（法医学专业论文）大鼠脑挫伤后βapp和nfκb的表达与损伤时间关系的实验研究.pdf

大鼠脑挫伤后p - a p p 和n f k b 的表达 与损伤时间关系的实验研究 摘要 目的：观察大鼠实验性脑挫伤后不同时间内挫伤灶及其周围组织中的1 3 一a p p 蛋白和n f r b 的表达及其时相性的关系，探讨其表达在损伤时间推断中的可行性，旨为法医实践中推断 早期脑损伤时间提供科学的实验依据。 方法：成年w i s t a r 大鼠6 0 只，随机分为对照组( 6 只) 和实验组( 5 4 只) 。参照f e e n e y s 法建立大鼠脑挫伤模型，分别于伤后1 h ，4 h ，1 2 h ，2 4 h ，2 d ，3 d ，5 d ，7 d ，1 4 d 取脑。运用免疫组 织化学技术( s a b c 法) ，结合计算机彩色图像分析技术观察大鼠实验性脑挫伤后1 3 一a p p 蛋 白和n f - kb 的表达。 结果：免疫组化染色观察，p a p p 蛋白和n f - kb 在正常对照组均为阴性表达。伤后1 h 挫伤 区及周围神经细胞可见1 3 一a p p 蛋白阳性表达增加，4 8 h 达高峰，1 4 d 后恢复正常；脑挫伤 1 h 后，在挫伤灶及其周围皮质即有少量n f kb 阳性细胞，4 8 h 达高峰，7 d 后恢复正常。 结论：1 3 - a p p 蛋白和n f - kb 在正常对照组均为阴性表达或偶见少量表达。大鼠脑挫伤后 p a p p 蛋白和n f kb 表达随着损伤时间呈规律性变化，可望用于法医学鉴定及早期法医学 损伤时间推断。 关键词：脑挫伤，1 3 - a p p ，n f kb ，损伤时间 山西医科大学硕士学位论文 s t u d yo nt h ee x p r e s s i o no fp - a p pp r o t e i na n dn f k ba f t e r c e r e b r a lc o n t u s i o ni nr a t sa n di t si n j u r yt i m e a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oo b s e r v et h ee x p r e s s i o nt r e n do n a p pp r o t e i na n dn f r b i nd i f f e r e n tt i m e a f t e rt h ee x p e r i m e n t a lt r a u m a t i cb r a i ni n j u r yi nr a t sa n dt h e i rr e l a t i o nw i t ht h ew o u n da g e s i n o r d e rt oe x p l o r et h ea p p l i c a t i o nf o re s t i m a t i n gt h ee a r l yt i m eo fb r a i nc o n t u s i o ni nf o r e n s i c m e d i c i n ea s p e c t m e t h o d s ：t h es i x t ys dr a t sw e r ed i v i d e di n t oc o n t r o lg r o u p ( c o n t a i n6r a t s ) a n d e x p e r i m e n t a lg r o u p ( c o n t a i n5 4r a t s ) r a n d o m l y b a s e do nf e e n e y sm o d e lo f c e r e b r a lc o n t u s i o n a n dt o o kt h es a m p l e sa tlh ，4 h ，12 h ，2 4 h ，2 d ，3 d ，5 d ，7 d ，14 da f t e rb r a i ni n j u r y , t h ee x p r e s s i o no f 1 3 - p a ap r o t e i ni nd i f f e r e n tt i m ew a so b s e r v e db yi m m u n o h i s t o c h e m i c a lt e c