（植物学专业论文）龙胆番茄红素β环化酶基因的克隆及功能分析.pdf

摘要 天然d 胡萝卜素对人体健康有重要的作用，特别是含有化学合成品所缺乏的 顺式异构体，人工合成品是纯单一的同种物质，而天然产品中含有相当比例的顺 反异构体，它们在体内协同作用，从而具有一定的的生物学功能，顺式异构体己 被证明在抗氧化和预防心血管疾病等方面具有较强的功能。b 胡萝卜素和含b 环的胡萝卜素作为人类及动物体内维生素a ( r e t i i l 0 1 ) 合成的前体，是补充维生素a 的最好途径。在人体和动物体内，b 胡萝卜素中部可裂解生成两个分子的维生素 a ，而含有一个p 环的仅胡萝卜素和b 隐黄质的裂解只能产生一个分子的维生素 a 。因此，如何利用代谢工程提高作物b 胡萝卜素含量，使人们在日常饮食中即 可获得足够的天然b 胡萝卜素，成为研究的热点。因此我们克隆并鉴定p 胡萝 卜素生物合成途径的关键酶基因，不仅有助于了解b 胡萝卜素生物合成与积累的 调控机理，而且为通过基因工程手段调节代谢途径，定向地控制目的基因的表达， 从而使植物高水平积累某一有价值的代谢产物的遗传工程提供目的基因。 本实验从龙胆花瓣c d n a 文库中克隆到与龙胆l y c b l 酶切图谱和长度不同 的另一克隆基因全长c d n a ，命名为龙胆番茄红素b 环化酶2 ( g l l y c b 2 ) ， g e l l b a i l k 登陆号：e f 0 6 2 5 0 5 。g l l ，y c b 2c d n a 核苷酸序列总长度为2 1 6 5b p ，含 有一段1 5 9 2b p 的不间断开放阅读框( o p e nr e a d i n gm i i n e ，o l 讧) ，1 7 7b p 的5 末端和5 1 5b p 的37 末端非编码区，在终止密码子( t 从) 与多聚核苷酸之间具 有p o l y ( a ) 添加信号。g l l y c b 2 编码一个含5 0 8 个氨基酸残基的蛋白质，分子 量5 7 1 6 9 2 0k d ，等电点为8 6 4 。由g l 【，y c b 2c d n a 序列所推导的氨基酸同源序 列分析表明，该基因编码的蛋白可能是l y c b 。利用含有g l l y c b 2 基因的 p b l u e s c r i p t g l l y c b 2 质粒扩增出的p c r 产物与t 载体连接，再亚克隆到p u c 8 表达载体上，构建表达质粒p u c g l l y c b 2 。应用可生成番茄红素的工程大肠杆 菌( 西c 办p r f 幽砌c d z f ) 鉴定了我们克隆的龙胆番茄红素b 环化酶2 基因( c d n a ) ，结 果表明龙胆番茄红素d 环化酶2 可将番茄红素转化为p 胡萝卜素。 关键词：龙胆；番茄红素b 环化酶；基因克隆；功能分析 a b s t r a c t t h en a ：t u r a lb c a r o t e n ei sv e r yi m p o 吨m tt ot h eh u m a j lh e a l m ，e s p e c i a l l vt h ec i s s t e r e o i s o m e ro fb c a r o t e n ew h i c hi s1 a c k i n gi nt h es y n t h e t i cc h e m i c a l s t h ea r t i f i c i a l s y n t h e t i cc h e m i c a l sa r ep u r eh o m o g e n e o u sm a t e r i a l s ，b u ta1 a r g ep r o p o r t i o no f c i s t r a n si s o m e ro fc a r o t e n e sw e r ei n c l u d e di nt h en a n l r aip r o d u c t s t h e yc o o p e r a t e a i l dt a k eo nc e n a i nb i 0 1 0 9 i c a l 如n c t i o n si nh 啪a no ra n i m a lb o d y c i si s o m e r so f c a r o t e n o i d sa p p e a rt ob em o r eb i o a v a i l a b l et h a nt 1 1 ea 1 1 t r a i l sf l o 咖s i th a sb e e np r o v e n m a t9 一c 主ss t e r e o i s o m e r o fb c a r o t e n ew a sp o w e r f h la n t i o x i d 锄t 甜l da p p l i e di n p r e v e n t i n gc 砌i o v a s c u l a rd i s e a s e b c a m t e n ei sap r e c u r s o rt os y n t h e s i z