（生态学专业论文）松嫩不同盐碱化羊草草原羊草叶片蛋白质积累特性.pdf

摘要 羊草( l e y m u sc h i n e n s i 5 ) 是多年生根茎型禾草，属于禾本科( g r a m i e a e ) 赖草属 ( l e y m u s ) ，是松嫩草地羊草草原的优势植物，是耐盐碱性较强的一种优质牧草，它的生态 分布幅度很宽，能和獐毛( a e l u r o p u ss i n e n s 括) 、星星草( p u c c y n e l l i at e n u i f o r a ) 碱蓬 ( s u a e d a “a u c a ) 等耐盐碱性较强的植物组成混合群落。具有生产力高、耐干旱、耐贫瘠、 耐盐碱、营养丰富和适口性好等生物生态学特性，经济价值较高。但是由于近年来对羊草 草原的不合理利用，造成大面积盐碱化，破坏了草原生态环境。所以羊草抗逆性生理生态及 分子机制的研究对于羊草草地的生产和盐碱化草原的治理与改良具有重要的意义。 本实验主要从蛋白质积累和氮代谢的角度，探讨羊草在盐碱化草地生长的适应性，并 试图分析蛋白质积累与羊草种群建成及土壤理化性质的关系。结果表明羊草在各盐碱群落 中的优势度、密度、高度及生物量不同。随着土壤含盐量增高，羊草的优势度、密度和及 生物量呈下降趋势，同时蛋白质也呈现规律性变化，表明羊草对不同盐碱环境适应程度的 差异。随着羊草种群退化程度的增大，不同发育阶段羊草可溶性蛋白质不仅含量上有差异， 而且在其亚基组成上也有所不同。孕穗期和开花期羊草可溶性蛋白质含量随着盐碱化程度 的增强表现出增加减小一增加减小的趋势；乳熟期、腊熟期、果后营养期和枯黄期羊草可 溶性蛋白质含量随着土壤p h 值的增高表现出减小增加减小的趋势；室内模拟盐碱环境条 件下的羊草可溶性蛋白质的含量的变化趋势与孕穗期和开花期相同。另外，在蛋白质组成 上，各期均出现了特异蛋白质，如孕穗期和开花期分子量为1 3 4 6 k d 的蛋白质；乳熟期、 腊熟期、果后营养期和枯黄期分子量为1 4 5 3 k d 的蛋白质；室内模拟盐碱胁迫下分子量为 1 3 4 6 k d 的蛋白质。这些蛋白质可能与盐碱胁迫有关。 在氮代谢方面，全氮量随着盐碱处理p h 值的增加而出现了先下降后升高又再下降的趋 势，但是总的来看，六个处理前后全氮量并没有太大的变化。铵态氮的含量则出现了明显 的下降。硝态氮的含量出现了先上升后下降又再上升的趋势。 关键词：羊草；盐碱化草地；可溶性蛋白质；盐胁迫蛋白；生育期；氮代谢 a b s t r a c t l e y m u sc h i n e n s i sam e m b e ro fg r a m i n e a el e y m u si s ap e r e n n i a lg r a m i n e o u sg r a s sw i t h l o n gr h i z o m e s ，w h i c hi s a d o m i n a t i n gg r a s ss p e c i e si ns o n g n e ng r a s s l a n d i t h a sw i d e l y e c o l o g i c a ls c o p e ，w h i c hc a r lg r o ww i t ha e l u r o p u ss i n e n s i s ，p u c c i n e l l i at e n u i f l o r aa n ds u a e d a g l a u c a i th a sl o t so fs p e c i a l i t i e si ne c o p h y s i o l o g ys u c ha sh i g hp r o d u c a v i t y , t o l e r a n c eo fd r y , l e a l l i l e s s r e s i s t a n ta n ds a l i n e a l k a l it o l e r a n c e ，a b u n d a n c eo fn u t r i t i o n ，g r e a tw o r t ho fe c o n o m y a n df e e l sw e l l b u tr e c e n t l ym a n ys t e p p e sb e c a m es a l i n e a l k a l ia n de c o l o g i c a le n v i r o n m e n th a s b e e nd e s t r o y e db e c a u s eo ft h ei n c o r r e c tu s i n go fl e y m u sc h i n e n s i ss t e p p e s os t u d yo n g r a m i n e a el e y m u si n v e r s e r e s i s t a n te c o p h y s i o l o g ya n dm o l e c u l a rm e c h a n i s mh a ds i g n i f