳腺癌3 1 1 表1 . 5物化亲合型吸附剂 吸附剂类型吸附剂应用 静电结合型 人工合成的聚阴离子 化合物一 磺化葡聚糖 低密度脂蛋白 吸附剂3 2 1 疏水结合型 聚乙 烯醇凝胶固定色 氨酸 治 疗类风湿性关节炎3 3 1 南开大学硕十研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制备及性能研究 聚乙烯醇凝胶固定苯 丙氨酸 治 疗系统性红斑狠疮3 4 免疫吸附剂疗法以其独特的优越性在临床上得到较大的应用， 在治疗自 身免疫疾病 方面取得显著疗效。免疫吸附疗法与药物疗法相结合，疗效更好。 二、免疫吸附剂治疗类风湿关节炎 免疫吸附剂的高选择性合高吸附容量，使其在治疗 r a ，尤其是活动期合重症 r a 患者上的研究得到开展。 同血浆交换法相比，免疫吸附 疗法治疗类风湿性关节炎具有下列优点3 5 1 . 表 1 . 6 免疫吸附疗法与血浆交换疗法的比较 血浆交换法免疫吸附疗法 无选择性，在去除致病因子的同时， 血液中的有效成分也遭到损失 具有吸附选择性，对血浆中有效成分 吸附低 由于血液制品的使用，在患者体内引 入外源性物质，增加了其它疾病的感染机 a 病人自身血浆可以回收，不引入外源 物质，可避免一些感染性疾病的发生 血液制品用量大，价格昂贵费用相对较低 免 疫吸附 疗法通过体外血液灌 流治 疗r a始于1 9 8 2 年。 y a m a z a k i 3 3 研制成功聚乙 烯醇凝胶一 色氨酸免疫吸附剂 ( i m- t r ) 和聚乙烯醇一 苯丙氨酸免疫吸附剂 ( t m- p h ) 。 将 i m- t r用于临床，成功地治疗了四例类风湿关节炎患者。 1 9 8 4 年， y a m a z a k i 3 6 用i m - p h对1 3 例r a及s l e 患者 进行了2 8 次临 床灌流治 疗。 其中八例为r a，治疗后，患者关节疼痛减轻，r f 也有了不同程度的减少。 1 9 9 0 年， k o l d 3 1 1用 戊 二 醛 溶 液 对i g g 进 行 化 学 交 联， 合 成i g g聚 合 体。 体 外 吸 附 实验表明，该聚合体对r f 的清除率高达9 4 %。由于形成的聚合物过于细小，该吸附剂 并不适于临床应用。 1 9 %年， j o s e p h 3 1 1将a蛋白 共 价 键 联 到 硅 胶 球上， 制 成r a免 疫 吸附 剂， 通 过血 浆 灌 流吸附 清除i g g r f 及免疫复 合物。 经多次 灌 流之后， 患者 体内i g g r f 的活 性大大降 低。 1 9 9 7 年， r a m l o w报道了以 琼脂糖凝胶为载体， 化学键联蛋白a制备r a免疫吸附 1 4 南开大学硕士研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制备及性能研究 剂的研究及其临床应用。 用该吸附剂对r a患者进行连续十几次的灌流治疗后，患者血 浆中i g g r f . i g m r f , i g a r f 几乎 全部 被清除。 国内， 余耀庭、陈长治 3 9 ,4 0 等人从9 0 年代初开始从事r a免疫吸附剂的研究工 作。1 9 9 5 年，该小组以包埋d s d n a 一 炭化树脂免疫吸附剂对两例病程超过5 年的r a患 者进行了全血灌流。治疗后，患者关节疼痛减轻，胸闷、发热等症状明显缓解，r f检 测结果 转阴， 激素用量减少了2 / 3 , 6 个月后未出 现反弹现象4 1 1 第三节 研究课题的提出及实验设计 类风湿关节炎的发病率高， 严重威胁人类健康。 但由于病因及病例过程尚不完全清 楚，目前还没有满意的疗法。对r a免疫吸附剂吸附效果的研究充分肯定了免疫吸附疗 法对降低患者血清中 r f ,减轻病人痛苦的作用。免疫吸附疗法在临床上己取得较好的 疗效，但总的来说，r a免疫吸附剂的研究还进行得较少。