（分析化学专业论文）痕量氟喹诺酮类药物的毛细管电泳在线富集方法研究.pdf

摘要 摘要 毛细管电泳( c e ) 是以高压电场为驱动力，以弹性熔融石英毛细管为通道，利用样品 各组份之间电泳淌度或分配行为的差异而实现分离的液相分离技术。它以所需样品量 少、实验成本低，消耗少、分离效率高，分析速度快、操作模式多、仪器简单、操作简 便、易于自动化和联用等特点，而得到了广泛应用。因为其检测灵敏度较低，限制了其 在分析领域的进一步发展。在线富集方法是提高毛细管电泳检测灵敏度的一个有效且经 济的方法，其在不延长分析时间的同时使得检测灵敏度大大提高。本工作发展了电堆积 法和吹扫法的毛细管电泳在线富集痕量恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星和苯甲酸的新方 法。 第一章：简述了毛细管电泳技术的发展概况，重点阐述了在线富集方法研究，以及 毛细管电泳技术在氟喹诺酮类药物痕量检测中的应用。 第二章：利用在线电堆积富集技术，以恩诺沙星为例建立了一种测定痕量氟喹诺酮 类药物的毛细管电泳分析方法。考察了影响分离检测的因素，并确立了实验条件：缓冲 溶液的浓度为6 0m m o l l 的硼砂和6 0m m o l l 的n a i l 2 p 0 4 混合而成，p h 值为4 6 ，电压为 1 8k v 。测定恩诺沙星的线性范围在0 0 5 2 0m g l 舻o 9 9 9 0 ，疗= 5 ) ，检测限为( 3 0 ) 0 0 0 8 9m g l ，方法精密度为2 1 6 ( 1m g l ，i = 5 ) ，回收率为9 5 一1 0 4 。将建立的富 集方法用于氧氟沙星和诺氟沙星富集分离检测，并进行了实验方法验证，证明该法操作 方法简单，分析时间短，富集效果好。 第三章：采用吹扫富集技术，建立了胶束毛细管电泳法测定防腐剂苯甲酸的方法。 考察了影响分离检测的因素，并确立了实验条件：1 0m m 硼砂+ 1 0m m 磷酸二氢钠+ 9 0 m ms d s ( p h = 9 0 0 ) 为背景缓冲溶液，在紫外检测波长2 2 6n m 运行电压1 8l 条件下， 样品在线吹扫富集，富集倍数可达8 0 倍。线性范围在0 0 5 - 一，2 0m g l 舻0 9 9 9 0 ，疗= 5 ) 。 方法精密度r s d 为1 5 ( 迁移时间) 和4 2 ( 峰高) ，检出限为0 0 1m g l 。在线吹 扫富集毛细管电泳技术是富集分离检测食品中痕量苯甲酸含量的有效方法。 关键词毛细管电泳在线富集氟喹诺酮食品防腐剂 a b s t r a c t a b s t r a c t h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( h p c e ，c e ) i sal i q u i d p h a s es e p a r a t i o n t e c h n i q u eb a s e do nt h ed i f f e r e n c e si ne l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t i e so rp a r t i t i o n b e h a v i o ro fs a m p l e c o m p o s i t i o ni n s i d et h ef l e x i b l ef u s e d s i l i c ac a p i l l a r yu n d e rh i g hv o l t a g ef i e l d t h ec a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sh a sg a i n e dw i d ea p p l i c a t i o n s ，o w i n gt oi t sl o ws a m p l ec o n s u m p t i o n ，l o wc o s t ， h i 曲e f f i c i e n c y , h i 曲s p e e d ，m u l t i p l es e p a r a t i o nm o d e s w i t hd i f f e r e n ts e l e c t i v i t y , f u l l a u t o m a t i o n ，p o s s i b i l i t yo fi n t e r f a c i n gw i t hd i f f e r e n td e t e c t i o ns y s t e m s ，t h es i m p l i c i t yo ft h e i n s t r u m e n t a t i o na n de a s yo p e r a t i o n h o w e v e r ，t h el o ws e n s i t i v i t yo fd e t e c t i o nr e s t r i c t si t s f u r t h e rd e v e l o p m e n ti na n a l y s i sf i e l d o n l i n ep r e c o n c e n t r a t i o ni sa l le f f e c t