i c a n t m e a n i n gi n b o t hp r o d u c t i o no fl e y m u sc h i n e n s i sa n dm a n a g e m e n ta n dr e f o r m a t i o no f s a l i n e a l k a l is t e p p e t h es t u d yd i s c u s s e dt h eg r o w t ha d a p t a t i o no fl e y m u sc h i n e n s i sf r o mt h ea s p e c t so ft h e p r o t e i na c c u m u l a t i o na n dn i t r o g e nm e t a b o l i s mi ns a l i n e a l k a l ig r a s s l a n da n dt r i e dt oa n a l y z et h e r e l a t i o n a m o n gp r o t e i na c c u m u l a t i o n ，l e y m u s c h i n e n s i s p o p u l a t i o n f o r m a t i o na n d p h y s i c - - c h e m i c a lc h a r a c t e r so fs o i l t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt l l es o l u b l ep r o t e i no fl e y m u s c h i n e n s i sa td i f f e r e n tg r o w t hp e r i o d sa l o n gt h es a l i n e a l k a l i n ew a sd i f f e r e n tn o to n l yi np r o t e i n c o n t e n tb u ta l s oi np r o t e i nu n i t sc o n s t i t u t e a l o n gw i t ht h ei n c r e a s eo ft h es a l i n e - a l k a l i n e ，t h e v a r i a t i o nt e n d e n c i e so ft h es o l u b l ep r o t e i nc o n t e n ta te v e r yg r o w t hs t a g e sw a sd i f f e r e n t s u c ha s a tf l o w e r i n gs t a g ea n db o o t i n gs t a g es h o w e dt h et r e n do fi n c r e a s e d e c r e a s e 抽c r e a s e d e c r e a s e ：a tm i l k i n gs t a g e ，w a xr i p e n i n gs t a g e ，v e g e t a t i v i n gs t a g ea f t e r t h ef u l lr i p ea n dp e r i s h i n gs t a g es h o w e dt h et r e n do f d e c r e a s e i n c r e a s e d e c r e a s e ；i na d d i t i o n ， w h e ni m i t a t i n gs a l i n e a l k a l it o l e r a n c e ，t h ev a r i a t i o nt e n d e n c i e so ft h es o l u b l ep r o t e i nc o n t e n t w a ss i m i l a rt of l o w e r i n gs t a g ea n db o o t i n gs t a g e a tp r o t e i nu n i t sc o n s t i t u t e ，e v e r yg r o w t hs t a g e so fl e y m u sc h i n e n s i sa l lf o u n de x c e p t i o n a l p r o t e i nb a n d s s u c ha s 1 3 4 6 k da tf l o w e r i n gs t a g ea n db o o t i n gs t a g e ；1 4 5 3 k da tm i l k i n g s t a g e ，w a xr i p e n i n gs t a g e ，v e g e t a t i v i n gs t a g ea f t e rt h ef u l lr i p ea n dp e r i