h n i q u e sa n d c o m p u t e ri m a g ea n a l y s i s t oo b s e r v et h ee x p r e s s i o nt r e n do n - a p pp r o t e i na n dn f - r , bi n d i f f e r e n tt i m ea f t e rt h ee x p e r i m e n t a lt r a u m a t i cb r a i ni n j u r yi nr a t s r e s u l t s ：t h ec o n t r o l - g r o u pw a sn e g o t i v e ，t h ee x p r e s s i o no f1 3 - a p ap r o t e i nc o u l db e d e t e c t e da tl ha f t e ri n j u r y , i n c r e a s e da n dp e a k e da t4 8 h r e t u r nt ot h el e v e lo fc o n t r o la t1 4d t h ee x p r e s s i o no fn f - 1 c bc o u l db ed e t e c t e da tlha f t e ri n j u r y , i n c r e a s e da n dp e a k e da t 4 8 h r e t u r n e dt ot h el e v e lo fc o n t r o la t7 d c o n c l u s i o n ：t h et i m e d e p e n d e n te x p r e s s i o no f1 3 - a p pp r o t e i na n dn f k bi nt h eb r a i n a f t e rb r a i nc o n t u s i o no fr a tc o u l db ea p p l i e di nd a t i n go fw o u n df o rb r a i nc o n t u s i o n k e yw o r d s ：c e r e b r a lc o n t u s i o n ；b e t a a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ( p a p p ) ；n f - kb ； i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yi n ju r yt i m e i i 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中任何 引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他 人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示致谢。 本文如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果： 1 、交回学校授予的学位证书； 2 、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报； 3 、本文按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开 道歉； 4 、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。 论文作者签名： 学位论文版权使用授权书 本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山西医 科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单 位仍然为山西医科大学。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名： 指导教师签名： 日期：年月一日 日期：年月日 ( 本声明的版权归山西医科大学所有，未经许可，任何单位及个人不得擅自使用) 前言 刖吾 损伤时间的推断是法医学检验鉴定的重要内容和任务之一，也一直是法医学界的难点 问题。