（动物遗传育种与繁殖专业论文）鸡胚性分化早期性别差异表达mirnas的鉴定及其特性分析.pdf

国家自然科学基金资助项目 ( 3 0 8 0 0 7 8 1 和3 0 6 7 1 4 9 4 ) s u p p o r t e db y t h en a t i o n a l n a t u r a ls c i e n c ef o u n d a t i o n p r o j e c t ( 3 0 8 0 0 7 8 1a n d3 0 6 7 1 4 9 4 ) 华中农渡大学学位论文独创性声明及使用授权书 学像论文 怒甭傻密否 如需保密，解密时间年月溺 独创性声明 本人声躜掰里受的论文是我个人在导师指导下迸行的研究工作及取得的磅究 残暴。尽我所知，除了文孛特别加1 , i 标注和致谢的地方外，论文中不包含箕钝人已 经发袋或撰写过的研究成累，也不包含为获褥华中农鼗大学或其他教窍搋构酶学位 或证书褥使用过的材辩，籀导教舜对茈避行了审定与我一溺工作鹩同态对本研究 辑徽的任何贾黻均巴在论文争做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：量格 时阍：纠p 年弗月 l l 露 学位论文使用授权书 本人宛全了解华中农韭大学关予保存，使用学位论文的规定，印学生必须按照 学援要求提交学位论文的印嗣本和电子舨本；学校有权保存提交论文酶印刷版和电 子舨，并提供露录检索和暖览暇务，可以采用影印缩印或扫描等复刳手段缳存 汇编学位论文。本人圈意华中农夔太学= - t 以罔不臻方式在不同媒体上发袭传撩学 位论文的全部残部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文纳权力 藏：保密学位论文( 印涉及技术秘密商曼秘密或申请专稠等潜在甓要提交铩密的 论文) 在解密后适用于本授板书 学位论文作者签名：黄杏 导师签名：钧麓确 零名舅甥：加嗨每而碍l ib 签名日期： 油扣年6 月l l 露 ? f ：港夥冬天l l 缓装ij 住学 论文的摩蜒羊 袋之闻 鸡胚性分化早期性别差异表达m i r n a s 的鉴定及其特性分析 目录 摘要i a b s t r a c t 。i i 缩略词表i v 1 前言11 日u 舌1 1 1 研究问题的由来1 1 2 文献综述2 1 2 1m i r n a 简介2 1 2 1 1m i r n a 的发现、特征及其命名2 1 2 1 2m i r n a 的生物发生过程及其作用机制。3 1 2 2m i r n a 对发育事件的调控作用5 1 2 2 1m i r n a 对发育时序的调控5 1 2 2 2m i r n a 对肌肉发育的调控5 1 2 2 3m i r n a 对神经系统发育的调控6 1 2 2 4m i r n a 对胚胎早期发育的调控6 1 2 2 5m i r n a 对生殖发育的调控7 1 2 2 6m i r n a 在其它组织器官发育过程中的作用7 1 2 3m i r n a 表达的检测技术8 1 2 3 1n o r t h e r nb l o t 8 1 2 3 2i s h 8 1 2 3 3 基因芯片9 1 2 3 4r t - p c r 1 0 1 2 3 5 测序法1 1 1 3 研究目的和意义1 2 2 材料与方法1 3 2 1 材料。：1 3 2 1 1 样品1 3 2 1 1 1 用于克隆的d n a 样品1 3 2 1 1 2 用于时间表达谱分析的鸡胚样品1 3 2 1 1 3 用于空间表达模式分析的鸡胚样品1 3 2 1 2 所用试剂和试剂盒13 2 1 2 1 主要试剂和试剂盒1 3 2 1 2 2 主要试剂的配制1 4 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 2 1 3 主要仪器设备1 6 2 1 4 生物信息学分析相关的软件和数据库1 6 2 2 方法1 7 2 2 1 鸡新m i r n a s 的结构分析1 7 2 2 1 1 鸡新m i r n a s 的染色体物理定位1 7 2 2 1 2m i r - 3 6 3 和3 6 3 * 前体结构的克隆1 7 2 2 1 3 鸡新m i r n a s 的前体结构预测1 7 2 2 1 4m i r - 3 6 3 和m i r - 3 6 3 * 、m i r - 5 51 b 前体的同源性分析1 7 2 2 2 鸡胚d n a 、r n a 的提取及性别鉴定1 8 2 2 2 1d n a 的提取及性别鉴定1 8 2 2 2 2 鸡胚性腺总r n a 的提取及质量检测18 2 2 3 时间表达谱分析1 9 2 2 3 1r n a 加尾以及引物延伸的r t - p c r 方法扩增m i r n a s 1 9 2 2 3 1 1 相关引物的设计1 9 2 2 3 1 2 总r n a 的纯化、加尾以及e d n a 第一链的合成2 1 2 2 3 2 茎环状引物的r t - p c r 方法扩增m i r n a s 2 2 2 2 3 2 1 相关引物的设计2 2 2 2 3 2 2e d n a 第一链的合成2 2 2 2 3 3m i r n a s 的扩增、检测以及半定量分析。