（动物遗传育种与繁殖专业论文）生物制剂—光合细菌（PSB）对中小型水库生态作用的研究.pdf

微生态制剂一光合细菌( p s b ) 对中小型水库生态作用的研究 摘要 本试验是在吉林省境内选取6 个水库，其中3 个作为对照水库。试验室内富集 培养p s b 原种后，利用当地井水大量培养p s b ，在试验水库中全池泼洒两次。泼洒前 后测定水库中理化因子、浮游生物量及鲢、鳙鱼的生长情况。 研究结果表明： 1 ) p s b 对水库的理化因子有显著影响。p s b 可降低水库的s d 、硫化物、n o 。一n 及c o d 。试验组1 、2 、3 水库s d 、硫化物、n o _ 2 一n 下降幅度较大，而对照水库仅在 较小范围内变动，不明显。试验水库c o d 与对照水库比也有所下降，但没有达到显著 影响；p s b 可增加水库的d o 、a l k 、t h 。试验组l 、2 、3 水库d o 、a l k 、t h 值在 p s b 泼洒后有较大幅度升高。对照组水库变化不明显。但是，试验组中不同的水库同 一指标的变化幅度不同，说明不同的水库环境影响p s b 的生态改良效果。 2 ) p s b 的泼洒对水库浮游生物量有明显影响。p s b 泼洒后，l 、2 。、3 水库浮 游植物量增加，其程度达到1 、6 水库间及2 、3 与5 水库间由差异显著变为差异 不显著。并且1 、2 、3 水库不利于鱼类消化的蓝藻门藻类所占百分数均有所下降； 同时p s b 的泼洒促进了浮游动物的增长，试验组水库在p s b 泼洒后，浮游动物量有较 大幅度增加，而对照组水库两年内的浮游动物量变化幅度不大。 3 ) p s b 对鲢、鳙鱼的日增重及成活率有较大影响。未泼洒p s b 的对照组4 、5 、 64 水库鲢、鳙鱼的日增重、成活率变化幅度不大，但是试验组中两项指标均有较大幅 度增加。这是因为p s b 改善了水环境，并且促进了浮游生物的增长，从而使鲢、鳙鱼 获得更好的生长环境与充足的饵料。 综上所述，本实验系统的研究了p s b 对水库的理化因子、浮游生物、鲢鱼生长情 况的影响。这不仅对水库的渔业生产有重要的意义，而且对改善水库的生态环境有重 要的参考作用。 关键词：光合细菌，水质调控，浮游生物，鲢，鳙 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉杯农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：球噎莲 签字日期：h 舶6 年r 月吕日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 学位论文作者签名：张f 豪踅 签字日期：沙弗年歹月g 同 导师签名： 戛艳i 苫 签字同期：山年f 月护曰 吉林农业大学硕士学位论文生物制剂一光合细菌( p s b ) 对中小型水库生态作用的研究 径，比如在黑暗中用有机物培养的红螺菌。 光照的强弱对p s b 的生长有很大影响。在供给光照的条件下，p s b 的活性随着光 照强度的增加而增加，光照强度不足会强烈抑制p s b 的生长，而光照强度过高导致光 饱和现象( s a t u r a t i o nl i g h ti m e n s i t y ) 。当光强度在7 0 0 1 5 0 0 l x 时，随着光强的增加， p s b 能呈现显著的快速生长。低于7 0 0 l x 或高于1 5 0 0 l x ，则会出现强烈的抑制作用 或光饱和现象。而在低光照下生长的细胞却比强光照射下生成的色素含量高。目前水 产上应用最广泛的红色p s b 进行光合作用时所吸收的光谱波长是8 0 0 9 0 0 l x ，主要 是红外区，只需7 0 0 一1 0 0 0 l x 的光照就能满足其生成色素的需要。 温度对p s b 的生长影响比较明显，因为温度是影响微生物生长的最重要的因素之 一p s b 可以在1 0 一4 0 的温度范围内生长。低温不利于p s b 的生长与繁殖，温 度下降至i o 以下，p s b 生长缓慢，5 以下基本停止生长。温度低于1 并置于黑 暗条件下时菌绿素将分解并导致p s b 死亡。在2 2 3 0 随温度的升高，p s b 的牛长 速率明显加快，而2 6 3 0 增长最快，所以一般认为p s b 在2 6 3 0 是p s b 的适宜 生长温度；当温度超过3 4 后，生长速率出现下降，迟滞期延长，可见过高的水温 划+ p s b 的生长也将产生抑制作用。 王笃彩等提出大多数p s b 的最佳p h 为75 8 5 7 j ，p 6 暑n n i n g 认为还有少数p s b 为6 5 88 1 5 j o 在p s b 生长过程中，c 0 2 的同化或释放，h 2 s 或硫代硫酸盐等被氧化 生成硫酸或者有机酸的消耗等代谢过程都将导致培养基中p h 值的变化。 1 11 4p s b 的物质代谢 ( 1 ) 碳的利用和代谢 c 0 2 和有机物都可作为p s b 生长的碳源。p s b 对有机物利用的能力按照绿色硫 细菌、紫色硫细菌、紫色非硫细菌顺序增强。