脑挫伤是法医学鉴定中常见的损伤，因此，对脑挫伤后损伤时间的推断在民事和刑 事案件的侦破中也尤为重要，可为案件侦破和审理提供可信的医学证据。传统脑挫伤时间 的推断方法是以损伤后脑组织常规病理形态学改变为依据u ，但这些脑损伤后常规形态 学的改变往往出现较晚，而且又缺乏明确的时间界限，因而，由此推断的损伤时间往往不 准确。随着医学生物研究领域的拓宽及科研技术手段的提高，人们发现脑损伤后不同时间 段，脑组织中部分生物酶的活性、神经递质的浓度、细胞因子的含量、相关基因的蛋白表 达等，具有一定的时间依赖性，以上生物学特征为早期脑损伤时间的推断研究提供了理论 依据。 近年来很多研究发现，一些神经系统的损伤，如创伤、感染、中毒、轴索损伤及缺血 等，均可影响b 淀粉样前体蛋白( b e t a - a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n , b - a p p ) 表达，国内外已有大量 文献报道，但主要集中于弥漫性轴索损伤( d a j ) 和脑缺血后损伤的研究，少见关于脑挫伤 方面报道。为此，我们应用b a p p 免疫组织化学技术，观察大鼠实验性脑挫伤后在皮质和海 马区表达情况。 细胞核因子1 出是一类普遍存在机体中的细胞转录因子，在许多细胞中均有表达，在脑 组织中的活性相对高于其它组织。在研究暴力性损伤动物模型的脑、脊髓组织细胞和分子 中发现，在修饰神经元变性和康复过程中起着十分复杂的作用。在机体感染、创伤后的免 疫反应、炎症反应及细胞的生长调控等方面也发挥着很重要的作用。核因子r , b 在机体创 伤早期即表达，且有时间上的变化规律，为法医病理学家推测伤后存活时间提供了新思路。 因此，对脑外伤后r , b 表达的研究对法医学判断脑损伤形成时间也有重要意义。 本研究课题应用脑挫伤动物模型，运用免疫组织化学( s a b c 法) 技术，结合计算机 彩色图像分析技术观察大鼠实验性脑挫伤后1 3 - a p p 和n f kb 的表达并探讨在脑挫伤后的 作用机制，研究其与损伤经过时间的关系，为法医学鉴定及早期法医学损伤时间推断提供 实验依据。 山西医科大学硕士学位论文 l 主要仪器试剂 1 1 主要仪器 自制生物撞击机 自动磨刀机( m d j 4 b ) e r m a 切片机 电热恒温浴水锅 电热恒温干燥箱 b i 2 0 0 0 图像分析系统 1 2 实验动物与主要试剂 健康成年w i s t a r 大鼠 免疫组化试剂盒 抗体稀释液 p b s 缓冲液 枸橼酸缓冲液 1 3 a p p ，n f kb 蛋白单克隆抗体 2 实验动物和模型制备 实验部分 天津航空机电公司 e l 王m ao p t i c a lw o r k s l r d 天津航空机电公司 天津泰斯特仪器有限公 成都泰盟科技有限公司 山西医科大学实验动物中心 北京中山生物技术有限公司。 北京中山生物技术有限公司。 北京中山生物技术有限公司。 北京中山生物技术有限公司。 北京中山生物技术有限公司。 2 1 实验动物及分组 健康成年w i s t a r 大鼠6 0 只( 山西医科大学实验动物中心提供) ， 体质量( 2 5 0 1 0 ) g ，雌雄不限，随机分为对照组( 假手术组) ，伤后1 、4 、1 2 、2 4h 和2 、3 、5 、7 、1 4 d 组， 每组6 只。 2 2 大鼠脑挫伤模型制备 参照f e e n e y s 法【7 】建立大鼠脑挫伤模型。大鼠称量后，3 的戊巴比妥钠( 4 0 m g k g ) 腹注射麻醉，大鼠脑立体定位仪固定大鼠头部，正中切开顶部头皮，在人字缝前方3 n u n 、 颅骨中线旁3 n u n 处钻直径为5 n u n 的圆形骨窗。保持硬脑膜完好无损，采用自由落体打击 装置，以4 0g 重锤从2 0c m 高处下落打击。术后动物常规进饮食。 2 3 灌流固定、取材及切片 在伤后不同时间点，大鼠麻醉后开胸，剪开心尖部，以细管穿刺至主动脉并固定，剪 开右心耳，由穿刺管依次灌注生理盐水4 0 0m l 、4 多聚甲醛p b s 液( p h 7 4 ) 5 0 0m l 和2 0 蔗糖p b s 液3 0 0m l 。开颅取脑，矢状面取材。对照组直接灌流固定取材。取材后用4 多聚 甲醛0 1 m o l l p b s 溶液固定( 固定时间2 4 h ) ，常规脱水石蜡包埋，5um 连续切片。 