已有的吸附剂在 r f的清除 率、选择性等方面都存在需要改进和提高的地方。 八十年代初以来， 我们课题组一直致力于吸附剂的研究， 先后研制和开发了多种血 液净化解毒吸附剂和免疫吸附剂。 本论文的工作就是在本课题组的技术优势下， 研制筛 选出新型高效的r a免疫吸附剂，进而希望在临床上得到应用。 作为生 物医学材 料应该 满足下列 一般要求4 2 1 . 1 .材料必须符合“ 医用级” 标准， 即满足无毒、 无热源反应、 不致畸、 不致癌、 不引起过敏反应或干扰肌体的免疫机制 等条件。 不损害临近组织和具有良好的血液相容性 良 好的生物稳定性。 良 好的机械性能。 4 .便于灭菌、消毒。 对于免疫吸附剂，还应该满足对去处物质有高的亲合选择性和特异性、血液灌流 过程中不发生配基泄漏、不破坏血细胞、不溶血和凝血等。 在制备r a免疫吸附剂的过程中，以 满足上述条件为基础， 将综合考虑吸附剂的特 异 性、 高 效 性 合 安 全 性 等因 素， 从 载 体、 配 基 等 方 面 入手， 研 制新 型r a免 疫吸 附 剂。 在载体方面， 选择琼脂凝胶作为载体。 琼脂凝胶为天然生物材料，具有非常好的生 物相容性，载体容易成型，容易活化。琼脂的主要成分是琼脂糖，它是一种天然多糖， 由s - d - ( 1 - - - 1, 4 ) 糖 昔 键 相 连 的d 一 半 乳 糖 单 元 和由“ - l - ( 1 - 1, 3 )糖昔键相连的 3 , 6 一 脱水一 l - 毗喃半乳糖单元组成。其分子结构为左手双螺旋结构，含有一个三倍于螺 南开大学硕士研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制备及性能研究 旋的轴，轴距为1 . 9 n m，其间可容纳水分子，是公认的优良医用吸附剂载体材料。 g h , o h 9 h , o h 9 队， 一o o h 日 卜争 hn。 球形 琼脂凝 胶具有下列 优良 的 性能 4 3 1 . 1 .化学稳定性:不溶于水和绝大多数有机溶剂，耐酸碱，有较好的热稳定性。 2 .亲水性:由于分子链上有大量经基，因此具有很强的亲水性。 3 .机械强度:具有良 好的力学性能，耐压性好， 适于血液灌流操作。 4 .化学反应功能:分子链上有大量羚基，具有良好的化学反应活性。 载体的活化采用环氧氯丙烷活化法，环氧活化法具有很多优点: 1 .通过稳定的醚键和配基上的氨基键将配基偶联在载体上， 制成的吸附剂稳定 性好。 2 .活化过程中引入的键合臂是亲水性的，与基制本身性能相似。 3 。活化效率高 4 .对载体进行活化的同时，可发生部分交联反应，提高载体的机械强度。 在配基选择上，我们选用 l 一 苯丙氨酸和 l 一 色氨酸作为吸附配基，主要通过配基和 r f之间的疏水性作用达到去除致病因子的目的。配基的非极性基团与极性的体液形成 界面，受体的非极性基团也于极性的体液形成界面。体系的能量与界面的大小成正比， 由体液包围的非极性界面越大，则能量越高。当两个基团互相靠拢，将界面的极性体液 排开，即发生缔合，此时界面较小，能量释放，这种缔合即为疏水作用。 南开大学硕上 研究生毕业论文 类风湿关节炎免疫吸附剂的制备及性能研究 受 体 ? 。 ? 配基一 受体非极性链的疏水作用 ( 表示水分子) 采用l 一 苯丙氨酸和l 一 色氨酸作为配基有如下优点: 1 .偶联量高， 苯丙氨酸和色氨酸的反应基团能够同活化载体上的环氧基团进行 比较容易的反应，制成的吸附剂上氨基酸配基含量高。 2 .吸附量高:通过自身的疏水基团，苯丙氨酸和色氨酸可以同r f上的疏水位 点进行比较强的缔合作用，从而实现较高的吸附量。 3 .稳定性强:氨基酸通过c -n键同环氧基团键合，制成的吸附剂稳定性高， 易于储存。 4 .安全性高: 本吸附剂采用的配基氨基酸为人体所需营养成分， 在血液灌流时 产生的副作用小， 相对于以 热聚i g g为配基的吸附剂来说， 对人体无毒副作用，易 于运输储存，可以进行高温灭菌。 