一般来说，绿色硫细菌主要靠氧化硫化 合物和固定c 0 2 而进行自养型营养生长；也能同化乙酸、丙酸和丙酮酸等，但在c 0 2 和无机供氢体大量存在时，才能同化有机物。紫色硫细菌在提供c o ：和无机供氢体， 在厌氧光照条件下可以同化有机物，其某些种也可以在微好氧到好氧条件下化能异养 利用有机物。紫色非硫细菌因为兼有各种获能方式，利用有机物范围十分广泛，既能 靠光能氧化有机物，也能在好氧条件下氧化有机物，某些菌株还能以反硝化和发酵的 形式生长】。 ( 2 ) 氮的代谢 所有的p s b 都能直接同化铵盐，或通过固氮作用将氮气转变为铵盐作为氮源。大 多数紫色硫细菌、绿色硫细菌、紫色非硫细菌在微好氧或黑暗条件下都能崮氮。例如 r _ c a p s u l a t u s 在光照厌氧、黑暗厌氧、光照微好氧、黑暗微好氧的条件下都可以固氮， 其中光照厌氧条件下固氮效率最高：当与不具固氮特性的异养菌混合培养时，在好氧 吉林农业大学硕士学位论文生物制剂一光台细菌( p s b ) 对中小型水库生意作用的研究 的环境也能利用异养菌分解得到的丙酮酸进行有效的崮氮【1 。此外，在厌氧条件下， 紫色非硫细菌还能以有机物为电子供体和碳源，将硝酸盐或哑硝酸盐还原为氮气，其 反硝化能力受到有机物的种类、光照强度和细菌所处的生长期的影响1 1 1 m 】。 ( 3 ) 含硫化合物的代谢 在光合作用过程中，不同的p s b 以不同的硫化合物如硫化物、硫单质、亚硫酸盐 及硫代硫化物等作为电子供体同化c 0 2 。某些p s b 还可利用硫醇类物质3 】。p s b 利用 硫化物时，首先将硫化物氧化为单质，沉积于细胞内( 如紫色硫细菌) 或细胞外( 如 紫色外硫细菌、绿色硫细菌及紫色非硫荫的某些种) 。当硫化物消耗殆尽时，p s b 将 沉积于细胞内外的单质硫进一步氧化成硫酸盐i l ”。尽管如此，硫化物对p s b 仍然有很 强的毒性。武书彬等的研究表明：无机含硫化合物对p s b 的毒性顺序依次为：n a 2 s n a 2 s 0 3 n a 2 s 0 4 n a 2 s 2 0 3 。大多数紫色硫细菌能忍受的基质中的硫化物浓度为 2 4 m m ；紫色非硫细菌在硫化物浓度超过2 m m ( 有些种仅为o 5 m m ) 时完全受到抑 制。 ( 4 ) 氢的代谢 p s b 的氢代谢包括氢的吸收和产氧。某些p s b 在氢酶( h y d r o g e n a s e ) 的参与下可 以在光合同化c o ：的过程中利用氢气作为电子供体。紫色硫细菌、紫色非硫细菌和 绿色色硫细菌都有产氢的报道。例如咒打聊，r 与咖舶砌出s 兄田胁咖坦兄v f v 砌墨z ，d 一船d 心卜s ，c 加d 细菌能在厌氧黑暗条件下利用乙醇、乙酸等产生h 2 和c 0 2 。p s b 产氢 性能除了受菌株和电子供体影响外“ 2 ”，还与光照强度1 1 1 8 2 1 】、细菌的初期活性川、 氮源、p h 及环境温度有关。 ( 5 ) 磷的代谢 磷是微生物细胞内核酸、核蛋白、磷脂、多种辅酶及磷酸腺苷的重要组成元素， 在细胞的代谢中起关键作用。某些p s b 如黝6 伽胞，s 础船，d f 出s ，7 1 9 刀， 删f ”朋 妒。具有较强的摄磷能力，其摄磷能力与光照强度、p h 和溶液中存在的阳离子量有 关1 2 ”。这些p s b 对于磷酸盐的吸收和积累特性还被用于处理被有机物和磷污染的海 湾污泥【2 3 l 。 11 2p s b 在水产上的应用 1 1 2 1 提高养殖池塘的能量转化效率 以投饵施肥为重要增产技术的精养池塘，随着养殖时间的延长，常因有机质投入 过多，超过了池塘生态系统的消耗与转化能力，造成循环不畅，池内有机质的大量沉 积，产生较严重的“能量陷井”效应，致使一般池塘的能量转化效率偏低。王育锋等 【2 t 2 5 1 对1 0 个普通鱼池的试验结果显示，能案转换效率在33 4 一88 3 。旋用，p s b 吉林农业大学硕士学位论文生物制利一光畚细菌( p s b ) 对中小型水库生态作用的研究 的池塘，由 ：p s b 发挥r 其处理低分子有机物、转化h 2 s 等有害物质的作用，促使池 塘中投入的n 、p 陷入“能量陷井”的效应减低，加之这种转化是在黑暗、弱光和厌氧 条件下进行，从而起到相对增氧和降低h 2 s 含量的效能，使d o 、p h 值、h 2 s 等诸 项理化因子更适应鱼、虾、贝生长需要，因而提高了单产和池塘的能量转换效率。王 育锋 2 4 2 5 】在实验中发现添加了p s b 的池塘要比普通池塘的能量转换效率晟少的提高 了2 3 9 ，高的甚至提高了1 7 0 5 0 。换句话说，就是投入相同的外源营养，在施用 了p s b 的池塘，能比普通池塘生产出更多的水产品。 1 122 净化水质 随着现代工业的发展，近海水域、河流、湖泊、池塘、养殖池等受污染的机会增 加，并且养殖密度的小断扩大使得海、淡水养殖池中，由于排泄物和残饵的累积，水 体中氨氮化合物浓度升高，从而引起水质污染，给水产养殖业造成重大危害。