（生物化学与分子生物学专业论文）ubiquitinlike家族蛋白溶液结构与分子作用机制研究.pdf

摘要 摘要 蛋白质翻译后修饰是蛋白质功能调节的重要手段之一，涉及到蛋白质降解、 信号转导、染色体装配、d n a 损伤修复等重要的生物学功能。目前已知的翻译 后修饰包括磷酸化、乙酰化、糖基化、泛素化、甲基化等。在这些翻译后修饰中， 泛素蛋白家族包含大约十几种相关的蛋白质，目前研究比较透彻的是泛素 ( u b i q u i t i n ) 蛋白和s u m o ( s m a l lu b i q u i t i n 1 i k e p r o t e i n s ) 蛋白。我们的研究工作 主要集中在两个方面：一个是锥体虫t r y p a n o s o m ab r u c e i 中s u m o 蛋白 ( t b s u m o ) 的溶液结构和人u b c 9 的相互作用；另一个是原核生物 u b i q u i t i n 蛋白( p u p ) 的溶液结构及与m p a 相互作用的研究。 锥体虫t r y p a n o s o m ab r u c e i 是一种古老的单细胞的原生生物，主要寄生在人 和牛的体内，造成人的嗜睡病和牛的那加那病。我们实验室的廖善晖同学通过 r n a i 的方法证明了s u m o 蛋白在锥体虫中细胞有丝分裂中起重要作用。我们利 用核磁共振方法研究t r y p a n o s o m ab r u c e i 中s u m o 蛋白的三维溶液结构，这是第 一个被解析出来的原生生物中s u m o 蛋白的溶液结构。通过核磁的溶液结构研究 发现，t b s u m o 的溶液结构具有典型的u b i q u i t i n 折叠构像，由5 个b 折叠和两个q 螺旋组成。与其他已知的s u m o 蛋白结构相比，t b s u m o 蛋白在氨基端含有一 段较长的无规卷曲序列，长度达至1 j 3 2 个氨基酸残基。为了研究t b s u m o 和e 2 酶 的相互作用，我们用化学微扰的方法研究了t b s u m o 与人e 2 ( t r y p a n o s o m a b r u c e i 中的e 2 酶尚未找到) 酶u b c 9 的相互作用界面，发现t b s u m o 与u b c 9 的主 要相互作用界面集中在b 片层上，相互作用方式主要以疏水相互作用和静电相互 作用为主。通过研究我们发现锥体虫中的s u m o 蛋白在结构和u b c 9 的结合方式在 进化上是保守的。 u b i q u i t i n 蛋白在真核生物中可以作为信号分子介导蛋白质到蛋白酶体中进 行水解。己知在结核杆菌中有蛋白酶体复合物，但是一直以来在原核生物中都没 有发现类 g u b i q u i t i n 介导蛋白水解的方式，直至1 1 2 0 0 8 年人们首次在结核杆菌中发 现了原核生物的u b i q u i t i n 蛋白( p u p ) 。并确定t p u p 蛋白在结核杆菌中介导底物 蛋白的水解。p u p 是一个由6 4 个氨基酸编码的小蛋白质，与真核生物0 0 u b i q u i t i n 蛋白一样，在p u p 的羧基端含有两个连续的甘氨酸残基。我们通过p u p 与真核生 物q u u b i q u i t i n t 构序列比对发现它与真核中u b i q u k i n 蛋白的序列同源性非常低，二 级结构预测也显示其具有不同于真核u b i q u i t i n 蛋白的二级结构。在实验方面我们 利用c d 和n m r 方法显示p u p 是一个天然无规蛋白( i d p ) ，1 h 1 5 nn o e $ 1 1 c s i 方 法显示在p u p 的羧基端有一些残留的二级结构。之后我们利用n m r 方法确定了 摘要 p u p 蛋白中各氨基酸的化学位移，同时我们用s p r 方法和化学微扰的方法研究了 p u p 蛋白与m p a ( m y c o b a c t e r i u mp r o t e a s o m a la t p a s e ) 蛋白的相互作用。m p a 是原核 生物中蛋白酶体的具有a t p a s e 功能的一个调节亚基，它能够与p u p 相互作用把底 物带到蛋白酶体中进行水解。研究结果表明p u p 和m p a 是种强疏水相互作用， 作用区段主要集中在羧基端的3 0 5 9 的氨基酸区域。同时我们还在进化角度上用 进化树对p u p 蛋白的进化进行分析，发现p u p 蛋白是个在进化树上独立的分支， 这也可以解释为什么p u p 蛋白的结构与真核的u b i q u i t i n 结构有很大的差别。这是 在国际上首次发现的原核生物q b u b i q u i t i n 的蛋白是一个天然无规蛋白质，这个研 究为后续的原核q b u b i q u i t i n 的功能研究和作用机制提供实验上的依据。 