5 . 操作简便，成本低。 南开大学硕十研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制备及性能研究 第二章 琼脂凝胶载体的制备研究 第一节实验部分 一、实验试剂与材料 琼脂粉进口分装中国新兴化工试剂研究所 三氯甲烷分析纯天津市化学试剂一厂 甲苯分析纯天津市化学试剂一厂 吐温 8 0分析纯天津市化学试剂三厂 二、仪器 h y c 恒温摇床中国科学院武汉科学仪器厂 三、实验方法 琼脂凝胶载体的制备: 向装有搅拌装置的三口 瓶中加入 1 5 0 m l 甲 苯、5 0 m l 三氯甲 烷和 i m i 吐温8 0 ，升温 至 6 0 0c。 称取 l o g 琼脂粉于烧杯中，向 其中加入9 0 m 1 蒸馏水， 在高压灭菌锅中将琼脂粉溶 解成溶液。 将琼脂粉溶液趁热缓慢倒入三口瓶中， 调节并固定搅拌速度，使琼脂溶液在 有机相中分散成大小适宜的液滴。 待分散均匀后 ( 约 1 5分钟) 撤去水浴，在室温下 搅 拌使体系自 然冷却。 待体系冷却后， 倾倒去上层有机溶剂， 用大量自 来水冲洗合成的球 状琼脂凝胶载体， 筛选出所需目 数的载体 ( 2 0 - 4 0目，小于4 0目，大于2 0目) ，再用蒸 馏水洗涤数次，4 冰箱中湿态保存。 第二节结果与讨论 琼脂凝胶载体的制备是采用悬浮凝胶化方法， 以甲苯和三氯甲烷混合液为有机分散 相，吐温 8 0为分散剂，搅拌下使热的琼脂溶液在有机分散相中分散成一定大小的球状 液滴， 冷却后固化而得。 有机相的比重、 搅拌速度、 琼脂溶液的 浓度等因素对载体的 合 成都产生了影响。 一、琼脂溶液浓度对自 体含水率的影响 合成了不同含水率的几种琼脂凝胶载体，如表2 . 1 所示: 南开大学硕 卜 研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制备及性能研究 第三章 琼脂凝胶载体活化过程的研究 第一节 实验部分 一、实验试剂 氢氧化钠分析纯天津市化学试剂一厂 环氧氯丙烷分析纯天津市化学试剂一厂 硫代硫酸钠分析纯天津市历特吉尔环保技术研究所 浓盐酸分析纯天津市文达稀贵试剂化工厂 酚酞标准试剂天津市石英钟厂坝县化工分厂 二、仪器 h y c型恒温摇床中国科学院武汉科学仪器厂 三、实验方法 在锥形瓶中加入1 .0 鲍湿态琼脂载体， 分别加入n a o h溶液和环氧氯丙烷， 在恒温 摇床中3 0 下震荡 ( 1 3 0 转/ 分钟) 反应3 小时， 用蒸馏水淋洗至中性， 用含有酚酞指示 剂的 1 .3 m硫代硫酸钠溶液检测流出液，若流出液不变红，则证明未反应的环氧氯丙烷 己被洗净。 载体环氧量的测定方法: 取l o o g 活化的琼脂凝胶载体， 加入3 .0 m 1 1 .3 m的 硫代硫 酸钠溶液，室温下反应 1 2 小时左右，用0 .0 1 m标准盐酸滴定，体系由红色变为无色便 为滴定终点，通过消耗的标准盐酸体积计算活化载体上的环氧量 ( e p v) i其原理如下 c h - c h 2 +2 n a + 5 2 0 2 -s 2 3 + h 2 o- c h - c h 2 - 5 2 0 3 _ +2 n a * + o h o 日 一 + 日 + 一h 2 o v ( h c l消耗的体积)x m ( h c l摩尔浓度) 环氧基含量= 琼脂凝胶载体质量 第二节 结果与讨论 、2 0 -4 0目 琼脂载体的活化研究 1 .