i v ea n de c o n o m i c a l m e t h o dt oi m p r o v ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t y ，a n di tc a ng r e a t l yi m p r o v et h ec es e n s i t i v i t yw i t h n o tp r o l o n g i n gt h ea n a l y s i st i m e t h et r a c ef l u o r o q u i n o l o n e s ( e n r o f l o x a c i n ，n o r f l o x a c i n o f l o x a c i n ) a n db e n z o i ca c i dd e t e c t i o nm e t h o d sw e r ed e v e l o p e di nt h i sp a p e rb yc ec o u p l i n g w i t ho n - l i n es t a c k i n ga n ds w e e p i n gc o n c e n t r a t i o nt e c h n o l o g y , r e s p e c t i v e l y c h a p t e ro n e ：b r i e fi n t o r d u c t i o nt ot h ed e v e l o p m e n t o f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s t e c h n i q u e ，e x p a t i a t i n gu p o nt h ea p p l i c a t i o no f t h eo n l i n ep r e c o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u ea n dt h e d e t e r m i n a t i o no ft r a c ef l u o r o q u i n o l o n e sb yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i st e c h n i q u e c h a p t e rt w o ：a m e t h o do ft h ed e t e r m i n a t i o no ft r a c ee n r o f l o x a c i nw a se s t a b l i s h e db yc e c o u p l i n gw i t ho n l i n es t a c k i n gp r e c o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u e t h ee f f e c t so fs o m eo p e r a t i o n p a r a m e t e r sw e r ei n v e s t i g a t e d ，a n dt h ee x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u tu n d e rt h ef o l l o w i n g c o n d i t i o n s ：b a c k g r o u n ds o l u t i o no f 6 0m m o l lb o r a t ea n d6 0m m o l ln a h 2 p 0 4 ( p h4 6 0 ) ； d e t e c t i o nw a v e l e n g t h2 7 7n l n ，r u nv o l t a g e18k v t h eg o o dl i n e a rr e l a t i o nw a so b t a i n e d ( r2 0 9 9 9 0 ，n = 5 ) i nr a n g eo f0 0 5 2 0m g ，l ，t h ed e t e c t i o nl i m i t ( 3 0 ) w a s0 0 0 8 9m g l ，t h er s d w a s2 16 f o r1m g le n r o f l o x a c i n ( 胛= 5 ) a n dt h er e c o v e r i e sw e r e9 5 - 10 4 t h e p r o p o s e dp r e c o n c e n t r a t i o nm e t h o dw a sa p p l i e dt od e t e r m i n a t i o no fo f l o x a c i na n dn o r f l o x a c i n , a n dt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e d t h i sp r e c o n c e n t r a t i o nm e t h o dw a sp r o v e d t ob es i m p l e 