关键字：s u m o ，u b i q u i t i n ，核磁共振波普，p u p ，溶液结构，蛋白一蛋白相互作 用 i l a b s t r a c t a bs t r a c t p o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o ni sa ni m p o r t a n tm e c h a n i s mt h a tr e g u l a t e saw i d e v a r i e t yo fc e l l u l a r e v e n t ss u c ha sp r o t e i nd e g r a d a t i o n ，s i n g a lt r a n s d u c t i o n ，g e n e e x p r e s s i o n ，c e l lc y c l e ，a n dd n ar e p a i r p o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n si n c l u d e p h o s p h o r y l a t i o n ，a c e t y l a t i o n ，m e t h y l a t i o n ，g l y c o s y l a t i o n ，u b i q u i t y 7 l m i o na n ds oo n u b i q u i t i np r o t e i n sf a m i l yi n c l u d e sm o r et h a nt e np r o t e i n s s of a r , m a n ys t u d i e sh a v e b e e nf o c u s e do nu b i q u i t i na n ds u m o ( s m a l lu b i q u i t i n - l i k ep r o t e i n s ) o u rs t u d i e sc a n b ed e v i d e di n t ot w op a r t s ：o n ei sa b o u tt h es t u d yo fs o l u t i o ns t r u c t u r eo fs u m oo f t r y p a n o s o m ab r u c e ia n di t si n t e r a c t i o nw i t hh u b c 9 ；t h eo t h e ri sa b o u tt h es t r u c t u r a l s t u d yo fp u pa n di t si n t e r a c t i o n 、 ，i t hm p a ( m y c o b a c t e r i u mp r o t e a s o m a la t p a s e ) t r y p a n o s o m ab r u c e ii st h em o s ta n c i e n tu n i c e l l u l a re u k a r y o t i co r g a n i s mt h a t c a u s e ss l e e p i n gs i c k n e s si nh u m a na n dn a g a n ad i s e a s e si na n i m a l s i nt h i ss t u d y , w e u s en m rm e t h o dt os o l v et h es o l u t i o ns t r u c t u r eo fs u m oo ft r y p a n o s o m ab r u c e i ( t b - s u m o ) t h i si st h ef i r s ts t r u c t u r eo fs u m od e t e r m i n e di np r o t i s t t b - s u m oh a s t h et y p i c a lu b i q u i t i n f o l dc o n t a i n i n gf i v ebs t a n d sa n dt w o0h a l i x c o m p a r e dw i t h o t h e rs u m os t r u c t u r e s ，t b s u m oh a sa ne x t e n d e dr e g i o nw i t hal e n g t ho f3 2a m i n o a c i d sa tt h en - t e r m i n u s w ea l s os t u d yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt b - s u m oa n dh u m a n u b c 9 ( t h ee 2e n z y m eh a sn o tb e e ni d e n t i f i e di nt r y p a n o s o m ab r u c e is of 砷o n s u m o ，t h es u r f a c ei sc o m p o s e db yps h e e ta n ds o m el o o p s ，w h i c hi sh i g h l y