反应时间对6 %琼脂凝胶载体环氧化的影响 南开大学硕士研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制备及性能研究 第四章 活化琼脂载体偶联 l 一 苯丙氨酸和 l 一 色氨酸的研究 第一节 实验部分 一、实验试剂 l 一 苯丙氨酸分析纯上海生工 l 一 色氨酸分析纯上海生工 氢氧化钠分析纯天津市化学试剂三厂 硫代硫酸钠分析纯天津市天大化工实验厂 碳酸纳分析纯天津市塘沽新华化工厂 碳酸氢纳分析纯天津市华东试剂厂 氯化钾分析纯天津市化学试剂一厂 酚酞标准试剂天津石英钟厂坝县化工分厂 浓盐酸分析纯 二、仪器 h y c型恒温摇床中国 科学院武汉科学仪器厂 7 5 2 c紫外可见分光光度计上海第三分析仪器厂 p h s - 3 c型精密p h计上海雷磁 三、实验方法 1 . l 一 苯丙氨酸和l 一 色氨酸浓度一 吸光度标准曲线的测定 使用万分之一电子分析天平精确称取不同质量的 l 一 苯丙氨酸和 l 一 色氨酸，定容于 2 5 0 m 1 容量瓶之中，配制成系列浓度的l 一 苯丙氨酸和l 一 色氨酸溶液，在2 5 7 n m下测定 其紫外吸光度，绘制吸光度 ( o .d)一 浓度标准曲线。 2 .活化琼脂载体偶联l 一 苯丙氨酸、l 一 色氨酸 在锥形瓶中加入l o o g 环氧活化琼脂载体， 在加入l 一 苯丙氨酸/ l 一 色氨酸溶液， 恒 温振荡反应数小时。 用蒸馏水洗脱反应后的琼脂载体， 收集洗脱液， 直至洗脱液在2 5 7 n m 下不再有紫外吸收为止。 记录洗脱液体积， 测定其在2 5 7 n m下的紫外吸光度， 计算l - 苯丙氨酸、l 一 色氨酸的偶联量。 加入l - 苯丙氨酸/ l 一 色氨酸的摩尔数 一 洗脱液中l 一 苯丙氨酸/ l 一 色氨酸的摩尔数 偶 联 量 -一_ 活化琼脂载体的 质量 4 0 南开大学硕上研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制备及性能研究 第二节 结果与讨论 一、2 0 - 4 0目 活化琼脂载体的l 一 苯丙氨酸/ l 一 色氨酸偶联反应 1 . l 一 苯丙氨酸浓度一 吸光度标准曲线的绘制 准确配制浓度为0 .4 0 5 6 , 0 . 8 0 8 4 , 1 . 2 0 4 8 , 1 .6 0 0 0 , 2 .0 0 5 2 g / 1 的l 一 苯丙 氨酸水溶液， 在2 5 7 n m下测定其紫外吸光度， 绘制浓度一 吸光度标准曲线。 结果如表4 . 1 和图4 . 1 所示: 表4 . 1 l 一 苯丙氨酸浓度一 吸光度关系 组份 l 一 苯丙 氨酸浓度 ( g / i ) 吸光度 门、6气月u 今乙，j，乙07 月片n八269 -.: 八unlll 0 . 4 0 5 6 0 . 8 0 8 4 2 0 4 8 6 0 0 0 2 . 0 0 5 2 y=0 . 9 9 9 6 x r 2 二0 . 9 9 9 2 八乙q白0八匕4c乙且0八o4n乙nu . q1111八u00八曰 1比侧锐翻球冠塔1司 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 1 . 2 1 . 4 1 . 6 1 . 8 2 2 . 2 吸光度 图4 . 1 l 一 苯丙氨酸浓度一 吸光度标准曲 线 由图4 . 1 可知， l 一 苯丙氨酸浓度同吸光度之间的关系式为: 浓度 ( g/ 1 ) 一 。 .9 9 %吸光 度，标准方差= 0 .9 9 9 2 0 41 南开大学硕七 研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制备及性能研究 2 . l 一 色氨酸浓度一 吸光度标准曲 线的绘制 准确配制浓 度为0 .0 1 8 0 , 0 .0 3 5 1 , 0 .0 5 1 0 , 0 .0 6 6 8 , 0 .0 8 5 4 g / 1 的l 一 苯丙 氨酸水 溶液， 在2 5 7 m n下测定其紫外吸光度， 绘制浓度一 吸光度标准曲线。 结果如表4 .2 和图4 .2 所示: 组份 l 一 色氨酸浓度 ( g / 1) 0 . 0 1 8 0 0 . 0 3 51 0 . 0 5 1 0 0 . 0 6 6 8 0 . 0 8 5 4 吸光度 0 . 2 7 9 0 . 5 2 1 0 . 7 4 7 0 . 