（微生物与生化药学专业论文）三孢布拉氏霉发酵辅酶q10及其代谢调控的研究.pdf

摘要 本论文对三孢布拉氏霉( b l a k e s l e at r i s p o r a ) 发酵辅酶q 1 0 的生物合成途径及代谢调控作了 初步研究。以三孢布拉氏霉j s f 4 为出发菌株，采用紫外线及6 0 c o y 射线诱变处理，以l 甲 硫氨酸及d 一酪氨酸或对氨基苯丙氨酸结构类似物抗性定向筛选，通过摇瓶初筛和复筛，获得 了一株双标记抗性突变菌株j s f 4 - j b l ，在未经优化的摇瓶发酵条件下，菌体中辅酶q l o 产量可 达2 7 1m g l ，较出发菌株j s f 4 提高了9 2 。 对三孢布拉氏霉j s f 4 j b l 的发酵条件进行了优化研究，确定最佳发酵培养基为( g l ) - 葡 萄糖1 9 ，豆粉3 0 ，蛋白胨1 5 ，k h 2 p 0 41 ，m g s 0 40 1 ，m n s 0 40 4 ，v b l0 0 1 ，豆油9 ， 棉籽油1 8 ，初始p h6 5 。菌株于2 5 在2 0 0r m i n 的旋转式摇床上振荡培养7 2h ，接种量为 8 ，装液量为4 0m l 5 0 0m l 三角瓶。结果表明辅酶q 1 0 产量达3 6 6 9m g l ，比未经优化提高 了3 5 。 采用正交实验，对醇碱皂化法提取三孢布拉氏霉菌体中辅酶q l o 的各工艺条件进行了研 究，确定最佳的工艺条件为：k o h 加量为干菌体质量的1 9 倍，醇碱浓度为1 0 ，焦性没 食子酸添加量为干菌体质量的1 2 ，在7 0 下皂化6 0 r a i n , 其平均提取收率达8 1 5 。 采用薄层层析法分离纯化三孢布拉氏霉提取菌液中的辅酶q l o ，结合紫外分光光度法及高 效液相色谱法对其进行定性定量分析。实验结果表明，薄层一紫外分光光度法操作简便，是 一种快速准确的辅酶q l o 分离测定方法，其薄板回收率可达8 2 8 ，r s d 值为1 4 9 。 关键词：辅酶q 。o 三孢布拉氏霉诱变育种发酵条件优化皂化提取薄层层析 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t b i o s y n t h e t i cp a t h w a yo fc o e n z y m eq l oi nb l a k e s l e at r i s p o r aa n di t sm e t a b o l i z e dr e g u l a t i o n w e r ep r i m a r i l ys t u d i e di nt h i ss t u d y t h es t r a i no fb l a k e s l e at r i s p o r aj s f 4w a st r e a t e dw i t h u l t r a v i o l e ta n d6 0 c oi r r a d i a t i o n b yr e s c r e e n i n g ，t h em u t a n tj s f 4 - j b l ，、v i t hd u a lr e s i s t a n tm a r k e r s ，w a s o b t a i n e do nt h el - m e t h i o n i n e ，d - t y r o s i n ea n dp a m i n o p h e n y l a l a n i n er e s i s t a n tc u l t u r em e d i a i t se o e n z y m eq i o y i e l dw a si m p r o v e d9 2 a st h ep a r e n ts t r a i n , r e a c h i n g 2 7 1m g l t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f 戮n 沁s l e at r i s p o r aj s f 4 - j b lw a ss t u d i e d a n dt h eo p t i m u n l c u l t u r em e d i u mw a so b t a i n e da sf o l l o w s ( g l ) ：g l u c o s e1 9 ，p e a s e3 0 ，p e p t o n e1 5 ，k h 2 p 0 4 l ， m g s 0 4o 1 ，m n s 0 40 4 ，v i t a m i nb io 0 1 ，b e a no i l9 ，c o t t o n s e e do i l1 8a n dt h eo r i g i n a l l yp h 6 5 t h em u t a n tw f l sc u l t u r e do nt h er o t a t i n gs h a k i n gb e da tt h es p e e do f2 0 0r m i nt r a d e r2 5 f o r7 2 h o u r s w