s h i n gs t a g ea n d1 3 4 6 k d a ti m i t m i n g t h e s ep r o t e i nu n i t sm i g h tb e c a u s eo fs a l i n e - a l k a l it o l e r a n c e a l o n gt h es a l i n e a l k a l i n e ，n i t r o g e nm e t a b o l i s mo fl e y m u sc h i n e n s 括c h a n g e d t h e c o n t e n t o fn h 4 + - na p p e a r e dt od e s c e n do b v i o u s l y t h ec o n t e n to fn 0 3 一na p p e a r e dt or i s et h e nd e s c e n d t h ew h o l en i t r o g e nc o n t e n th a dn oo b v i o u sv a r i e t y k e yw o r d ：l e y m u sc h i n e n s i s ；s a l i n e a l k a l ig a r a s s l a n d ；s o l u b l ep r o t e i n ；s a l t - _ i n d u c e d p r o t e i n ；g r o w t hp e r i o d ；n i t r o g e nm e t a b o l i s m l i y1 0 1 2 9 9 3 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行 的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别 加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得东= l o i t i 范大学或其 他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：跹日期 狮9 j 吼魂 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复 印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：厦丞指导教师签名： 日 期：| 2 。z ，冶f i 期： 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 电话 邮编 丕逝 幺! 型：步矛 引言 植物生理生态学是植物生态学的一个分支，它是一f 7 9 - 关植物与环境相互作用中生命 过程和生命现象的一门科学 1 。它从生理机制上探讨植物与环境的关系、物质代谢和能量 流动规律以及植物在不同环境条件下的适应性 2 1 。由于它能够给许多生态环境问题以生理 机制上的解释，因而得到日益广泛的重视。当前植物生理生态学研究主要围绕下述问题展 开，包括植物在全球变化中的生理生态响应，植物适应和进化的机理，对有限资源的合理 利用，光、温、水、气、营养等多种环境因子的相互作用对植物行为的影响，植物的抗逆 性潜能和植物生长过程的动态模拟与模型、特殊生境下植物的生态适应机制等等。 1 植物的盐碱胁迫 植物体是一个开放的体系，生存于自然环境。自然环境不是恒定不变的，不同区域间 水热条件相差悬殊，即使同一地区，一年四季也有冷热旱涝之分1 3 j 。另外植物作为生态系 统的生产者，无时无刻不在同环境进行着物质、能量和信息的交流。环境中与植物相关的 因子多种多样，且处于动态变化之中，而植物对每一个因子都有一定的耐受限度，一旦环 境因子的变化超越了这一耐受限度，就形成了逆境。因此植物的生长过程中，逆境是不可 避免的。逆境( s t r e s s ) 就是指对植物产生伤害的环境“1 。植物在长期的进化过程中，形 成了相应的保护机制：从感受环境条件的变化到调整体内代谢，直至发生有遗传性的改变， 将抗性传递给后代。 逆境对植物的作用称为胁迫( s t r e s s ) 。胁迫的种类包括：1 ) 、生物胁迫，如病害、虫 害和杂草等。2 ) 、理化胁迫，如气象因子( 风、雪、雹等) 、辐射( 离子辐射、光照射) 、 温度( 冷害、冻害、热害) 、水分( 水涝、干旱) 和化学因子( 农药、环境污染、盐碱土) 等。其中土壤的盐渍化所造成的盐碱胁迫已经对农业产生了严重的影响【4 “。 盐碱胁迫可能是地球上生物进化期间所遭遇的第一个胁迫因子，这是因为最古老的生 物是海洋生物。迄今，含盐的群落生境定植于海边而不是淡水中。因此，在最初，生物必 须发展离子调节和稳定原生质结构的有效机制。在细胞内形成了对盐适应的能力和涉及整 个生物体的其它调节能力之后，盐生植物才能适应在高盐生境中存活。近年来由于气候 干燥，雨量稀少和人类对土地的不正确的管理和使用造成土壤水分的严重蒸发，地下水位 上升，盐分聚集在地表，从而造成了土壤的盐碱化。