ev i t a m i n a ( r e t i n 0 1 ) i na i l i m a la n dh u m a i lb o d y i ti sab e s tw a yt os u p p l vv i t 锄i na o n e m o l e c u l eo fp - c a r o t e n ec a nb ec o n v e r t e di n t ot w om o l e c u l a ro fv i t a m i na ，b u t a - c a l o t e n ea n dd c r y p t o x a n t l l i nw i mo n eb r i n gc a no n l yp r o d u c eo n em o l e c u l eo f v i t a i l l i na t h u s ，h o wt oi n c r e a s et h ec o n t e n to fb c a r o t e n ei i lc r o p sb yc a r o t e n o i d g e n e t i ce n g i n e e r i n gi no r d e rt og e te n o u g hn a t l l r a jp - c a r o t e n ei nd a i l yd i e th a sb e e na s t u d y i n gf o c u s w 色c l o n e da 1 1 di d e n t i f i e dl y c o p e n eb c y c l a u s e2 ( 【，y c b 2 ) c d n a 行o m ( ；巴甩，f 口玎口z “f p 口，w h i c hi sk e yr e g u l a t o r ye n z y m ei nc a r o t e n o i db i o s y n t h e t i c 口a t h w a y t h e 矗m c t i o n a l a 1 1 a l y s i so fg掰 g 口l y c b 2c d n ai sn o to m yh e l p 如lt ot h e u i l d e r s t a n d i n go fb i o s y n t l l e s i s 锄da c c 啪u l a t i o nm e c h a m s mo fb c a i o t e n e ，b u ta l s o p r o v i d et a r g e tg e n ef o rg e n e t i ce n g e e r i n gw l l i c hc a i ld i r e c t i o n a l l yc o n 仃0 1t h e e x p r e s s i o no ft 鹕e tg e n et oa d j u s tm e t a b o l i c 印p r o a c hi no r d e rt om a k ec o 叩s a c c u m u l a t es o m ev a l u a b l em e t l b o l i t e s i i lt h i st 1 1 e s i s ，l y c o p e n e6 一c y c l 2 u s e2 ( l y c b 2 ) c d n aw 2 u sc l o n e df 两mn o w e rp e t a l c d n al i b r a r yo fg ，材据口t h el y c b 2c d n ai n f i o m l a t u i o nw a sd 印o s i t e di nn c b i ( n a t i o n a jc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o m a t i o n )g e r 心a n k ( a c c e s s i o nn u m b e r ： e f 0 6 2 5 0 ) t h e 如1 1 1 e n 孓ho fn u c l e o t i d es e q u e n c eo fg ，“f p 口i j y c b 2c d n ac o n s i s t e d o f 2 1 6 5b pw i t ha1 5 9 2b po p e nr e a d i n g 矗锄e ( o r f ) ，a1 7 7b p5 t e m i n a la i l da5 1 5 b p 3 t e 咖i n a l n o n c o d i n gr e g i o n s ，r e s p e c t i v e l y t h e r e h a st l l e s i g l l i 6 c a n t p o l y a d e n y l a t i o ns i 驴a l ( p o l y ( a ) s i 印a 1 ) i nt h j sc d n a 1 1 1 ed e d u c e d 锄i n oa c i d s e q u e n c e so f ( i ，甜玉p 口i j y c b 2c d n aw a sap o l y p e p t i d eo f5 0 8a m i n oa c i dr e s i d u e s w i 也m o l e c u l a rw e i g h t0 f5 7 16 9 2 0d 。