丽t hs a t i s f a c t o r ya n a l y t i c a lt i m ea n dp r e e o n c e n t r a t i o ne f f e c t c h a p t e rt h r e e ：am e t h o do ft h ed e t e r m i n a t i o no f t r a c eb e n z o i ca c i dw a se s t a b l i s h e db y i t a b s t r a c t t h em i c e l l ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i so n l i n es w e e p i n gp r e c o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u e t h ee f f e c t s o fs o m eo p e r a t i o np a r a m e t e r sw e r ei n v e s t i g a t e d ，a n dt h ee x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u tu n d e r t h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：w i t hab a c k g r o u n ds o l u t i o no f10m m o l lb o r a t e 一10m m o l l n a h 2 p 0 4 9 0m m o l ls d s ( p h9 o o ) a n dad e t e c t i o nw a v e l e n g t ho f2 2 6n n l ，a n dar u n n i n g v o l t a g eo f18k v ，t h es a m p l ew a s d e t e c t e dw i t h8 0 一f o l dp r e c o n c e n t r a t i o nb yo n l i n es w e e p i n g p r e c o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u e ；t h eg o o d l i n e a rr e l a t i o nw a so b t a i n e d ( r - - - 0 9 9 9 0 ，行= 5 ) i nr a n g e o f0 0 5 - 2 0m g lw i t ht h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s ( n - - 8 1f o rt h er e l a t i v em i g r a t i o nt i m ea n d p e a kh i g ho f1 5 a n d4 2 ，r e s p e c t i v e l y ；t h ed e t e c t i o nl i m i t ( 3 0 ) w a s0 o1m g l i tw a s c o n c l u d e dt h a tt h et r a c eb e n z o i ca c i di nf o o ds a m p l ec o u l ds u c c e s s f u l l yb ed e t e r m i n e db y o n - l i n es w e e p i n gt e c h n i q u e k e yw o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；o n l i n ep r e c o n c e n t r a t i o n ；f l u o r o q u i n o l o n e s ；f o o d p r e s e r v a t i v e i i i 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了致谢。 作者签名：基继日期：丝年卫月日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方格内打“”) 保护知识产权声明 本人为申请河北大学学位所提交的题目为酿量胜渤司交药钧的黾磁窖懈概 论文，是我个人在导师疆遮冲指导并与导师合作下取得的研究成果，研究工作及取得 i 的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完全 了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法律、行政法规以及河北 大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大学的书 面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内容。