（分析化学专业论文）蔬菜中有机磷农药残留的快速检测方法研究.pdf

河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕士学位论文赵永福 摘要 农药的使用给农业带来了巨大的经济效益，但同时对环境与产品造成严重污 染。为了更好地确保人们健康，必须加强对蔬菜水果中农药残留的监控。 农药残留常用的检测方法为色谱法，质谱法以及波谱法等，此外，还有免疫 分析法、生物传感器检测法及酶抑制法等快速检测方法。传统农残检测方法通常 耗时长、成本高、难以满足现场快速检测的需要。免疫分析法虽然具有操作简单、 快速、灵敏度高优点，但它的开发过程需要投人大量资金、较长时间、抗体制备 难度较大、抗体只适用于单一农药残留量的检测分析。相对而言，酶抑制检测法 则为有机磷农药的检测提供一条快速、简便的途径，且酶抑制法无需昂贵的仪器 设备，适于现场检测及大量样品筛选。鉴于此，本论文着重研究了农残速测的植 物酶抑制法。具体开展的研究工作如下： 一、植物酶抑制光度法中增敏剂的探讨研究 1 ，表面活性剂在蔬菜农药残留检测中增敏效果研究 系统研究了阴离子、阳离子、非离子表面活性剂对于植物酶抑制法测定蔬果 农药残留灵敏度的影响及其对显色剂的增稳作用。结果表明，阴离子表面活性剂 十二烷基硫酸钠具有显著增敏和增稳作用。 2 十二烷基硫酸钠在蔬菜农药残留检测中的应用研究 在植物酶抑制法测定蔬果农药残留中，阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠对 显色体系具有显著增敏效果，其增敏幅度达到7 0 ，同时对显色剂有增稳作用。 实验中将十二烷基硫酸钠加入到显色剂中，测定蔬菜中敌敌畏等有机磷农药残留， 取得了满意的结果。 二、b 环糊精增敏荧光法快速测定蔬菜中有机磷农药残留 酶抑制法中，植物酯酶催化底物乙酸1 萘酯分解为荧光物质1 萘酚，采用荧 光法测定1 蔡酚的荧光强度，由于1 一萘酚荧光效率低造成检测灵敏度较低。研究 中通过d 一环糊精对1 萘酚的包络作用，提高了1 萘酚的荧光效率，荧光强度显著 河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕士学位论文赵永福 增加，极大提高了检测灵敏度。该体系用于蔬菜中甲胺磷农药残留测定，取得了 满意的结果。 三、甲胺磷离子选择性电极的研制及其在农药残留检测中的应用 以四苯硼钠与甲胺磷在盐酸介质中生成的离子缔合物为电活性物质，首次研 制出一种甲胺磷p v c 涂层玻璃电极。并对该电极的响应机理及性能进行了研究。 实验表明，该电极的n e m s t 响应范围为1 1 0 1 1 0 4 ( v v ) ，斜率为5 0 2 8 m v 佑c 该 电极响应迅速，重现性好，用于甲胺磷农药的测定，方法快速、准确结果满意。 关键词：农药残留，植物酶，有机磷农药，蔬菜 i i 河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕士学位论文赵永福 a b s t r a c t p e s t i c i d eu s e di na g r i c u l t u r eh a sg r e a n yi n l p r o v e df b o dp r o d u c t i o nw o r l d w i d e h o w e v e r ，d u et of h el a 唱e s c a l ea p p l i c 撕o no fo 穆a i l o p h o s p h o m sp e s t i c i d e s ，t 1 1 e r e s i d u ao fp e s t i c i d e sh a d b r o u g h t s e r i o u se n v i r o n m e mp 0 1 l u t i o n 、v h i c hb e c a i l l ea g r e a t e ra n dg r e a t e rt i l r e a t e nt ot i l eh e a l mo fh u m a l lb e i n g s a t p r e s e n t t h u st l l e a n a l y s i sa n dd e t e r m i n a t i o no f p e s t i c i d er e s d u e si nv e g e t a b l e si sv e r yi m p o r t a n t c o n v e n t i o n “m e t h o d sf o rd e t e c t i n gr c s i d u a lp e s t i c i d e si n c l u d e dc l r o m a t o g r a p h y ， m a s ss p e c t r o m e t r y ， s p e c t r o s c o p y ， i n r u l u n o a s s a v a i l a l y s i s，b i o s e n s o r a 1 1 ds o o n ， c o n v e n t i o n a lm e m o d sf o rd e t e c t i n gr e s i d u a lp e s t i c i d e sw e r et i m ec o