t h ei s o e l e c 俯cp o i n to fg 勉阳l y c b 2u 潞 8 6 4 t h ed e d u c e d 锄i n oa c i ds e q u e n c e so fg ，“f p 口l y c b 2c d n al l a sh i g h e r i d e m i t e s 谢t hk n o 、v nf u n c t i o n a ll y c bs e q u e n c e s t h e c t i o no fg ，妣口l y c b 2 c d n aw a se 妇b l i s h e db yc o m p l e m e n t a t i o ni ne n g i n e e r i n g 上强c 而p r f 砌胁肛t h e r e s u l t si i l d i c a t e dgz “纪口l y c b 2c a i lc o n v e r tl y c o p e n ei n t ob c a r o t e r l e k e yw o r d s ：g 明砌凇，甜胞口；l y c 叩e n ep c y c l a s e ； c l o n e ； f u l l c t i o n a la n a l y s i s 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得 的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了 明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：峦鱼丝日期： 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、 汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士学位论文全文数据库 ( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全文数据库( 中国科学技 术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：盘丝 指导教师签名： 黼i f 矧 憾j 踩i 曰 期：蛰型篁：查3 日期：0 碰g 。厶! 丕 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 l j 刖罱 1 9 2 7 年，首先发现类胡萝卜素存在于绿色叶片中，直到3 0 年后f r e m v 和 s t o k e s 才将这些色素完全确定下来。1 9 3 1 年，w a c h e i l r o d e r 首先从胡萝卜根中分 离出黄色色素晶体胡萝卜素。1 9 3 7 年，b e r z e l i u s 从秋天的叶片中分离提出黄色 的极性色素叶黄素。随着色谱分析技术的发展，人们发现自然界中存在一个类胡 萝卜素家族，w i l l s t a _ c t e r 和m i e g 证实它们是类异戊二烯衍生物。z e c h m e i s t e r 首 先认识到类胡萝卜素是一种多烯化合物，之后k a 盯e r 发现许多类胡萝卜素具有 对称结构，i “l n 证实它们是一种共轭的多烯化合物。随着分光镜技术的发展， 特别是核磁共振技术和质谱术的发展，有关类胡萝卜素的结构的研究有了革命性 的进展。 类胡萝卜素是由类异戊二烯合成途径合成的一大类呈现黄色，橙红色和红色 的萜类色素，通常在植物叶片的叶绿体及花、果实的有色体中积累。目前已分离 鉴定出7 5 0 多种1 2 j ，这些花及果实的颜色可用以吸引昆虫、鸟类或动物来帮助它 们授粉和传播种子。在园艺上含有类胡萝卜素的花也具有很重要的观赏性和经济 价值。在植物光合组织中，类胡萝卜素作为光合系统集光组分，主要参与聚光及 光保护机制【3 】。由于人类及动物体内不能合成类胡萝卜素，必须依赖每曰膳食供 给，不同的类胡萝卜素对人类健康有着各种不同的重要作用。b 胡萝卜素及其衍 生物是形成维生素a 的必要组分【4 】；叶黄体素( 1 u t e i n ) 和玉米黄质有助于预防老年 黄斑变性【5 1 以及减少动脉硬化的危险【6 】；番茄红素能够有效预防各种癌症【7 9 1 ，心 血管疾病【1o 】以及糖尿病【l l 】。食物中丰富的类胡萝卜素能够有效预防某种慢性疾 病和癌症，这可能与类胡萝卜素的抗氧化有关。同样的类黄酮类( 花青素和裸藻 酮) 也是一种具有强抗氧化活性的光稳定色素【1 引，能够增强人的免疫功能，可预 防血栓和肿瘤的形成【1 3 15 1 。此外，类胡萝卜素作为一种天然色素，已用于食物添 加剂， 化妆品着色剂以及及花卉的颜色修饰等方面。 