i t hi n o c u l u ms i z e8 a n dm e d i u mv o l u m e4 0m l 5 0 0m l t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e c o e n z y m eq l oc o u l db ei m p r o v e d3 5 ，r e a c h i n g3 6 6 9m g l t h ee x t r a c t i n gc o e n z y m eq 1 0f r o mb l a k e s l e at r i s p o r au s i n gs a p o n i f i ca t i o nw a sa l s os t u d i e db y o r t h o g o n a lt e s t a n dt h eo p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e da sf o l l o w s ：钮c u l t u r e 、a s d i s d l e da t7 0 4 cf o r6 0 m i n ，a d d e dc a u s t i cp o t a s hu pt o1 9t i m e so fd r yc u l t u r e ( w w ) ，p y r o g a l l o lu p t o1 2d r yc u l t u r e ( w w ) a n dt h ec o n c e n t r a t i o no f a l k a l i - m e t h a n o lw a s1 0 t h ea v e r a g er e c o v e r yo f c o q l 0w a s8 1 5 c o e n z y m eq l ow a ss e p a r a t e db yt h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h ，w i t hi t sa v e r a g er e c o v e r yo f 8 2 8 a n dw a sd e t e r m i n e d b y u l t r a v i o l e t s p e c t r a m e t e r a n d h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h t h er e s u l t ss h o w e di taf a s ta n da c c u r a t ed e t e r m i n a t i o nf o rc o q l o k e y w o r d s ：c o e n z y m eq 1 0 ；b l a 妇s & at r i s p o r a ；m u t a t i o n ；f e r m e n t a t i o n ；o p t i m u mo fc u l t u r e c o n d i t i o n ；e x t r a c t i n gb ys a p o n i f i ca t i o n ；t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h 英文缩略语与中文对照表 英文缩略语与中文对照表 ( 美国) 食品及药物管理局 酵解途径 纠空基一3 _ 甲基戊二酰辅酶a 砥；c o a 还原酶 甲羟戊酸 异戊烯基焦磷酸 二甲基丙烯基焦磷酸 异戊二烯焦磷酸转移酶 犍牛儿基焦磷酸 法尼基焦磷酸 橘牛几档牛儿焦磷酸 c , g p p 合成酶 聚五戊二烯焦磷酸 己糖单磷酸途径 磷酸烯醇式丙酮酸 3 脱氧一d - 阿拉伯糖型庚酮糖酸一7 - 磷酸 d 衄p 合成酶 预苯酸 对羟基苯甲酸 细胞生物量( g 干菌体l 发酵液) 眦肿一懈肌胛咖|耋唧肿哪|耋眦哪啪宝眦眦哪 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文巾特捌加以标注和致谢的地 方井，论文中不包含其饱人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书面使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文q l 作了明 确的说明并表示曝蠹。 