水体中 的无机氮包含n o 一。一n 、n o 。一n 和n | 3 一n 三种形态，它们可以相互转化，n o 。_ n 一般对水 产动物无毒害作用，毒害主要来自n h 3 一n 和n o 。一n f 狮。l i n 等m2 8 1 研究发现，氨氮在 高浓度时对水产动物有致死作用，即使在低于致死浓度的条件下对水产动物的生理功 能如氧消耗、氮排泄、 t p 酶活性及渗透压等也有显著影响。陈红菊等【2 “3 0 1 研究发 现，n 0 一。- n 达到一定浓度易引起水产动物中毒而使血液里高铁血红蛋白的含量升高， 载氧能力下降，造成组织缺氧，神经麻痹，甚至窒息死亡。这时候往往通过换水加以 解决。但采用换水难以保持池塘水的适当肥度，还要消耗大量能源，在早春和冬季， 换水不能保持最适水温。p s b 在海、淡水中均能生长繁殖，能在厌氧或好氧条件下利 用有机酸、和h 2 s 等供氢体进行不放氧光合作用，可参与水体中污染物的降解过程【3 。 ”j ，能将从池底不断产生的n h 。n 和有机物的初始分解物转化除去，从而不必换水就可 保持良好水质。丁二汝芬等【33 l 利用p s b 固定化技术进行实验表明，固定化p s b 在鱼池中 除n 地一n 率达9 0 以 ，而游离p s b 的除n 心_ n 率在5 0 左右。p s b 作为池塘养殖水 质净化剂，目前国内外己进入应用阶段。在日本、东南亚各国和我国的养鱼池和养虾 池均已较普遍的投放p s b 作为改善水质的净化剂，并已取得明最的效果1 3 ”。 1 1 2 3p s b 用于防治鱼瘸 现代化水产养殖为可控条件下生产水产品提供了多种有效的手段，然而由于未能 控制饲育系统的微生物，使得这个发展很快的产业面临比较严重的病害问题。病害控 制是任何集约化动物生产系统中一个固有的组成部分，在水环境中，细菌及寄主之间 的内在关系以及经常采用开放式生产使得这个问题变得更加严重。在集约化的水产生 产系统中，采用各种水处理和消毒使得细菌数量较低，这种做法扰乱了微生物群落之 问的平衡，有利于机会菌的繁殖或微生物群落不可预测的变化f 4 。而p s b 的应用，可 形成对养殖生物有利的微生物群落。王绪峨等f 4 1 1 证实p s b 对水中可引起细菌性疾病的 吉林农业大学硕士学位论文生物制割一光合细菌( p s b ) 对中小型水库生态作用的研究 病原体如嗜水气单胞菌、爱德华氏菌、霉菌等均有一定的抑制作| j 。并且p s b 本身含 有或可产生一定的抗病物质。如p s b 中的荚膜红假单孢菌细胞壁中含有的多糖类为广 谱的非特异性免疫激活剂，使鱼类的免疫球蛋白提高1 0 倍以上，增强其免疫功能。 菌体中的色素有抑制生物体f e ”诱导的活性氧产生人工膜脂过氧化反应，因而降低死 亡率【4 ”。近年来人们发现维生素a 和类胡萝h 素有抗肿瘤作用m 】，p s b 中含有的类胡 萝b 素的防病机理引起人们的重视。 112 4p s b 作为水产动物饲料添加剂的应用 p s b 菌体的营养成分非常丰富，其蛋白质含量超过酵母、小球藻和大豆。而且其 它营养成分含量也较高。在饲料中少量添加，可以提高饲料效率，增加脂肪含量，提 高鱼类生殖力和抗病力，改善色泽。b a n e r i e e s 等在尼罗罗非鱼商品饲料中添加单 细胞p s b 一红螺菌，提高了鱼的成活率和生长率。试验初期鱼体长1 7 5 c m ，每个水 族箱( 1 0 0 l ) 中养7 8 尾，试验结束后测出添加p s b 喂养的鱼成活率提高1 6 ，平均 个体重3 0 1 3 9 ，而对照组平均个体重2 31 8 9 。p s b 作为其它种水产动物饲料添加的应 用也取得了很好的效果。姚志军等将p s b 添加到鳖的配合饲料中与不添加p s b 的 相同配方饲料和全动物性饲料进行比较试验，试验池为2 02 m 2 的水泥池，每池放养 7 5 只，温度为3 0 土1 ，鳖种2 1 3 2 2 0 9 ，9 0 天试验结束后添加p s b 饵料池中鳖生长 最快，日增重达4 7 5 9 。a z a d 等1 4 6 i 使用p s b 、海洋硅藻和卤虫将斑节对虾从无节幼体 养至后期幼体，饵料中分别添加1 、2 、3 和5 的p s b ，测出饵料中添加p s b 显著影响了对虾的成活率。添加p s b 的幼虾9 天后总体长达( 6 1 3 土00 5 ) m m ，个体 显著大于投喂其他3 种饵料的虾。投喂添加2 p s b 的虾成活率高达4 6 ，体长 ( 68 8 土01 8 ) m m ，显著大于投喂对照饵料和添加3 一5 p s b 的虾。表明对虾幼体 饵料中p s b 添加量在2 以上水质变坏，n h 3 一n 含量高。可见，在饲料中添加适量的 p s b ，将对水产动物的生长有很大的促进作用。 1 1 25p s b 用于鱼、虾、贝幼体的培育 鱼苗培育成败的关键在于充足的开口饵料，清水千秋认为在育苗池中施放p s b 可被浮游动物捕食，而浮游动物又作为各种鱼类的开口饵料，为鱼苗所摄食，从而大 幅度提高育苗的成活率 4 7 。