1 类胡萝i 、素结构和性质 1 1 类胡萝卜素结构 类胡萝卜素是异戊二烯类化合物，一般由两分子二十个碳原子组成的栊牛儿 基栊牛儿基焦磷酸连接而成，构成四十个碳原子的基本结构骨架。类胡萝卜素通 常指c 4 0 碳氢化合物所形成的不含氧的碳氢类胡萝卜素( 胡萝卜素) 和在此基础 上通过羟基化、甲氧基化及酯化所形成的含氧衍生物【l6 ，。7 】( 叶黄素) 的统称。按 东北师范大学硕士学位论文 碳骨架末端的衍生结构可分为开环式类胡萝卜素( 如八氢番茄红素、番茄红素) 和 环式类胡萝卜素( 如0 【胡萝卜素、b 胡萝卜素、p 隐黄素、玉米黄素等) 。有的类 胡萝卜素的碳原子数少于四十个，它们一般在类胡萝卜素抗氧化的反应中产生， 如b 酮胡萝卜素。 1 2 类胡萝卜素的光学特性 类胡萝卜素的光吸收主要取决于分子内的吸光色素基团，能够吸收 4 0 0 5 5 0 啪的可见光，其中共轭双键是影响光吸收的主要因素，结构上的其它差 异对光吸收的影响相对较小。一般类胡萝卜素的颜色随着分子不饱和程度的增 加，其吸收光谱向红光方向移动，呈现黄色到红色的的特点f 1 8 】，并使其能猝灭 单线态氧【l9 1 。一般来讲，典型的类胡萝卜素紫外可见光吸收图谱有3 个吸收峰， 分别是i 、i i 、i i i 峰，此外，顺式胡萝卜素异构体在3 4 0n m 周围还有一个特殊吸 收峰，常称为顺式吸收峰，各峰的位置和相对峰高都与类胡萝卜素的分子结构有 关，是其分子的结构特征。同时各吸收峰的相对峰高比率也能反映类胡萝卜素的 结构和纯度。因此，紫外可见光吸收图谱是鉴定类胡萝卜素种类的重要依据之 一【2 0 】 o 1 3 类胡萝卜素的理化性质 类胡萝卜素一般不溶于水，而溶于脂类溶剂，对空气、光、热、金属离子极 不稳定，易发生异构化、聚合等反应【2 l 】。 2 类胡萝l 、素生物合成代谢途径及主要酶的功能 不同生物类胡萝卜素的合成发生在细胞的不同部位，在植物中类胡萝卜素在 质体中合成，生物合成起始的异戊二烯焦磷酸( p p ) ，是由甲羟戊酸( m v a ) 途径合成，它与其异构体二甲基丙烯焦磷酸( d 舢仰p ) 在栊牛儿基栊牛儿基焦 磷酸合成酶( g g p s ) 催化下生成栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸( g g p p ) ，即类胡萝 卜素的前体物质。两分子g g p p 缩合得到第一个无色类胡萝卜素八氢番茄红素。 经过一系列脱氢反应，形成链孢红素和番茄红素，又经过一些列的环化或非环化 反应，形成各种类胡萝卜素( 图1 ) 。细菌、真菌、蓝藻中的类胡萝卜素在细胞 质中合成，其前体物质i p p 来自于2 c 甲基d 赤藓糖醇4 磷酸( m e p ) 途径。 在噬夏孢欧文氏杆菌中，m i s a v 旧等【2 2 】将欧氏杆菌( e 刑f 疗衙甜比咖v d m ) 的基因 组d n a 部分酶切后，构建基因组文库，转入大肠杆菌( e ，f ) 后，筛选黄色菌落， 从中提取质粒d n a ，序列分析发现含有5 个o i 江，分别为c 形，f z ，c 刀j ，c 和仃培，它们呈基因簇存在，参与由法呢焦磷酸( f p p ) 到玉米黄质的合成反应 ( 图2 ) 。其中，c 胎编码八氢番茄红素合成酶( c r l m ) ，洲编码八氢番茄红素 脱氢酶( c r t i ) ，c 力j ，编码番茄红素b 环化酶( c r t y ) ，c ，亿编码b 一胡萝卜素羟化 酶( c i h z ) 。与植物相比，八氢番茄红素到全反式番茄红素的脱氢过程需要有3 2 东北师范大学硕士学位论文 个酶参与，八氢番茄红素脱氢酶( p d s ) ，胡萝卜素脱氢酶( z d s ) 和一个类胡 萝卜素异构酶( c r t i s o ) ，分别由基因础、z 凼和c ，咖。编码。 带有环末端基团的类胡萝卜素是所有植物、藻类及光合细菌光合膜的重要组 分。这些脂溶性组分可以防止光致氧化，为光合反应聚集光能，以及通过天线色 素吸收继而消散多余的光能量。番茄红素的环化是胡萝卜素线性分子向具环类分 子转化的关键步骤，是类胡萝卜素( 、| ，v c a r o t e n e ) 生物合成途径的一个重要的分 支点。在高等植物类胡萝卜素中发现两种坏末端：b 环和环i ，2 川。带有两个p - 环的类胡萝卜素在生物界普遍存在，带有一个d - 环和一个环也很普遍，但是带 有两个环却很稀少。因为一般在生物合成途径中番茄红素在番茄红素环化酶 ( l y c e ) 催化下只能环化形成一个环的6 胡萝卜素( ，v c a r o t e n e ) ，继而在番 茄红素b 环化酶( l y c b ) 作用下环化形成0 l 胡萝卜素( p ，c a r o t e n e ) 。但在莴 苣中有一种特殊功能的l y c e ，能催化番茄红素形成具有两个环的胡萝卜素 【2 4 1 。另一途径是在l y c b 作用下，番茄红素两末端各环化形成一个b 环，即形 成有两个b 环的p 胡萝卜素( p ，p c a r o t e n e ) 。