n s u m i n ga n dc o s t l y ， 孤dw e r eh a r dt o s “s 母 t h e i n c r e a s i n gr e q u i r e m e n t s o ft h eo n l i n ed e t e c t i o n i n i l i l u n o a s s a va n a l y s i sw a sb o t hr a p i d ，s i m p l e 趾ds e n s i t i v e ，b u ti t sd e v e l o p m e n t 、a s t i m ec o n s u m i n ga n dc o s t l y a sac o m p a r i s o n ，e n z y m ei n h i b i t i o nt e c h n i q u ep r o v i d e da p r o m i s i n gw a yt o d e t e c to 唱a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e sw h i c hw a sb o t l lr 印i da n d s i m p l e w i mt h i sm e t h o dam a s so fs a i l l p l e sc o u l db ed e t e c t e dq u i c “y s ow ep l a c e d e m p h a s i so ns t u d y i n go ne n z y m e p l a n ti n h i b i t i o nt e c l l n i q u ea i l dh a v ed o n es o m ew o r k i n m i s p a p e r f i r s t s t u d ya n da p p l i c a t i o no fs u r f h c t a n ti nd e t e c t i o no fp e s t i c i d er e s i d u e si v e g e t a b i e sw i t he s t e i a s ei n h i b i t i o nm e t h o d 1 s t u d yo ne f f e c to fs u r f h c t a n to ns e n s i t i v i t yi nd e t e c t i o no fp e s t i c i d er e s i d u e si n v e g e t a b l e s 1 1 1d e t e c t i o no fp e s t i c i d er e s i d u e sw n hp l 趾t - e s t e r a s ei i l l l i b i t i o nm e t l l o d ，e 脏c to f a n i o ns u r f a c t a n t s ，c a t i o ns u r f a c t a n t sa i l dn o n i o ns u r f a c t a j l to nd e t e c t i n gs e n s i t i v i t ya 1 1 d c 0 1 0 rr e a g e ms t a b i l i t yw a sr c s e a r c h e di n 廿l i sp a p e la sar e s u l t ，a n j o ns 1 1 r f a c t a m sh a v e 矗m c t i o ni n c r e a s i n gs e n s i t i v i t ya n ds t a b i l i t yb ya d d i n g “i n t oc o l o rr e a g e n t 2 a p p l i c a t i o no fs o d i u md o d e c y ls u l f h t ei nd e t e c t i o no fp e s t i c i d er e s i d u e si n v e g e t a b l e s i nd e t e c t i o no fp e s t i c i d er e s i d u e sw i t hp l a n t - e s t e r a s ei 1 1 h i b i t i o nm e m o d a n i o n s l l r f k t a i l t ( s d s ) h a s 如n c t i o n si n c r e a s i n gs e n s i t i v “yo ft 上1 ec o i o rr c a c t i o ns y s t e ma i l d s t a b i l i t yo f 血e c o l o r i h a g e n t i n t h i s p 印e r ，s o d i 啪d o d e c y ls u l f a t e ( s d s )，w h i c hw a s a d d e di n t o 血ec o l o rr e a g e n t ，w a su s e dt od e t e 吼i n ed i c h l o o si