c o m p l e m e n t a r yi ni t s e l e c t r o s t a t i cp o t e n t i a l sa n dh y d r o p h o b i c i t yt ot h ep o s i t i v e l y c h a r g e ds u r f a c eo fu b c 9 t h er e s u l ts h o w st h a tt h es t r u c t u r ea n db i n d i n gs u r f a c eo f t b s ij m oi sc o n s e r v e d i ne u k a r y o t i cc e l l s ，u b i q u i t i ni sa t t a c h e dt os u b s t r a c t sa sat a gt ob r i n gp r o t e i n s i n t op r o t e a s o m ef o rd e g r a d a t i o n p r o t e a s o m ei nm y c o b a c t e r i a lh a sb e e nf o u n df o r m a n yy e a r s u b i q u i t i np r o t e i ni sn o tk n o w ni np r o k a r y o t a e ，u n t i lp u p i sr e p o r t e dt ob e c o u p l e d t o p r o t e i n s ，r e n d e r i n g t h e ma ss u b s t r a t e sf o r p r o t e a s o m e m e d i a t e d d e g r a d a t i o ni nm y c o b a c t e r i u mi n2 0 0 8 p u pi sas m a l lp r o t e i ne n c o d e db y6 4a m i n o a c i d s l i k ee u k a r y o t i cu b i q u i t i np r o t e i n s ，t h e r ea r et w og l y c i n e si nt h ec t e r m i n u so f p u p s e q u e n c ea l i g n m e n ts h o w st h a tp u pa n du b i q u i t i np r o t e i n ss h a r ev e r yl o w s i m i l a r i t y d i v e r s es t r u c t u r ep r e d i c t i o n sc o m b i n e dw i t hc da n dn m rs p e c t r o s c o p i c s t u d i e sa l ld e m o n s t r a t et h a tp u pi sa ni n t r i n s i c a l l yd i s o r d e r e dp r o t e i n m o r e o v e r ， 1 h 1 5 nn o e ( n u c l e a ro v e r h a u s e re f f e c t ) d a t aa n dc s i ( c h e m i c a ls h i f ti n d e x ) a n a l y s e s i n d i c a t et h a tt h e r ei sar e s i d u a ls e c o n d a r ys t r u c t u r ea tt h ec t e r m i n u so fp u p i n 必 i i i a b s t r a c t t u b e r c u l o s i s ，m p ai st h er e g u l a t o r yc a pa t p a s eo ft h ep r o t e a s o m et h a ti n t e r a c t sw i t h p u pa n db r i n g st h es u b s t r a t e st ot h ep r o t e a s o m ef o rd e g r a d a t i o n s p r ( s u r f a c e p l a s m o nr e s o n a n c e ) a n dn m rp e r t u r b a t i o ns t u d i e si m p l yt h a tt h ec t e r m i n u so fp u p ， r a n g i n gf r o mr e s i d u e3 0t o5 9 ，b i n d st om p ap r o b a b l yt h r o u g hah y d r o p h o b i c i n t e r f a c e i