3 研究方法 2 山西医科大学硕士学位论文 3 1 大体观察 处死大鼠后，取出脑，于挫伤区纵向切开，观察挫伤区矢状切面。 3 2 常规h e 染色 脑标本用4 多聚甲醛0 1 m o l l p b s 溶液固定，常规脱水包埋，连续切片，常规h e 染色，光镜下观察形态学改变。 3 3 免疫组织化学染色( s a b c 法) ( 1 ) 分组取材，4 多聚甲醛溶液( 4 ) 中固定2 4 3 6 小时； ( 2 ) 石蜡切片( 厚5 u m ) ，常规脱蜡至水； ( 3 ) 3 过氧化氢孵育1 0 分钟，消除内源性过氧化物酶的活性； ( 4 ) 蒸馏水冲洗2 次，p b s 浸泡5 分钟； ( 5 ) 枸椽酸盐溶液微波修复5 分钟2 次； ( 6 ) p b s 冲洗2 次，浸泡5 分钟； ( 7 ) 滴加封闭用正常羊血清工作液卜2 滴覆盖全部组织块，3 7 孵育2 0 分钟，倾去，勿洗； ( 8 ) 滴加稀释的一抗( b a p p1 ：1 0 0 ，n f kb1 ：1 0 0 ) ，4 过夜； ( 9 ) p b s 冲洗2 次，浸泡5 分钟； ( 1 0 ) 滴加生物素化二抗工作液，3 7 孵育2 0 分钟； ( 1 1 ) p b s 冲洗2 次，浸泡5 分钟： ( 1 2 ) 滴j j i s a b c - f 作液，3 7 孵育2 0 分钟； ( 1 3 ) p b s 冲洗2 次，浸泡5 分钟； ( 1 4 ) 显色剂d a b 显色，镜下观察显色结果； ( 1 5 ) 自来水充分漂洗终止显色，透明、苏木精复染、封片，观察； ( 1 6 ) 阴性对照组除以p b s 液代替一抗外，其余步骤相同。 3 4 图像分析及统计学处理 各组切片均应用b i - 2 0 0 0 图像分析系统对b - a p p 和n f - kb 免疫组织化学染色的阳性反 应物进行定量分析，具体操作为：每张切片在脑挫伤区周围随机选取5 个高倍视野( 放大 倍数x 2 0 0 ，观察窗面积1 2 0 8 5 2 u m 2 ) ，以损伤部位周围出现棕色颗粒为阳性反应，进行 b - a p p 和n f - kb 免疫组化染色阳性细胞记数，所得数据进行实验组与对照组以及各实验 组之间的比较，实验组各时间段的比值，应用s p s s1 1 5 软件包进行方差分析和q 检验，数 据以均数标准差( 孑s ) 表示。 结果 1 大体观察 j f 常对照组脑组织未见异常。实验组大鼠遭打击后，即可见到受损处的硬脑膜呈紫红 色、肿胀取材见大脑硬膜下血肿及蛛网膜下腔出血，切面见撞击侧浅表脑皮质破碎、出 血，脑实质内点状出血，颅骨骨折( 见图a 、圈b ) 。 一 蝻bj 2 常规h e 染色病理组织学改变 正常对照组：人脑皮质神经元呈锥体形或- 角形，神经元细胞形态、结构i f 常，胞核 圆形或椭圆形，监染核仁明显。( 见图1 ) 实验组：脯损伤后6 h 以内受掩击局部的蛛网膜下腔出血，浅表脑组织挫 碎、出血、坏死，j 同侧深部脑组织或侧脑室周围组坌 l 点灶状出血和挫醉，挫伤 灶周围小血管及毛细血管扩张、淤血，组织水肿：神经元和胶质细胞肿胀，胞核 着色浅淡，部分神经兀核深染( 见图2 、3 ) 。伤后1 2 h 一2 4 h 神经细胞肿胀，并出现小圆形 细胞浸润细胞周围划隙增人，神经兀数量减少：伤后3 d ，均以胶质细胞增生为主；肺挫 伤后1 周到2 蒯+ ，见脑挫伤区或形成囊状包裹，或缺失，神经细胞数量明显减少。 3 免疫组织化学染色 3 1b a p p 免疫组织化学染色 镜下对照蛆可见少量b a p p g i | 性表达( 见圈4 ) 。损伤后l h ，在挫伤灶及其周围皮质即 柏少最b a p p i 日性细胞( 见图5 ) 。损伤后4 h ，大脑皮质和皮质下神经核团内神经元可见b a p p 免疫阳件表达f 旦夫脑应质下白质、胼胍体和脑于呈剥阳性表达，主要位丁神经元核周体及 其周围的轴突部位，而细胞核免疫反应呈阴性，轴突出现局部肿胀，肿胀的轴突免疫反应增强 染色较深，表现为节段性免疫反应强弱不等、形奄多样，于纵行纤维内可见条索状或泡状的 轴突直径扩大( 见图6 ) 。损伤厉4 8 h 轴突局部的免瘦阳性反应较伤后4 h 明显增强，栋黄色 颗粒增多，染色加深，免撞反应范闭增大，经典斑块呈丛状或簇状聚集( 见刚7 ) 。7 d 时仍可见 少鑫表达( 见图8 ) ，伤后1 4 d 后挫伤区及其周围组织基本恢复n 一常。 