a 及p 胡萝卜素是合成途径中最先 生成的具环状的类胡萝卜素，位于合成代谢的重要分支点上，植物可通过两种环 化酶的相对活性和相对数量来调节不同胡萝卜素的数量和种类【2 4 j 。因此，对调 配下游分支的走向起重要作用。 东北师范大学硕士学位论文 i p p i 、久伸p = ；p “入 鼻虎二二薹丙 上g g p s 上p s y 八囊丘。 l y i l y c b 1 | b c h ，e c h i l p 0 s i i z d s ， 二二。一：。l 、7 ，二。 辱菇红蛮 。，袭如意筹丫善卫 、 z e p ： 。，u o ，o 一：y j ，o 、， “。虢椒红麝一5 。6 一环氧化钧 + c c sa ：、献砖a n v 勺飞人 审 辣擞玉红囊 c c s - 一 一0 - + _ 乙l - 一+ _ - 丝坐 上c r t s 。 y c b i l y c b l b c h lb c h v 。e f l 御 v 。e n z e p i in x s 图1 植物体内类胡萝卜素生物合成途径 4 东北师范大学硕士学位论文 缩写词；刀p p i ，瑾i p 异构酶：g g p s ，g g p p 合成酶；p s y ，八氢番茄红素合成酶；p d s ，八 氢番茄红素脱氢酶；z d s ，争胡萝卜素脱氢酶；c r t i s o ：类胡萝卜异构酶；n r c e ，番茄红 素8 - 环化酶：i y c b ，番茄红素争环化酶；b c h ，胡萝卜素争环羟化酶；e c h ，胡萝卜素8 - 环羟化酶；z e p ，玉米黄质环氧化酶；v d e ，堇菜黄质脱环氧化酶；n x s ，新黄质合成酶； v p l 4 ，9 顺式环氧类胡萝卜素双氧合酶；c c s ，辣椒红素辣椒玉红素合酶 砖姒高，o p p fp p 。 i 山c r t e 入 江o 纵0 p p 牦牛儿基牦牛几基焦一 上c r t b 八氢茄红素。 1 i r c rt i 1 i r c r t y 上c r t z 上c r t 图2 ：细菌类胡萝卜素生物合成途径 缩写词：f p p ：法呢焦磷酸；c r t e ：锟牛儿基铭牛儿基焦磷酸合成酶；c r t b ：八氢番茄红 素合成酶；c r = r i ：八氢番茄红素脱氢酶；c r ：r y ：番茄红素d 环化酶；c 髓z ：胡萝卜素p 羟化酶；c r l ：玉米黄质葡糖基转移酶 5 东北师范大学硕士学位论文 3 类胡萝i 、素合成相关基因在植物基因工程的研究进展 类胡萝卜素是一种类异戊二烯聚合物，在自然界广泛存在，常见于果蔬、花、 鸟和甲壳类动物中。2 0 世纪6 0 年代就已人工合成p 胡萝卜素，但随着人类对类 胡萝卜素药用价值及医疗保健作用的不断重视，天然胡萝卜素也随之受到广泛关 注。培育富含类胡萝卜素的农作物是一种经济有效的途径，尤其是提高作物中d - 胡萝卜素的含量，对满足人们健康的需求有极大的现实意义。 自1 9 8 3 年首次获得转基因烟草以来，植物基因工程技术取得了重要进展， 随着分子克隆和遗传转化技术的飞速发展，类胡萝卜素在水稻、番茄、马铃薯、 油菜等转基因作物中取得了重大突破，不但可提高食物中类胡萝卜素含量和营养 价值，而且还可应用于花卉上，改善其花色，以提高其观赏价值和经济效益1 2 引。 许多农作物中只含有少量的类胡萝卜素，通过转基因途径使类胡萝卜素生物 合成途径中某些基因过表达，已经成功证实能够提高类胡萝卜素含量【2 6 2 7 ，2 8 刎。 其中，水稻是人类主要的粮食作物，在胚乳中含有大量的g g p p ，但不能合成类 胡萝卜素。因此，常规育种技术不可能育成在水稻种子胚乳中具有类胡萝卜素的 水稻品种。2 0 0 0 年y e 等将艘y ，咖6 、c 川三个基因一起转入水稻，通过类胡萝 卜素生物途径中若干基因的组织特异性过表达获得胚乳呈黄色的“金色水稻” 【3 0 ，3 1 1 ，其中，b 胡萝卜素的含量高达1 6 “g g d w ，并含有玉米黄素、叶黄体素， 这一含量已经充分满足了儿童同常饮食标准摄入维生素a 的需求p 。类胡萝卜 素生物途径中某一关键基因的种子特异性过表达也产生了“金色油菜 ，p 胡萝 卜素含量提高了3 0 0 多倍，由原来的3 垤g f w 提高到9 4 9 g f w ，类胡萝卜素 总量提高了5 0 倍【3 3 】。最近，通过基因工程途径还成功的获得了“金色马铃薯” 转基因植物p 4 1 。 通过基因代谢工程在马铃薯和番茄中也成功地提高了b 胡萝卜素，番茄红素 和玉米黄质的含量f 3 5 ，3 够刀，而且在马铃薯块茎中积累虾青素使其具有更高的经济 价值【3 8 】。在番茄眈幻突变体中，由于其果实中有色体特异性l y c b 基因的大量 表达，使其果实积累大量的b 一胡萝卜素【3 9 j 。r o s a t i 等将拟南芥l y c b 基因正义 链导入番茄，在果实中特异性过表达，结果果实中的8 胡萝卜素含量增加5 倍， 转入番茄自身l y c b 基因的反义链进行遗传转化，结果d 胡萝卜素表达水平下 调5 0 ，而果实中番茄红素含量增加了约l 倍【删。英国及f 1 本各自研制开发了 富含d 胡萝卜素的转基因番茄，它能产生正常品种3 倍的p 胡萝卜素，单个番 茄果实所含的p 胡萝卜素可达推荐的维生素a 前体日需求量的4 2 ，而一般品 种的番茄只有2 3 。 