na d d i t i o n ，p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sc l e a r l ys h o w st h a tt h ep u pf a m i l yb e l o n g st oa u n i q u ea n dd i v e r g e n te v o l u t i o n a r yb r a n c h ，s u g g e s t i n gt h a ti ti st h em o s ta n c i e n ta n d d e e p l y b r a n c h e df a m i l ya m o n gu b i q u i t i n l i k ep r o t e i n s t h i sm i g h te x p l a i nt h e s t r u c t u r a ld i s t i n c t i o nb e t w e e np u pa n do t h e ru b i q u i t i n l i k es u p e r f a m i l yp r o t e i n s k e yw o r d s ：s u m o ，u b i q u i t i n ，n m r ，s o l u t i o ns t r u c t u r e ，p u p ，p r o t e i n p r o t e i n i n t e r a c t i o n i v 中国科学技术大学学位论文原创性和授权使用声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任 何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究 所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学 校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名：面 i 3 重t 氢i作者签名：囱 刀d 年月6 日 t r y p a n o s o m ab ； u c e i 中s u m o 蛋白的n m r 结构研究 第一章t r y p a n o s o m ab r u c e i d ps u m o 蛋白的n m r 结构研究 1 1u b i q u i t i n 和u b i q u i t i n l i k e 蛋白家族 u b i q u i t i n 和u b i q u i t i n 1 i k ep r o t e i n s ( u l p ) 能够共价的结合到底物蛋白上，对 底物蛋白进行翻译后修饰。在真核细胞中这类蛋白质参与很多细胞内的重要生物 学功能，包括细胞转录、d n a 损伤修复、信号转导、蛋白质细胞内定位和细胞 周期调控等。u b i q u i t i n 和u l p 是一类家族性蛋白，它们在结构上比较相似却行使 着不同的功能，目前已知的这类蛋白包括u b i q u i t i n 、s u m o 、n e d d 8 、 i s g l 5 u c r p 、f a t l 0 、f u b l 、u b l 5 h u b l 和u 咖1 等。这些蛋白与u b i q u i t i n 蛋白 的序列同源性及其底物蛋白和一些细胞内的功能如表1 1 所示 表1 1u b i q u i t i n 类似家族蛋白及一些相关功能。r e b e c c a ll w e ta 1 2 0 0 5 m o l c e l l b i o u b l q u r i n l i k e p r o t e i n n e d d 8 ( r u b l ) s u m o - 1 s m t 3 ) s u m o 2a n d - 3 i s g l5 ，u c r p f a t lo t f u b l u b l 5f h u b l j u r m l s e q u e n c ei d e n t i t y t ou b i q u i t i n ( ) 5 8 1 8 1 6 2 9 ，3 7 2 9 3 6 3 7 2 2 1 2 a r g 81 0 a 丁g 1 21 7 1 2s u m o 蛋白 s u b s t r a t e ( s ) c u l l l n s p 5 3 m o m 2 m a n y c e b p i b1 ，t q x i l s o 黼s ei i p l c 卅j a k l s t a t l ， e r k t 2 s e r p i n2 a u n k c v 3 * m t c r 一l i k ep r o t e i n b e t - g u n k n o v m a h d l p l - k ) s p h a u d y l e t h a n o l a m i n e a 1 9 5 a t t r i b u t e df u n c t i o n ( s l r e g u l a t