2 3 2 2 4 空间表达模式分析2 5 2 2 4 1 探针的合成以及纯化2 5 2 2 4 2 斑点杂交检测探针标记效率和量2 7 2 2 4 3 胚胎干粉的制备以及f a b 片段的预吸附2 7 2 2 4 4w i s h 程序2 8 3 结果与分析3 0 3 1 鸡新m i r n a s 的结构分析3 0 3 1 1 鸡新m i r n a s 的染色体物理定位3 0 3 1 2m i r 3 6 3 和3 6 3 * 前体结构的克隆3 0 3 1 3 鸡新m i r n a s 的前体结构预测3 l 3 1 4 m i r - 3 6 3 ( m i r - 3 6 3 宰) 和m i r - 5 5 1 b 前体的同源性分析3 2 3 2 鸡胚性别鉴定以及r n a 提取3 4 3 3 时间表达谱分析。3 5 3 3 1m i r 一3 6 3 和3 6 3 * 的表达及比较3 5 鸡胚性分化早期性别差异表达m i r n a s 的鉴定及其特性分析 3 3 2 雌性高表达的m i r n a s 3 7 3 3 3 雄性高表达的m i r n a s 3 9 3 3 4 其它m i r n a s 的表达4 2 3 4 空间表达模式分析4 3 3 4 1 斑点杂交结果4 3 3 4 2g g a m i r - 3 6 3 的表达。4 4 3 4 3g g a m i r 一181 0 的表达4 5 4 讨论4 7 4 1m i r n a 的保守性。4 7 4 2 新m i r n a 的确认4 7 4 3m i r n a 的表达谱4 8 4 4m 1 r n ai s h 方法的改进4 9 4 5 早期鸡胚性分化相关候选m i r n a s 的功能分析。4 9 4 5 1m i r - 3 6 3 功能的预测4 9 4 5 2m i r - 1 8 1 0 功能的预测5 0 4 5 3m i r - 2 0 0 b 、m i r - 1 5 9 9 和m i r - 5 5 l b 功能的预测5 1 5 小结。5 2 5 1 本研究所取得的结果5 2 5 2 本研究的创新点和特色一5 2 5 3 下一步需要研究的问题5 3 参考文献5 4 致 射6 2 在读期间发表的论文6 3 鸡胚性分化早期性别差异表达m i r n a s 的鉴定及其特性分析 摘要 m i r n a 是近年来新发现的一类在转录后水平下调基因表达的小分子非编码 r n a 家族。研究发现，m i r n a 在动物发育过程中发挥着重要作用，但它在鸡胚性 腺分化中的调控作用还未确定。为研究m i r n a 在鸡胚早期性分化过程中的表达， 探讨m i r n a 在性腺早期发育中的作用，本研究以前期芯片筛选出的差异表达 m i r n a s 为研究对象，对其中新的m i r n a s 进行生物信息学分析，并分析了候选 m i r n a s 在雌、雄鸡胚早期性腺中的时空表达模式。本研究所取得的结果如下： 1 利用鸡基因组信息对新m i r n a s 进行定位，发现m i r - 3 6 3 和3 6 3 * 、m i r 一5 5 1 b 和m i r - 6 1 2 分别位于鸡染色体4 ( ) 、9 ( ) 和z ( 一) 上，同时通过克隆获得了m i r - 3 6 3 * 在鸡基因组上的未知侧翼序列。前体的二级结构折叠结果表明，预测的鸡新m i r n a s 均具有茎环状前体结构，成熟序列基本位于相应的茎部，且折叠最低自由能均s 2 5 k c a l m o l 。m i r - 3 6 3 ( 3 6 3 * ) 和m i r 5 5 1 b 在人、大鼠、小鼠和鸡4 个物种中的同源性 分析结果表明，前体序列的相似性均在8 0 以上，且成熟序列中仅有个别碱基的差 异。 2 利用r n a 加尾及引物延伸和茎环状引物的半定量r t - p c r 方法分析了1 3 个 m i r n a s 在e 3 5 6 5d 雌、雄鸡胚性腺中的时间表达谱，并对它们在同一时期不同 性别中以及同一性别不同时期中的差异性进行了显著性分析。