nv e g e t a b l e “廿l i i i 河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕士学位论文赵永福 s a t l s t a c t o r yr e s u i t s s e c o n df i u o r o m e t r i cd e t e r m i n a t i o nf o ro r g a n o p h o s p h o l l i sp e s t i c i d er e s i d u s e s i v e g “a b l e sw i t hp c ds e n s i t i z e r p i a l l t e s t e r a s ec a nc a t a l y s es u b s t r a t e 1 _ n a p h t l l y la c e 诅t et od e c o m p o u l l dn u o r e s c e n t p m d u c t f l u o r e s c e n c ei n t e n s 时o f1 - n 印h t h o lw a sm e n s u r a t e dw i t hs p e c 廿o n u o r o g e n j c m e t h o d a sn u o r e s c e n c ee m c i e n c yo f1 一n a p h m 0 1w a sl o w ，s e n s i t i v i 锣o fd e t e c t i o n 吣 l o ww i t hn u o r e s c e n c ee 币c i e n c yo f1 _ n a p h t l l 0 1i n c r e a s e d ，n u o r e s c e n c ei m e n s i t yo f l - n a p l l t i l o le n h a n c e df o r i n c l u s i o no fp - c y c l o d e x t r i ns od e t e i m i n a t i o ns e n s i t i v i 妙 i n c r e a s e d t l l 主sm e m o dw a sa p p l i e dt od e t e m l i n em e m 枷d o p h o si nv e g e t a b l e sw i m 8 a t i s f i e dr e s u l t t h i r d p r e p a r a t i o a n da p p l i c a t i o no fm e t h a m i d o p h o ss e l e c t i v ee l e c t m d e m e t l l 锄i d o p h o si o n i s e l e c t i v ee l e c t r o d e ，i n c o i p o r a t i n gp v c m e m b 越n ew i t h m e t h a m i d o p h o s t e t r a p h e n y l b o r o ni o np a i rc o m p i e xo ng l a s se l e 吐r o d e ，i s 丘r s tr c p o n e d i t sr c s p o n s em e c h a l l i s ma n dp e r f 0 册a i l c ew e r es t u d i e d t h ee l e c t r o d eg a v en e m s t r e s p o n s e t o m e t h a m i d o p h o so v e r m ec o n c e n t r a t i o nr a t l g e o f lx 1 0 。2 1 1 0 。4 ( v v ) w i t h s l o p eo f 5 0 2 8m v ，p c n ee l e c t r o d eu s e df o rd c t e c “o no f m e 恤锄i d o p h o si nv e g e t a b l e ， t h er e s u 】ti ss a “s f h c t j o n k e y w o r d ：p e s t i c i d e r e s i d u e s ，p l a m e s t e r a s e， o 唱a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s ， v e g e t a b l e s 1 v y 9 1 0 8 5 l 关于学位论文独立完成和内容创新的声明 本人向河南大学提出硕士学仕面磊士学位口中请。本人郑重 声明：所呈芡的学位论文是本人独立完成的，对所研究的课题有 新的见解翻创造性的见解口。播我所知，除克中加以说明、标注 和致谢的地方外，论文中不包括共他人已经发表或撰写过的研究 校学术发展和进行学术交流等目的，可仪采取影印、缩印、扫描 和拷贝等复制手段保存、汇编学位论文( 纸质文本和电于文本) 。 ( 涉及保密内容的学位论文在解密后适用本授权书) 学位获得者( 学住论文作者) 签名：起。录橘 莲奎：诸在相醢的“口”内划“”。 