尽管已经取得了这些成功的例子，但在许多情况下，在农作物中单一基因的 调控很难成功获得期望水平的类胡萝卜素含量的积累【4 l 4 2 。植物中类胡萝卜素几 6 东北师范大学硕士学位论文 乎都在质体膜上合成，并在许多花、果实、及根的有色体中得到高水平的积累1 4 3 。 有色体具有独特的能够产生新的类胡萝卜素脂蛋白结构，从而积累大量类胡萝卜 素，这些结构被称为类胡萝卜素螯合( s e q u e s t e 曲g ) 结构【4 4 ，4 5 】，这些结构使类胡 萝卜素生物合成途径的最终产物在有色体类胡萝卜素生物合成位点上得到过量 积累【4 6 4 7 ，4 8 1 。例如花椰菜凝乳中虽然类胡萝卜素的含量微乎其微，但是仍具有合 成类胡萝卜素的能力，通过铆基因功能突变诱导了有色体螯合结构的形成，从 而积累了大量的b 胡萝卜素【4 9 】。通过这些螯合结构使类胡萝卜素沉积物有效得到 积累的方法，能进一步提高农作物中类胡萝卜素成分，以满足人类营养和健康的 需求。这种代谢调控或许能够提供一种新的辅助途径介导作物中类胡萝卜素的积 累。 综上所述，通过基因工程技术调控类胡萝卜素生物合成途径，完全有可能在 主要农作物( 如玉米、小麦和大豆) 和蔬菜生产中，改善类胡萝卜素的含量并通过 改变类胡萝卜素的含量与种类进而修饰花卉颜色。 4 本文的研究目的及意义 天然b 胡萝卜素对人体健康有重要的作用，特别是含有化学合成品所缺乏的 顺式异构体，而顺式异构体己被证明在抗氧化和预防心血管疾病等方面具有更强 的功能。p 一胡萝卜素和含p 环的胡萝卜素作为入类及动物体内维生素a ( r e t i n 0 1 ) 合成的前体，是补充维生素a 的最好途径，在人体和动物体内，b 胡萝卜素中部 可裂解生成两个分子的维生素a ，而含有一个p 环的0 l 胡萝卜素和b 隐黄质的 裂解只能产生一个分子的维生素a 【5 0 ，5 1 。因此，如何利用代谢工程提高作物6 胡萝卜素含量，使人们在日常饮食中即可获得足够的天然b 胡萝卜素，成为研究 的热点。因此，克隆并鉴定b 胡萝卜素生物合成途径的关键酶基因，不仅有助于 了解b 胡萝卜素生物合成与积累的调控机理，而且为通过基因工程手段调节代谢 途径，定向地控制目的基因的表达，从而使植物高水平积累某一有价值的代谢产 物的遗传工程提供目的基因。 本实验从龙胆花瓣c d n a 文库中克隆到与l y c b l c d n a 酶切图谱和长度不 同的另一克隆，命名为龙胆l y c b 2 基因。g e r m a n k 登陆号：e f 0 6 2 5 0 5 。由龙胆 l y c b 2 c d n a 序列所推导的氨基酸同源序列分析表明，该基因编码的蛋白可能是 l y c b 。利用含有g l l y c b 2 基因的p b l u e s 嘶p t g l l y c b 2 质粒扩增出的p c r 产物 与t 载体连接，再亚克隆到p u c 8 表达载体上，构建表达质粒p u c g l l y c b 2 ， 应用可生成番茄红素的工程大肠杆菌陋c d z ) ，鉴定了我们克隆的龙胆番茄红素 p 环化酶2 基因( c d n a ) 编码的酶，结果表明该酶可将番茄红素转化为p 胡萝卜 素。 7 东北师范大学硕士学位论文 材料与方法 1 材料 1 1 质粒和菌种 本实验所用到的质粒均由朱长甫博士提供( 表1 ) 表1 实验所用的质粒 质粒携带的基因选择标记 p b l u e s c r i p t g l l y c b 2咖6氨苄青霉素 d a c c r t e b i e u厄，c ，馏，仃玎氯霉素 p a c c a r l6 c r t x c ，压，c 玎nc r 玎，c ，馏氯霉素 菌株：大肠杆菌( e z f ) x l l b l u e ，由本实验保存。 表达载体：p u c 8 本实验室保存。 1 2 化学药品试剂及仪器 质粒d n a 提取试剂盒购自上海博光生物公司。 p c r 引物：由上海生工生物公司合成我们所需的p c r 引物。 d n a 凝胶回收试剂盒，p g e m te a s yv e c t e r 试剂盒，异丙基p d 硫代半乳糖苷 ( i s o p r o p y l b d t 1 1 i o g a l a c t o s i d ei p t g ) ，购自北京鼎国生物技术发展中心。 核酸限制性内切酶肋，z h i 、d ，t a q 酶，t 4d n a 连接酶均购自t o y o b o 公司。 d n a 分子量m 独e r1 k bd n al a d d e r 购自北京鼎国生物技术发展中心。 四环素，氨苄青霉素，氯霉素等购自北京鼎国生物技术发展中心。 酚、氯仿、异戊醇等其余常规试剂为国产分析纯试剂。 高压液相仪器为日本岛津s h i m a d z u 。 p c r 仪为美国p 嘶1 1 e l m e r 9 6 0 0 型基因扩增仪。 1 3 培养基 l b 液体培养基( 1l ) ：1 0g 胰蛋白胨，5g 酵母提取物，5gn a c l ，用n a o h 调p h 值为7 0 l b 固体培养基：l b 液体培养基中加入的1 5 琼脂粉 1 4d n a 测序 送上海生工生物公司测序。 