关予论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了鳃江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：疰南大学有较保留势翔匿家有关部门或机构送交论文的复瘁件和 擞盘，允许论文被查阅和借阔，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有- 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 ， 日期：口g 年岁月0 日 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 辅酶q l o ( c o e n z y m eq l o ，或c o q l o ) ，化学名称为2 ，3 - q 3 氧基- 5 - 甲基一6 一癸异戊烯基 苯醌，其聚异戊烯基侧链含有1 0 个异戊烯单位，所以称为辅酶q 1 0 ，由于广泛分布于各种 生物体内，所以又叫泛醌l o ，其结构简式如下： o h 图1 1 辅酶q 1 0 的结构简式( c 5 9 1 9 0 0 4 ：8 6 3 3 0 f i g1 1s f f u c t u r eo f c o q i o 在不同的生物中，辅酶q 的合成途径、前体来源、涉及的酶和编码的基因都存在着差 异。此外不同种类的生物所含辅酶q 的种类也不同，这主要体现在侧链的长度上，如大肠 杆菌主要含有辅酶q 8 ( 侧链长为八个异戊二烯，以此类推) ，酵母主要含有辅酶q 6 ，动物中 除一些啮齿目和鱼类含辅酶q 9 外，多数含有辅酶q l o ，人体所含也是辅酶q 1 0 。 1 2 辅酶q l o 的理化性质 辅酶q l o 在室温下为黄色或淡橙色结晶物，无臭无味，熔点为4 9 。因具有长聚异戊 二烯侧链而易溶于氯仿、苯、四氯化碳，溶于丙酮、石油醚及乙醚，微溶于乙醇，不溶于 水和甲醇。在光照下辅酶q l o 易分解成微红色，对温度和湿度较稳定【l l 。 辅酶q l o 的醌环中虽然存在碳碳双键与碳氢双键间的丌共轭体系，但x 射线分析证 明，醌环不是芳香烃，不属芳香族化合物，它具有典型的烯烃和羰基化合物的反应性能， 可以进行多种形式的加成反应和氧化还原反应 2 1 ( 图1 2 ) ，但由于辅酶q l o 是四元取代物， 故不起加成反应。 o0 h h 0 h i c o c h + 2 h + + 2 e 一 一c c h l h 图1 2 辅酶q l o 的氧化还原反应 f i g1 2o x i d a t i o n - r e d u c t i o nr e a c t i o no f c o c n z y m eq l o 第1 页 c h i i = c - c h i ) i 。h 拄南大学硬圭学赶逾文 i 3 辅酶q i o 的生物学功麓 辕酶q 1 0 驰生物学功麓生要来垂手冀驻垮豹氧德还蒙特性秘奄l | | 镶豹穆理特经。在生物戆 氧化呼吸链中，辅酶q l o 律为n a d h 或琥珀酸脱氢酶和细胞色素之间的电子传递物质刚， 对促进电子传递和质子跨膜主动运输，以及维持跨膜的质子浓度起着至关重要的作用。它 能促进细胞的氧化磷酸化反应，是细胞代谢和细胞呼吸的激活剂；同时，也是一静能清除 囱蠹基豹天然抗氧纯剂捌，宽其是还原黧麴辅酶q 持能疆遁嚣类锄霞( 生物骥串翁磷器和盘 液中的l d l ) 的过氧化作用刚。和其他抗氧化物相比，它的抗氧化活性不依赖维生素e ，而 且能通过自身的还原能力保护维生素e 的抗氧化性，是一种安全的天然抗氧化剂m 。 毒辅骛q i o 藏奁掰 辅酶q l o 悬能量产生，代谢和贮存的重要辅酶，敞被称为生物原动力嗍，在欧美也称之 为维生素q 渺它是人体举可或缺的营养素之一。人体毙够合成辅酶q t o ，特别怒在器官的 腋肉组织中含慧较高，2 0 岁对，糖酶q ”的含量迭舞高峰，然后遗速减少，躯羞年赞增长 心肌细胞中辅酶q 1 0 的减少特别明显，7 7 岁的老人比2 0 岁的年轻人心肌中辆酶q 1 0 减少了 5 7 。如果人体中辅酶q 1 0 禽量降低到常量的2 5 时，即会导致一系列的健康问题，包括 商虚压、心脏瘸和免疫力下降等，如条人体中辕酶q l o 含量下降超过7 5 ，那么生鑫耨终 嫩i 舛。因此，随着年龄静增大，适当补充辅酶q i o 是非常重要的。圊此，辅酶q i o 作为一种 熏要的生化药物，已广泛应用于临床。 1 tl 心血管病竣廉方面的应用 自f o l k c r s 等u 卅发现心脏病患者的心勰有辅酶q i o 活性降低的现象，辅酶q , o 就开始应 用于心血管病临床，这是目前辅酶q - 0 应用的主要领域。专家认为，辅酶q l o 属内源性生物 动力学的氧化还原物，不属于对心功能宵药理作用的药物，在心赢管病睡床上的疗效主要 喜改善心飘旋爨的产生、傻缌脆生物貘稳定及撬氧佬豹特性# 1 。辅酶q 辩簸巍性。薤病 和风湿性充血性心力衰竭所引起的症状( 浮肿、肺充肌、肝肿胀和心绞痛等) 有效”】；在 常规抗心肌缺i 靓药物治疗基础上加用辅酶q 1 0 ，可显著减少心绞痛发作次数、减少硝酸酯类 的用量、提高运动耐量和缺斑性s - t 及f 波改变粒转瓣率f 1 4 l ；辍酶q i o 霹心肌癍、霍状动 濂疾瘸、急饿心肌梗塞、预防和治疗篥燕药物g i 起的心功能紊乱及心肌保护有效髑：可降 低脂蛋白( a ) 和虹液胰岛素，抑制胆固醇氧化而防止动脉粥样硬化：辅酶q i o 对治疗高血压 也甯一定的疗效，且降压作厢较为缓和，无不良副作用( “。 i 毒j2 辅酶q 撺在其貔医学矮壕的应溺 近年来研究发现，辅酶q i o 对炎症、肿瘤等也有相当好的作用。因此，在l j 蠡床上已广泛 应用于辅助治疗十二指肠溃疡、坏死性牙周炎、病毒性肝炎【”】、糖屎病性神经炎、脱发， 菇垒性贫盘、支气警璋嚷及瓣瘪和癌症等。