9 9 2 1 . 2 2 8 inlllwv 0 . 1 0 . 0 8 y ， - 尺 0 . 0 6 8 4 x 0 . 9 9 9 1 0 . 0 6 (之国侧说翻场司1司 t. 0 . 0 4 0 . 0 2 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 11 . 2 1 . 4 吸光度 图 4 .2 l 一 色氨酸浓度一 吸光度标准曲 线 由图4 .2 可知，l 一 色氨酸浓度同吸= 0 .0 6 8 4 吸光度，标准方差= 0 .9 9 9 1 0 3 体系p h值对环氧化琼脂载体偶联l 一 苯丙氨酸的影响 以 p h值为 9 .2 ,9 .8 , 1 0 .4 , 1 0 .8 , 1 1 .3 , 1 1 .8的 n a c 0 3 - n a r c 0 3 缓冲溶液和 p h值为 1 2 . 3 , 1 2 .6 , 1 3 .0 的k c l - n a o h缓冲溶 液作为 溶剂， 配制l o g / l 的l 一 苯丙 氨酸 溶液。 在九支锥形瓶中加入1 .0 0 g 2 0 - 4 0目 环氧化琼脂载体 (m0 0 g 琼脂载体，l o m l 环氧 氯丙烷， 2 .o m l l .2 5 m n a o h , 3 0 0c 1 3 0 转 / 分钟的 摇床中反应3 小时) ，向 其中加入配制 好的 不同p h值的l o g / l l 一 苯丙 氨酸溶 液4 m l ， 在3 7 摇床中 ( 1 3 0 转 / 分钟) 振荡反 应 4 0 小时。测定计算l 一 苯丙氨酸偶联量，结果如表4 .3 和图4 .3 所示: 南开大学硕十研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制备及性能研究 表4 .3不同p h值 ( 9 .2一 1 3 .0 )的反应体系对环氧化琼脂载体偶联l 一 苯丙氨酸的影响 组份p h洗脱液 ( m i ) 洗脱液。d . l 一 苯丙氨 酸偶联量 ( u m o l/ g ) 0 . 1 4 4 0 . 1 5 6 0 . 1 5 0 0 . 1 3 0 0 . 1 6 8 0 . 1 6 0 0 . 1 6 6 0 . 1 5 5 0 . 2 6 0 6 7 . 8 6 5 3 . 3 4 6 0 . 6 0 8 4 . 81 2 8 . 6 5 4 8 . 5 0 41 24 5 4 . 5 5 8 4 . 81 nu乃u00nu八曰n曰on 0000弓.卫八u000 22，222，121 9298104108113115123126130 iniliivvvivll姗ix 尸l月|r.lesl士.il 妙侣启蕊叫签毕盛喊杖漪山 9 9 . 51 0 1 0 . 5 1 1 1 1 . 5 1 2 1 2 . 5 1 3 1 3 . 5 p h 值 图 4 .3 p h 值对环氧化琼脂载体偶联l - 苯丙氨酸的影响 4 . 环氧化琼脂载体在不同浓度的n a o h溶液体系中偶联l 一 苯丙氨酸的 研究 配制20.00g/1的l 一 苯丙氨酸溶液3 m 1 分别同 浓度为0 .0 1 , 0 .0 5 , 0 . 1 0 , 0 .2 0 , 0 .3 0 , 0 .5 0 , 0 .8 0 , 1 .0 0 , 1 .2 5 , 1 . 5 0 m o l / l 的n a o h溶液 6 .o m l 混合均匀， 在从混合液中取出 4 . o m l 加入l o o g 环氧化琼脂载体中( 1 .0 0 g , l o m l 环 氧氯丙 烷， 2 .o m l 1 .2 5 m n a o h , 3 0 1 3 0 转/ 分钟摇床反应3 小时) 。 在3 7 下于摇床中振荡( 1 3 0 转/ 分钟) 反应2 l 小时。 