结果表明，从总体趋 势看，所检测m i r n a s 中有5 个呈雌性高表达和4 个呈雄性高表达，其余4 个为不 规则表达；m i r - 3 6 3 、m i r - 2 0 0 b 、m i r - 1 8 1 0 、m i r - 1 5 9 9 、m i r - 5 5 1 b 和m i r - 1 9 6 在所 检某些时期两性间的差异表达达到显著或极显著水平；m i r - 3 6 3 、m i r - 1 4 5 6 、 m i r - 1 9 6 、m i r - 3 6 3 、m i r 一6 1 2 、m i r - 1 5 9 9 、m i r - 1 2 6 和m i r - 1 8 1 0 在同一性别某些时 期间的表达存在显著或极显著差异。 3 利用w i s h 技术对m i r 3 6 3 和m i r - 1 8 1 0 进行空间表达模式分析，结果表明， m i r - 3 6 3 主要在e 4 5d 鸡胚的四肢、外胚层、脊索以及脑等部位表达，在e 6 5d 性 腺部位的表达明显高于肾脏，且在雌性性腺中的表达高于雄性；m i r - 1 8 1 0 主要在 e 4 5d 鸡胚的脑和四肢表达，在e 6 5 及e 8 5d 性腺中表达高于肾脏，且雄性性腺中 的表达高于雌性。 结合本研究结果及其它物种中相应m i r n a 的研究，筛选了5 个( m i r 3 6 3 、 m i r - 5 5 1 b 、m i r - 1 8 1 0 、m i r - 1 5 9 9 和m i r - 2 0 0 b ) 可能参与早期鸡胚性腺发育过程的 m i r n a s 作为下一步研究的对象。 关键词：m i r n a ；鸡；性腺发育；时间表达谱；空间表达模式 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 a bs t r a c t m i r n ai sa g r o u p o fr e c e n t l yd i s c o v e r e d , s m a l l ，n o n - c o d i n gr n a ，w h i c h d o w n r e g u l a t eg e n ee x p r e s s i o na tt h ep o s t t r a n s c r i p t i o n a ll e v e l m i r n a sh a v eb e e n p r o v e dt op l a yi m p o r t a n tr o l e sd u r i n gt h ep r o c e s so fd e v e l o p m e n t , b u ti t sf u n c t i o no nt h e c h i c k e ns e x u a ld i f f e r e n t i a t i o ni su n c e r t a i n i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o nd u r i n g t h ee a r l ys t a g e so f g o n a ds e x u a ld i f f e r e n t i a t i o na n de x p l o r et h ee f f e c to fm i r n a o ng o n a d d e v e l o p m e n ti nc h i c k e n ，ab o d yo fm i r n a sw i t hs e x u a ld i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s i o nw e r e p r e l i m i n a r ys e l e c t e db a s e do nt h er e s u l t so fm i r n ac h i p s ，i nw h i c ht h en o v e lm i r n a s w e r ea n a l y z e db yb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d s ，a n dt h e t e m p o r a la n ds p a t i a le x p r e s s i o n p a t t e r n so fc a n d i d a t e dm i r n a si nf e m a l ea n dm a l eg o n a d so fc h i c k e ne m b r y ow e r e s t u d i e d t h er e s u l t so b t a i n e dw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h