如果违反 本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人： 作者签名： 导师签名： 型量年上月日 日期：兰壁年上月止日 第1 章绪论 第1 章绪论 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 是2 0 世纪8 0 年代兴起并且迅速发展起来的 一种新型液相分离分析方法，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。目前，它 己成为和2 0 世纪5 0 年代末、6 0 年代初出现的气相色谱( g a sc h r o m a t o g r a p h y ，6 c ) 以及2 0 世纪7 0 年代初出现的液相色谱( h i g hp e r f o r m a n o el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 相媲美 的一种分离技术，并被认为是当代分析科学最具活力的前沿研究课题，也是近二十年来 发展最快的分离分析技术之一。它使物质的分离从微升水平进入纳升水平，并使单细胞 分析，乃至单分子分析成为可能。广泛应用于药物分析、生化分析、环境分析、食品分 析等几乎所有的分析领域。 喹诺酮药物( q u i n o l o n e s ，q n s ) 是人类和兽类广泛使用的预防和治疗各种传染病 的抗生素。作为兽药，禽畜及鱼类少量使用可以促进生长，但此类药物在动物体内存留 时间较长，若长期食用动物组织可能会造成抗生素在人体内残留，而这些喹诺酮类物质 会损害人体健剧1 。2 】，因此引起人们的极大关注。喹诺酮类药可致重症肌无力症状加重， 呼吸肌无力而危及生命，并且有潜在的致癌性和遗传毒性，同时还容易使病菌产生耐药 性【3 1 。欧盟对这种可食性组织中的化合物设立了最高残留限量【4 1 。建立简便、快捷、灵 敏的痕量氟喹诺酮药物残留的分析方法是分析工作者的重要研究课题。 本章评述了在线富集方法研究的重要性，并简述了毛细管电泳技术及其在喹诺酮 类药物分析检测应用中的研究进展。 1 1 毛细管电泳技术 1 1 1 毛细管电泳技术概述 毛细管电泳技术的发展可追溯到六十年代中期或者更早，1 9 6 7 年，h j e r t e n 【5 】的工作 可视为毛细管电泳时代的开端，他首先提出可将高电场作用于细孔径管进行自由溶液区 带电泳分离，他采用内径为3m n - i 、内壁涂有甲基纤维素的石英毛细管对会属离子进行 了分离，这种分离模式就是毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 。1 9 7 4 河北大学理学硕十学何论文 年，v i r t a n e n 6 】进一步提出采用内径为2 0 0 5 0 0i t m 的毛细管进行分离，由于所用电场小于 5k v m ，所获得的效率并不高。p r e t o r i u s 等人【刀于同年阐明了电渗流( e o f ) 可像泵一样驱 动液体流过毛细管。1 9 7 9 年，m i k k e r s 等人【8 】利用2 0 0 岫内径的聚四氟乙烯毛细管对1 6 种有机酸进行分离，获得t 1 于1 0 岬板高的高柱效，但检测器灵敏度不高，由于样品 负载量大导致了峰形不对称。 1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 和l u k a c s 【9 1 首次使用内径为7 5l a m 的石英毛细管和3 0k v 的高电 压，分离了一组用丹磺酰氯衍生的氨基酸，并采用荧光检测，获得了高于4 0 万理论塔板 数的分离柱效，他们还从理论上发现，毛细管电泳柱效与电场强度成正比，与分子扩散 系数成反比，他们的工作在分离科学界引起了轰动，成为毛细管电泳发展史上的里程碑。 从2 0 世纪8 0 年代开始，毛细管电泳技术迅猛发展，1 9 8 3 年，h j e r t e n t l o 】将聚丙烯酰胺凝胶 和琼脂糖凝胶分别引入毛细管建立了毛细管凝胶电泳( c g e ) 模式：1 9 8 4 年，t e r a b e 等【i i l 建立了c e 中可对中性组分进行分离的基于组分疏水性差异而实现分离的胶束电动色谱 模式( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i c c h r o m a t o g r a p h y ，m e k c ) ；19 8 7 年，h j e n e i l 等【1 2 】建立了毛细 管等速电泳( c r r p ) 。1 9 8 8 年第一台商业化毛细管电泳仪正式投入市场，这在一定程度上 又促进了毛细管电泳技术的发展。目f j ，毛细管电泳已成为现代分析中不可或缺的工具， 广泛应用于d n a 片断分析、蛋白质分析、多糖分析和手性分析等各个方面，并且其中许 多分离形式的理论也已经比较完善。 1 i 2 毛细管电泳的基本原理 3 图1 1 毛细管电泳原理图 1 高压电源；2 在线检测器；3 毛细管；4 紫外灯；5 数据处理器6 缓冲液样晶；7 缓冲液 2 第1 章绪论 毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，根据样品各组分之间的 淌度及分配行为的差异而实现分离目的的一类液相分离技术。其仪器装曼如图1 1 所示。 