4 3 南开大学顿十研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制备及性能研究 测定计算l 一 苯丙氨酸偶联量，结果如表4 .4 和图4 .4 所示: 表4 .4不同浓度n a o h溶液体系对环氧化琼脂载体偶联l 一 苯丙 氨酸的影响 组份 n a o h ( m o l/ i )洗脱液 ( m l )洗脱液o . d . l 一 苯丙氨酸偶联量( u m o l/ g ) 0 . 0 0 6 70 . 0 9 84 2 . 8 4 0 . 0 3 3 00 . 0 9 64 5 . 2 6 i i i 0 . 0 6 7 00 . 0 9 24 6 . 21 n 0. 1 3 0 00 . 0 8 35 4 . 4 7 v0 . 2 0 0 0 vi 0. 3 3 0 0 0 . 1 0 0 0 . 1 2 0 1 1 11 0 . 5 3 0 00 . 1 1 61 4. 7 4 200200207213200200209200200200 姗 0 . 6 7 0 00 . 1 2 31 2 . 5 9 fx0 . 8 3 0 00 . 1 2 95 33 x 1 . 0 0 0 00 . 1 2 95 . 3 3 nn曰nunnn 匕二j40dc11 的二。落叫苗螟班城杖拼二 0 0 . 1 0 . 20 . 3 0 . 4 0 . 5 0 . 6 0 . 7 0 . 8 0 . 9 1 1 . 1 n a o h浓度( m o l / i ) 图 4 .4 n a o h 溶液浓度对活化琼脂载体偶联l 一 苯丙 氨酸的 影响 4 4 南开人学硕十研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制备及性能研究 5 .体系p h值对环氧化琼脂载体偶联l 一 色氨酸的影响 以p h 值为9 .2 ,9 .8 , 1 0 .4 , 1 0 . 8 , 1 1 . 8 的n a c 0 3 - n a h c o 缓冲溶液和p h 值为1 2 . 3 , 1 2 .6 , 1 3 .0 的k c l - n a o h缓冲溶液作为溶剂， 配制l o g / l 的l 一 苯丙氨酸溶液。 在八支锥形瓶中 加入1 . 0 0 g 2 0 - 4 0目 环氧化琼脂载体 (u .0 0 g 琼脂载体，l o m l 环氧 氯丙烷，2 .o m 1 1 .2 5 m n a o h , 3 0 0c 1 3 0 转/ 分钟的摇床中反应 3小时) ，向其中加入配制 好的不同p h值的l o g / l l 一 苯丙 氨酸溶液4 m l ， 在3 7 摇床中 ( 1 3 0 转/ 分钟) 振荡反应 4 0 小时。计算 l 一 色氨酸偶联量，结果如表4 .5 和图4 .5 所示: 表4 . 5 体系p h值对环氧化琼脂载体偶联l 一 色氨酸的影响 组份p h洗脱液 ( m i )洗脱液o . d . l 一 苯丙氨酸偶联量 ( “ m o l / g ) 5，r，、40061 朽29332771744524 800080828080阶80 今一内、，22，一22 200 、. n，n， in 1 0 . 4 1 0 . 8 1 1.8 1 2 . 3 1 2 . 6 1 3 . 0 5 9 41 6 6 . 0 4 7 0 . 3 8 7 5 . 6 3 3 5 . 1 2 3 1 . 9 4 5 9 . 3 2 7 9 . 4 8 mivvvivn姻 0口n月犷八匕二刁连且njq山 妙一。日tf叫签够班喊因泊 图4 . 5 p h 值对环氧化琼脂载体偶联l 一 色氨酸的影响 1 4 p h 值 从图4 . 3 - 4 . 5 给出的结果可以 看出，体系的p h值对环氧化琼脂载体偶联l 一 苯丙氨酸和 4 5 南开大学硕士 研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制备 及性能研究 l 一 色氨酸产生重要的影响。