i o no fe g s n u c l e a ri o c a l z a t i o n t r a n s c n p t i o n a r e g u l a t i o n a n t a g o n i z i n gu b i q u 哪a t i o n 1 i a n 取：n o n a ir e g u l 8 b o n m i t o s i s i m i - n u n er e s p o n s e s i n t e r f e r o ns i l 辨il r a n s d u c t l o n a p o p t o s i s c y l o i d n es i g n a l 删u c t i o n t - c , e l ia c t i v a t i o n p r e - m r n as p l i c i n g o x i d a t t v es l r o s s 停s p o n s e r v o t r i e n ts s n s i n g 钟、r o u 9 ht h e t o rs i c j n a n gp a t h w a y ) a u l o p h a 口y c y t o p l a s m t o v a c u o l et a r g e t i n g a u t o p h a g y , c y t o p l a s m t o v a c u o l et a r g o t i n g u b i q u i t i n 和u b i q u i t i n 类似蛋白是一类共价结和到底物蛋自从而改变其功能 的一类蛋白质。s u m o ( s m a l lu b i q u i t i n r e l a t e dm o d i f i e r ) 属于u b i q u i t i n 类似蛋白 中的一种，它在1 9 9 6 年由m e l u hp b 等人首次在裂殖酵母中发现( m e l u h ，p b & k o s h l a n d ，d 1 9 9 5 ) 。s u m o 蛋白首先被发现是在实验中利用酵母双杂交证明 s u m o 蛋白是人类蛋白r a d 5 1 和r a d 5 2 、f a s 和p m l 蛋白的结合伴侣( s h e n ， z e t a t 1 9 9 6 ；o k u r a ，t e ta 1 1 9 9 6 ) ，之后的实验证明s u m o 蛋白能够共价的结合 到r a l l 一a c t i v a t i n gp r o t e i n ( r a n g a p1 ) 上( m a t u n i s ，m j e t a l ，19 9 6 ；m a h a j a n r e t a l 1 9 9 7 ) 。各种已知的文献报道s u m o 蛋白可以共价的结合到底物蛋白上对蛋白质 t r y p a n o s o m ah r u c e i 中s u m o 蛋白的n m r 结构研究 进行翻译后修饰。改变蛋白质之间的相互作用及他们的空间构象进而调节蛋白质 在细胞中的各种生物学功能。 s u m o 蛋白是一类由一百多个氨基酸组成的分子量大约1 0 k d 的蛋白质，它 具有u b i q u i t i n 类似的三维空间结构( b a y e rp e t a 1 1 9 9 8 ；m o s s e s s o v ae a n dl i m a c d 2 0 0 0 ；d i n gh s 2 0 0 5 ；s h a n gq2 0 0 9 ) 。但是通过序列比对发现s u m o 蛋白与 b u i q u i t i n l 拘序列同源性比较低( 2 0 ) 。此外，s u m o 与u b i q u i t i n 具有完全不同的 表面电荷分布。从目前已知人和酵母中的的s u m o 蛋白的序列上看到，s u m o 蛋 白质在氨基端都有一段1 0 2 5 个残基的无规卷曲序列，这种序列上的特殊性在 u b i q u i t i n 和l 其他b u i q u i t i n 相关蛋白中是没有的。s u m o 蛋白存在于所有的真核生 物细胞中，从低等的单细胞生物到高等的人细胞中都有s u m o 蛋白的存在。但是 在不同物种中s u m o 蛋白的数量和种类却各不相同( f r a s e re ta 1 ，2 0 0 0 ；h a y a s h ie t a 1 ，2 0 0 2 ；s e u f e r te ta 1 ，1 9 9 5 ) ，在一些低等真核生物中如酵母j 昆虫、线虫等， 只有- - 种s u m o 蛋白质进行表达。而在一些比较高等的生物中如植物中存在高达 8 种s u m o 蛋i 刍( k u r e p ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。