崔竟进在中国对虾( 尺p ，柳鲫曲加鲫捃) 整个实验期间， 加p s b ( 月 o 却卵a 幽m o 煳ss p ) 的实验池水质明显优于对照池，其中糠虾池期池水泡 沫少，水气较清，s d 比对照池提高近2 0 c m ，虾幼体从无节幼体发育至蚤状幼体( 2 ) 后，镜检观察其摄食及施便情况，发现加p s b 的实验池中幼体普遍较对照池幼体胃肠 饱满，且施便较多，在重复实验中发现在幼体发育至蚤状期后第4d ，多点检查由z 3 转化为m 1 的情况，结果加p s b 的实验池变态率比对照池高出近3 倍，且幼体挂脏率 降低5 0 ，当第一批试样进入1 0 天，取样镜检由糠虾( m ) 发育至仔虾( p ) 数量 6 吉林农业大学硕士学位论文 生物制剂一光合细营( p s b ) 对中小型水库生态作用的研究 时，表明加p s b 的实验池仔虾数比对照池高出近1 倍，在5 0 m 3 水体育苗池中多产仔 虾百万尾。安树忐【49 j 用p s b 与单胞藻混合投喂海湾扇贝幼体的效果明显优于单纯投喂 单胞藻。并且发现p s b 具有很好的净化水质的能力。常规育苗每天换水2 3 次，每 次换水1 3 1 2 ，而混投p s b 后每天只换水2 次，每次l 6 1 3 ；常规育苗在2 3 条件下，d 形幼虫培育7 一l o d 才出现眼点，开始附着。而混投p s b 的d 形幼虫，仅 用6 7 d ，缩短了育苗时间，降低了育苗成本。总之，p s b 在育苗生产中促进了鱼类 开口饵料一浮游动物的增殖，并且净化水质，减少了换水奄，维持了育苗池水质的稳 定与清洁，这些都是育苗成功的关键条件。 p s b 不仅可用于水产养殖业，提高育苗成活率、净化水质、促进生氏防治鱼病。 也可用作家禽饲料添加剂，p s b 中的红假单胞菌属和红螺菌属的许多菌种均能产生类 胡萝h 素类物质。实验证明：用o 0 1 的比例添加于蛋鸡饲料中，结果发现产蛋率增 加，卵黄中类胡萝h 素和维生素a 含量显著提高p 。也可用作农作物的肥料，提高水 果的产量和质量等。此外，p s b 菌体还可用于提取类胡萝h 素口”、生物可降解塑料p h a s 等陋2 。”。总之，p s b 的应用研究十分广泛，而由于其菌体内含有丰富的蛋白质、维生 素及各种生理活性物质，它在水产养殖业领域将有更广阔的应用前景。 1 2 水库环境的污染研究 近2 0 年来，由j 二生活及工业污染严重，在水库的开发利用上客观上采取了超负 荷高投放、过度捕捞、盲目施肥投饵、江湖拦隔、养殖结构不科学等不合理渔业措施， 使得水库环境日益恶化，大大削弱了水库的生态功能和社会功能。 水库环境恶化，主要表现在以下几个方面。l 、水体污染严重，s d 下降，富营养 化。1 9 9 9 年对1 4 1 座水库的调查表明，有1 3 座水库富营养化，2 2 座中等污染。戴泽 贵等f 5 4 】对全国2 1 个省( 市、区) 3 4 5 座水库分类表明，富营养型的7 6 座，占2 2 ， 中营养型1 5 0 座，占4 3 ，贫营养型的1 1 9 座，占3 5 ，贫营养型水库主要分布在 西北地区。朱爱民等垆卅研究了4 省2 2 2 座水库营养类型，结果中一富营养型以上水库， 海南达6 67 ，福建6 6 6 ，山东6 0 2 ，广东4 21 。长江流域9 座大型水库也均 处于不同程度的中营养型以上状况。2 、生物多样性下降，研究表明【5 65 7 5 “5 ，由于 水库污染及不合理渔业措施，使得水生生物包括鱼类、浮游动物、浮游植物、底栖动 物、水生生物的多样性大幅度下降，甚至出现某些鱼类的绝迹。3 、水体生态系统稳 定性差，水体自净能力减弱，鱼类易得病死亡。近年来，我国不少水库发生了大面积 死鱼事件，大水面中鱼类病害也曰趋严重。据调查，水体污染导致的病害，占整个病 害的5 0 以上，且发病和死鱼的时间往往发生在气候变化之时。究其原因，是由于水 体生态系统稳定性差，水体自净能力减弱，当气候变化时，导致整个水体生态系统崩 吉林农业太学硕士学位论文生物制剂一光台细菌( p s b ) 列中小型水库生态作用的研究 溃，d 0 卜降，c o d 、n i i ，一n 增加，危害鱼类和其它生物的存在。 121 水库的污染的主要原因 12 1 1 生活污水污染 近年来，由于城乡人口的不断膨胀，以及人民生活水平的大幅提高，生活污水的 排放量和有机物的含量日益增加。生活污水中的f e 、m n 、氢氧化物悬浮物引起的浑浊 度，尽管对水体不产生直接危害，但水体浑浊减少了太阳辐射，使水体初级生产力下 降。生活污水产生的恶臭可导致水牛- 生物产生回避及死亡等生物效应，水产品食用价 值也大打折扣。生活污水中有机物大量富积，造成水体色度加深，出现富营养化。从 而导致缺氧浮头及死亡事故。在湖北省武汉市，据专家估算，每年因生活污水造成死 亡的鱼类约5 0 万k g 。 12 22 工业废水污染 工业废水对渔业水体污染是毁灭性的。据专家介绍，造纸厂废水中的硫化物，可 使所有鱼类致死；农药厂的产品和原料，都是鱼类的克星；冶金矿山废物中的重金属。 