加睡sa | 舀镪 河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕士学位论文赵永福 前言 随着农药品种日益增多，使用范围不断拓宽，加之人们对害物综合治理( i p m ， i n t e 掣a t e dp e s tm a n a g e m e n t ) 不够重视而导致农药的不合理不科学使用，农药的管理 不舰范不严格，使得农药在保证和促进农牧业发展，满足人们对农副产品需求的 同时，虽终也危及到人类健康和生态平衡。农药残留给食品带来的影响己受到普 遍重视，联合l 虱食品法典委员会( f a o 脚h o ) 对食品中的农药残留量作了十分严格 的规定。在我国亟待建立健全一套快速、准确、灵敏、简便、无二次污染的农药 残留分析技术。 传统的农药残留检测技术气相色谱、高效液相色谱等需要昂贵的设备、较长 的样品处理和测定时间，等分析结果出来，果菜不能再食用。随着超高效农药的 开发应用和待检样品量的增加，特别是要求现场速测样品数量的增加，对分析的 灵敏度、特异性和快捷性提出了更苛刻的要求。传统的理化分析手段难以适应现 代农药残留分析的要求。传统的应用理化手段在实验室进行样品分析将为二级测 试方法所代替，即先应用简便、快捷的分析方法f 如酶抑制法、免疫分析、生物传 感器等) 进行现场快速初级监测，然后对初级监测中呈阳性反应的样品进行实验室 确证，从而可大大减少分析工作量，提高分析效率。 目前，在蔬菜水果的农药残留检测中，快速的检测方法研究十分活跃，如酶 抑制法、免疫分析法与生物传感器分析法等。 其中，用于农残速测免疫分析法的研究十分活跃。、免疫分析法是将抗体抗原 反应与现代测试手段相结合的超微量分析法。免疫分析法虽然具有操作简单、快 速、灵敏度高、适合现场筛选等优点。但它的开发过程需要投人较多资金、较长 时间、抗体制各难度较大、抗体有特异性只适用于单一农药残留量的检测分析。 在农残的速测技术中，酶抑制法是相对成熟的一种对部分农药残留进行速测 的技术。它适用于有机磷与氨基甲酸酯类农药。而这两类农药已经占到农药市场 的5 7 以上，所以研究有机磷及氨基甲酸酯类农药的速测技术更具有实际意义。 根据此类农药可特异性地抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶 河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕士学位论文 赵永福 ( a c h e ) 活性，破坏神经的正常传导，使昆虫中毒致死这一毒力学原理，将乙酰胆 碱酯酶与样品反应，根据乙酰胆碱酯酶活性受到抑制的情况，可判断出样品中是 否含有有机磷与氨基甲酸酯类农药。 酶抑制法所用的酶包括乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、动物与植物酯酶，其 中乙酰胆碱酯酶应用较多，乙酰胆碱酯酶对有机磷农药较敏感，测定的灵敏度高， 选择性强。但是，乙酰胆碱酯酶的价格昂贵，研究中可采用丁酰胆碱酯酶及动物、 植物酯酶代替乙酰胆碱酯酶。 酶抑制法操作简便、易行、成本低、前期投人少，能对蔬菜水果上常施用有 机磷与氨基甲酸酯类农药残留进行测定。所以，为了防止受此类农药污染的蔬菜 水果进入销售市场，给人们的身体造成危害，本文着重进行了的农药残留检测的 植物酶抑制法研究。 河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕士学位论文赵永福 第一章农药残留分析的研究概况 第一节传统的农药残留检测方法研究进展 1 前言 农药的使用给农业带来了巨大的经济效益，但是农药的大量与不合理使用所 造成的蔬菜水果污染问题也日益严重。因食用受到农药严重污染的蔬菜水果造成 的食物中毒事件屡有发生。因此为了更好地确保人们健康，必须加强对蔬菜水果 中农药残留的监控。 蔬菜水果中农药残留分析是在复杂基质中对目标物质进行定性和定量分析川。 由于蔬菜水果中农药残留水平一般在“业g 】m g l ( g 之间【2 】，因此农药残留分析既要 有精细的微量操作手段，又需要高灵敏度的痕量检测技术。5 0 年代农药残留的分 析法局限于化学法、比色法、和生物检测法，检测方法缺乏专一性，灵敏度也不 高。6 0 年代色谱技术的发展使薄层色谱法在农药残留分析中广泛应用，而气相色 谱的出现推动了农药残留分析的高度发展。直到现在，气相色谱仍起着不可替代 的作用。8 0 年代以来对热不稳定、极性农药及其代谢物应用液相色谱法检测，尤 其是高效液相色谱【3 】。目前，在蔬菜水果的农药残留检测中，免疫分析法与酶抑制 法的研究十分活跃。近年来在农药残留分析领域所取得的重要进展和发展趋势有 以下方面：样品提取和净化方法的简单化、微型化、和自动化，检测方法更加灵 敏、快速。本章就农药残留分析方法及其研究进展情况作一概述。 2 样品的前处理 蔬菜水果中农药残留的一般分析过程为提取一净化一检测。提取是指使用适当 的溶剂将待测物连同样品基质从固态样品中转移至易于净化和分析的液态。净化 是指将待测物与提取液中的干扰物分离。提取、净化是样品的前处理部分，也是 最重要的部分，它们决定着分析的准确性和重现性。由于蔬菜水果组成复杂，基 质与目标物含量相差悬殊，且有降解物及代谢物等影响，从而增加了农药残留分 析的难度。对不同性质蔬菜水果中的不同目标物要采用不同的前处理技术。