在人的细胞中目前己知的s u m o 蛋白有四种 s u m o 一1 、s u m o - 2 、s u m o - 3 和s u m o 一4 ( g u od e ta 1 ，2 0 0 4 ；m e l c h i o rf ，2 0 0 0 ) ， 其中s u m o 1 、s u m o 2 和s u m o 3 在脊椎动物的所有细胞中都有表达，它们的 表达不具有组织特异性，而s u m o 4 蛋白的表达具有组织特异性，它只能在脊椎 动物的肾脏、淋巴结和脾脏中进行表达( g u od e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。现在研究结果显示 s u m o 4 与人的i 型糖尿病有密切相关( q uh e ta 1 ，2 0 0 5 ；s m y t hd j e ta 1 ，2 0 0 5 ； w a n gc y & s h ej x ，2 0 0 8 ) 。在脊椎动物的四种s u m o 蛋白中s u m o 2 和 s u m o 3 的序列同源性高达9 7 ，同时它们又与s u m o 1 的序列同源性达到5 0 左右，但这些s u m o 蛋白在细胞内识别不同的底物行使着不同的生物学功能。一 个比较明显的例子是s u m o 1 的底物r a n g a p 1 ，在一般情况下它优先与s u m o 1 结合，但是在一些特定的条件下它也可以与s u m o 一2 3 进行结合( s a i t o ha n d h i n c h e y ，2 0 0 0 ) 。虽然在细胞内几乎所有的s u m o 1 蛋白都处在结合状态，但是 在细胞内却储存着大量的s u m o 2 - 3 蛋白以备细胞在各种不同的生存压力的下 所利用。 1 2 1s u m o 化机制 s u m o 化( s u m o y l a t i o n ) 机制和泛素化( u b i q u i t y l a t i o n ) 机制非常相似， 它们都是用羧基端的甘氨酸残基的羧基共价的结合到底物蛋白的赖氨酸e 氨基 上，形成异肽键来调节蛋白质的功能。这个过程需要一系列酶的催化。这个过程 需要三种酶催化完成，且i e 1 激活酶( e la c t i v a t i n ge n z y m e ) 、e 2 结合酶( e 2 c o n j u g m i n ge n z y m e ) 和e 3 连接酶( e 3l i g a s e ) 。其 e l 和e 2 是催化过程中必须的。 2 t r y p a n o s o n m 由 u c e l 中s o l o 蛋白的r 结构研究 在细胞中，所有的s u m o 蛋白都是以一种前体形式进行表达( i m m a t u r e p r o f o r m ) ， 这种状态下s u m o 蛋白的羧基端两个甘氨酸残基后面一般连有2 - 1 1 个氨基酸残 基。这种状态的s u m o 蛋白不具有生物学功能即不能共价结合到底物蛋白上， 它需要一些s u m o 特异性蛋白激酶( s u m o s p e c i f i cp r o t e a s e s ) 进行催化，对甘 氨酸残基后面的氨基酸进行剪切，以暴露出两个连续的甘氨酸。然后s u m o 蛋白 才能在一系列酶的催化过程中共价结合到底物蛋白的赖氨酸残基上。 图1 1s u m o 连结途径。s u m o 前体被s u m o 特异性蛋白酶酶( s e n p s ) 切暴露山c 端的两个 甘氨酸残基。在a t p 依赖的条件下s u m o 和e 1 酶形成硫酯键，然后s u m o 被转移到e 2 酶上形 成中间态的硫酯键，之后s u m o 与底物蛋白的赖氨酸形成异肚键有些底物需要e 3 酶的参与 形成异肚键，最后s u m o 由s e n p s 从底物上酶切下来回收。g i l lg ，2 0 0 4 g e n e s d e v e l o p m e n t 1 2 2e l 激活酶( e l - a c t i v a t i n ge n z y m e ) 在s u m o 的催化反应中，首先由e 1 酶对s u m o 蛋白进行激活，这个过程需 要a t p 的水解来提供能量。e 1 酶是一个由两个亚基组成的异二聚体，a o s l 和 u b a 2 ( d e s t e r r oe ta l ，1 9 9 9 ；g o n ge ta l ，1 9 9 9 ；j o h n s o ne ta l ，1 9 9 7 ；o k u m ae ta l ， 1 9 9 9 ) 与u b i q u i t i n 不同的是，s u m o 蛋白的e 1 酶只有一种，而u b i q u i t i n 的e l 酶有 很多种。e 1 酶活化的这一步反应需要a t p 酶的催化，首先a t p 水解形成a m p 与 s u m o 羧基端的甘氨酸羧基共价结合形成s u m o - a m p 复合物。之后s u m o a m p 复合物被转移f u e l 酶上，与e 1 酶的u b a 2 亚基上1 7 3 位的半胱氨酸形成硫酯键。 e 1 酶的两个不同亚基在酵母细胞循环中，对于细胞由g 2 向m 期转化的过程中起 到很重要的作用。有趣的是分别剔除这两个亚基对细胞生长造成的影响是不同 的，剔除a o s l 仅仅导致细胞对d n a 损伤的敏感度降低( s h a y e h ie tm ，1 9 9 7 ) 而 剔除u b a 2 将会导致胚胎致死( j o n e s e ta l ，2 0 0 2 ) 。 