ec h r o m o s o m e sm a p p i n go fn e wm i r n a sw e r ea n a l y z e dt h r o u g hc h i c k e n g e n o m ei n f o r m a t i o n ，m i r - 3 6 3a n d3 6 3 掌，m i r - 5 5l ba n dm i r - 6 1 2w e r em a p p e dt ot h e 4 ( - ) ，9 ( 一) a n dz ( 一) a n dt h eb k n o w nf l a n k i n gs e q u e n c eo fm i r - 3 6 3 幸i nc h i c k e ng e n o m e w a so b t a i n e db yc l o n i n g s e c o n d a r ys t r u c t u r ea n a l y s i so fp r e c u r s o rs h o w e dt h a ta l l p r e d i c t e dc h i c k e nn o v e lm i r n a sp o s s e s s e ds t e m - l o o pp r e c u r s o rs t r u c t u r e s ，m a t u r e s e q u e n c e sl o c a t e di nt h es t e m so ft h ec o r r e s p o n d i n gh a i r p i n s ，a n dt h el o w e s tf r e ee n e r g y w a s - 2 5k c a l m 0 1 h o m o l o g ya n a l y s i sa m o n gh u m a n , r a t ，m o u s ea n dc h i c k e ns u g g e s t e d t h a tt h es i m i l a r i t i e so fp r e c u r s o rs e q u e n c ew e r ea l la b o v e8 0 ，a n do n l yo n eo rt w ob a s e s d i f f e r e n c ee x i s t e di nm a t u r es e q u e n c e s 2 t e m p o r a le x p r e s s i o np r o f i l e so f13m i r n a si nf e m a l ea n dm a l ec h i c k e ne m b r y o g o n a d sa te 3 5 - - 6 5dw e r es t u d i e db yr n at a i l i n ga n dp r i m e re x t e n s i o na n ds t e m - l o o p p r i m e rr t p c rm e t h o d s ，a n ds i g n i f i c a n ta n a l y s i sb e t w e e nd i f f e r e n ts e x e sa tt h es a m e s t a g ea n dd i f f e r e n ts t a g e si nt h es a m es e xw e r ec a r r i e do u t 1 1 1 er e s u l t si n d i c a t e dt h a t5 鸡胚性分化早期性别差异表达m i r n a s 的签定及j 特性分析 t h a ns u r r o u n d i n gk i d n e y sw i t hh i g h e re x p r e e s i o ni nf e m a l eg o n a d st h a nt h a ti nm a l ei n e 6 5du g s s m i r - 1810e x p r e s s e dm a i n l ya tb r a i na n dl i m bb u d si ne 4 5dc h i c k e n e m b r y o ，a n dh i g h e ri ng o n a d st h a ns u r r o u n d i n gk i d n e y sw i t hh i g h e re x p r e s s i o ni nm a l e g o n a d st h a nt