在c e 中常用的毛细管是由熔融石英加工制成的( 内径为2 5 1 0 0p m ，长度为2 0 1 0 0 e m ) ，外壁涂有一层聚二酰亚胺以增加其柔韧性，内壁通常直接和溶液接触，有时也可 根据需要涂上一层高聚物。与平板凝胶电泳类似的，毛细管内也可填充支持介质，如琼 脂糖，聚丙烯酰胺及甲基纤维素等。 毛细管电泳通常使用的是内径为2 5 1 0 0g m 的弹性( 聚酰亚胺) 涂层熔融石英管，融硅 毛细管内表面有一定数量的硅羟基( s i o h ) 存在，在碱性和弱酸性条件下，可解离形成定 域负电荷s i o ，因此，在大多数操作条件下，石英毛细管表面将带有负电荷。由于静电 引力，s i o 将把电解质溶液中的异性电荷吸引到管壁附近，并在一定距离内形成阳离子 相对过剩的扩散双电层。当有轴向直流电场作用于毛细管两端时，带正电荷的溶液表面 即扩散层的阳离子向阴极移动。由于这些阳离子的碰撞作用，推动了溶剂分子同向移动， 从而带动毛细管中的液体整体向阴极移动，这就是毛细管电泳中的电渗现象。在电渗力 驱动下毛细管中整个液体的流动叫毛细管电泳中的电渗流( e o f ) 。它是c e 分离中重要 的影响因素之一。衡量e o f 大小的指标为电渗流淌度“。0 ，其表达式为： c 声 。= 塾 ( 1 - 1 ) l | 式中和1 1 分别为溶液的介电常数和粘滞系数，亏w 为管壁相对于无穷远处的电势。 电渗流是c e 中推动流体前进的驱动力，电渗速度在毛细管横截面上几乎处处相等，它使 整个流体像一个平头塞子一样以均匀的速度向前运动，这种流形克服了机械泵推动液流 产生的抛物面流形所造成的区带加宽，是c e 高效的重要原因。 带电粒子在直流电场的作用下会在介质中发生定向移动，这就是电泳。介质中的粒 子受到电场力和介质阻力的共同作用，当达到平衡时即做匀速运动。带电粒子在单位场 强作用下的运动速度称为它的淌度，用e p 表示。在无限稀释溶液中测得的( 球形) 粒子 淌度为绝对淌度，可由三表示为： 0 ：昙坚( 1 - 2 ) 3 l l 其中p 为离子在无限稀释时的电动电势。在实际溶液中，离子的淌度一般要小于它 气 河北大学理学硕+ 学位论文 的绝对淌度。在毛细管电泳中，样品分子的迁移是电泳淌度和电渗流淌度( ) 的综合表 现，这时的淌度称为表观淌度( 惭) 。 表观淌度可以直接从毛细管电泳的测量结果求得，表示为： 驴咎 ( 1 - 3 ) 唧2 芍 【卜3 ) 式中l d 是毛细管从进样口到检测器的距离，t r 是离子通过这段距离所用的时间， l t 是柱的总长，v 是电压。 粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流( e o f ) 两种速度的矢量和： 阳离子：0 6 = 。+ 印( 1 - 4 ) 中性粒子：0 6 = 。 ( 1 - 5 ) 阴离子：曲= + 印( 1 - 6 ) 阳离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出，中性粒子的电泳流速度为零，故其 迁移速度相当于电渗流速度，阴离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一 般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，分离后的出峰次序为：正离子 中 性分子 负离子，从而因各种粒子迁移速度的不同而实现分离。 c e 以其高效、快速、进样量小等特点引起了广泛的重视，但由于毛细管内径极小( 通 常为2 5 1 0 0g m ) 和纳升级的进样量，使得对检测手段的灵敏度要求也非常高。经过人 们的不断努力，目前，已有多种商品化检测器成功地用于c e 分离技术【1 3 】。包括紫外检 测器、荧光检测器、质谱检测器、电化学检测器等，下面分别对它们进行介绍。 ( 1 ) 紫外一可见检测器( u v - v i s ) u v - s 检测器是毛细管电泳中的一种常规检测器，主要是因为u v - s 检测器的通 用性好，结构简单，因此它是目i j 应用最为广泛的检测器。u v - v i s 检测器主要有固定 波长检测器和多波长可变检测器，常用钨灯或氖灯作为光源。 虽然u v 检测器具有很好的通用性，但是它的检测灵敏度受光程的限制，因而灵 敏度不高，检测限一般只能在1 0 。5 1 0 击m o l l 范围，而且其线性范围一般也只有2 3 岬 个数量级，远远满足不了越来越多的对低浓度和极微量样品分析的要求。因此为了进一 步降低检测限，人们提出了不少扩展吸收光程和提高检测灵敏度的新方法和新技术。 第1 章绪论 c h e r v e t 1 4 】等人将毛细管检测部分设计成z 形，增加了光程，使检测灵敏度提高了6 倍， 但是分离度却下降了1 7 0 o - 3 2 。t s u k a 【”】用矩形毛细管，使光程增加到11 t l n l ，极大的 提高了灵敏度，而且降低了光的散射。w a i l d l 6 1 通过在毛细管内的多次反射来增加光程， 使检测限降低到3 x 1 0 - 7m o l l ；而t a y l o r 【”】贝0 将入射光沿毛细管方向，将光程提高了6 0 倍，检测限降低了1 5 倍。所有上述提高灵敏度的方法都会在一定程度上降低分离效率， 而且实现起来也比较困难，所以几乎没有引起仪器商的兴趣。 ( 2 ) 电化学检测器( e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ，e c d ) 电化学检测器是c e 中比较灵敏的检测器之一，而且它的仪器简单，价格低廉，是 一种很有前景的检测器。根据检测原理的不同，电化学检测器可分为电势检测器、电导 检测器和安培检测器( 电流检测器) 。 电化学检测器虽然有较高的灵敏度，但制作过程复杂，不同实验者之间重复性较差， 仪器自动化程度低等缺点限制了其进一步发展。近年来，化学修饰电极越来越受到重视， 为了使电化学检测方法更容易、方便，设计容易准直的毛细管和电极的检测池【18 】或腐蚀 毛细管柱端【1 9 】的方法来获得低的检测限和好的重现性。 ( 3 ) 二极管阵列扫描检测器( d a d ) 二极管阵列扫描检测器是c e 中比较常用的检测器之一，在八十年代初h p 公司率 先推出真正意义上的二极管阵列扫描检测器1 0 4 0a ，并于1 9 8 3 年获美国i r l 0 0 奖。自从 1 9 8 6 年开始，d a d 的发展主要集中于提高灵敏度、改善选择性和减小带宽。由于d a d 的光谱分辨率依赖于光学设计，如光栅、阵列分辨率和狭缝宽度。一般来说光谱分辨率 和灵敏度成反比，光谱分辨率高、灵敏度就低，反之光谱分辨率低、灵敏度就高。因为 通过降低狭缝宽度来提高光谱分辨率，会减少光的输入量而使灵敏度减低，人们可以通 过浓缩等方法解决灵敏度问题，但是光谱分辨率低导致相似光谱图不能分辨的缺陷使我 们对化合物定性的期望破灭。为了既兼顾高的光谱分辨率又兼顾高的灵敏度，人们采取 了双灯、高密度光源、参考波长、二极管集拢技术、全封闭和短光路设计和光纤技术， 使这种检测器的灵敏度达到甚至超过常规紫外检测器。通常人们认为1 x 1 0 5a u c m 为紫 外检测器检测的物理极限，通过光管和密集束技术改变样品池，增加光程、减少能量损 失，可显著提高d a d 检测器的检测灵敏度。 5 河北大学理学硕+ 学位论文 ( 4 ) 激光诱导荧光检测器( 1 a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ，l i f ) 激光诱导荧光检测器是一种比较好的检测器，其具有最高的检测灵敏度。自 o a s s m a n 首次将l i f 引入c e 检测后，l i f 就得到了广泛的研究和运用。利用激光诱导 荧光检测技术人们可对单细胞中核酸进行定量测定，对某些荧光效率较高的物质甚至达 到单分子检测。 虽然激光诱导荧光检测器具有极高的检测灵敏度，但大多数物质不具有荧光或荧光 特性很弱，因此必须进行衍生才能使用激光诱导荧光检测器检测，而很多物质由于分子 结构的限制难于进行衍生，使其应用受到了很大限制，同时目前商品化的激光诱导荧光 检测器十分昂贵，进一步限制了其推广使用。此外，由于激光诱导荧光为单色光，对于 激发波长不在此处的分析物或衍生物则不再适用。 ( 5 ) 质谱检测器 在c e 中，紫外检测器由于通过样品的光程较短导致灵敏度较低，特别对一些紫外 吸收较弱的化合物的检测。近年由于大气压电离( a p i ) 、电喷雾电离( e s i ) 及新型质谱仪 的快速扫描等新技术的出现，足以满足c e 窄峰形的特点，使得c e m s 、c e m s m s 均 得到快速发展，并正在成为实验室的重要常规分析方法之一。 1 1 3 毛细管电泳的主要特点 高效毛细管电泳是一种液相分析分离技术，和传统电泳相比，它的最大优点是克服 了由两段电压引起的介质离子流的焦耳热，极大的改善了分离效果。它们遵循不同的分 离机理，都有许多分离模式，因此在很大程度上c e 与h p l c 互为补充，但无论从效率、 速度、样品用量和成本来说，都显示了它的优势。c e 没有泵运输系统，成本相对要低， 且可通过改变操作模式和缓冲液成分，根据不同的分子性质( 如大小、电荷数、手征性、 疏水性等) 对极广泛的物质进行有效分离，相比之下，为达到相同目的，h p l c 要用价 格昂贵的柱子和溶剂。c e 以电渗流为推动力，使溶质带在毛细管中原则上不会扩散， 而h p l c 以压力驱动，柱中流动相呈抛物线型导致谱带展宽，柱效降低( 见图1 2 ) 。 c e 用迁移时间取代h p l c 中的保留时间，c e 的分析时间通常不超过3 0m i n ，比h p l c 速度快。所需样品为n l 级，流动相用量也只需几毫升，而h p l c 所需样品为l 级， 流动相则需几百毫升甚至更多，但c e 仅能实现微量制备而h p l c 可作常量制备。 6 第1 章绪论 + + + + + + + + _+ + + + + + 9= 0 0 今 一 0 = =o + i + + 土一 r p + 4 - + + + 图1 2c e 和h p l c 流动相示意图 a c e 流动相示意图b h p l c 流动相示意图 总之，c e 作为经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，其突出优点可概括为： ( 1 ) c e 所采用的毛细管柱易于全面清洗，不必担心柱污染而全面报废； ( 2 ) 所需样品量少、仪器简单、操作简便：毛细管进样体积一般为纳升级( 可少到 ln l ，消耗体积在1 5 0n l ) ，仪器结构简单，容易使用，易于维护，仅需简单的培训就 能掌握基本操作。