现在 河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕士学位论文 赵永福 分析中提取、净化已没有严格界限，可一步完成【4 】。 2 1 样品的提取 蔬菜水果的农药残留分析中，样品的提取方法有漂洗法、匀浆法、索氏萃取 法等。匀浆法是将被测样品与萃取溶剂置于粉碎机中高速搅拌，以达到萃取完全 的目的，该方法较为常用。近年来又出现了一些新的提取技术，如，微波加热提 取法( m a e ) 、加速溶剂提取法( a s e ) 等【5 j ，这些方法克服了索氏提取法时间长、 有机溶剂用量大等缺点。 2 1 1 微波加热提取法( m a e )微波加热提取法的原理是利用微波能加速溶剂 萃取并提高效率，使被测物从固体到半固体的样品基质中被分离出来。微波萃取 是在一个不吸收微波的封闭容器内进行的，样品内部的温度和体系压力都较高。 微波萃取装置目前已自动化，可自动控制萃取温度、压力和时间等。但是萃取完 成后，需等待萃取溶剂冷却，然后倒出溶剂，进行离心或过滤等操作。杨云、李 攻科等6 - 7 1 用微波辅助萃取气相色谱质谱联用法分别测定了蔬菜中的扑草净及几 种有机磷农药，回收率在9 2 5 9 9 5 之间。与传统的机械振荡萃取法相比，回 收率相当，同时具有操作简便、省时、省溶剂等优点。 2 1 2 加速溶剂提取法( a s e )加速溶剂提取法是一种新的提取方法，特别适于 固体半固体样品，该方法在较高的温度和压力条件下，用有机溶剂萃取。它的突 出优点是有机溶剂用量少、快速和回收率高。被美国e p a 选定为推荐的标准方法， 己广泛用于环境、药物、食品等样品的提取，特别是农药残留的分析博j 。 2 2 样品的净化 2 2 1 基质固相分散( m s p d ) 基质固相分散是一种新的提取净化技术，其基本操 作是将样品与适量的固体基质( 硅胶、硅酸镁、c 1 8 、c 8 等) 一起研磨，混匀制成 半固态装柱，用合适的溶剂淋洗。基质固相分散法将样品的提取、净化一步完成， 避免了待测农药组分的损失。a i v 0 1 e 1 1 z u e l a 等【9 1 用m s p d 方法对柑橘类水果样品 进行处理，以结合c 8 的二氧化硅作吸附质，二氯甲烷作淋洗剂进行萃取，然后用 h l p c u v 测定，回收率为7 4 8 4 ，检测限为0 1 5 加2 5 肛g 。 2 2 2 固相萃取( s p e ) 固相萃取是一种非常重要的净化手段，它可以将农药从非 4 河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕士学位论文 赵永福 常稀的溶液中富集起来，更利于分析。固相萃取是根据物质极性的不同来进行分 离的。选择一定极性的填料将待分离样品过柱，使物质选择性地吸附于填料上， 然后再进行洗脱，从而达到分离净化的目的。常用的填料有硅酸镁、氧化铝、硅 胶等。刘长武等1 0 1 采用固相萃取代替传统的液液萃取技术和柱层析前处理技术， 使水果蔬菜中的2 5 种农药迅速得到分离、净化、浓缩。m j s a l l t o sd e l g a d o 掣“j 首先用石油醚和二氯甲烷萃取，然后以c 8 作填料用s p e 处理蔬菜样品，用g c 进 行测定，回收率为9 2 一1 1 5 ，检出限为2 0 之1 1 g l ( g 。m o n i k a m i c h e l 用s p e 处 理水果蔬菜等样品，然后测定，回收率为6 8 7 一1 0 5 0 ，检出限为0 0 2 o 2 5 “g 取得了满意的结果。 2 2 3 固相微萃取( s p m e )在固相萃取的基础上出现了圃相微萃取提取净化技 术。固相微萃取实际上是固相萃取的微型化。它是一种非溶剂的提取净化手段， 其优点是将萃取、浓缩两个步骤合为一个步骤，操作简单，所需时间短，用样量 少，选择性强【1 3 】。用固相微萃取处理蔬菜水果样品时，要求先用丙酮等溶剂萃取 样品，以获得好的结果。c h e n y i i 等【1 4 l 用s p m e g c e c d 测定了蔬菜中敌敌畏， 在优化的条件下，测得的回收率为1 0 6 ，检测限为1 0 “g l ，结果令人满意。r a f a e l r 0 d r i 2 u e s 等测定水果中的联苯酚、碘苯睛、毒莠定等农药，用s p m e 处理水果 样品，然后用c e ，m s 测定，回收率达到9 4 ，检测限为0 0 2m g 爪g 。 2 2 4 分子印迹合成技术( m i s r )分子印迹合成技术的原理是首先使被印迹的 分子与聚合物单体键合，然后将聚合物单体交联，再将印迹分子从聚合物中提取 出来，聚合物内部就留下被印迹分子的印迹。分子印迹技术可用于药物，农药， 蛋白质等各种化合物的分离。b j 啪ib j a n n a s o n 等 1 6 、j u nm a t s u i 等分别合成了 以阿特拉津为模板的分子印迹聚合物，对氯代三嗪类除草剂进行富集提取，取得 较好的效果( 提取效率7 4 r 7 7 ) 。i m m af e r r e r i 8 】利用特丁津印迹聚合物对环境水 和底泥样品中的微量氯代三嗪类农药( 去异丙基阿特拉津、去乙基阿特拉滓、西玛 三嗪、阿特拉津、扑灭滓、特丁滓) 进行选择性富集，除扑灭津外( 回收率为5 3 ) ， 所有的三嗪类化合物回收率都高于8 0 ，表明该聚合物具有较高的选择性。 