h a t i nf e m a l ei ne 6 5da n d8 5dg o n a d s c o m b i n e do u rr e s u l t si np r e s e n ts t u d yw i t hs t u d i e so fc o r r e s p o n d i n gm i r n ai no t h e r s p e c i e s ，5m i r n a s ( m 诹- 3 6 3 ，m i r - 5 51 b ，m i r 一1810 ，15 9 9a n d2 0 0 b ) w h i c hm i g h tb e i n v o l v e di nt h ep r o c e s so fe a r l yc h i c k e ne m b r y o n i cg o n a d a ld e v e l o p m e n tw e r es c r e e n e d a st a r g e t sf o rf u r t h e rr e s e a r c h k e yw o r d s ：m i r n a ；c h i c k e n ；g o n a dd e v e l o p m e n t ；t e m p o r a le x p r e s s i o np r o f i l e ；s p a t i a l e x p r e s s i o np a a e m i i i 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 缩略词表( a b b r e v i a t i o n s ) i v 鸡的性别决定与性分化是发育学、医学及畜牧学等多领域专家学者近二十年来 的研究热点。从分类学上看，鸟类是处于从低等动物到高等动物的一个重要类群， 而鸡是鸟类中一个极具代表性的物种，研究鸡性别决定及性分化的分子机制，将有 助于阐明鸟类的性别决定机制，为了解性别决定及分化基因进化过程提供有意义的 资料。从畜牧生产角度来说，鸡的性别在养鸡生产中具有重要意义，如能实现有效 的性别控制，则可极大的提高养鸡生产效率；但目前还没有可行的鸡性别控制方法， 问题的解决还需依赖于对鸡性别决定及性分化分子机制的深入研究。 自从1 9 9 0 年发现哺乳动物y 染色体上的睾丸决定基因艘y ( y 染色体上的性别 决定区域，s e x - d e t e r m i n i n gr e g i o no ft h eyc h r o m o s o m e ) 后，研究者们试图去寻找 鸡中的性别决定基因，但遗憾的是鸡中并不存在s r y 同源基因，控制睾丸或卵巢形 成的机制仍然不清楚。目前，鸡中主要存在两种性别决定假说，即z 染色体上的剂 量补偿学说以及w 染色体上的显性学说( m a r s h a l lg r a v e sa n ds h e t t y , 2 0 0 1 ) 。前一假 说认为，z 染色体上携带雄性决定基因，且有剂量效应，即两个z 染色体时为雄性， 一个z 染色体时为雌性：后一假说认为，w 染色体上可能携带着显性的卵巢决定基 因，即类似于哺乳动物中的s r y 基因，它具有显性效应使z w 成为雌性。但是在鸡 中由于缺乏一些重要的非整倍体的性染色体个体，所以很难验证着两种假说的正确 性。近年来，s m i t h 等通过比较d m r t ( d o u b l e s e x 和m a b 一3 相关的转录因子1 ， d o u b l e s e xa n dm a b 一3 r e l a t e dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r1 ) 基因敲除与未敲除鸡胚的研究表 明，敲除该基因的雄性表现出部分性反转，这一结果支持了z 染色上的剂量学说 ( s m i t he t a l ，2 0 0 9 ) ，但是最近z h a o 等的研究却认为鸡的性别决定并非由性别决定基 因决定，而是在受精时由雌、雄个体体细胞决定的( z h a oe t a l ，2 0 1 0 ) 。 在性别决定候选基因方面，目前已经分离并提出了分别代表两种性别决定假说 的z 染色体上的d m r t 基因和w 染色体上的4 s 形( 鸟类性别特异性w 连锁基因， a v i a ns e x s p e c i f i cw - l i n k e dg e n e ) 基因以及尼t ( 雌性特异性表达转录子1 ，f e m a l e e x p r e s s e dt r a n s c r i p t i o n1 ) 基因( o n e i l le ta 1 2 0 0 0 ；r e e da n ds i n c l a i r , 2 0 0 2 ) 。