表层土壤中含有大量可溶性盐类的土 壤称为盐土，当表层土壤中性盐含量超过0 2 时，对大部分农作物均可产生不同程度的危 害，这种土壤称为盐化土壤，或盐渍化土壤。盐土和盐化土壤总称为盐土类土壤。表层土 壤中含碱性盐为主的土壤称为碱土，这种土壤的溶液呈强碱性反应p h 8 5 ，一般含可溶 性盐很少，土壤胶体吸附一定数量的交换性钠。碱化度超过5 时，这种土壤称为碱化土 壤；碱化度大于2 0 时，此种土壤称为碱土，碱化土壤和碱土合称为碱土类土壤【7j 。中国 的盐碱土主要分布于西北、华北、东北和沿海地区，约2 0 0 0 万公顷，约占总耕地面积的 1 0 。随着工业污染加剧、灌溉农业的发展和化肥使用不当等原因，次生盐碱化土壤面积 还在继续扩大，给农业生产造成重大损失【引。自然界中，盐碱土所含盐分的种类很多，但 其中的中性盐以n a c l 和n a 2 s 0 4 为主，碱性盐则以n a 2 c 0 3 和n a h c 0 3 为主。通常土壤含 盐量在o 2 0 5 时不利于植物生长，而盐碱土的含盐量高达0 6 1 0 时就会严重伤害植 物，而且破坏土壤结构，危害农业生产。综上所述，研究植物的抗盐碱性已经成为国内外 科研工作者十分重要的任务。 s h i d c 等( 1 9 9 3 ) 研究证明，中性盐胁迫和碱性盐胁迫是两种不同性质的胁迫。他们 应该相应地称为盐胁迫和碱胁迫，并且认为碱胁迫对植物的破坏作用明显大于盐胁迫1 9 j 。 土壤盐化与碱化的含义也应有所区别，盐化应以土壤盐度升高为主要特征，碱化则应以土 壤p h 高为主要特征 1 0 _ 1 3 ，单一的高p h 或盐度对植物的有害影响低于两者共同作用时的有 害影响。后来的研究也证实了以上的观点【1 4 4 ”。 逆境胁迫会使植物受到伤害，严重时甚至会导致死亡。当胁迫因子作用于植物时，首 先直接受到伤害的是生物膜系统。位于膜上的酶的结构紊乱，活性改变，各种代谢活动无 序进行，透性加大，这种伤害称为原初直接伤害。质膜受伤后，进一步导致植物的代谢作 用失调，影响正常的生长发育，此种伤害称为原初间接伤害。一些胁迫因子还可以产生次 生胁迫伤害，即不是胁迫因子本身而是由它引起的次生胁追造成的伤害。例如，盐分胁迫 的原初胁迫是盐分本身对植物细胞质膜的伤害及其导致的代谢失调；另外，由于盐分过多， 使土壤水势下降，产生水分胁迫，使植物吸水困难，这种伤害称为次生伤害。 植物对环境的适应( 或抵抗) 主要包括两个方面：避逆性( s t r e s sa v o i d a n c e ) 和耐 逆性( s t r e s st o l e r a n c e ) 。前者是指植物通过各种方式( 包括调整生育期、特殊的形态 结构等) 对不良环境在时间或空间上的躲避。后者是指植物在不良的环境中，通过代谢的 变化来阻止、降低甚至修复由逆境造成的伤害，从而保证正常的生理活动。一般来说，避 逆性多表现为植物的形态结构特点，而耐逆性往往与原生质和内部生理机制有关。 根据植物的抗盐能力的大小，可分为盐生植物( h a l o p h y t e ) ( 即能在盐渍生境中正常发 育，并且可以完成其生活史的植物) 和甜土植物( g l y c o p h y t e ) ( 即不能在盐渍生境中正常 生长和发育，其生长发育很容易受到盐分胁迫的伤害，开始生长发育迟缓，后来则走向死 亡) 两大类。前者可生长的盐度范围为1 5 2 o ，一后者的盐度范围为o 2 0 8 。根据不 同植物对盐碱胁迫的适应方式不同也可分为以下几种 18 】： l 、泌盐植物【19 】：植物在吸收盐分后，不积累在植物体内，而是通过盐腺 2 0 排出体外，如 柽柳( t a m a r i xc h i n e n s i s ) 。 2 、稀盐植物：植物生长快，吸水多，能把吸进体内的盐分稀释，如小麦( t r i t i c u m a e s t iv u m ) 、大麦( h o r d e u mv u l g a t el ) 。 3 、聚盐植物：植物具有肉质茎，体内有盐泡，能将原生质内的盐分排到液泡里去，使细 胞的渗透压增加，就可提高吸收水分和养分的能力，如盐角草( s a l i c o r n i ae u r o p a o a ) 、 碱蓬( s u a e d ag l a u c a ) 。 4 、拒盐植物：植物体内的细胞的原生质对盐分的透性很小，并在液泡内累积有机酸、可 溶性糖和其他物质，渗透压较高，能从外界吸水，如长冰草( a g r o p y r o ne o n g a t u m i ) 。 5 、中生植物：植物能分泌有机酸到根际，中和碱性离子，同时在原生质中又有能与盐类 结合的清蛋白，可提高原生质对盐类的抗凝固作用。清蛋白对细胞内氢离子浓度、细胞含 水量和盐分进入细胞都有稳定作用，因而可以提高植物的抗盐能力【18 1 。 2 盐碱胁迫蛋白的研究 在逆境胁迫下，植物体内正常的蛋白质合成被抑制，但同时也有若干新的蛋白产生， 这些蛋白的生成往往提示新的功能的产生并且能提高抗性。最早发现的就是在高温诱导下 的热激蛋白h s p 。盐碱胁迫蛋白是指植物在受到盐碱胁迫时表达的新蛋白质或含量增加的 蛋白质，其主要的作用是植物对逆境条件的一种适应性的反应。