3 2n f k b 免疫组织化学染色 山西医科大学硕士学位论文 镜下可见正常对照组少量n f k b 阳性表达( 图9 ) 。实验组脑挫伤1 h 后，在挫伤灶及其 周围皮质即有少量n f r b 阳性细胞，着色浅，1 2 h 后，挫伤区及其周围灶阳性细胞数量有所增 加，胞核着色程度略深( 见图1 0 ) ，伤后4 8 d 时，阳性细胞数量明显增加，达高峰( 见图1 1 ) 。 伤后3 d ，免疫反应性逐渐减弱，阳性细胞数逐渐减少，但仍高于正常对照组( 见图1 2 ) 伤 后7 d 后挫伤区及其周围组织基本恢复正常。 4 图像分析及统计学处理 4 1 b a p p ，n f - r , b 的图像分析( 表1 ，表2 ) 表1 脑挫伤后p - a p p 阳性细胞计数 t a b l eli b - a p pap o s i t i v ec e l l sc o u n ta f t e re e l e b r a lc o n t u s i o n 注：表示与对照组比较p 0 0 5 山西医科大学硕士学位论文 表2脑挫伤后n f k b 阳性细胞计数 t a b l e 2n f r , bap o s i t i v ec e l l sc o u n ta f t e rc e l e b r a lc o n t u s i o n 注：表示与对照组比较p 0 0 5 6 山西医科大学硕士学位论文 讨论 1 1 i i - a p p 的概述和特性 b 淀粉样前体蛋白( 1 3 - a m y l o i dp r e c u r s o r p r o t e i n ，p - a p p ) 是一种具有受体样结构的大 分子膜整合糖蛋白，相对分子量约为11 0 1 3 0 l 。它包括膜外较长的氨基端、较短的跨 膜区和胞内羧基端。细胞外功能区与k u n i t z 蛋白酶抑制剂( k p i ) 具有高度同源性。p a p p 可在人体大多数细胞中表达，普遍存在于血液和脑脊液中。1 3 - a p p 基因定位于人染色体 2 1 q 2 1 2 。通过选性剪切，可形成至少8 种长度不等的p - a p p 异构体，其中以a p p 6 9 5 、 a p p 7 1 4 、a p p 7 1 0 较为常见。a p 7 5 1 、a p p 7 7 0 皆含有k p i 功能区p j 。a p p 6 5 9 在神经元特 意表达，a p p 7 7 0 主要见于a d 患者，其他异构体则广泛表达。对p - a p p 的生理功能尚不 完全清楚，正常情况下广泛表达于大多数细胞，以神经元和星形胶质细胞中含量较丰富， 主要经非淀粉样蛋白生成途径水解，促进神经细胞生长分化、增加神经突触的可塑性、参 与信号转导、促进细胞黏附、神经保护作用p j 。在机械性损伤，缺血缺氧、兴奋性毒素等 引起的脑损伤后，b - a p p 可作为一种快速反应性蛋白而诱导增高，或者由于b a p p 的轴 突运输被打断，而出现b a p p 的聚集。 1 2 口a p p 在脑挫伤中的作用 神经元损伤是否可逆与细胞骨架的变化密切相关。神经细胞骨架是维持轴突正 常形态、结构和功能的重要亚细胞结构。超微结构研究显示，脑损伤后神经元和神 经轴突的细胞骨架崩解是脑组织创伤反应一种重要特征。有学者认为， 3 - a p p 是 沿微管蛋白通过快速顺性轴浆运输传送。外伤性脑损伤导致的细胞骨架崩解、细胞 轴浆流动停止是p - a p p 在轴突积聚的一个重要原因，同时，1 3 - a p p 含量的变化还 受到损伤、炎症过程中多种生物活性成分( 如i l 1 、f o s j u n 、c a 2 + 、c a m p 等) 的影响 1 2 - 1 5 】。目前， 3 - a p p 主要被应用于弥散性轴索损伤的早期诊断【16 1 ，用于脑挫伤相 关的文献报道较少。b r a m l e t t 等川利用免疫细胞化学方法，定量测定了外伤性脑损 伤( t b i ) 后大脑局部轴突损伤1 3 - a p p 的变化。发现在伤后2 4 h 内，在受伤部位1 3 - a p p 免疫反应阳性的轴突数量明显增多，并在伤后的生存期继续升高。在纹状体背外侧 p - a p p 免疫反应阳性的轴突，在2 4 h 内增加，并随生存时间的延长而逐渐下降。相 反，脑室中p - a p p 在受伤后初期较低，但在伤后7 天明显增多。