2 2 5 超i 缶界流体萃取( s f e )近年来超临界流体萃取的发展很快，它以超临界 5 河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕士学位论文赵永福 的c 0 2 作淋洗剂，淋洗剂兼有气体的渗透能力和液体的分配能力。流出液中的c 0 2 在常压下挥发，待测物用溶剂溶解后可直接进行分析【4 】。超临界流体萃取可以通过 调节淋洗液的极性来提高萃取的选择性，以便萃取不同性质的残留农药。与传统 的溶剂提取方法相比，超临界流体萃取有很多的优点，首先，可以避免使用大量 的有机溶剂，提高了萃取的选择性，减少了分析时间，且可以实现自动化。另外， 超临界流体萃取可以采用固相吸附剂，提取、净化一步完成。提取液较溶剂提取 法“清洁”，可以直接用气相色谱质谱联用仪测定。s t e v e nj l e h o t a y 统计了来 自7 个国家的1 7 个实验室用s f e g c m s 测定的蔬菜水果上的农药残留的分析结 果，都满足农药残留分析的要求。王建华等2 0 j 用s f e 对蔬菜样品进行处理，在优 化的条件下萃取只需十分钟。王建华等f 2 1 】用s f e g c 测定水果蔬菜中多残留有机 磷农药，样品与硅藻土混合，利用超临界c 0 2 提取，乙酸乙酯收集，回收率为 8 2 1 0 8 。n o b o n lm o t o h a s h i ( 2 列总结了s f e 在农药残留分析中的应用，并指出 该法更适用于水果、蔬菜、生物组织等含水量高的样品中极性农药多组分残留分 析。 3 测定方法 农药残留的检测中，气相色谱和液相色谱技术有了长足的发展，起着不可替代 的作用，近年来新的检测方法，免疫分析法、酶抑制法，生物传感器分析法等的 研究十分活跃。 3 1 气相色谱法( g c ) 气相色谱法是椒药残留分析中重要的方法。气相色谱法准确度及灵敏度高， 现在农药残留分析多数仍采用此方法【2 3 _ 3 。农药残留分析中，尽管前处理中净化 效果越来越好，但样品的干扰物难以避免，所以气相色谱一般采用选择性检测器。 e c d 是农药残留分析中对有机氯的测定最常用的检测器。n p d 因其对n 和p 具有 良好的选择性，是测定有机磷和氨基甲酸酯类农药的常用检测器。f p d 是一种高 灵敏度和高选择性的检测器，主要用于含硫磷化合物。m s d 常用作验证性技术， 它既可以对复杂样品进行总离子扫描也可以进行选择离子扫描。定量分析一般采 用选择离子扫描( s i m ) 。使用串联质谱可大大提高m s 的选择性。j l m a r t i n e zv i d a l 6 河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕士学位论文赵永福 等 3 1 1 用g c m s m s 测定黄瓜、西红柿、西瓜等样品中残留农药，只需简单的前 处理，用二氯甲烷萃取后即可测定，回收率为7 1 一1 1 9 ，检测限小于ln g 幢，大 大节省了时间，并且结果准确。 3 2 高效液相色谱( h p l c ) h p l c 常用于分析高沸点和热不稳定的农药残留。h p l c 在进行农药残留分析 时一般用c 1 8 、c 8 作填料，以甲醇、乙腈等水溶性有机溶剂作流动相的反相色谱。 它连接的检测器一般为紫外吸收、质谱、荧光、二极管阵列检测器和电化学检测 器”。段文仲等用h p l c 和具有可变波长的紫外检测器测定了7 种农药残留， 结果均低于f a o w h 0 对水果所要求的检测限。a _ i v a l e n z u e l a 等用 m s p d - h p l c u v 测定水果农药残留，检出限为0 1 5 0 2 5 “g ，回收率为 7 4 8 4 。h p l c m s 能够分析比较复杂的样品，是农药残留分析的重要方法。 3 3 免疫分析法( i a ) 免疫分析法就是将免疫技术与现代测试技术手段相结合而建立起来的一种超 微量测定技术【3 3 j ，该法被列为9 0 年代优先研究、开发和利用的农药残留分析技术。 由于抗体专为抗原产生，所以专一性及亲和力强，因而方法灵敏。根据采用的检 测手段不同，可分为放射免疫法、荧光免疫法、酶免疫法p ，其中以酶免疫法最 为简单。近几年来很多农作物农药残留采用了酶免疫法。酶免疫分析法具有特异 性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大等优点。e u g e n i a ，k a t s o u d a s 【3 5 j 用酶联免疫 法测定氨基甲酸酯类农药残留，检测限达到2p p b 。 对于免疫分析法来说，关键的问题是抗体的制备。小分子量的农药一般不具 备免疫原性，不能刺激动物产生免疫反应。将小分子量的农药以半抗原的形式与 分子量大的载体相连制备人工抗原，以人工抗原免疫动物，产生对该农药有特异 性的活性物质抗体来识别该农药分子并与之结合，这种结合不仅在体内进行， 也可在体外进行，符合质量作用定律，这就是免疫分析的基础。通过对半抗原或 抗体进行标记，利用标记物的生物、物理或化学放大作用进行定性、定量检测。 免疫分析技术在应用方面有一定的局限性，但由于此法可直接检测样品或仅需要 简便的净化步骤，作为现场的筛选仍是重要的手段。 7 河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕士学位论文赵永福 3 4 酶抑制法( e l m ) 酶抑制法就是根据酶的活性受有机磷和氨基甲酸酯类农药的抑制而降低的原 理进行检测的。