而且商品化的仪器自动化程度很高，操作可通过程序控制，省去一些 繁琐的步骤； ( 3 ) 分析速度快，分离效率高，分辨率高：高电场的应用提高了分离效率，缩短了 分离时间，一般几十秒到十几分钟就能完成一次分离。由于液体流动由电场驱动，为平 面型流，且进样端和检测端都无死体积，峰展宽程度小，另外由于毛细管极细的内径， 焦耳热得到有效的克服，因此具有很高的柱效。凝胶毛细管电泳可以识别相差一个碱基 片段，因而被广泛的用来进行基因测序； ( 4 ) 灵敏度高：常用的紫外检测器的检测限可达1 0 一3 1 0 j 5t o o l ，激光诱导荧光检测 器则可达1 0 - 1 9 1 0 翻m o l ； ( 5 ) 操作模式多，开发分析方法容易：毛细管电泳至今已经发展出多种分离模式， 适用于不同的分离对象，这是其他分离技术无法媲美的。 ( 6 ) 应用范围极广：毛细管电泳技术可检测多种样品，可分离分析多种组分，甚至 可用于碱性药物分子及其代谢产物、无机及有机离子、有机酸、单细胞分析、药物与细 胞的相互作用和病毒的分析，在临床医学等领域也有较多应用。 ( 7 ) 仪器简单、操作简便、易于自动化和联用：只要有一个高压电源，一根毛细管 柱，一个检测器和两个缓冲溶液瓶就能进行电泳的实验，容易实现自动化，并能与各种 7 河北大学理学硕十学位论文 检测器相连接，特别是毛细管电泳一质谱联用技术。 1 1 4 毛细管电泳的分离模式 毛细管电泳分离模式的发展是多方面的，经典的分离模式有毛细管区带电泳、毛细 管胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳等；新方法的发展研究难度大，但近年来却有不小的 进展，其中新的分离模式和联用技术最为突出。比如建立了阵列毛细管电泳( c a e ) ，亲 和毛细管电泳技术( a c e ) ，芯片毛细管电泳( c c e ) ，非水毛细管电泳技术( n a c e ) 等。 表1 - 1 ，c e 分离模式的分离依据及应用范围 ( 1 ) 毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) c z e 是c e 中最简单、最基本的模式，它是以高压电场为驱动力，以毛细管作为分 离通道，依据样品中各组分之间淌度的差异而实现分离的一类液相分离技术。在外加电 场作用下，具有不同电泳淌度的分离对象将在彼此分丌的区带中迁移，而具有相同电泳 淌度的分离对象将在同一个区带中共迁移。c z e 应用范围广，可用于多种蛋白质、肽、 氨基酸的分析。 r 第1 章绪论 c z e 的缺陷是不能分析中性物质，因为中性物质的淌度差为零。在实际使用过程 中，常常通过一些管壁修饰技术，功能化添加剂等来减少管壁的吸附，提高分离效率， 扩大应用范围。 ( 2 ) 胶束电动毛细管色谱法( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y , m e k c ) m e k c 是一种既可以分离带电组分也可以分离中性组分的分离模式。在缓冲液中 加入离子型表面活性剂如十二烷基硫酸纳，当表面活性剂分子达到临界胶束浓度后，其 疏水链会依疏水相互作用相互结合在一起，形成表面带电的胶束( 准固定相) 。当毛细管 中的缓冲液含有胶束时，在外加电场的作用下，胶束会在电泳和电渗的共同作用下以较 慢的速度向检测端运动。混合物中的组分则会在液相和胶束相之间发生分配，同时在电 泳和电渗的作用下向检测端运动，物质不仅可以由于淌度差异而分离，同时又可基于在 水相和胶束相之间的分配系数不同而得以分离。 m e k c 的突出优点是不仅能分析离子化合物，还能分析不带电荷的中性化合物， 把电泳分离的对象从离子化合物扩展到中性化合物，从而拓宽了毛细管电泳的应用范 围，是c e 发展史上的罩程碑【2 0 】。此外，胶束电动毛细管色谱还能很快且很容易地通过 改变流动相和胶束相的组成来增加分离选择性，非常适合于手性化合物的分离 2 1 - 2 4 1 。 ( 3 ) 毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e le i e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) c g e 分凝胶和无胶筛分两类，主要用于d n a 、r n a 片段分离和顺序、p c r 产物 分析及蛋白质等大分子化合物的检测。c g e 是将凝胶或其他筛分介质( 如交联或非交 联的聚丙烯酰胺) 加入到毛细管中作支持物，由于凝胶是一种固态的分散体系，具有多 孔性，类似分子筛的作用。电荷质量之比相等但分子的大小不同的分子，在电场力的 推动下经凝胶聚合物构成的网状介质电泳，其运动受到网状结构的阻碍。大分子受到的 阻力大，在毛细管中迁移的速度慢，小分子受到的阻力小，在毛细管中迁移的速度快， 从而使它们得以分离。 凝胶能有效降低溶质的扩散，提高柱效。因此，毛细管凝胶电泳成为分离生物样品， 如蛋白质、核酸的强有力手段。c g e 中的难题是难以制备性能良好寿命较长的凝胶毛 细管柱以及电泳过程中的气泡问题。现在研究了用非线性聚合物溶液代替传统凝胶，进 行无胶筛分，以求解决这个问题。 9 河北大学理学硕十学位论文 ( 4 ) 毛细管等电聚焦电泳( c a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，c i e f ) 两性物质以电中性状态存在时的值叫做等电点。