活化载体偶联氨基酸的过程中有以下的反应: a .氨基酸游离氨基亲合进攻环氧基团 l 一 苯丙氨酸: o - c h , -c h -c h n日0 :日 、刀7/ /八叭丫n h o - h oic - i u - o /o ho l 一 色氨酸: o - c h , - ch - ch o - c h 2 -c h -c h 2 n ho b . 活化在体内部的交联反应 南开大学硕十研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制各及性能研究 h 0 - i c 一 0 习不目 na oh ? 。 一 c h , - c 日 一 山 ， 十泪 -c h , -o c . 体系内游离轻基对固定环氧基团的碱式开环 户 冬一 : o : o - c h , -c h -c h , : o-日 o - c h 2 c h -c h zg h oh oh o -c h , -c h -c h , : o- h 作为一种两性化合物，氮基酸分子中既有碱性一h : 和酸性一 c o o n ，与强酸或强碱 都能作生成盐: r一 c h - c oon+h c i r- c h一 c ooh o +，j i ln n h z r一 c h - c o on+ n a oh r一 ch一 coo n a n h z 在同一分子内，氨基和狡基也相互作用生成内盐: r一 ch - coonr一 ch一 c oo一 +3 h ln n h z 内盐 ( 两性离子或偶极离子) 若将氨基酸的水溶液酸化，则两性离子与 h + 结合而成阳离子，若加碱于氨基酸的 水溶液中， 则两性离子中氮原子上的一个氢离子与o h 一 结合成水， 而两性离子变成阴离 子: 们 南开大学硕士研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制备及性能研究 r- c h - c oo + h oh r- ch - c oo- h r- c h- c oon o日 一 n h , n h 3 阴离子偶极离子阳离子 苯丙氨酸和色氨酸的p i 分别为5 .4 8 和5 .8 9 ，在体系p h值较低的情况下，他们多 r- ch- coon 以阳离子 孤对电子， 大为减弱， nh 其亲核性大大下降， 的形式存在，此时的游离氨基为钱根正离子，并不存在 氨基酸同琼脂载体上固定的环氧基团之间的亲核反应也 表现为l 一 苯丙氨酸和 l 一 色氨酸偶联量减少， 因此过低的p h值不利于氨基酸 的偶联反应。 但当体系p h过高时，载体间的交联反应和体系中游离经基进攻固定环氧基团的碱 式开环反应的比例也相应增加， 在这样的竞争反应存在的条件下， l 一 苯丙氨酸和l 一 色氨 酸同环氧基团之间的偶联反应也随之减弱，表现为氨基酸的偶联量下降。 从图4 .3 和4 . 5 中可以看出， 当p h = 1 0 .8 8 时环氧化琼脂载体有较大的l 一 苯丙氨酸和 l 色氨酸偶联量。 6 温度对环氧化琼脂载体偶联l 一 苯丙氨酸的影响 以p h = 1 0 .8 8 的n a c 0 3 - n a h c o 3 缓冲溶液配制c = 8 g / l 的l 一 苯丙氨酸溶液，量 取 8 .0 m 1 该溶液与2 .0 0 g 环氧化琼脂载体( 2 . 0 0 g 琼脂载体， 2 .o m l 环氧氯丙 烷， 4 .o m l 1 .2 5 m n a o h溶液，3 0 0c 摇床中反应3 小时制得)分别在2 0 0c , 2 5 0c , 3 0 0c, 3 5 0c , 4 0 0c , 4 5 ， 5 0 0c , 5 5 0c , 6 0 0c , 6 9 0c , 8 3 等温度下于摇床中 ( 1 3 0 转/ 分钟)反应5 小时。计 算l 一 苯丙氨酸偶联量。 