己发现逆境诱导蛋白( 耐 盐碱蛋白) 在整体植株、悬浮培养和愈伤组织细胞中均有存在。但是由于经过长期自然选 择和人工选择生存下来的物种，有其独特的方式来适应外界环境的变化。因此，并非所有 植物的培养细胞或幼苗在盐环境下都有新蛋白出现，或出现的新蛋白都是2 6 k d 蛋白。研 究表明，盐碱胁迫诱导的蛋白随物种变化而变化，没有明显的相似性存在。盐碱胁迫蛋白 的多样性引发了学者们对不同物种盐碱胁迫蛋白种间差异性的研究。 国外学者进行了某些盐胁迫蛋白的亚细胞定位、不同物种盐胁迫蛋白差异性等方面的 研究【2 1 2 钔，试图通过深入研究，弄清植物耐盐基因的调控机理，最终产生出工程耐盐作物 品种。目前的研究主要集中在烟草( n i c o t i a n at a b a c u ml ) 、水稻、小麦等甜土植物上， 采用基因工程手段提高植物的耐盐能力，并已能部分提高转基因植株的耐盐能力。而对于 真正耐盐植物胁迫蛋白研究也多数集中在大米草( s p a r t i n aa n g l i c a ) 、铺地黍( p a n i c u m 2 e p e n $ l ) 、碱蓬等植物中。 1 存在于悬浮培养和愈伤组织细胞中的耐盐蛋白 s i n g h 等( 1 9 8 3 ，1 9 8 5 ) 报道，在筛选出的n a c i 适应型细胞系中存在5 8 、3 7 、3 5 5 、 3 4 、2 6 、2 l 、1 9 5 和1 8 5 k d 的耐盐蛋白，烟草n a c i 适应型细胞大量积累2 6 k d 耐盐蛋白， 可达总蛋白量的1 2 。r a m a g o p a l ( 1 9 8 6 ) 报道，生长在含n a c i 培养基上的玉米愈伤组织 合成了2 6 2 、2 8 5 和7 4 k d 的耐盐蛋白。e r i c s o n 等( 1 9 8 4 ) 和k i n g 等( 1 9 8 6 ) 分别发现， 除去盐胁迫后，盐蛋白含量回到对照水平。 2 存在于整体植株中的耐盐蛋白 s t a p l e s 等( 1 9 8 6 ) 报道，番茄幼苗的根在盐处理6 小时后出现耐盐蛋白。r a m a g o p a l ( 1 9 8 7 ) 报道，大麦幼苗的根在盐处理4 小时后出现耐盐蛋白，而一旦除去盐胁迫，其耐 盐蛋白含量便回到对照水平。 3 耐盐蛋白积累与其它逆境的联系 s i n g h 等( 1 9 8 5 ) 报道，渗透胁迫也引起2 6 k d 耐盐蛋白的积累。b r e s s a n 等( 1 9 8 7 ) 把等电点大于8 2 的2 6 k d 耐盐蛋白命名为渗透压蛋白( o s m o t i n ) ，因其积累总是伴随渗 透调节过程的开始。s i n g h 等( 1 9 8 7 ，1 9 8 9 ) 提纯了渗透压蛋白，并进行了兔疫亚细胞定 位研究。 s i n g h 等( t 9 8 4 ，1 9 8 7 ，1 9 9 0 ) 还报道，外源脱落酸处理诱导了2 6 k d 耐盐蛋白的积累， 但是暂时的，只有继续用n a c i 处理，该积累才能维持。 4 、耐盐蛋白产生与作物品种的关系 r a m a g o p a l ( 1 9 8 7 ) 发现，耐盐的大麦品种c m 7 2 和不耐盐品种的耐盐蛋白及盐诱导的 p o l y ( a + ) r n a 有种属特异性。g u l i c k 等( 1 9 8 5 ，1 9 8 7 ) 研究了用不耐盐的栽培品种中国 春小麦与有高耐盐性( 由不同染色体上的多个基因控制) 的野生高冰草进行杂交的情况。 他们观察到：盐处理的杂种植株根中变化的p o l y ( a + ) r n a 在盐处理的中国春小麦根中也 都有，但两者的调节方式有区别，高冰草的高耐盐性在杂交品种中得到表达。 我国学者也作了大量的研究 2 5 _ 删。 目前，随着植物耐碱机制研究的深入，人们得到了许多与植物耐盐碱有关的蛋白质和 基因f 3 0 】。 l 、通道蛋白 通道蛋白是在细胞膜上的一类蛋白质，是水选择性通透的膜内在蛋白。1 9 9 2 年y a m a g u d h i h i n o z a k i 等人利用差别杂交的方法从缺水诱导的拟南芥菜中分离得到九个基因的c d n a 克隆，称r d 基因。1 9 9 5 年y a m a d a 等人从冰叶龙须海棠的c d n a 文库中分离了水通道蛋白 基因。分别命名为m i p a ，m i p b ，m i p c 。他们的m r n a 水平的波动变化与盐胁迫下叶子的 膨压变化相一致。目前，己从根瘤菌共生膜蛋白和拟南芥中分离出了三类水通道蛋白： n o d 2 6 类、液泡膜水通道蛋白、植物质膜水通道蛋白。研究表明，水通道蛋白的活性受磷 酸化调节。 2 、l e a 蛋白( 晚期胚胎发生富集蛋白) 1 9 8 1 年d u r e 等人首次从棉花种子发育晚期胚胎中发现大量积累的一类蛋白质。1 9 9 3 年b e w l e y 和b 1 a c k 发现l e a 蛋白与种子的脱水耐性有关。1 9 9 7 年k e r m o d e 发现在幼苗和 成年植株中l e a 蛋白在转录水平上为a b a 、高渗透浓度和水分胁迫诱导表达。可保护植株 免受脱水伤害作用。l e a 蛋白可根据其同源性分为六组。