出于辕酶q m 具有良好麴抗氧犯靛力，其在美容 护肤品方面的成用也越来越广泛1 1 8 。辅酶q l o 作为保健品，具有改善循环状态、防氧化抗 第2 砸 第一章绪论 衰老的作用，在美国已广泛用作食品补充剂，在超市、食品连锁店和药店里能自由出售， 无需医生处方。 1 5 辅酶q i o 的市场情况 随着辅酶q l o 在医药、食品、化妆品等领域的广泛应用，这种产品在全世界的开发已成 为热潮。据有关资料显示，全世界辅酶q 1 0 的年消费量约5 0 0t ，且每年增长率为1 5 - 2 0 ， 其中美国市场约占三分之一，主要用作食品补充剂。近几年来，美国国内形成了天然保健 品热，使辅酶q i o 的需求量迅速增长。美国f d a 于2 0 0 4 年3 月又将辅酶q l o 的建议用量提 高了4 倍，使得本来就供不应求的辅酶q l o 市场更加紧俏。据中国医药保健品进出口总公司 介绍，国际市场对我国的辅酶q i o 需求量在4 0 以以上；欧洲等地也是重要的消费市场，同 样是用于保健食品；日本和我国则应用于医药领域。据了解，我国2 0 0 4 年消耗辅酶q l o 为 2 6 8 t ，其中大部分产品是从国外进口的，国内市场缺口较为严重。 目前国际市场上用微生物发酵提取生产的辅酶q l o 小包装售价为3 0 美元克以上，国内 同样包装用半化学合成法生产的辅酶q l o 售价也在7 0 元( 人民r p ) 克以上由此可见，开发 生产高质量的辅酶q 1 0 产品具有广阔的市场潜力。 1 6 辅酶q 。o 的生产方法 辅酶q 1 0 的生产方法可以分为四种：生物提取法、化学合成法、半化学合成法和微生物 发酵法。 6 1 生物提取法 生物提取法是世界上最先采用的辅酶q l o 生产工艺，主要从动物的脏器及植物组织中提 取，如猪心【1 9 1 、牛心、大豆等。但由于动植物组织中辅酶q l o 含量低、各种化学成分复 杂、原料来源受限制，必将制约生产规模的扩大，因此用这种方法生产辅酶q l o 成本高，产 品的价格昂贵。 1 6 2 化学合成法 辅酶q l o 的化学合成方法主要有两种口1 j ：其一是直接在母核化合物上引入癸异戊二烯 醇基，即侧链直接引入法；另一种方法是首先于母核化合物上引入较短的侧链，然后再引 入所期望的长链，即侧链延长法。 1 9 8 8 年e e m 和k e i n a n 开发的全化学合成法生产辅酶q l o 工艺是目前唯一成功的全化学 法技术。但由于使用该技术合成辅酶q l o 的条件苛刻，且线性不饱和侧链的合成也存在一定 难度，与工业化生产还有一定的距离。 1 6 3 半化学合成法 2 0 世纪8 0 年代初期，日本成功开发了半化学合成工艺【2 2 】，使辅酶q l o 生产成本大幅度 降低。该法从烟叶中提取茄尼醇进而再合成辅酶q l o ，在技术上已比较成熟，并实现了工业 化，产品成本低、价格适中，但在使用上与用生物提取法生产的产品有较大差距，原因在 第3 页 江南大学硕士学位论文 于生物提取法的产品是天然的、侧链全为反式，易于被人体吸收和转化：而半化学合成的 辅酶q l o 侧链有顺、反两种异构体，不易被人体完全吸收，生物活性较差，难以充分发挥其 药理作用。 1 。6 4 微生物发酵法 近几年，微生物发酵法得到了长足的发展。由于微生物发酵原料来源广、生产成本低， 易于大规模生产，产品易分离纯化，且临床疗效较佳，是一种最有前途的辅酶q l o 生产方法。 但每种微生物中的辅酶q 1 0 分布不均匀，菌种发酵水平低。为了获得高产菌株，需要进行大 量突变育种的研究工作 2 3 - 2 5 】。近年来，人们对参与辅酶q 1 0 生物合成的基因组研究很感兴 趣，并取得了一定的成果，相信随着研究的进一步深入，会得到通过基因工程构建的辅酶 q l o 高产菌株 2 6 - 2 8 1 ，以满足工业生产的要求。 1 7 三孢布拉氏霉菌中辅酶q l o 的生物合成途径及其代谢调控 1 7 1 三孢布拉氏霉的特性 三孢布拉氏霉( b l a k e s l e at r i s p o r a ) 属于藻状菌纲毛霉目笄霉科布拉霉属1 2 9 】，在马铃薯葡 萄糖琼脂上呈浅橙黄色棉絮状。三孢布拉氏霉生长迅速，能生产发达的长菌丝，为长管单 细胞，没有隔膜，细胞质内含多个细胞核，不产生假根，是单细胞低等真菌。生长过程表 现为菌丝的延长和细胞核的裂殖增多及细胞质的增加。三孢布拉氏霉是异宗结合菌，有正、 负两种单性菌株，它们在外观形态上并没有显著差别，可独立无性繁殖形成孢子囊和孢囊 孢子；也可异宗配合进行有性繁殖，正、负菌株的菌丝体相互接触、融合产生异核体。正、 负菌株主要区别在于需要协同合成一种性激素三孢酸( t r i s p o d ea c i d ) ，而单性菌株仅合 成三孢酸的前体物质，两种交配型所产生的三孢酸前体结合生成三孢酸【3 0 】。 1 7 2 三孢布拉氏霉合成辅酶q n 的生物途径 辅酶q 1 0 的生物合成途径大致经历三个主要的过程：1 ) 聚异戊二烯长链的合成；2 ) 醌 环的合成；3 ) 产物的最后修饰。聚异戊二烯侧链的长度对每一个物种来说是固定的，是由 其自身的聚异戊二烯焦磷酸合成酶所决定的【3 l 】。