酶抑制法具有操作简便、快速、不需要昂贵的仪器设备、测定方 法易于掌握等优点，特别适于现场检测及大批量样品的筛选。对此要专门论述， 在此不多赘述。 3 5 生物传感器法 生物传感器通常是由一种生物敏感部件与转换器紧密配合，对特定的化学物 质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的装置。传感器的生物敏感层与复杂样 品中特定的目标分析物之间( 如酶与底物，抗体与抗原) 的识别反应会产生物理 化学信号，转换成电信号后可放大记录。生物传感器包括酶传感器，组织传感器， 微生物传感器，免疫传感器等。农药残留分析常用的是酶传感器和免疫传感器。 4 农药残留分析的发展趋势 农药残留检测中色谱法仍是一种重要的方法，随着上述及其它先进的样品处 理技术和高灵敏度检测器的出现，色谱技术会更趋于高效快速、灵敏，特别是联 机技术的发展将使农药残留的定性定量更加准确快速。酶抑制法及免疫分析法以 其快速、简便等特点将在农药残留的分析中发挥越来越重要的作用，目前在这方 面已进行了一定的研究工作，初步建立了一些监测方法，在此方面己取得相当的 成果。生物传感器响应快速灵敏并且可实现在线及现场检测，发展生物传感器技 术是农药检测技术的发展趋势。 从发展来看，农药残留的分析趋向于灵敏和快速，当然这要根据实际需要而 定。为了防止受农药污染的蔬菜水果进入市场，各国政府都在加强农药残留的现 场监测，因此需要快速高效的分析方法。利用色谱技术的传统实验室分析模式将 被两步分析模式所代替，即先利用免疫技术、生物传感器、快速检测仪进行现场 检测，对呈阳性的商品进行实验室的检测确认。 河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕士学位论文赵永福 第二节酶抑制技术检测蔬果农药残留量研究进展 1 前言 据统计，有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂占全球农药市场的5 7 以上，其快速 检测方法的研究具有较高的经济与实际价值。有机磷与氨基甲酸酯类农药残留常 用的检测方法为色谱法，但是色谱法所使用的仪器设备价格昂贵，分析样品所需 时间较长，不适宜于蔬果农药残留的现场监控。酶抑制法具有操作简便、快速、 无需昂贵的仪器设备、测定方法易于掌握等优点愈加受到关注，该方法特别适于 现场检测及大量样品筛选，克服了色谱法分析时间长的缺点。 酶抑制技术最初应用于临床医学分析，该技术用于农药残留检测始于上个世 纪五十年代。目前，在农药残留检测方面，酶抑制技术主要用于有机磷与氨基甲 酸酯农药的检测。其检测原理为：在一定条件下，酯酶可以催化羧酸酯类物质水 解，有机磷和氨基甲酸酯类农药对酯酶催化水解的正常功能有抑制作用，其抑制 率与农药的浓度呈正相关。所用酯酶包括：各种动物来源的乙酰胆碱酯酶和丁酰 胆碱酯酶以及从植物中提取的植物酯酶。酯酶与样品进行反应，如果样品中没有 农药残留或残留量极少，酶的活性就不被抑制，底物可以被酶水解，水解产物可通 过光度法和电化学的方式进行检测；反之，如果农药残留量比较高，酶的活性就 会被农药所抑制，底物就不能被酶水解或水解速度较慢。一般是通过抑制率判断 出样品中是否含有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在及其含量的多少。 2 酯酶的种类与活性研究 酶抑制法中酶最为关键，酶的种类决定着检测的灵敏度。酶抑制法测定农药 残留所用的酶包括乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、动物与植物酯酶，其中乙酰胆 碱酯酶应用较多，乙酰胆碱酯酶对有机磷农药较敏感，测定的灵敏度高，选择性 强。但是，乙酰胆碱酯酶的价格昂贵，现在还无法大量制备出纯度较高的乙酰胆 碱酯酶，于是有人研究用丁酰胆碱酯酶及动物植物酯酶代替乙酰胆碱酯酶。为提 高检测的准确性与灵敏性，研究者在酶的种类选择、保存及使用条件等方面开展 河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕士学位论文赵永福 了大量工作。 2 1 胆碱酯酶及其活性研究 张慧君等3 6 l 研究了4 种农药对鸡肝酶和电鳗乙酰胆碱酯酶的总酯酶活力以及 乙酰胆碱酯酶活力的抑制灵敏度，发现鸡肝总酯酶活力与电鳗乙酰胆碱酯酶活力 受农药的抑制灵敏度相近，并且鸡肝总酯酶活力在检测农残时，可获得更低的农 药含量检出限，除马拉硫磷外均低于国家规定的最大农药残留限量标准。因此， 以测总酯酶活力的方法替代测乙酰胆碱酯酶活力的方法，同样可以达到快速检测 农药残留的目的，而且鸡肝酶具有提取简便、价格低廉的优点。 余孝颖口7 悃酶电极研究了有机磷农药对3 种不同来源的乙酰胆碱酯酶选择性 抑制，结果表明家蝇乙酰胆碱酯酶对敌敌畏的抑制最敏感，电鳐次之，鸡肝最弱。 酶分子的结构差异是选择性抑制的主要原因。 为了获得高活性的乙酰胆碱酯酶，董杰等研究了家蝇中乙酰胆碱酯酶的最 佳提取条件，发现家蝇羽化后的时间对乙酰胆碱酯酶的比活力及酶源蛋白质含量 有较大影响，羽化后2 4 天酶的敏感度较高。此研究对于乙酰胆碱酯酶的制备提 供了一定的指导。 在用酶抑制光度法测定有机磷与氨基甲酯类农药时，重金属离子对酶有抑制 作用，影响了对农药的测定，对此d 0 v e t k i n 等对汞离子存在时测定有机磷农 药的酶抑制法进行了研究，提出一个在重金属离子与农药共存时测定农药的方法。 