目前其功能大部分己知。 3 、s o s 基因家族川 ( 1 ) 、s o s l 基因：s o s l 基因是通过t d n a 插入法得到的，w u 等人运用分子标记技术s s l p 对s o s l 突变体进行了检测，发现标记靠近n g a l l 4 5 的2 号染色体上，又借助b a c 克隆技 术把s o s l 基因定位在7 0 k b 范围内。研究表明：s o s l 基因编码一个假定的n a + h + 逆向转运 因子，盐胁迫因素正调控s o s l 基因的表达。 ( 2 ) 、s o s 2 基因：s o s 2 基因是通过定位克隆得到的，被定位在5 号染色体上，编码一个 假定的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，盐胁迫因素正调控s o s 2 基因在根部的表达 ( 3 ) 、s o s 3 基因：s o s 3 基因位于5 号染色体上，在分子标记n a g l 3 9 和c k p k 9 之间，a f l p 分析s o s 3 限定在1 2 0 k b 之内，运用b a c 标记方法发现：b a c 毗连的序列群与这个区域相连。 s o s 3 基因编码钙结合蛋白和一个假定的n 一豆蔻酸化序列。 对于盐碱胁迫蛋白今后的研究应着重于：( 1 ) 搞清耐盐碱蛋白的生理功能；( 2 ) 搞清 4 与耐盐碱性相关的耐盐蛋白合成的调控机制。在耐盐碱蛋白合成过程中，参与调控的因子 可能有直接作用和间接作用之别，前者如n a + ，后者如内源性脱落酸。最近的研究表明， 耐盐性可能依赖多基因的协调表达。目前要操作这些多基因是有困难的。但随着对与耐盐 性有关的耐盐蛋白合成调控机制的了解，相信终有一天可通过基因操作提高固有耐盐基因 的表达，从而达到提高作物耐盐碱性的目的p 。 3 氮代谢的研究 植物生长在盐渍条件，蛋白质合成受到抑制，而蛋白质水解加强，结果导致各种氨基 酸积累，由大量蛋白质水解产生的各种各样的氨基酸，其中一些氨基酸在高浓度下对植物 是有害的，例如天冬氨酸，谷氨酸等。 氨基酸和其他可溶性氮化物在植物代谢中具有重要作用，它们是无机氮素同化以及蛋 白质和核酸的前体的重要原料。植物的氮素代谢主要经过三个步骤：第一，无机氮向低分 子有机氮的转变。在高等植物中，这一过程是不可逆的，意思是说氮素一旦被转变成有机 形式，它将以此种形式长期保存在植物体中。第二，高分子量氮化物的合成以及作为合成 反应建成单位的氨基酸的合成。第三，增大水解酶的活性，分解大分子氮化物。已知盐分 胁迫可以采用不同的方式影响所有这些过程，从而影响植物的氮素代谢垆j 。 盐分对植物氮素的干扰是通过降低氮素的吸收( r u s h 等，1 9 7 5 ) ，降低硝酸还原酶活 性( h e i m e r ，1 9 7 3 ：s h a r m a ，1 9 8 3 ) ，改变氨基酸合成( h e l a l 等，1 9 7 9 ：s h a r m a ，1 9 8 0 ) 来 实现的。然而，也有相反的报道，h e i m e r 提出，盐分对硝酸还原酶的活性没有作用”1 。 植物既能吸收和同化n o 。形式的氮，也能吸收和同化n h 。+ 形式的氮，盐分胁迫影响氮 素代谢正是从无机氮的吸收水平着手的。硝酸还原酶催化n o 。到n o 。的还原作用，这种酶 对所有胁迫都十分敏感，特别是对盐渗透的胁迫。p l a n t ( 1 9 7 4 ) 发现当以n a c l 处理时，硝 酸还原酶活性被抑制。k l y s h e v 等( 1 9 7 4 ) 报道，豌豆以等渗的n a c l 和n a z s 0 4 处理时，可 以导致硝酸盐和亚硝酸盐的积累。s h a r m a 等( 1 9 8 3 ) 证明等渗n a c l 对小麦硝酸还原酶有 抑制作用。r a k o v a 等( i 9 7 8 ) 报道，豌豆根中酶的总活性及谷氨酸脱氢酶和谷氨酸合成酶 的活性都被盐分胁迫抑制。s h a r m a ( 1 9 8 0 ) 以及s h a r m a ( 1 9 8 5 ) 发现小麦在等渗的p e g 和 n a c l 条件下，在幼苗、分蘖、抽穗和灌浆期，其丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶的活性都 增大【5 1 。 无机氮被吸收还原后，在植物体内经运输! 合成! 转化及再循环等各种生理活动过程 后，与蛋白质代谢共同构成其生命活动的基本过程。 4 研究意义和目的 世界上约有9 5 5 亿h w 土地具有不同程度的盐碱化，我国有盐渍化土地3 3 0 0 万h m 2 ， 主要分布在东北、华北、西北的内陆地区以及沿海地区。在耕地有限、人口不断增长的今 天，快速开发和有效利用盐渍化土壤资源具有重要的现实意义。提高植物的耐盐碱性是开 发和利用盐渍土地最有效的方法之一，也是未来农业和畜牧业发展的重大课题之一。有关 植物耐盐性的研究进展非常迅速，但通过生物技术和基因工程提高作物抗盐性的研究工作 进展缓慢，主要是因为耐盐的机理没有完全搞清楚，目前不能确定是哪些基因或者哪些代 谢过程在植物的抗盐碱性中起关键作用，所以到目前为止尚没有培育出较理想的耐盐植 物，也没有找到从本质上阐明植物耐盐性的生理生化指标。 