1 2 3e 2 结合酶( e 2 - c o n j u g a t i n ge n z y m e ) 3 t r y p a n o s o m ab r u c e i 中s u m o 蛋白的n l v l r 结构研究 催化s u m o 反应的e 2 酶只有_ 个：i l b c 9 。在s u m o 反应过程中s u m o u b a 2 复合物被转移至u u b c 9 蛋白上，然后s u m o 从e 1 酶上脱离下来，与u b c 9 的9 3 位的 半胱氨酸形成硫酯键( d e s t e r r oe ta 1 ，1 9 9 7 ；j o h n s o na n db l o b e l ，1 9 9 7 ) 。与其它 u b i q u i t i n 1 i k e 蛋白的结合酶不同的是，u b c 9 可以直接对底物蛋白进行识别，从而 促进s u m o 羧基端的甘氨酸与底物蛋白的赖氨酸形成异肽键。u b c 9 蛋白在细胞中 也起着比较重要的生物学功能，基因敲除实验显示u b c 9 在胚胎发育早期中起着 很重要的作用，而且这种作用在进化上是很保守的。u b c 9 敲除的小鼠胚胎在着 床早期死亡，而不能形成胚胎。从u b c 9 敲除的胚胎细胞培养衍生出的u b c 9 缺失 细胞系在细胞核的形成上存在严重的缺失显现，包括核膜的畸变、核仁和p m l 核小体的瓦解、染色体浓缩和分离的缺失以及r a n g a p l 在核孔处聚集的失败 ( n a c e r d d i n ee ta l 。，2 0 0 5 ) 等。另p b u b c 9 功能的缺失在线虫中也表现为胚胎的致 死，而在酵母细胞中则表现为g 2 到m 期转化的失败，在果蝇中表现为减数分裂 的缺失等。 1 2 4e 3 连接酶( e 3l i g a s e ) 在s u m o 催化过程中，有些底物的催化过程不需要e 3l i g a s e 的参与，s u m o 蛋白可以直接从u b e 9 上转移到底物蛋白上。但是对于大部分底物，s u m o 的催化 过程需要e 3l i g a s e 的参与。到目前为止，已经有超过十种的e 3l i g a s e 被鉴定出来， 它们主要是催化s u m o 从e 2 上转移到特殊的底物蛋白上。虽然在体外试验中， s u m o 的催化过程并不需要e 3 的参与，但是在细胞内e 3l i g a s e 对s u m o 底物的选 择起着至关重要的作用，尤其是对于一些些缺乏共有s u m o 化结合位点的底物蛋 白，e 3 显得尤为重要。至今，有三类相关的蛋白家族被确定为具有e 3l i g a s e 的活 性：r a n b p 2 ( p i c h l e re ta 1 ，2 0 0 2 ) 、s p r j n g ( s i z p i a s ) ( h o c h s t r a s s e r ，2 0 0 1 ；j a e h s o n ， 2 0 0 1 ) 蛋白家族和p o l y c o m bg r o u pp r o t e i np c 2 ( k a g e ye ta 1 2 0 0 3 ) 蛋白家族。虽然这 些蛋白被称为“l i g a s e ”，但是这些s u m o 的e 3 酶在功能上更像是“a d a p t o r s ”。 r a n b p 2 和p i a s 蛋白能够和e 2 酶u b c 9 相互作用促进s u m o 从u b c 9 上转移到底物 蛋白上( j o h n s o na n dg u p t a2 0 0 1 ；k a h y oe ta 1 2 0 0 1 ；t a k a h a s h ie ta 1 2 0 0 1 ；p i c h l e r e ta 1 2 0 0 2 ) 。r a n b p 2 的e 3 酶活性的特殊性在于：r a n b p 2 可以刺激一些底物蛋白 的s u m o 化过程例如r a n g a p l 和s p l 0 0 ，但是对于其他的底物却没有催化的功能 如i p 5 3 ( p i c h l e re ta 1 ，2 0 0 2 ) 蛋白。 表1 2 哺乳动物中s u m oe 3l i g a s e 及其部分底物 4 t l - y p a n o s o m ab r u c e i 中s i l o 蛋白的n m r 结构研究 e 3b 口a o e1 a x 亡tp i - 亡d o m l n 矗l l tl o c a l j 2 a 缸o n p a n b p 2 ( r 丑n b i n d i n gp r o t e i “ s p l o on t k 】e a rp o r e 2 ， 鼢a c p l s lq z r o t e i ni n h i b t t o ro fp 5 3n t l c l e u $ a c t i v a t e ds t a tl p r o t e m1 )c ， a r s p 3 g 甓珏l