会毒死一切水生动植物：皮革厂、肉类加工厂废水排入水体可使水色加深、浊度加 重减少太阳辐射限制鱼类正常活动与摄食：工业废水排放还有可能引起水温骤升， 引发水体生物种群的变化与更迭，破坏水生生态平衡；同时工业废水的恶劣气味可致 水生生物死亡，使水产品失去食用价值。在武汉市，据有关媒体报道，7 5 的死鱼事 件悉因工业污染造成。 1 22 3 农业源污染 农业面源污染最主要的因素是大量施用化学肥料。根据统计，近年来，我国施用 化肥量高达14 0 0 万t a ，年耕地平均使用化肥量达到了3 0 0 蚝h m 2 ，是世界上施用 氮肥最多的国家之一。国内外研究表明，在小麦田间，土壤上部对肥料氮的回收率为 2 6 一7 0 ，多在4 5 一5 0 之间，肥料氮的损失为4 一3 8 ，土壤残留为3 一7 2 ；在稻田间，平均施用氮肥为1 4 1 蜒，h m 2 ，( 以n 计) ，磷肥为7 2k g m m 2 ( 以p 2 0 5 计) ， 稻田排水中有2 0 2 5 是当季施用的氮素化肥；磷肥平均利用率为1 6 ，磷肥施人 土壤后，在2 个月内，有6 5 以上变成不溶性磷，主要是c a _ _ p ，a j p ，f e p 的形成， 通过径流等途径而流失进入水体。 12 2 4 不合理的渔业措施 在水库的开发利用上，不合理的渔业措施也是水域环境恶化的重要因素。许多 研究证明，江湖阻隔、养殖结构不合理、湖泊放养和网箱养鱼均会对水域环境造成影 响，导致水体总磷增加，d o 下降，c o d 升高，s d 下降，促进水体富营养化，引起水 质恶化，进而影响到天然鱼类的组成和生长。张家波等| 6 0 】研究了在库湾进行投饵式网 吉林农业大学硕士学位论文生物制荆一光台细菌( p s b j 对中小型水库生志作用的研究 源等意义重大，推广应月；j 前景广阔，能形成产业化。 1 4 主要研究内容与创新 1 4 1 主要研究内容本课题是吉林省科技发展计划项同( 合同编号：2 0 0 4 0 5 7 8 ) 。 研究目的在于分离纯化适用于水库生产的p s b 菌种后，进行大量的生产性的扩繁，并 以此为基础应用于中小型水库，为改善水体生态环境、促进健康养殖的发展研究做基 础。主要研究内容： a 、p s b 的纯化与扩繁； b 、对水中s d 、d o 、c o d 、n 0 2 一n 、a l k 、t h 、浮游生物量、鲢鳙生长情 况等进行跟踪监测； 1 4 2 创新占林农业大学图书馆情报部一科技成果查新报告表明：课题组没计的 研究内容国内尚未见到相同或类似的专利文献和其他研究文献报道。 2 1 实验时间、地点 2 材料与方法 21 1 时间2 0 0 4 年5 月一2 0 0 5 年1 0 月 2 1 2 地点吉林省境内白城、四平等地区的六个水库 在动物科技学院水产养殖系列实验室及基础( 一) 实验室进行实验室分 析 2 2 实验用仪器、物品、材料及方法 2 2 1 实验用仪器、物品、材料 22 11 水化指标与浮游生物的测定分光光度计、电子天平、磁力加热搅拌器、生 物网、显微镜、计数器等。 2 2 12 鱼种及p s b 菌种鱼种来源f 各试验水库。实验用的p s b 菌液为红螺菌科 的单胞菌和红螺菌的混合液，经扩繁后，菌液中含活菌数为3 0 一4 0 亿个m l 。 22 1 3p s b 的富集培养与计数酵母粉无菌水、选择性培养基、高压灭菌锅、c 0 2 光照培养箱、灭菌水、超净工作台、微量移液器等。 2 214p s b 的扩繁 a 常规仪器、物品、药品 吉林农业大学硕士学位论文生物制剂一光台细菌( p s r ) 对中小型水库生态作用的研究 个时，计数2 0 0 个视野以上。同一样品的2 片计算结果和平均数之差如不大于其均数 士1 5 ，其均数n j 视为有效结果，否则还要计数第三片，直至3 片平均数与相近两数 之差不超过均数的1 5 为止，取两相近值的均数作为计算结果。计数过程中碰到的一 部分在视野中，而另一部分存视野外的情况时，则规定在视野l 二半圈者计数，下半圈 者不计数。另外，数量用细胞数表示，对不易用细胞数表示的群体或丝状体，求出平 均细胞数计数。计数具体要求；校正计数框容积；定量用的盖玻片用肥皂水洗净备用， 用前浸于7 0 酒精中，用时取出擦干；用台微尺标定所用显微镜一定倍数下的视野直 径；选好与计数框同样容积的吸管备用；定量时将浓缩标本尽量摇匀，快吸快滴；加 上盖玻片后不应有气泡出现；计算l l 水中的浮游植物的数量( n ) ，根据浮游植物细 胞平均湿重表计算生物量。 2 3 22 浮游动物的计数 用2 5 号浮游生物网，在水中作“o 。”形缓缓反复捞取。捞取时间随水中浮游生 物密度大小而定，在密度大的水中( 水的s d 在1 0 2 0 c m ) ，捞3 5 m n ，在密度低的 水体( s d 为2 3 m ) 则捞取1 5 3 0 m i n 。捞时尽可能注意不要搅起底部泥沙。用甲醛 现场固定。显微镜下观察计数，根据浮游动物个体平均湿重表计算生物量。 23 3 鱼病检查、鱼类学测定 鱼病检查、体重等鱼类学测定采用鱼类学测量标准的常规方法【6 ”，按科学院水 生生物研究所鱼病学研究室鱼病调查手册第三版进行。 