再向洗脱完的琼脂载体中加入3 . o m l 1 .3 m的硫代硫酸钠溶液和2 滴酚酞指示剂，室温下反应 1 2 小时，用0 .0 0 9 1 m标准盐酸滴定，计算琼脂载体上剩余 的环氧基团含量。结果如表4 .6 和图4 .6 所示: 南开大学硕士 研究生毕业论文: 类风湿关节炎免疫吸附剂的制备及性能研究 表4 .6反应温度对环氧化琼脂载体偶联l 一 苯丙氨酸的影响 剩 余 环 氧 量 组份反应温度 ( ) 洗脱液 ( ml )洗脱液 o . d . l - 苯丙氨酸偶 联量( r m o l/ g )( u m o l/ g ) 3 0 00 . 2 0 94 刀i5 9 . 1 5 3 0 00 . 2 0 11 1 . 2 7 5 5 . 0 6 3 0 00 . 1 9 81 3 . 9 9 4 9 . 1 4 3 0 00 . 1 8 62 4 . 8 94 2 32 3 0 00 . 1 8 12 9 . 4 2 4 5 . 5 0 3 0 00 . 1 4 6 61 . 1 92 0 . 4 8 3 0 00 . 1 5 25 5 . 7 52 . 7 3 3 0 00 . 1 5 15 6 . 6 5 3 0 00 . 1 4 46 3 . 011 . 8 2 3 0 00 . 1 3 27 3 . 9 0 加253035405055606983 inlllwvvivll姗ixx nnnuc日八钊nucun曰 0曰一了65a几今曰0自1.j 汤语日蕊叫搏军盛喊杖料闷 罗oe落)搁嘛氏暇减雄麟 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 图 4 .6 反 应 a 度 对 环 氧 化 载 体 偶 联 l - 苯 丙 氮 酸 的 影 响 c c 反 应 9 度 4 9 南开大学硕 l 研究生毕业论文:类风湿关节炎免疫吸附剂的制各及性能研究 7 . 温度对环氧化琼脂载体偶联l 一 色氨酸的影响 以p h = 1 0 . 8 8 的n a c 0 3 - n a h c o 3 缓冲溶液配制c = 1 0 g / 1 的l 一 苯丙 氨酸溶液， 量 取 8 .o m l 该溶液与2 .0 0 g 环氧化琼脂载体( 2 .0 0 g 琼脂载体， 2 .o m l 环氧氯丙烷， 4 .0 m 1 1 .2 5 m n a o h溶液，3 0 摇床中反应3 小时制得)分别在2 0 0c , 2 5 0c , 3 0 0c , 3 5 0c , 4 0 0c , 4 5 0c , 5 0 0c , 5 5 0c , 6 0 0c, 6 9 0c , 8 3 等温度下于摇床中 ( 1 3 0 转/ 分钟)反应5 小时。测 定计算l 一 色氨酸偶联量。再向洗脱完的琼脂载体中加入3 .o m l 1 . 3 m的硫代硫酸钠溶液 和 2 滴酚酞指示剂，室温下反应 1 2 小时，用 0 .0 0 9 1 m标准盐酸滴定，计算琼脂载体上 剩余的环氧基团含量。结果如表4 .7 和图4 .7 所示: 表4 .7 温度对环氧化琼脂载体偶联l 一 色氨酸的影响 洗脱液 o.d 乘 9 余 环 氧 量 组份反应温度 ( ) 洗脱液 ( m l ) l 一 色氨酸偶联 量 ( 稀释 5 倍)( u m o l/ g ) ( u m o l/ g ) 0 . 6 5 6 0 . 6 4 3 0 . 61 5 0 . 5 7 9 0 . 5 6 6 0 . 4 7 2 0 . 4 61 0 . 4 7 7 0 . 4 8 9 31 . 0 85 9 . 6 1 3 4 . 3 45 6 . 8 8 41 . 3 84 4 . 3 6 5 0 . 4 24 7 . 3 2 5 3 . 6 94 4 . 1 4 7 7 . 3 03 . 0 6 8 0 . 0 66 . 7 3 7 6 . 0 45 . 9 2 7 3 . 0 31 . 3 7 000000000000000000 ，内j气j几、，j凡，、几j气 20253035405055606