8 东北师范大学硕士学位论文 2 实验方法 2 1 质粒d n a 的提取 a 常规提取质粒法 1 ) 无菌条件下挑取大肠杆菌，接种到5m l 含有氨苄青霉素( 1 0 0p 幽m ) 的l b 培养液中，3 7 2 0 0 印m 振摇培养1 2 1 6h ，用以质粒提取。 2 ) 取1 5m l 菌液于微量离心管中，1 2 0 0 0 平m 离心1m i n ，弃上清，将离心管倒 置于吸水纸上，尽可能地吸去残留的培养液。 3 ) 用1 0 0 1 冰预冷的溶液i ( 5 0m m 葡萄糖，2 5i i 心订t r i s h c lp h - 8 0 ，1 0i n m 乙二胺四乙酸( e d t a ) p h - 8 0 ) 重悬细菌沉淀，加入2 0 0 肛l 新配制的溶液i i ( 0 2 m o l l n a o h ，1 s d s ) ，颠倒数次混匀。 4 ) 加入1 5 0 “l 用冰预冷的溶液i i i ( 3m o l l 醋酸钾，5m o l l 冰醋酸p h 4 8 ) ， 颠倒数次混匀，有絮状沉淀，1 2 0 0 0 印m 离心5i i l i n ，取上清，加入2 倍体积冷 无水乙醇，混合均匀，置2 0 3 0 武n 。 5 ) 4 1 2 0 0 0r p m 离心l om i l l ，弃上清。 6 ) 再加1m l7 0 乙醇，1 2 0 0 0r p m ，1 2m i i l ，洗涤。 7 ) 倒置干燥，使剩余酒精挥发殆尽。 8 ) 视质粒提取的量，加入2 0 肛l 或3 0m 含终浓度为2 0 鹇m li a 酶( 无d n a 酶) 的t e ( 1 0m m t r i s h c lp h 8 o ，h c l lm m 卫d t a p h 8 0 ) 溶解沉淀。 9 ) 取适量电泳观察，其余2 0 冰箱中保存备用。 b 用上海博光试剂盒提取质粒d n a 1 ) 挑取单克隆至含有1 0 0 “咖l 卡那霉素的5 i i l ll b 液体培养基中，3 7 ，2 0 0 印m 振荡培养过夜。 2 ) 将过夜培养的菌液1 3 0 0 0 印m 离心2m i n ，弃上清，收集菌体。 3 ) 加入2 5 0 “l 溶液i ，振荡至沉淀彻底悬浮。 4 ) 加入2 5 0u l 溶液i i ，小心轻混，温和颠倒5 1 0 次，室温孵育3 - 5m i n 。 5 ) 加入3 5 0 l 预冷的溶液i i i ，小心轻混，温和颠倒5 1 0 次，冰上放置3i n i n ， 有白色絮状沉淀。 6 ) 1 3 0 0 0r p m 离心1 0i i l i n ，吸上清液，转移至套放在2m l 收集管中的吸附柱内。 7 ) 1 3 0 0 0r d m 离心1m i n ，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 8 ) 在吸附柱中加入5 0 0 山溶液b ，静置1i 山，1 3 0 0 0 蛳离心1i n i n ，倒掉收 集管中的液体。 9 ) 在吸附柱中加入5 0 0p l 溶液，静置1m i n ，1 3 0 0 0 印m 离心1m i n ，倒掉收 集管中的液体。 1 0 ) 重复步骤9 一次。 9 东北师范大学硕士学位论文 11 ) 将吸附柱放入同一个收集管中，1 3 0 0 0 印m 空柱离心1m i n 。 1 2 ) 将吸附柱放入一个干净的1 5m 1 离心管中，在吸附管中加入4 0 “1 溶液v ， 室温下静置1m i n ，1 3 0 0 0 印m 离心1m i n ，将洗脱下来的d n a 溶液于一2 0 保存。 2 2 聚合酶链式反应( p c r ) p c r 反应体系为： l0 p c rb u 虢r ( 一m g c l 2 ) d n t p s ( 5m m ) m g c l 2 ( 5 0m m ) 引物1 ( 2 0u m ) 引物2 ( 2 0p m ) d d h 2 0 模板( 5 0n “1 ) 1 l a q 酶( 5w p l ) 2 山 1m 1 山 1m 1 “l 1 2 5 山 1 “l o 5m 2 0 斗l p c r 程序为：9 4 预变性2m i n ；9 4 变性1n l i l l ；6 0 退火1m i n ；7 2 延伸2 m i n ；3 5 个循环；7 2 延伸1 0m i n ，4 保存。 2 3p c r 产物回收与纯化( 回收试剂盒购自北京鼎国生物技术发展中心) 1 ) 切取含目的d n a 片段的琼脂糖，用吸头捣碎按重量比1 ：3 ( 切取质量：溶 液a 的体积比) 加入溶液a 。 2 ) 5 0 水溶1 0m i n ，待胶完全溶化后，置室温加入1 5 “l 溶液b 充分混匀。 3 ) 将溶液置于离心柱中，静置2m i n ，1 0 0 0 0 巾m 离心3 0 s 。 4 ) 弃液体，加入5 0 0 斗l 溶液c 于离心柱中，1 0 0 0 0 印m 离心3 0s ，弃液体。 5 ) 重复步骤4 。 6 ) 1 0 0 0 0r p m 再离心1m i l l 。 