1 9 7 6 年r u d a e y 在关于辅酶q l o 的国际专题 会议上提出辅酶q i o 的生物合成途径主要为聚异戊二烯基侧链及芳香环两条合成路线【3 2 】组 成，其中，聚异戊二烯基侧链是通过甲羟戊酸途径p 副( m v a p a t h w a y ) 合成3 异戊烯基焦磷酸 ( i p p ) ( 图1 3 ) ，m p 与其异构体二甲基丙烯基焦磷酸( d m a p p ) 经异戊二烯焦磷酸转移酶( i p p s ) 合成搦牛儿基焦磷酸( g p p ) ，g p p 再逐步与八个i p p 聚合形成了辅酶q l o 的侧链。三孢布拉 氏霉作为工业化生产1 3 胡萝卜素的高产菌州，存在着很强的1 3 胡萝卜素代谢支流，见图 1 3 ，经m v a 途径合成的大量i p p ，通过聚合反应生成栊牛儿糖牛儿基焦磷酸( g g p p ) ，两分 子g g p p 聚合生成八氢番茄红素，再通过脱氢、环化等步骤生成p 胡萝b 素。 第4 页 第一章绪论 异戊二 乙酰c o a ( e m p 溶径产牛) 乙酰c o a 转耪酶i r i l m g c o a 缩合酶工 3 羟基- 3 - q j 基戊二酸单酰c o a ( 卸m g c o a ) h m g c o a 还原酶( m 心r ) j r 甲羟戊酸( m v a ) l m v a 激酶1 l 孓磷酸甲羟戊酸( 5 - p - m v a ) 5 磷酸甲羟戊酸激酶f 脱羧 5 _ p p - m v a ) 桩牛几基焦磷酸( g p p ) 聊寸异戊烯转移醵 法尼基焦磷酸( f p p ) 一 儿犍牛儿焦磷酸( g g p p ) 二：蝴删触耠腑 肿_ l i 胞奄 对羟基苯甲酸 聚十异戊二烯焦磷酸 番茄红素环化酶 c o q l 。合成酶 b 瑚萝h 素 辅酶q l 固醇合成途径卜辅酶q | o 合成途径c = = = p 胡萝l - 素合成途径 图1 3 三孢布拉氏霉中聚异戊二烯及衍生物的合成途径 f i g1 3b i o s y n t h e t i cp a t h w a yo f i s o p r e n o i d sa n di t sr a m i f i c a t i o n 辅酶q l o 中的芳香环被普遍认为是通过莽草酸途径闭合成对羟基苯甲酸( p 舳) ( 图1 4 ) ， p h b 通过异戊烯基转移酶将聚异戊烯基侧链连接到醌环上，进一步对醌环上的碳实施羟化 与甲基化，最终形成辅酶q 1 0 ，同时菌体中存在芳香族氨基酸的代谢支路。 第5 页 r 哦弋一 。 胆冁 巍露天学顼士孝巍稔文 e m p - 磷酸烯醇式丙酮酸( p e p ) 磷酸赤藓糖一h m p 。a 玲台成酶( 。s ) l 誊聪氧d - 阿拉伯糖壁凑酲藉麓牛磷酸b a l 臻， 释摹酸 l 舟专醋攀摊酶p p a 脱水酶，j 苯丙氨酸 色蘸簸+ 一i 癸毒醛覆苯黢( p e 氏 ：。 i p p a 脱瓴酶 。酪氯酸 对野纂幕单酿( p i i b ) 蒙十巽虎= 爝焦骥酸啼l 辅酶o t n 合成酶 毒 辅酶q ” 图1 4 辅酶q l o 的芳香环生物合成途径 辩9 1 4 b i o s y n t h e t i c p a t h w a y o f q u i n o n i dr k i g 衙故起l o 。7 3 三孢布拄氏霉合成辅酶q 妁代襟调控 工业发酵蒙获得较高的目的产物产最，必须突破( 或解除) 微生物细胞的自我调节控制机 制，最常用且有效的方法就是从遗传的角度解除微生物的正常代谢控制机制。在异戊爝基 懈链酶生耪含成途径中，h m o - c o a 还簸籀箍佬形戏甲羟戊酸是一令不嚣遂豹避程，为第一 个限速酶，蹙终产物的反馈抑制；而芳香环合成途径中的关键酶是d a h p 合成酶和分支酸 变位酶，这两种酶受终产物l 酪氨酸和l 一苯丙氨酸的协同反馈抑制。 据文献f 蝴蛔报道，对哥生耨合成穗酶q ”的钱谢调控，主要为选毒辕酶q 埒或其前终镌 质的结构类似物抗性菌株或代谢支路静缺珞型菌株。对聚舜戊二烯基铡链合成途径来说， 增强甲羟戊酸途径的代谢流星，就有可能为合成辅酶q - o 提供大量的前体物质l p p ，因 此，选育i p p 结构类似物( l - 甲硫氨酸、l - 乙硫氨酸等) 的抗性菌株柬解除i p p 射h m g - c o a 还原酶静反馈捧割；同静，胃选喜朝萝 素缺昭型菇抹，淡阻赣胡萝 素麴钱 奏 支路， 来增加辅酶q m 侧链的原料供给。而对于芳香环生物合成途径，加强莽草酸途径的代谢流量， 就有可能增加辅酶q l o 产嫩，具体可通过选育营养缺陷型突变株( l - 苯丙氨酸缺陷、l 酪氨 羧缺骆或色氨酸缺陷) 默阻颠不必要的代澍支路；可敬选育不分解利岗裁酶q l o 黔突变抹， 使辅酶q | o 褥到积累；也可以选育抗结构类似物突变稳株，如遥蠢l 一酪氨酸结构类似物( 如 d 酪氨酸) 或b 苯丙氨酸结构类似物( 如对氨基苯丙氨酸) 的抗性突变株有利予解除l 一酪氨 酸与。色氨酸或l 苯丙氨酸对前段d h a p 合成酶的协同反馈抑制作用p 2 l 。同时还可以选育 穗酶q 结褥类儆物摇维生素抗性菌撩柬辩豫赣酶q l o 对箕套袋酶豹挣锻终瘸。