23 4p s b 的富集培养纯化 用采泥器采集底泥，装入大试管中，再加入富集培养基，充分搅拌，使样品与培 养基充分分散混合，然后在试管中加入液体石蜡，外加橡皮塞，以阻断夕 界空气。进 行光照厌氧培养，温度为2 8 ，光照强度为1 0 0 0 一2 0 0 0l x ，在培养基变为红色后， 用移液管吸取菌液，接种到另外的大试管中，加入培养基，按前述的方法和条件继续 培养。如此经过3 5 次接种培养。 细菌的分离纯化，采用平板分离法。按培养基的配方要求，配置成营养液后，再 加入1 的琼脂粉。然后将培养基以及培养皿等器具进行灭菌后。在无菌间里接种后 置于光照培养箱中培养，照度保持在1 0 0 0 一2 0 0 0l x ，温度保持在2 8 3 2 培养 3 5 d 后，取生长良好的红色单菌落，进一步采用划线法分离3 4 次，显微镜下检 查无杂菌后，将其保存于液体培养基中4 冰箱保存备用或加入液体石蜡进行保种 存放。 2 3 5p s 8 定量 p s b 计数采用选择性培养基培养计数法。选用合适的连续3 个菌液稀释度，接种 于平皿内，每个稀释度设3 个重复，迅速倾注2 0 m l 已融化放冷至4 5 士1 的选择性培 吉林农业大学硕士学位论文生物制剩一光台细菌( p s b ) 对中小型水库生态作用的研究 养基j 二平皿内。选择p s b 的培养条件为：温度2 8 一3 2 ，此照强度2 0 0 0 l x ，培养7 2 h ， 如果菌落不明显，则继续培养4 8 h 。p s b 的典型特征是菌落呈粉红色、红色、红褐色或 深红色，在培养基中菌落呈铁饼状。计数时以2 5 2 5 0 个菌落为合适范围，适宜稀释 度的两个平叽的菌落数据平均值或两个稀释度的平皿菌落数平均值乘以相应稀释倍 数即得到每毫升样品中的p s b 活菌数。 23 6p s b 的扩繁 大量培养p s b 主要有两种方式，种是全封闭式厌气光照培养方式；另一种是 开放式的微气光照的培养方式。本实验采用的是微气光照的培养方式。 2 3 61 容器、工具的消毒 将k m n 0 4 配成浓度为3 0 0 m g l 溶液，把塑料桶和搅拌棒放在溶液中浸泡5 m i n 取出，用清洁水冲洗2 次。k m n 0 4 溶液一般现用现配。 2 362 配制培养基的用水 使用前将井水静止沉淀1 2 h ，然后将无杂质的井水装入5 0 l 的透明塑料桶中。 2 363 配制培养液 将培养基溶解于装有井水的塑料桶中。 23 64 接种 培养液配制好后，立即进行接种。将菌种( 3 5 0 m l 3 0 亿级) 接入培养液中。 2 3 65 培养管理 培养过程中，根据生长情况调节光照度，培养p s b 需要连续进行照明，白天利用 太阳光源培养，晚间用人工光源照明，在每个塑料桶中吊一只l o o w 的白帜灯，灯泡 距液面l o c m 左右；同时培养过程中要进行搅拌，p s b 培养过程中必须搅拌或充气， 其作用是帮助沉淀的p s b 上浮获得光照，保持菌细胞的良好生长，每天至少搅拌3 5 次，定时进行；另外还要注意调节温度，在p s b 的培养中，保持适宜的温度是十 分必要的，般控制在2 5 3 4 的范围内。 生长情况的观察在培养中，通过观察菌液的颜色及其变化来了解p s b 生长繁殖 大致情况，培养液颜色由浅变深，说明其生长正常，温度适宜，经8 1 0 d 可培养成 熟菌液每毫升含2 0 4 0 亿个活菌体，培养成熟后，取一半用于生产，再加井水和培 养基继续培养。 2 4 数据处理及统计 数据处理用e x c e l l 软件进行。 吉林农业大学硕士学位论文生物制荆一光台细菌( p s b ) 剧中小型水库生恋作用的研究 2 、3 + 水_ 【荜变化较人，在p s b 泼洒后n 0 2 一一n 值降低，泼洒p s b 后的折线趋势较对照 组4 。、5 、6 水库有明显改变，由i ：折线趋向于变平或下折。对p s b 泼洒前的各水 库的n o ：一- n 值进行比较，埘照组5 水库n 0 2 一n 值最高，与l 、4 水库差异不显著， 与其它组著异显著。其次是2 水库，2 水库仅与5 水库差异显著。3 水库与2 水库 及对照组6 水库n 0 2 一一n 值差异不显著，与其它组差异显著。对p s b 泼洒后的各水库 的n 0 2 - n 值比较发现，l 、2 水库n 0 2 - n 值下降程度达到与剥。照组4 水库差异显 著，3 水库n 0 2 。一n 值下降，与6 水库差异显著( 见表6 ) 。 316p s b 对水库a l k 影响 总体来看，各水库a l k 值均不高，对p s b 泼洒前各水库的a l k 值进行显著陛检验， 各水库间差异显著，对照组4 水库a l k 值最高，其次是i 、6 水库。对p s b 泼洒后 各水库间的a l k 值进行显著性检验，l 水库与4 水库差异不显著。从i 、4 水库的 总体变化趋势看，1 水库在p s b 泼洒后碱度上升，而对照组4 水库a i ，k 值则变化不 大。