另外对于植物耐盐性的研究国内外学者大多集中在烟草、水稻、小麦等甜土植物上， 而对于耐盐碱蛋白的研究也仅限于实验室内，以种子实生苗为实验材料。从天然群落植物 取样研究盐胁迫蛋白的比较少，本实验采用野外不同盐碱化程度草地的主要禾本科优势植 物羊草为实验材料，与室内模拟生境( 不同梯度混合盐碱) 相结合的方法，对羊草的盐胁 迫蛋白以及羊草氮代谢的方面进行研究，为进一步筛选出耐盐基因，搞清楚耐盐植物抗盐 碱的代谢过程提供基础资料，为进一步培育出优良耐盐碱牧草提供理论依据。 松嫩平原位于我国平原的中北部，是东北平原的主体部分，地理位置位于东经 1 2 1 。3 1 一1 2 7 。o o7 ，北纬4 3 。3 07 4 8 。4 0 ，海拔高度约1 5 0 一2 0 0 m 之间，由松 花江、嫩江及其冲积和洪积而成，总面积约1 7 万k r n 2 【3 。 松嫩平原全区地形低平，略有起伏，低洼地主要分布于平原中部，岗丘主要分布于平 原周边位置。周围有嫩江、松花江纵横川流于其北部和中部，地表径流宣泄不畅，同时汇 聚成大大小小不的沼泽和湿地，是典型的盐碱地平原1 3 。 羊草( l e y m u sc h i n e n s i s ) 属于禾本科赖草属，是松嫩平原盐生草甸的优势植物，是 耐盐碱性较强的一种优质牧草。它的生态分布幅度很宽，能和獐毛( a e l u r o p u ss i n e n s i s ) ，碱 茅( p u c c i n e l l i at e n u i f l o r a ) ，碱蓬( s u a e d ag l a u c a ) 等耐盐碱性较强的植物组成混合群落， 说明羊草对不同盐碱生境的适应程度不同，羊草具有较强的适应盐碱逆境的能力，是由它 自身的耐盐碱机理决定的。 6 第一章材料与方法 一、自然概况 研究地点位于吉林省长岭县腰井子种马场境内东北师范大学松嫩草原研究站，地处松 嫩平原南部，其地理位置为1 2 3 。4 47 1 2 3 。4 7 e4 4 。4 0 4 4 。4 4 n ，海拔 1 3 8 1 4 5 m 。该地区为冲积一湖积平原。由于地形封闭，径流不畅，地面蒸发量大，地下水 位高，且含可溶性盐类，使该地区土壤大部分盐渍化【35 1 。该地区属于温带半湿润草原气 候，年降水量平均为4 7 0 m m ，多集中在6 8 月份，年蒸发量约为降水量的3 5 倍。年平均 温度为4 9 c ，最高月平均气温出现在7 月，最低月平均气温出现在1 月。土壤以碱化草 垫土为主，p h 值大于8 以上，可溶性盐含量较高为0 3 0 0 5 。植被以羊草群落占绝对 优势，分布广泛。在土壤条件较好的地段分布着拂子茅( c a l a m a g r o s t i se p i g e i o s ) 群落。 在不同程度盐碱化土壤上分布着碱茅群落、虎尾草( f o r 括v i r g a t a ) 群落和碱蓬群落。在 碱化严重地段出现碱斑f 3 6 j 。 二取样 按照土壤p h 值由低到高依次选取6 个样地，其典型标志为土壤p h 值和电导率依次 逐渐升高，羊草种群密度逐渐降低，草地盐碱程度逐渐加重( 表1 ) 。每个样地面积为3 m 3 m 。从5 月到1 0 月每月取样一次，每个样地重复3 次。取样时主要取羊草的叶片。 表1 不同退化演替阶段土壤p h 值和电导率( 单位：ps c m 。1 ) t a b l e lt h es o i lp ha n dc o n d u c t i v i t yi nd i f f e r e n td e g e n e r a t ee v o l u t i o ns t a g e ( u n i t ：us e m 一1 ) 三模拟盐碱环境实验 用砂培法培养羊草，4 月中旬于温室播种，出苗后约5 月初移至室外培养。每天下午4 时左右，以h o a g l a n d 完全培养液浇灌，每次用量为砂基含水量的2 倍。 盐碱土取自松嫩草地东北师范大学长岭实验站的碱斑土。按照土壤和蒸馏水1 ：1 、 7 1 ：2 、1 ：3 、1 ：4 、1 ：5 、l ：6 的比例提取土壤可溶性离子作为胁迫处理液。以蒸馏水作 对照。光碱斑土壤和水比例为1 ：5 时，其电导率为1 5 7 0 6 ps c m ，p h 值为1 0 3 9 0 3 。处理于下午5 7 时进行，每隔3 天处理一次。处理液体积与营养液体积一致，按每 盆砂基含水量的2 倍透灌，进行盐碱胁迫处理，共处理3 次，处理期间人工遮雨。每天早 晚两次用称重法确定每盆失水量，以完全营养液补充所失水分。第3 次处理后的翌日清晨 5 点左右取样，取样时选取叶片节位一致，大小相同的叶片做实验用材料，每个花盆重复 三次。取完样后用冰盒保存直接带回实验室测定。 四实验方法 1 、可溶性蛋白含量的测定 羊草叶片洗净，剪碎用t r i s h c l 缓冲液( 0 0 5 t 0 0 1 1 1t r i s h c l ；p h 8 0 ) 低温研磨， 1 5 ，0 0 0 g 离心1 0 m i n ( 4 c ) 。取上清液按考马斯亮蓝g 2 5 0 法( b r a d f o r d ，1 9 7 6 ) 【3 7 1 测定。 