裁克移 等 3 6 1 采用n t g 、d e s 对搬癌土壤杆菌进行交替诱变处理，筛选到r 一株抗维生素硒和乙 第6 贞 第一章绪论 硫氨酸的酪氨酸缺陷型菌株a g r0 6 1 0 ，其辅酶q 1 0 产量较原始菌株提高了1 5 6 1 。 1 8 发酵法生产辅酶q o 的国内外研究现状 目前，我国辅酶q 1 0 的生产发酵水平一般在1 0 0 2 0 0m g l ，国际先进水平可达到1 0 0 0 m g l 3 7 1 。 日本是最早开展辅酶q l o 研发的国家，也是水平最高的国家。1 9 7 7 年日本首先实现微 生物法生产辅酶q o 的工业化；1 9 8 3 年专利公布的辅酶q 1 0 发酵水平为2 0 1m g l ( 2 3m g g 干菌体) ；另有报道，日本基因工程菌e f r m - p 6 0 0 8 的发酵水平达3 0 0m g l 。y o s h i d a 等【2 5 】 用n 甲基- n 硝基- n 亚硝基胍( n t g ) 处理类球红细菌，得到一株突变株，辅酶q l o 产量达 3 5 0m g l 。日本在发酵法生产辅酶q l o 的研究中一直处于领先地位，1 9 9 2 年产量已达7 7 0 m g l 3 引。 近几年来，国内关于微生物发酵法生产辅酶q l o 的研究也取得了部分进展。华东理工大 学生化研究所从1 9 9 6 年起开始调研并进而立项，开始辅酶q l o 的发酵法生产研发工作，目 前已达到的水平为：1 6l 发酵罐发酵生物量3 5g 干菌体l ，辅酶q l o 水平为1 5 0m g l 。北 京化工学院经过筛选，获得一株辅酶q l o 的菌株，经过优化产量达到1 6 0m g l 。西南师范 大学现代生物医药研究所通过定向选育技术已获得一株高产菌株，辅酶q l o 产量可达2 0 0 m g l 【3 9 l 。但综合上述研究，我国发酵法生产辅酶q l o 的产量普遍较低，实现工业化还有一 定距离，高产菌株的选育，包括采用基因手段改造或构建新的菌种是目前发酵法生产辅酶 q l o 面临的首要问题。 1 9 研究的目的及意义 辅酶q l o 作为一种多功能的生化药物，不仅在提供生物能量、维持生命机能方面起着重 要的作用；而且作为细胞自身产生的天然抗氧化剂，在抑制线粒体和生物体内过氧化物的 堆积，维持生物膜结构完整性，增强体内非特异性免疫力等方面起着重要作用，已广泛应 用于医药、保健品及食品添加剂等领域。目前辅酶q l o 在世界各国的销售量不断增加，世界 辅酶q l o 的年消费量约5 0 0t ，且每年增长率达1 5 2 0 ，致使辅酶q l o 不仅在国际市场上供 不应求，在国内市场的缺口也很大。开展本研究将推动微生物发酵生产辅酶q l o 工艺的突破， 而且将提高我国辅酶q l o 产品在国际市场上的竞争力。因此本研究不仅对推动我国科技进 步、提高经济效益具有重大的作用，而且对促进我国人民的身体健康具有重大的社会意义。 微生物发酵已被各国普遍认为是最有前途实现工业化生产辅酶q l o 的工艺，但是我国由 于菌种产量低，在发酵法生产辅酶q 1 0 的水平与国外相比，还有很大差距，难以实现工业化。 本研究的目的是在菌种水平、发酵工艺控制及提取上有所突破，推动我国的辅酶q l o 产业化 的发展。 第7 页 疆鹰大学霹l 士学锂论文 1 1 0 本论文的研究内容 本论文采惩三孢毒拉既霉发酵辘酶q l 。，醅究的主要走容如下： ( i ) 三孢布拉氏霉中辅酶q l o 钓分离投禽量溯定 采用薄层层析法分离纯化三孢布拉氏霉中的辅酶q l o 并用紫外分光光度法对其进行定 性定量分析。 ( 2 ) 三孢碡i 拖氏霉发酵辖薅q | 。及箕健谢赣控簿 究 对三孢布拉氏霉发酵辅酶q l o 的生物合成途径及代谢调控作了初步研究，并以此为理论 依据，采用紫外、”c ov 射线诱变，定向选育具遗传性状稳定的辅酶q l o 生产菌。 ( 3 ) 辅酶q 皤摇瓶发酵条传鲍研究 在摇瓶发酵条停下，对其代涛鞲酶q l o 的培养蘩组成进行了考察，并对发酵条徉进行优 化。 。 ( 4 ) 三孢布拙氏霉菌体中辅酶q l o 的提取 采用醇藏皂位法提取蘩律中篱骧酶q l 劳霹该王艺涉及熟备嚣紊遘聋亍了考察，鞫露邀 对有机溶剂萃取法提取菌体中辅酶q l o 的工艺作了初步探索。 第8 页 第二章三孢布拉氏霉中辅酶q ，o 的分离及含量测定 2 1 引言 第二章三孢布拉氏霉中辅酶q l o 的分离及含量测定 薄层层析( t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h , t l c ) 已广泛应用于生化物质的分离和纯化，该技术 具有操作简便、设备简单、样品用量少等优点，其作用机理【蚰l 主要包括吸附、分配、离子 交换和凝胶过滤等作用。三孢布拉氏霉菌的提取液成分复杂多样，除辅酶q l o 等终产物外， 还含有生物合成途径中的各种代谢中间体，给目的产物的测定带来极大困扰，采用薄层层 析可分离三孢布拉氏霉菌提取液中的辅酶q ”其主要原理以吸附作用为主，因样品组分极 性的差异，使其与吸附剂和展层剂具有不同的亲和能力，从而导致各组分在薄板上的移动 距离不同，组分与吸附剂亲和能力强的留在接近原点的位置；反之，组分与吸附剂亲和能 力弱的留在离原点较远的位置，最终使提取液中的辅酶q l o 得以分离。 