c l e f 正是基于两性物质的等电点 不同而分离生物大分子的高分辨电泳技术。等电点聚焦就是在电泳槽中放入载体两性电 解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的梯度，当蛋白 质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的位置上。当溶质迁 移到等于其等电点的范围时，就不再移动，形成一个很窄的溶质带。由于不同两性物质 的等电点不同，聚焦的范围不同，可以形成一个个独立的溶质带而彼此分开。 等电聚焦的优点是有很高的分辨率，可将等电点相差一个单位的蛋白质分开。一般 电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走的距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能 抵消扩散作用，使区带越走越窄。电聚焦技术的缺点：一是电聚焦要求用无盐溶液，而 在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀，二是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在 等电点不溶或发生变性的蛋白质。 ( 5 ) 毛细管等速电泳( c a p i l l a r yi s o t a c h o p h o r e s i s ，c i t p ) c i t p 是在两缓冲溶液中使用i i 导电解质和后继电解质，被分离的成分央在其中， 按电泳淌度不同而实现分离的一种分离方法。此技术的关键是两种电解质的选择，就带 负电荷物质分离而言，前导电解质中阴离子迁移速率应大于被分析物的，而后继电解质 中迁移速率应小于分析物的。当施加电场进行电泳分离时，电位梯度的扩展使所有离子 最终以同一速度泳动，样品带按淌度大小彼此连接而互不重叠。 目前，毛细管等速电泳在分析和微制备中的应用，特别是作为一种在柱的样品预浓 缩方法得到了普遍重视。但因其要采用不连续缓冲体系，分辨率差，所以目前应用不多。 ( 6 ) 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye i e c t r o c h r o m a t o g r a p h y c e c ) c e c 是把毛细管电泳和毛细管液相色谱结合起来的一种分离技术，是将h p l c 发 展起来的众多固定相填充到毛细管中或涂敷在毛细管壁上，以电渗流为驱动力的色谱， 从另一角度也可看成液相色谱的机械泵被“电渗泵”取代的产物。中性物、可电离物主要 根据其与固定相相互作用大小的不同而达到彼此分离。 微毛细管电泳装置柱短、场强大，因此速度快、效率高、检测限低，在当今纳米技 术快速发展的情况下会显示出更大的发展自口景。 1 0 第1 章绪论 ( 7 ) 亲和毛细管电泳( a f f i n i t yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，a c e ) 亲和毛细管电泳是指在电泳过程中具有生物专一性亲和力的两种分子受体( r e c e p t 0 0 和其配体( 1 i g a n d ) 间，发生了特异性相互作用，形成了受体一配体复合物。通过研究受体 或配体在发生亲和作用前后的电泳谱图变化，可获得有关受体配体亲和力大小、结构 变化、作用产物等方面的信息。a c e 主要应用与分子生物学和生物化学等研究领域， 如核酸片段的特异性识别、蛋白相互作用、竞争免疫分析、药物受体和药物蛋白作用 研究等。此； - a c e 也可用于提高毛细管电泳分析的灵敏度、选择性和分辨率。a c e 技 术在研究生物分子相互作用方面具有快速、微量、简便的优点。 1 1 5 毛细管电泳法的应用 由于毛细管电泳的分离模式多样化，加上毛细管内壁的修饰方法及运动的缓冲液中 的添加剂的不同，随着检测技术的发展，毛细管电泳的应用也越来越广泛，主要表现在 以下几方面： 在药物及临床方面，杜斌等建立了毛细管区带电泳法( c z e ) 测定地塞米松磷酸钠 注射液中地塞米松磷酸钠含量的方法。梁改玲【2 6 】等采用高效毛细管电泳法建立了测定复 方阿昔洛韦滴眼液含量的方法。吕元琦【2 7 1 等采用毛细管电泳法测定了药片中的烟酸。在 体液检测方面，范国荣等【2 8 】测定了人体尿液中的头孢克洛。夏东亚等【2 9 】建立了测定人血 清中美洛培南的h p c e 法。 在生命科学中，c e 是蛋白质分离分析的重要分析手段之一。s u e 等例对一种寄生 虫单链d n a 模板测序。s i l l 等【3 1 】检测细胞基因n q 0 1 表达后反转录产物的含量从而进行 p c r 分析。a r a n 等【3 2 1 对多聚核苷酸进行分离并对产物进行纯度测定。c o h e n 等【3 3 1 对人工 合成寡聚核苷酸链和单链噬菌体d n a 进行的片段分离。 由于手性分离研究中选择剂的多样性，提高了毛细管电泳的分离能力。l e e 等3 4 1 利 用d m 1 3 c d 为手性选择剂，分离甲基苯丙胺、麻黄素等几种手性对映体。j i a n g 等3 5 1 利 用衍生环糊精为手性选择剂，