c t b p l p 工 s x 口( s p l i c ei s o f o r a to f c j u nx t k l e u t p 丸豇lb o d i d l m b p i _ - x s 2 ) a r s t a = r l s n l a _ e l - l p t a s x 参( s p li c ei s o f o t a to f p 5 3x t ，c k u p n lb o d i e * p l a s 2 ) c - 4 t a n c t b p l p l s 3卫乇f l ，：u c l e u 5 p l l a s y l e f ln u c k 酬t g $ p 冬重lb o d i e 搴 t t 矗毒 c m y b c ，e b p a s l 吐a d p c 2 c t b p l c t b p 2n t k l t u s p c gb f o d i e s s u m oe 3l i g a s e 中最大的一组蛋白是含有s p r i n gm o t i f l 筝j 蛋白，这个m o t i f 对它们的功能起着很重要的作用( h o c h s t r a s s e r2 0 0 1 ) 。s p r i n gl i g a s e 可以直接 结合到底物和u b c 9 上，他们通过s i m s b m 序列非共价的与s u m o 结合。因此他 们可能提供一个平台为底物蛋白的硫酯键定位一个最好的方向以便提供s u m o 的转移。s p r i n g 蛋白又可以进一步分成两个不同的亚组，第一组是p i a s 蛋白家 族，在酵母中也被称为s i z 蛋白。这个家族的蛋白在n 端都含有一个保守的4 0 0 个 氨基酸序列( s h a r r o c k s ，2 0 0 6 ) 。至今为止在酵母细胞中有两个p i a s 家族成员 被鉴定出来：s i z l 和s i z 2 ( j o h n s o na n dg u p t a , 2 0 0 1 ；t a j a h a s h ie ta 1 ，2 0 0 1 ) ，而在 哺乳动物中有五种p i a s 家族成员：p i a s l ，p i a s x a ，p l a s x l 3 ，p i a s 3 和p i a s y ( r u t h a n dm e l c h i o r ，2 0 0 7 ) 。其他的p i a s 家族蛋白包括m m s 2 1 和z i p 3 ，m m s 2 1 蛋白 是八聚体复合物s m c 5 s m c 6 中的一部分，它们在脊椎动物的细胞生长中d n a 损 伤修复中起着重要作用( z h a oa n db l o b e l ，2 0 0 5 ；a n d r e we ta 1 ，2 0 0 5 ；p o t t sa n dw u ， 2 0 0 7 ) 。 人的p o l y c o m b 组分p c 2 是第三类s u m oe 3l i g a s e 。p o l y c o m bg r o u p ( p e g ) 蛋白形成大的多亚基的复合物( p c gb o d i e s ) 在基因沉默中起重要作用。p c 2 可 以募集转录共抑制子c t b p 至u p c gb o d i e s 。过表达p c 2 可以增强c t b p 蛋白的s u m o 化( k a g e ye ta 1 ，2 0 0 3 ；2 0 0 5 ) 。 值得一提的是，至今已知的不同的e 3 酶具有不同的亚细胞定位：r a n b p 2 定位在核孔复合物中，p i a s 则定位在核膜和核小体中，而p c 2 定位在亚核结构 p o l y c o m bb o d y e 0 ( s a c h d e ve ta 1 2 0 0 1 ；k o t a j ae ta 1 2 0 0 2 ；p i c h l e re ta 1 2 0 0 2 ；k a g e y e ta 1 2 0 0 3 ) 。e 3 酶的这种细胞定位可能和他们在细胞中的功能特异性起很大作 5 t r y p a n o s o m ab r u c e i 中s u m o 蛋白的n m r 结构研究 用。 在大多数情况下，s u m o 蛋白是单个的结合到底物蛋白上。但是人的细胞 中s u m o 2 3 蛋白可以在细胞内形成s u m o 链。虽然这些s u m o 链形成的具体功 能上还不是很清楚，但是在酵母细胞中s u m o 蛋白突变使s u m o 链不能形成会导 致联会复合体形成的缺失( s y n a t o n e m a lc o m p l e x s ) ( c h e n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) 。这部 分工作还需要更多的实验研究来揭示它们的作用 1 , 2 5s u m o 的加工和去连接 和其他u b i q u i t i n 1 i k e 蛋白一样，s u m o 是以前体形式合成的，在连接到底物 之前，前体s u m o 蛋白需要通过蛋白酶的剪切以暴露出羧基端的两个甘氨酸