目前辅酶q l o 的测定方法主要有紫外分光光度法( u n 【4 、可见分光光度法【4 2 】及高效液 ( h p l c ) m 】。可见分光光度法是根据辅酶q i o 在碱性条件下其醌环上的甲氧基被氰 基乙酸乙酯取代生成蓝色络合物 4 4 j 这一原理进行测定的，但由于形成的蓝色络合物不太稳 定而导致测定结果不够准确。高效液相色谱是在高压，快速条件下进行的液相层析，由于 层析柱固定相基质粒度很小，表面积大，可以偶联各种基团，选择性好，流动相可根据不 同要求而改变，因此分辨率高，灵敏度高，但成本较大。紫外分光光度法因具有操作简便、 分析速度快、灵敏度及准确度高等优点【4 5 】而成为较好的辅酶q l o 测定方法。 本研究采用薄层层析对三孢布拉氏霉发酵提取液进行分离，结合紫外分光光度法及高 效液相色谱法对其中的辅酶q l o 作定性分析，并按照紫外分光光度法测定出菌液中辅酶q l o 的含量。 2 2 材料与方法 2 2 1 主要试剂与仪器 辅酶q l o 标准品，纯度为9 8 ( a r ) 硅胶h f 2 5 4 ( 薄层层析用) ( a r ) 羧甲基纤维素钠( a r ) 石油醚( 6 0 9 0 ) ( a r ) 无水乙醚( a r ) 无水乙醇( h p l c ) n a b i ( a r ) k o h ( c p ) 甲醇( h p l c ) 焦性没食子酸( c p ) s i g m a 公司 青岛海洋化工厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海马陆制药厂 上海联试化工试剂有限公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 第9 页 江南大学硕士学位论文 t u - 1 8 0 0 紫外可见分光光度计 微量进样器 紫外分析仪( 2 5 4n m ) 9 0 - 1 型恒温磁力搅拌器 旋转蒸发器r - 2 0 1 恒温水浴锅w 2 0 1 d 循环水式多用真空泵s h b b 9 5 台式高速离心机t g l 6 薄层色谱展开缸 2 2 2 菌种 北京普析通用仪器有限责任公司 宁波市镇海玻璃仪器厂 上海科艺光学仪器厂 上海沪西分析仪器厂 上海申科机械研究所 上海申顺生物科技有限公司 郑州长城科工贸有限公司 中国科学院武汉科学仪器厂 上海信谊仪器厂 三孢布拉氏霉b l a k e s l e a 矿i s p o r aj s f 4 ( f l 旭苏省微生物研究所提供1 。 。 2 2 3 培养基 2 2 3 1 斜面培养基：p d a 培养基。 2 2 3 2 种子培养基( g l ) ：淀粉4 0 ：葡萄糖2 0 ：玉米浆5 0 ：k h 2 p 0 41 ；m g s 0 40 1 ； v b l0 0 1 ：p h6 4 。 2 2 3 3 发酵培养基( g 几) ：淀粉2 0 ：黄豆饼粉4 0 ：玉米浆3 0 1k h 2 p 0 4l ；m g s 0 4o 1 ； v b lo 0 1 ；大豆油2 5 1p h6 7 。 2 2 4 培养方法 2 2 4 1 种子培养 将斜面上的少量菌丝接种于种子培养基( 装液量5 0m l 2 5 0m l ) ，置2 7 、2 1 0r m i n 的旋转摇床上振荡培养4 2h 。 2 ，2 4 2 发酵培养 将培养好的种子以1 5 c c n ) 的按种量转入发酵培养基( 装液量4 0m l 5 0 0m e ) ，置2 7 、2 2 0r m i n 的旋转摇床上振荡培养7 2h 。 2 2 5 发酵菌体提取液及辅酶q l o 标准品溶液的制备 将菌体移入5 0 0 m l 平底烧瓶内，加入焦性没食子酸、k o h 、甲醇及少量去离子水混匀。 在9 0 水浴锅中回流3 0 m i l l 郴】后，用自来水迅速冷却至室温，倒入分液漏斗，加石油醚萃取 辅酶q 1 0 ，多次萃取，合并萃取液，用去离子水洗涤至中性，加无水硫酸钠干燥。用旋转蒸发 仪浓缩，得供试品溶液。 一9 精密称取辅酶q i o 标准品1 0 0 0 0m g ，置2 5m l 容量瓶中，加2 0m l 无水乙醇将其溶解，并 稀释至刻度，制成4 0 0l ig m l 的标准品溶液。 * 2 2 6 薄层层析 t l 2 2 6 1 制板 称取硅胶h f 2 5 43g ，加1 0m lo 3 的羧甲基纤维素钠溶液，搅拌成糊状，均匀地铺在1 9 5 第l o 页 第一章三孢布拉氏霉中辅酶q ，。的分离及含量测定 9 5c m 洁净玻璃板上，自然风干。1 0 5 活化1h ，放入干燥器内，备用。 2 2 6 2 点样及展层 用微量注射器将样品溶液带状点样于活化好的硅胶板上，点样量为1 0 0ul ，点样线距 底边2 0c m ( 标准品点状点样，点样量为5 0ul ) 。将薄板置于层析缸内，室温下展层，溶剂 上行移动1 5c m ，挥干展层剂，在紫外灯下定位，r f 值计算公式为：r f = 展层后斑点与原点 的距离展层原点与溶剂前缘的距离。 