7 ) 将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖5 1 0m 试。 8 ) 加入2 0 3 0u 1 溶液d ( 5 0 水浴) ，静置2m i n 。 9 ) 1 0 0 0 0 聊离心1m i i l ，管底溶液即为d n a ，2 0 保存。 2 4d n a 纯度和浓度测定 1 ) 以1 ：2 0 或更高的比例将样品d n a 溶液在t e 或双蒸水中稀释。 2 ) 用t e 或双蒸水在紫外分光光度计波长2 3 0 、2 6 0 、2 8 0i l i i l 处做空白对照。 3 ) 将d n a 稀释液装入比色皿比色，读取上述三个波长下的光密度，即0 d 值。 4 ) 记录光密度数据，计算公式为( 单位昭枷) ： 1 0 东北师范大学硕士学位论文 d s d n a 浓度约= 5 0 o d 2 6 0 稀释倍数 2 5p b l u e s c r i p t g l l ，y c b 2 基因p c r 产物与载体p g e m te a s y 连接 反应体系为： p g e m - te a s y 载体( 5 0n p 1 ) p b l u e s c r i p t g l i y c b 2p c r 产物 2 r a p i db u 自陆 t 4d n a 连接酶( 5u 肛1 ) 7 1 m p l 出 p l 2 5 连接1h 。 1 5m 2 6 大肠感菌热击感受态细胞的制各 1 ) 取冻存的大肠感菌菌株g n lb l u e ) ，室温解冻。 2 ) 用划线法将大肠杆菌接种于含四环抗生素的l b 固体培养基平板上，3 7 下 倒置培养过夜。 3 ) 用牙签挑取单菌落接种于5i m 含四环抗生素的l b 液体培养基中，3 7 ，2 0 0 r p m 振荡培养1 2h 左右。 4 ) 将上述菌液接种于l o ol i l ll b 液体培养基中，3 7 ，2 0 0r p m 。 振荡培养5 6h ，使细菌达到对数生长期( o d 6 0 0 值介于0 4 0 5 之间) 。 5 ) 冰浴1 0m i n ，终止生长。 6 ) 将培养液转到冰预冷的5 0 d 无菌离心管中，配平，4 5 0 0 0r p m ，离心1 0m i l l 。 7 ) 弃上清，加1 0m 1 冰预冷的t f b l ( 3 0m m 乙酸钾，5 0m m 氯化镁，4 0 0r 州 氯化钾，1 0n 1 m 氯化钙，1 5 ( v v ) 甘油，用0 2m 醋酸调p h 至5 8 ，抽滤灭菌) ， 悬浮，冰浴3h 。 8 ) 离心，4 ，5 0 0 0 r p m ，1 0 1 5m i l l 。 9 ) 弃上清，倒置1 2 1 1 1 i n ，使液体流尽。 1 0 ) 根据沉淀量的多少，约按2m l 5 0 1 1 1 l 加入t f b 2 ( 1 0i 删3 吗啉丙磺酸钠 ( n a m o p s ) ，7 51 1 1 m 氯化钙，1 0m m 氯化钾，1 5 ( v v ) 甘油，用1n 氢氧化钠 调p h 至7 0 ，抽滤灭菌) 悬浮。 1 1 ) 分装，按1 0 0 山每管分装，8 0 冻存备用。 2 7 热击转化及蓝白斑筛选 分别设两个对照，阳性对照和阴性对照( 即空白对照，不加任何物质) ，样 品为连接产物。 东北师范大学硕士学位论文 1 ) 用冰盒取冻存的感受态菌3 支，冰浴1 0m i n ，化开即可。 2 ) 向转化管中分别加入5 “l 连接产物、lp l 阳性对照，1p 1 阴性对照混匀，冰 上放置3 0 m i n 。 3 ) 4 2 热击9 0s 。 4 ) 加4 0 0u l3 7 预热的l b 液体培养基，振荡培养，3 7 ，2 0 0 印m ，6 0m i n 。 5 ) 涂板，即吸取2 0 0u 1 上述培养液于含氨苄青霉素抗生素的l b 固体培养基上， 用一无菌的弯头玻璃棒轻轻地将溶液涂布于整个平板的表面，静置半个小时，使 液体被充分吸收。 6 ) 倒置平皿，3 7 培养，1 2 1 6h 出现菌落。 7 ) 蓝白斑筛选：挑取白色克隆进行质粒提取检测。 2 8p u c 8 载体的酶切 p u c 8 质粒d n a 的& d m 、鼢聊h i 双酶切： 反应体系如下 p u c 8 质粒d n a ( 5 0 0 n p 1 ) b u 髓r h d d h 2 0 髓d r j ( 1 0u “1 ) 肋聊h i ( 1 0u p 1 ) 2 0 肛l 1 0p l 6 2m 4 肛l 4 山 1 0 0u l 3 7 酶切3h ，然后电泳，回收约2 7k b 酶切产物，2 0 “lt e 溶解。 2 9 质粒d n a 的大量酶切 p g e m g l l y c b 2 质粒d n a 的晟0 融、b 口珑h i 双酶切： 反应体系如下 p g e m - g l l y c b 2 ( 5 0 0n m ) 2 0m b u 蔬r h l o 斗l d d h 2 06 5 山 b 口所h i ( 1 0 u m ) 5p l 1 0 0 “l 3 7 酶切3h ，放在冰上，在反应体系中加入1 “l & d 酣( 1 0u 扯1 ) 在3