称取1 0 0m g g 2 5 0 溶于5 0m l9 5 乙醇中，加入8 0 正磷酸1 0 0m l ，最后加蒸馏水定容 1 0 0 0 m l 。试管中加入5m l g 2 5 0 和o 1m 1 样品，振荡摇匀，2m i n 后于5 9 5n i n 比色。用牛 血清蛋白质制作标准曲线，根据测定的a 值，查标准曲线，计算样品蛋白质含量。单位为： m g 酉1 f w 。 比色采用u v - 7 5 4 型分光光度计 2 、可溶性蛋白质提取和s d s p a g e 取鲜重0 4 9 的羊草叶片，加8 m l 蛋白提取液( 7 5 m m o l 1p h 7 8 的磷酸缓冲液) 低温 研磨成匀浆，1 5 ，0 0 0 g 离心2 0 m i n ( 4 ) ，上清液用2 0 m l 冷丙酮沉淀，8 8 0 0 g 离心 1 5 m i n ( 4 。c ) ，所得蛋白沉淀用蛋白溶解液( 含6 2 5 m m o l 1 的t r i s h e l ，p h6 8 ：2 s d s ：1 0 甘油：5 巯基乙醇) 溶解后供电泳用。 s d s p a g e i l 5 j ：( 改良) 1 、制胶： 溶液组成 a ：1 nh c l2 4 0 m lb ：1 nh c l2 4 0 m i s d s2 o gs d s2 0 9 t r i s1 8 1 5 9用t r i s 调p h 到7 0 后定容至 定容至5 0 0 m l ，冰箱保存。5 0 0 m l ，冰箱保存。 c ：丙烯酰胺3 0 9e ：核黄素8 m g 甲叉双丙烯酰胺0 8 9定容至2 0 0 m l ，冰箱保存。 定容至1 0 0 m l ，冰箱保存。 p ：过硫酸铵1 5 9 定容至l o o m l ，冰箱保存。 t e m e d 试剂：四甲基乙二胺 凝胶配制： 分离胶：1 0 m la + 1 6 m lc + 2 m lp + 蒸馏水1 2 m l + t e m e d2 0 t al 浓缩胶：5 m l b + 3 m l c + 4 m l e + 0 5 m l p + 蒸馏水7 5 m l + t e m e d5u l 将分离胶缓缓灌入玻璃槽中( 注意防止产生气泡) ，垂直放置电泳槽，立即在胶面上 小心注入3 - 4 m m 水层，静放聚合，然后去水层，吸干。同样方法制备浓缩胶，将胶注入 制备好的分离胶上，插上梳子，放于光下聚合。胶聚合后，小心取出梳子，向样品槽中加 入电极缓冲液( 甘氨酸1 4 4 9 + t r i s3 0 9 + s d s1 2 5 9 蒸馏水定容至l l 。 2 、点样： 用微量注射器抽取样品( 5 0 u1 ) ，小心加入样品槽中，边缘的样品槽中加标准蛋白。 3 、电泳： 向电泳槽中注入电极缓冲液，接通电源，在1 7 0 v 下电泳，当指示染料离胶底1 c m 处 时可停止电泳。 4 、染色和脱色： 取出胶后，平放在直径1 5 c m 的大培养皿中，水漂洗后加染色液( 考马斯亮蓝g _ 一2 5 0 2 2 5g - t - 丙酮4 4 0 m l + 醋酸6 0 m l 定容至5 0 0 m 1 ) 染色8 - 9h 。而后倒去染色剂，水洗1 2 次后加入脱色液( 丙酮2 0 0 m l + 醋酸5 0 m l 定容至1 0 0 0 m 1 ) 脱色直至背景清晰为止。 3 、总氮含量的测定3 8 i 参照微量凯氏定氮法删测定。仪器采用凯氏定氮仪。 4 、硝态氮的测定【3 9 1 将o 5 9 新鲜材料，放入研钵中，加入1 醋酸后研细，以1 醋酸定容至1 2 5 m l ，混匀 后用干滤纸过滤，取过滤液4 m 1 + 4 m l0 8 m o l l 醋酸钠，混匀，加适量锌粉，震荡1 0 m i n ， 然后用滤纸过滤，取4 m l 过滤液加l m l 硝酸试剂，混匀，1 0 m i n 后用7 5 4 型分光光度计在 波长为5 4 0 n m 处比色。以2 m 1 分析液补水至5 m l 为对照。 5 、铵态氮的测定1 3 9 1 0 5 9 鲜样十5 m l1 0 醋酸于研钵中研磨至匀浆，以水稀释至1 0 0 m ，混匀，滤纸过 滤，弃去最先滤下的一部分滤液。从剩下的滤液中取2 m 1 + 3 m 1 水合印满三酮试剂+ 0 1 m 1 抗坏血酸，摇匀。沸水加热1 5 m i n 。同时将对照溶液( 2 m 1 + 3 m 1 印满三酮试剂+ 0 1 m l1 抗坏血酸) 的试管一起加热1 5 m i n 。取出后放入冷水中迅速冷却，以7 5 4 型分光光度计于 波长5 8 0 n m 处比色。 五、数据处理 所有数据均为三次重复的平均值标准误差进行计算，采用m i c r o s o f te x c l 程序 对所有数据进行相关数学分析。蛋白电泳用d o l p h i n d o ( 凝胶成像仪) 照相与分析。 一、土壤盐碱度的变化 1 1 1 0 5 1 0 姆9 5 纛。 一8 5 8 7 5 7 0 0 6 0 0 褂5 0 0 曲4 0 0 羽 繇3 0 0 刊2 0 0 1 0 0 0 第二章实验结果 样地 图1 不同退化演替阶段土壤p h 值 6 l23456 样地