2 2 7 薄层层析加样回收率试验 精密移取1 0 0 ul 的样品溶液六份，分别在其中的三份中加入2 5i ll 辅酶q l o 标准品， 在剩余三份样品中加入5 0 ul 辅酶q l o 标准品，充分混匀后带状点样于同一块薄板上，展 层后刮下与辅酶q l o 标准品相同r f 值的色带，溶于无水乙醇中，测定其辅酶q 1 0 含量。 2 3 结果与讨论 2 3 1 展层系统的选择 展层剂的选择应能使待测组分很好地溶解；使待测组分与杂质分开，而待测各组分之 间也能达到较好的分离效果；展层后组分斑点集中，无拖尾现象；r f 值最好在0 4 ，o 5 等i 4 7 1 。 展层剂的选择原则主要以溶剂的极性大小为依据，溶剂的极性愈大，对同一化合物的洗脱 能力也愈大，即在薄板上把它推进得愈远，r f 值也愈大。薄层层析分离菌体萃取液中的辅 酶q i o 通常采用石油醚和乙醚的混合展层剂m j ，在石油醚中加入不同体积的乙醚，其分离 效果见表2 1 。 表2 1 混合展层剂对r f 值的影响 t a b2 1e f r e c to f m i x e ds o l v e n to nr f 从表2 1 可以看出，采用混合展层剂石油醚( 6 0 9 0 ) ：乙醚( 2 0 ：3 ) 能得到很好的分离 效果，见图2 1 ，展层后带状斑点清晰集中，无拖尾现象。 第l i 贝 江南大学硕士学位论文 样品1 标准晶样品2 图21 供试样品与标准品的薄层层析图 f t 9 2 1t h e p t c t u r e o f t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h f o r t h es a m p l e sa n ds t a n d a r d 2 3 2 辅酶q l o 的分析鉴定 采用紫外分光光度法和高效液相色谱法对与辅酶q l o 标准品具相同r f 值的色带进行分 析鉴定。 2 3 2 1 紫外分光光度法 将薄板上的辅酶q l o 标准品及与其相同r f 值的色带刮下，分另放入小塑料管中，加4 m l 无水乙醇溶解，充分振荡后离心，取上层清液，置石英比色皿中，以无水乙醇为对照，在 紫外分光光度计上于3 2 0 2 3 0n m 波长范围内扫描其吸收光谱( 氧化型) ，然后在对照池及样 品池中同时加入等量还原剂- n a b h 4 溶液( 2 0m g n a b l 4 _ 4 溶于3m l 无离子水) ，振荡，待 气泡完全消失后，扫描其吸收光谱( 还原型) ，所有吸收图谱见图2 2 。 图22 辅酶q i o 的紫外吸收光谱( 乙醇) 薄层上刮下的色带；一辅酶q 1 0 标准品 f i g22a b s o r p t i o ns p e c t r ao f c o e n z y m eq 1 0 由图2 ，2 可知，该色带的氧化型及其还原型图谱均与辅酶q l o 标准品及其还原型的图谱 相吻合，即最大吸收峰均分别在2 7 5 砌和2 9 0n n l ，初步证明该色带为辅酶q 1 0 0 第1 2 页 第二章三孢布拉氏霉中辅酶q o 的分离及含量测定 2 3 2 2 高效液相色谱法 将该色带与辅酶q l o 标准品的乙醇溶液进行高效液相色谱分析，其色谱条件为： s p h e r i s o r b c l 8 色谱柱，以甲醇无水乙醇( 体积比为h1 ) 为流动相，检测波长2 7 5 m n ，进样 量2 0p l 。所得的色谱图见图2 3 。 辅酶 带 宅 ， 一 j【o r 7 t 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 一l 。l - 一l 。i 一i 一i 7 5101 2 51 51 7 52 0 t r a i n7 51 01 2 ，51 5 7 ，52 02 2 a 图2 3 试样( 色带) 及辅酶q 1 0 标准品的高效液相色谱分析色谱图 f i g2 3a h p l ca n a l y s i sg r a p ho f t h es a m p l ea n ds t a n d a r ds a m p l e 由图2 3 可知，被t l c 分离出的与辅酶q 1 0 标准品具相同r f 值的色带中仍含有丽种物 质，而其中的一种物质保留时间为1 5 1r a i n ，与辅酶q 1 0 标准品的保留时间相同，可见，三 孢布拉氏霉合成的确为辅酶q i 0 。 2 3 3 紫外分光光度法测定菌液中辅酶q l o 含量 辅酶q 1 0 在无水乙醇的1 溶液中，于波长2 7 5i l r f l 处氧化型与还原型的吸收度差值为 1 4 2 ，即e 1 1 。m o x - r e d = 1 4 2 4 s l ，利用此特征吸收系数，可以进行辅酶q l o 的含量测定。以无 水乙醇作空白对照，测定样品的乙醇溶液在波长2 7 5n n l 处的吸光度彳j ，将样品用硼氢化钠 溶液还原，测定同一波长下的吸光度也，则溶液中辅酶q i o 的浓度c 可按下式计算： “，4 2 ) 1 0 4 c = 1 4 2 ( 其中f 单位为i ig m e ) 2 3 4 薄层层析加样回收率试验 薄层层析加样回收率试验结果总结于表2 2 。由表2 2 可知，该实验方法的平均回收率为 8 2 8 ，r s d 为1 4 9