2 、3 水库的a l k 值总体呈上升趋势，并且2 水库上升幅度较大，在p s b 泼洒 前与3 水库差异显著，但泼洒p s b 后与3 水库无显著差异( 见表7 ) 。 3 1 7p s b 对水库t h 的影响 纵观各水库的t h 值，l 、2 、3 水库在p s b 泼洒后总硬度升高，而对照组4 、 5 、6 水库则变化幅度不大。对p s b 泼洒前各水库的t h 值比较，4 水库t h 值最高， 与其他各组差异显著，其次是l + 、6 水库，但l 、6 水库之间差异显著。对照组5 水库t h 度值与2 、3 水库差异不显著；p s b 泼洒后l 、2 、3 水库硬度值呈上升 趋势，对各水库间进行显著性检验，l 水库与4 水库无显著性差异，与其他各组差 异显著。2 、3 水库t h 上升，5 水库t h 变化不大，2 、3 。水库与5 水库差异显 著，与6 水库差异不显著( 见表8 ) 。 吉林农业大学硕士学位论文 生物制剂一光合细苗( p s b ) 对中小型水库生态作用的研究 1 h b k2 表2 各水库s o 的测量值的变化( m ) t h ec h a “g eo fs d 吖e l p e r j m e n t a lr c s e n ，0 i r ( m ) 水库 注同一数据上角标无相同小写字母者表示处理间差异显著( p 0 5 ) 表3 各水库的变化( m g l ) t a b l e3t h ec h a n g eo f d oo f e i p e r i m 吼t a ir e s e r v o i h ( m 阻o 水库 3 5 6 注同一数据上角标无相同小写字母者表示处理间差异显著( p 0 5 ) 1 6 吉林农业大学硕士学位论文 圭物制荆一光台细菌( p s b 炳中小型水库生态作用的研究 表4 各水库硫化物变化情况( m g l ) t a b k 4t h cc h a n g eo f 蛐m d eo f t h er e s e n 俩r s ( m g 几) 水库 5 6 1 7 吉林农业大学硕士学位论文 生物制剂一光台细菌( p s b ) 对中小型水库生态作用的研究 表6 各水库n 啦一n 变化情况“g l ) h b l e6 t h ec h a n g eo f n 0 2 _ n o f t h e 腭s e r v o i n ( m 鲫l ) 图l 水库的n 0 2 n 变化 f i g1t l l ec h 柚g eo f n 0 2 j no f t h er c s e v o i r s 吉林表廿天学硕士学位论文 生物制剂一光合细菌p r r l 对中小痘j 汞虚单裹张确醐硼牟 墓；麓蠢 冀；| 刮蠹婴鬟嚣蘩羹羹羹蓠篓囊 x illiiiliilllli高磊冀蛊品= 兽g 锗昌导s 罱嚣 o6ooo 寸oon寸一“一旦 要墨! 善量；i 量； 娶誓篁季磊量詈詈琶霉若薹逞霹 vo6c ；6 no 6n 寸一一_ 一西 函三嚣三暑墨器量虽暑景萝童 墨暑彗甍甍暑毒暑警蚤旦嚣墨on 、。n - n 母oo粤9n o 。弩 c ；一ooono o一寸hh 一口、 ；i墨i ；i 童是荨暑曩曩基三寰景三墨晕誊 。一ooo oonh一一 i ；i il 量i ；i ； 蓍量譬虽善里善量墨暮兰窑詈善 。一ooo ooh 一一一一o o口。小o_【 o n c l 讲一 。一芒一h o o o h n o n d 0 i 寸0 1 1 心n n o 一竺o oc 们口o o o 一一o q n o o 矗吐oo 口g n oo 心一1 c o o 一是寸一 高1 9 0 0 暑i i o o o 盈o n oo 口c 9 一oo 呐卜2 0o 若。一o o ；3 一 n i o 鲁o o n o 一_ 卜 墨2 一一 o = 舌一。口o”卜一。呐2 一 o h ! o o高0 1 0 0o _ 【z i n o o 罱c i o o n g oo【誉苫 o n 2 二 n n 寻o o o 芝n 口一。卜c 9 一一 。高一o oo n 型oo n n n o o o 卜i i o0 6 0 一_ o o 寸寸n 卜一 寸n n o o 虹 如 蜒鞯酬 蜷鞋健 麟踺州 麟雷 麟摧埘辚+ 蜷喇捌蜷锥麟叹蟮 醚睾谜蕾艇最麟酱o l j 麟鞯l j 糍堋 n o 口o o “曲o c 1 卜o o 一口。 叶n o o n o n o n o o o n o 廿苫o n 一，矗昌v_c七宝旨t兰j0蓦r暑。iq e宴，i善id。暑工厶jo彗_弓。ii 一譬u暮斟g埘霉州霉覃攘齄毒*。竹。=懈 _【_liq芦i 诔拳嚣f世嵫剞逝*剐七岳靛一d)糨景如栽i礞幂霉赳 似掣掣朴书器扑k剖博嚣枢 售毫誊素 ：。竺篇 兽窨答害三 荟董堇喜基誊誊喜喜誊茎 nnn nrnn nnn 中 _ 0 v山v椰哺峨删f一酎文临懈椰时仆叶叵罂限监援叫蜡辐f叵尝 目。节”+6hn皇- 弋一寸c l j q g 。o n2 9 口口o n 采h r 6 i - 气基1 6 一 onon刊on磊母1日n2可ol。茸导c l 孙心c i 一一寻口寸q口一 oon寸一十卜n凸口卜n 心卜 h n 小i | o 一卜z 一一一h 卜。