2 2 植物酯酶及其活性研究 徐斐等【4 0 1 利用酶法分析中的酶抑制原理，在不同p h 条件下对可被有机磷农药 抑制的不同来源的植物酯酶进行了筛选。以总酯酶活力和对敌敌艮的灵敏度为指 标，确定从豫麦3 9 中提取的植物酯酶为最佳的农药检测用酶，其最佳检测p h 为 6 5 。 肖建军等 4 1 1 以乐果为抑制剂对各种小麦酯酶进行了筛选，结果表明，不同品 种小麦酯酶对乐果的敏感度不同。针对这种情况，应选出酯酶对有机磷抑制敏感 的小麦品种，并且确定酶的适宜的催化条件，以便于对农药的准确测定。作者进 一步研究了酶浓度与温度对检测灵敏度的影响【4 2 叫3 1 。在检测农药残留时，采用农 l n 河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕士学位论文 赵永福 药为抑制剂，为了提高灵敏度，酶的浓度应较低。采用植物酯酶利用分光光度法 检测农药含量，在进行微量分析时，酶的浓度存在一个最适浓度，用此浓度的酶 进行分析，分辨率较高、灵敏度也较高，酶的浓度高于或低于此浓度，分辨率都 会下降。酶活性受温度的影响较大，不同的植物酯酶都有一个最适温度，低于此 温度时，酶促反应速度随温度的增加而提高，温度高于该温度时，反应速度随温 度的增加而降低。肖建军等h 4 】进一步研究了保存温度对小麦酯酶活性的影响，在 室温2 0 和4 保存时，酶的活性降低较快，保存l o 天酶活性分别降低为原来 的4 0 与6 0 。采用快速冷冻法将酶液温度从室温降至1 9 6 ，在液氮中保存2 0 m i n 和3 4h 酶仍维持很高的活性，在液氮中保存8 天，酶的活性仍有9 7 5 ，研 究表明酶的保存需要较低的温度。 2 3 胆碱酯酶与植物酯酶活性的对比研究 王仲海噪用分光光度法对不同来源酯酶的抑制效果进行了比较，并对植物 酯酶和动物酯酶在不同p h 值下的酶活性及被抑制程度等性质进行了实验研究。研 究结果表明，动物酯酶中的苍蝇酶、蝇蛆酶与植物酯酶中的小麦酯酶相比，它们 的活力和被农药抑制程度处于相近的水平；植物酯酶中小麦与玉米相比，玉米酯 酶的活力远低于小麦酯酶的活力，不宣用酶抑制反应来检测农药。动物酯酶在d h 值为7 5 时活力最高，小麦酯酶在p h 值6 5 左右时最高。 黄志勇等【4 6 1 比较了测定蔬菜中有机磷农残的两种酶抑制法即胆碱酯酶抑制法 和植物酯酶抑制法，通过正交试验优化了两种酶抑制法的测定条件。对实际蔬菜 样品的有机磷农残测定结果表明：两种酶抑制快速测定方法均可用于蔬菜中有机 磷农残的测定，其加标回收率都达到8 5 以上。但植物酯酶法测量精密度较好( 相 对标准偏差3 以下) ，酶源易得，提取、保存方便，在有机磷的快速测定中有更 广泛的应用价值。 酶抑制法中动物乙酰胆碱酯酶的专一| 生最好，灵敏度高，干扰小，但是乙酰 胆碱酯酶纯品的价格昂贵，而液态的乙酰胆碱酯酶不易保存。动物来源的丁酰胆 碱酯酶与植物来源的植物酯酶来源广，价格便宜，但是使用时干扰较多，出现假 阳性率较高。不同来源的动植物酯酶受农药的抑制不同，使用时必须选择相应的 1 1 河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕士学位论文赵永福 酯酶，这样才能确保检测结果的可靠性与可比性。 3 检测方法 酶抑制法测定农药残留时，根据所选用的酶的种类不同，可以采用不同的底 物进行反应，对分解产物的测定常用的有光度法和电化学( 酶传感器) 方法等。 3 1 酶抑制光度法 按照酶存在的状态可以分为游离态的酶和固定化酶，应用光度法时多采用酶 溶液( 游离态) ，目前，应用这种方法检测有机磷及氨基甲酸酯类农药较多。 王林等根据乙酰胆碱酶( a c h e ) 催化基质碘化硫代乙酰胆碱分解，生成乙酸 和碘化硫代胆碱，然后碘化硫代胆碱与5 ，57 二硫代2 ，2 二硝基苯甲酸( d n 旧) 作 用，生成5 一巯基2 一硝基苯甲酸( 黄色) 。于特征波长( 4 l on m ) 处测定溶液吸光度， 用酶抑制率来确定有机磷农药残留量，检出限一般在o 0 5m g m g 5m g k g ，能满 足半定量的要求。 赵建庄等”柳从敏感家蝇中提取的乙酰胆碱酯酶采用相同的反应体系，并且用 自行研制的农药残留速测仪对催化反应中溶液吸光度变化的信号进行处理，直接 显示抑制率，从而确定农药残留量，该方法准确度高、速度快、操作简便。 侯学文等【划利用胆碱酯酶水解碘化硫代丁酰胆碱后形成的硫代胆碱，与二硫 双对硝基苯甲酸发生化学反应生成黄色产物，在4 1 2m n 波长处比色测定。研究了 利用此法测定酶、底物的添加量以及保温温度和保温时间对酶活力的影响，还研 究了不同浓度与保温时间的辛硫磷对胆碱酯酶活力的抑制情况，获得了胆碱酯酶 优化的反应条件。结果还表明胆碱酯酶对辛硫磷比较敏感，其抑制程度为1 5 0 时的 检出限3 9 0 4 9u 2 ，l 。 黄文风【5 0 1 以乙酰胆碱酯酶催化碘化乙酰胆碱，分解产物碘化胆碱与显色剂 d t n b 反应，以此方法用自制的速测仪测定蔬菜中的农药残留，其中敌敌畏的检 测限为2 2 1 0 一g r i l l 。 e u g e n i a 沁s o u d a s 5 1 采用乙酰胆碱酯酶抑制法测定了香蕉、草莓、桃和西红 柿等水果中的氨基甲酸酯类农药，检出限为o 1p p m ，并且在四种水果中的检出限基 本相同。 1 ， 河南大学化学化工学院2 0 0 3 级硕