在性腺 分化研究方面，根据物种问性腺发育的进化保守性，已经分离得到了一批与其相关 的基因，如s 研( 类固醇因子1 基因，s t e r o i d o g e n i cf a c t o r - 1g e n e ) 、矽丌( w i l m s 肿瘤基因1 ，w i l m st u m o rg e n e ) 、s o x 9 ( 类似子s r y h m g 框的基因9 ，s r y - l i k eh m g b o xg e n e9 ) 、芳香化酶基因等( 孟和和潘玉春，2 0 0 5 ) 。纵观已有报道及我们现有的 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 研究结果，尽管鸡性别决定和性分化这一生物学过程中的作用因子不断地被挖掘和 研究，但在这一过程中起开关调控作用的性别决定因子仍不清楚，鸡的性别决定机 制仍无定论。 目前，对于鸡性别决定和性腺分化的研究主要集中在转录水平起调控作用的编 码基因，而对于转录后水平起调控作用的非编码基因的研究则鲜少报道。在本实验 室前期的研究中，在雄性c d n a 富集的消减文库中分离得到了一个呈现性别差异表 达的非编码r n a 分子( g e n b a n k 登录号为e f 4 2 2 2 1 2 ) ；并且有研究已经报道，在黑腹 果蝇中至少存在1 2 0 个参与性生殖功能遗传控制的非编码r n a ( 杨勇飞等，2 0 0 7 ) ； 这表明非编码r n a 在动物性腺发育中的调控作用是不容忽视的，可能涉及鸡胚性腺 发育过程。近年来发现m i r n a 介导的基因表达在动物发育中具有广泛的调控作用， 特别是与一些动植物的生殖发育相关，为我们从新的层面上寻找鸡的性别决定和性 分化调控因子，为全面阐明鸡性别决定分子调控机制提供了新的线索与思路。 1 2 文献综述 1 2 1m i r n a 简介 1 2 1 1i i l i r n a 的发现、特征及其命名 1 9 9 3 年，l e e 等在对秀丽隐杆线虫( c e 锄弘凇) 的研究中发现了第一个定时调控胚 胎后期发育的基因1 i n 4 ，进而发现该基因是长度为2 2n t 的小分子r n a ，不编码蛋 白质；同时n o r t h e r n 杂交分析发现了两个分别长约2 2n t 和约6 0n t 的小r n a ，并证 实了后者是前者的前体，经预测约6 0n t 的r n a 可形成茎环结构( l e ee ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 2 0 0 0 年，r e i n h a r t 等在ce l e g a n s 体内又发现了另一个小分子非编码r n a ，即l e t 7 。 进一步的研究发现这两个约2 0n t 小分子r n a 分别通过与其靶基因砌一j 4 和，砌一彳j 的3 u t r 互补配对，抑制靶基因的翻译，调节幼虫第一期向第二期的过渡和晚期幼 虫向成虫的过渡( r e i n h a r te ta 1 ，2 0 0 0 ) 。2 0 0 1 年，世界不同国家的3 个研究小组在线 虫( c e l e g a n s ) 、果蝇( d m e l a n o g a s t e r ) 和人体中均发现了这种长度为2 1 - - 2 2n t 的非编 码小分子r n a ，将其命名为m i r n a ( l a g o s q u i n t a n ae t a ，2 0 0 1 ；l a ue t a l ，2 0 0 1 ；l e e a n da m b r o s ，2 0 0 1 ) 。 m i r n a 是一类长度约为2 2n t 的非编码调控小r n a 家族，其特征主要表现在以 下几个方面：广泛存在于生物中，是一类长度约2 0 - 2 4n t 的非编码调控单链小分 子r n a ，由一段具有发夹环结构的长度为7 0 , - - 8 0n t 的单链p r e m i r n a 剪切后生成； 成熟的m i r n a ，有5 端磷酸基和3 端羟基。m i r n a 在各个物种间具有高度的进 化保守性，并且在茎部的保守性更强，但环部可以容许更多突变位点的存在。 2 鸡胚性分化早期性别差异表达m i r n a s 的鉴定及其特性分析 m i r n a 基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分 定位于基因间隔区。m i r n a 的表达具有时间特异性和组织特异性( l e ee ta 1 。