一一 。寸口n 叶m寸口寸岬i|卅乱oo口 一n寸n+一oo”hn -孓。n一i 一牮o h- p 9 n n 。nu 哥西c 1 鬣g 口； 呐磊口n斟口一譬on 。”磊一。6小一 ，卜n 卜n 口n ，c 9 9 9 一 一乱n+口卜卜一0 。嗣n 饥一 8 旨夏h 0 葛c 9 乱一0 。心6 0 一 k a h 2 再一n【刊也寸袋 onn西n+non一0 吕科口一 0豁拯【| 0口。盘卜。謦葛c l 。k 瓮【6累一一刊霉芝 。i 葛。一 a 6 巴寸 oh葛掌n荨高色。一葛 ；。一瓮啦一 ；罱。n 蜀0 2 高n h ；譬芎口一 心咕口hn=8嚣一岫一，芒6曲oo一，母nnh一一 。小n 口q o “ 。n 卜0 0 口一 世若 jlo芒q兰jo器_暑oiq鲁釜鲁ido甍置jo=鲁芒鲁8 铎盖g捌霉州霉姆躔婕世*2琳 n 【卫j b 工 诔奄苦匠壮瑚斟世*剥岳莨一山叫蚓引蚓驯刊引引制剥 似袋g舯卅曙*k爿锥嚣姐 吉林农业大学硕士学位论文 生物制剂一光台细菌 p s b ) 对中小型水库生态作用的研究 表1 6 各水库浮游动物变化情况( 湿重m g l ) t a b l e “t h ec h a n g eo f z 0 0 p l a n k t o nb i o m a s so f t h er e s c n o i r ( m l ) 3 3psb 对水库鲢、鳙鱼生长的影响 p s b 对鲢、鳙鱼的曰增重及成活率有较大影响。未泼洒p s b 的对照组4 、5 、 6 水库鲢、鳙鱼日增重变化f 晤度不大，但是试验组l 、2 、3 水库变化较大。未泼 洒p s b 前的1 、2 、3 水库鲢鱼的日增重分别为14 2 9 、o9 6 9 、o 8 5 9 ，鳙鱼的日增 重为1 1 3g 、o 8 4 9 、o 6 诒。p s b 泼洒后1 、2 、3 水库鲢鱼的日增重为1 5 5 9 、1 2 7 9 、 1 0 1 9 。分别增加91 5 、3 22 9 、1 8 8 2 ，鳙鱼的日增重为1 4 2 9 ，12 0 9 ，l1 6 9 ：p s b 呵提高鲢、鳙鱼的成活率。未泼洒p s b 的对照组水库鲢、鳙鱼成活率两年内变化不 大，而试验组水库泼洒p s b 后鲢、鳙鱼成活率上升，鲢鱼由8 56 1 、7 69 2 、8 0 增加到9 2 、8 l8 1 、8 31 7 。鳙鱼由8 5 6 1 、7 9 、7 65 0 增加到8 87 0 、8 6 、 8 2 3 0 ( 见表1 7 2 0 ) 。整个实验过程，鲢、鳙鱼没有发现疾病。 吉林农业大学硕士学位论文生物制剂一光合细菌( p s b ) 对中小型水库生态作用的研究 表”2 0 0 4 年鲢鱼的饲养情况 t a b l e1 7n l cr c s u l t o fs d v e r 行s hb r 比d i l l g i i l t h ey e a r 2 0 0 4 表1 82 0 0 5 年鲢鱼饲养情况 t a b l e l8t h er e s m to f 商1 v 盯丘s i l b r 【1 i n g j i l t h ey c a r 2 0 0 5 水库 表192 0 0 4 年鳙鱼的饲养情况 t a b l e1 9mr e s u no f b l 曲e a dm l v 廿疗s hb r e e d i n gi i lt h ey e a r2 0 0 4 表2 02 0 0 5 年鳙鱼的饲养情况 t a b l e2 0t h er e s u | to f b i g h e a ds i l v 盯丘出b r c e d i l l gmt h ey e a r2 0 0 5 水库 l 2 3 4 5 6 生物常静卜_ 咣台纽商i 冲小型水庠的生态阚的研究 2 1 5 3 型1 皿- 5 o 2 j爨 4 25 是6 # 水库 吉林农业大学硕士学位论文生物制裁一光台细菌( p s b ) 对中小型水库生态作用的研究 值分别为i7 4 士o2 5 、o9 牡o2 6 、o 9 8 土o1 8 ，1 水库在p s b 泼洒前与对照组4 水库差 异显著，p s b 泼洒后a l k 增加程度达到与4 水库差异不显著。2 、3 水库在p s b 泼洒前差异显著，在p s b 泼洒后二荇a l k 均增加，并且2 水库增加幅度较大，达到 与3 。水库差异不显著。这r 日j 能是由于2 水库较3 水库水浅，更利于p s b 生长。但是 从底质、水深、水质等对于具体哪种类型的水库能使p s b 发挥最大的生态效益则有 待于进一步研究。 41 7 p s b 对水库t h 的影响 t h 是养殖水体生产力的一项重要指标。一般认为t h 的适宜范围是 1 o 3o m 0 1 l 。本试验中试验组水库的t h 值在p s b 泼洒后有较大幅度升高。1 水库 与对照组4 水库在p s b 前差异显著，p s b 泼洒后，1 水库t h 上升到与4 。水库差异 不显著。2 + 、3 + 水库与对照组6