1 9 9 3 ； r e i n h a r te ta 1 ，2 0 0 0 ) 。m i r n a 及其前体可用n o r t h e r nb l o t 验证。 除最先发现的l i n - 4 和l e t 7 外，其它m i r n a 均以m i r - # 表示，其中m i r 表示 m i r n a ，“群”代表其序号，用斜体的m i r - # - - - 表示其相应的基因( l a g o s q u i n t a n ae ta l 2 0 0 1 ) 。不同物种中相同的m i r n a 采用相同的序号，如以h a s m i r - 1 表示人中的 m i r 1 ，g g a m i r 1 表示鸡中的m i r - 1 ，前三个字母代表其来源组织。如果同一个 m i r n a 基因具有不同的转录本，那么在其名称后后加一数字加以区分，如m i r 6 1 ， m i r - 6 2 ；高度同源的来自同一家族的m i r n a ，可在其名称后加一小写字母加以区 分，如l e t 7 a ，l e b 7 b ；来源于同一前体不同茎上的2 个m i r n a s ，用* a n 以区分，如 m i r 2 0 2 ，m i r 2 0 2 * ，一般而言，表达量水平较低或是最终降解的m i r n a 用宰表示。 1 2 1 2m i i 矾a 的生物发生过程及其作用机制 图1 所示的是m i r n a 的生物发生过程及作用机制。首先，细胞核内编码m i r n a 的基因在r n a 聚合酶i i 的作用下转录成p f i m i r n a 。在d r o s h ar n a s e 的作用下， p f i - m i r n a 被剪切为约7 0n t 且具有茎环结构的p r e - m i r n a ( l e ee ta 1 ，2 0 0 3 ) ，然后由 r a n g t p 依赖的核质转运蛋白e x p o r t i n 5 将其从细胞核内转运到细胞质中( l u n de t a 1 ，2 0 0 4 ) 。在细胞质中，p r e m i r n a 在d i c e r 酶的作用下，被剪切成长度约2 2n t 的 m i r n a ：m i r n a * 双螺旋结构( m i r n a * 是m i r n a 的互补序列) ；随后，在解旋酶的 作用下，双螺旋解链，其中的一条链结合到r i s c 中，形成非对称性的r i s c 复合物 去结合靶基因，从而引起靶基因的降解或是翻译抑n ( l e ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 。大多数情况 下，双螺旋中的m i r n a 链结合到r i s c 中去识别靶基因，而另一条m i r n a * 链则降 解，这是由于成熟m i r n a 的产生总是趋向于选择5 端更不稳定的一条链，导致 m i r n a 链被选中的机会要远远高于m i r n a * 。但已有研究表明，在极少数的情况， m i r n a ：m i r n a * 双螺旋中的两条链具有相似的5 端稳定性，导致成对m i r n a s 的 产生( s c h w a r ze ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 生物体内，m i r n a 主要通过与其靶基因3 u t r 的互补配对，在转录后水平下调 基因的表达( k l o o s t e r m a na n dp l a s t e r k , 2 0 0 6 ) 。这种调控机制主要有三种：降解靶 m r n a 、抑制靶m r n a 的翻译以及快速脱腺苷酸化影响靶n 瓜n a 的稳定性( z h a oa n d s f i v a s t a v a , 2 0 0 7 ) ；并且m i r n a 与靶基因m r n a 之间的配对程度决定了抑制靶基因的 方式，其发挥功能的关键区域是5 端的种子序列( m i r n a5 ，端的2 8 或2 7 个核苷酸) 。 在植物中，大多数m i r n a s 完全或几乎完全与靶基因的3 u t r 互补，通过类似r n a 干 扰的机制，利用含有s l i c e r 的具有切割功能的r i s c 切割、降解m r n a ( t a n g ，2 0 0 5 ) 。在 动物中，多数的m i r n a s 与靶基因不完全配对，通过不具备切割功能的r i s c 改变靶 3 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 m r n a 核糖体的密度或是特异性地降解新合成的多肽而抑制靶m r n a 翻译( t a n g ， 2 0 0 5 ) 。 吣c 图1m i r n a 的生物发生过程及作用机制 f i g 1b i o g e n e s i sa n dm e c h a n i s mo fa c t i o no fm i r n a 研究发现，m i r n a 还可以通过其它的方式对靶基因进行调控：在基因表达调控 方面，m i r n a 通过转录因子来调控d n a 甲基化，可能参与转录水平的基因表达调 控，如在拟南芥中，m i r - 1 6 5 和m i r - 1 6 6 对转录因子p h a b u l o s a 和p h a v o l u t a 的调控( b a oe ta 1 ，2 0 0 4 ) ；除对靶基因具有抑制作用外，m i r n a 可上调靶m r n a 的 翻译水平，如m i r - 3 6 9 3 ，在细胞周期停滞时期，它通过与两个微核糖核蛋白相关因 子：a g o 蛋白和脆性x 染色体智力发育迟缓相关蛋白1 的直接作用上调肿瘤坏死因 子a 基因m r n a 的翻译水平( v a s u d e v a ne ta 1 ，2 0 0 7 ) 。在与靶m r n a 的作用位点及作 用方式方面，m i r n a 可以通过作用于靶m r n a 的5 u t r 或o r f 来调控基因的表达， 如在植物中，m i r - 3 9 9 结合p h 0 2 ( 磷酸盐2 ，p h o s p h a t e2 ) 基因的5 u t r 来实 4 鸡胚性分化早期性别差异表达m i r n a s 的鉴定及其特性分析 现对其的降解作用( v a l e n c i a s a n c h e ze ta 1 ，2 0 0 6 ) ，m i r - 17 2 通过与靶m r n a 的o r f 完全互补配对抑制靶基因的表达( d u g a sa n db a r r e l ，2 0 0 4 ) ；动物中的m i r n a 除通过 与靶基因的不完全互补配对来抑制靶基因的翻译外，还可以对其进行切割、降解， 如m i r 1 9 6 对其靶基因h o x b 8 ( 同源异型盒基因8 ，h o m e o b o xg e n e8 ) 的调控 ( m a n s f i e l de ta 1 ，2 0 0 4 ；y e k t ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。此外，m i r n a 可能作用于m r n a 以外的 非编码靶分子，通过与其它r n a 竞争结合蛋白质来实现其调控作用( d ua n dz a m o r e 2 0 0 5 ) 。 1 2 2m i r n a 对发育事件的调控作用 m i r n a 广泛存在于脊椎动物、果蝇、线虫、植物甚至病毒中( g r i f f i t h s j o n e se ta 1 ， 2 0 0 6 ) ，在真核细胞中m i r n a 占基因组的1 - - 2 。m i r n a 的主要功能是调节与个 体生长、发育、疾病发生等过程有关基因的表达，参与生命过程中一系列重要进程 ( j o h n s t o na n dh o b e r t ，2 0 0 3 ；l i me ta l ，2 0 0 3 a ) 。大量研究表明m i r n a 在动物中表现最 广泛的功能是对发育事件的调控，包括发育时序、肌肉发育、细胞分化、神经系统 发育以及胚胎发育和生殖发育等多个方面( 4 , - t 元帅和施志仪，2 0 1 0 ) 。 1 2 2 1m i r n a 对发育时序的调控 线虫是研究动物发育理想的模式系统，在生命科学的发展过程中发挥着举足轻 重的作用。在对线虫发育的研究中发现的两个m i r n a s ( 1 i n 4 和l e t - 7 ) ，分别通过与 其靶基因砌- j 4 和，加一4 j 的相互作用调控线虫的发育。研究表明1 # 7 4 与，f 玎j 4 基因 m r n a 的3 u t r 互补配对，下调砌一j 4 蛋白质表达水平，控制线虫幼虫由l 1 期向 l 2 期过渡( l e ee ta 1 ，1 9 9 3 ) 。l e t - 7 是在线虫中发现的第二个与发育时序相关的 m i r n a ，它的作用机制与1 i n 4 相似，通过与砌彳j 基因m r n a 的3 u t r 互补配对， 抑制砌4 j 的翻译，调控线虫幼虫l 4 期向成虫的演变( r e i n h a r te ta 1 ，2 0 0 0 ) 。随后在 线虫中发现的m i r - 4 8 、m i r - 8 4 和m i r - 2 4 1 通过靶向作用于h b l - 1 ( 驼背蛋白质的直系 同源物l ，h