但是g r a h a m 等6 j 通过对6 3 例致死型外伤性脑损伤者，应用1 3 - a p p 免疫组织化学染色观察后，发现 神经元p - a p p 染色阳性率超过7 0 。o e h m i c h e n 等刈通过用脑桥部位 3 - a p p 抗体 免疫组化检测来衡量轴突损伤( a i ) 时发现原发性脑损伤和由脑缺血缺氧引起的继发 性脑损伤中轴突损伤无明显差别。 1 3 p - a p p 与脑挫伤时间关系 国内外已有部分学者在d i a 实验模型中，探讨伤后d - a p p 的表达情况。有学者 7 山西医科大学硕士学位论文 发现脑挫伤后1 3 - a p p 在3 h 呈明显阳性表达，1d 达到高峰，3 d 后逐渐减弱，1 4 d 基 本恢复正常m 。m u r a k a m i 等卜u 用蛋白印迹分析显示，弥漫性轴索损伤后2 9 h ，1 3 - a p p 表达增加，免疫组化结果显示皮质在伤后2 4 h - - 7 d ，1 3 - a p p 表达显著增加，海马区 1 3 - a p p 在伤后2 4 h - - - 3 d 积聚于c a 3 区。有人在沙鼠短暂性前脑缺血模型中发现，伤 后2 4 h 海马c a l 区1 3 - a p p 免疫标记的神经元数量减少，2 d 后突然表达增加，7 d 后 又减少m 引。陈艳听等m 刈在人脑缺血的海马中研究发现，1 3 - a p p 在缺血2 h - - 一6 h 组表 达明显，4 d 组达高峰；4 d 以后下降，但仍高于对照组。 本实验研究发现，在正常脑组织和神经元中表达的i b - a p p 主要位于轴突内，主要 用于促进神经元突起长出和突触发生作用，这一点和m i l w a r d 等弘叫报告的1 3 a p p 在培 养的p c i 2 细胞中具有增加神经元突起的延长和分支的作用相符。伤后l h 且l j 可观察到 1 3 - a p p 蛋白表达增多，这表明i b - a p p 作为一种快速反应性蛋白而诱导增高，可能起一 种脑保护作用。全长的1 3 - a p p 及其分泌性n 端衍生物( a p p s ) 能保护神经元免受兴奋性 毒性的损害。4 h 后明显增高并于4 8 h 达到高峰，增多的1 3 - a p p 位于肿胀的轴索和营养 不良的神经元轴突和神经元核周体中，外伤性脑损伤导致的细胞骨架崩解、细胞轴浆 流动停止是1 3 - a p p 在轴突积聚的一个重要原因，所以多数学者认为1 3 - a p p 是轴突损 伤和断裂很好的标志物m 川。高浓度的人类1 3 a p p 能诱导p c i 2 细胞神经突触的生长， 低浓度的b a p p , 0 能增强神经生长因子的神经营养活性。实验结果表明大鼠脑挫伤后 大脑皮质内1 3 - a p p 蛋白表达具有时序性规律，有望成为今后法医学推断脑损伤时间 的客观规律之一。 2 1n f r , b 的概述和特性 细胞核因子1 c b( n u c l e a rf a c t o r k a p p ab ，n f r b ) 是真核细胞的核转录因子。 1 9 8 6 年s e n 和b a l t i m o r e 首先发现它是b 淋巴细胞中免疫球蛋白k a p p a 轻链转录所 需要的转录因子，故命名为n f r b 。后发观n f r b 不仅存在于b 淋巴细胞，而且普 遍存在于真核细胞。n f 1 c b 是r e l 蛋白家族成员，目前发现哺乳动物细胞中有p 5 0 、 p 5 2 、r e l a ( p 6 5 ) 、r e l b ( p 6 8 ) 和c r e l ( p 7 5 ) 五种n f 1 cb r e l 蛋白。p 5 0 和r e l a 形成 的异源二聚体( p 5 0 r e l a ，即通常所称的n f r b ) 最常见，活性最高，几乎存在于所 有细胞中m 叭。大量的刺激因素如促炎性因子( ，r n f a ，i l 1 b ，i l 2 ，i l 6 ，i l 8 ) 、t 细 胞和b 细胞激活抗原等均能激活n f 1 c b 和它的靶基因m 川。炎性因子活化膜受体， 继之活化i k k ( n f k b 抑制蛋白激酶) ，分子构象改变，n f k b 进入细胞核调节特异 基因的转录。n f k b 受多种刺激因素激活后入核内发挥其转录调节因子的功能。功 能性n f r b 存在于神经系统的各种类型的细胞中，包括神经元、星形胶质细胞、小 胶质细胞、少突胶质细胞弘o 。近年来n f r b 在损伤、免疫学和肿瘤等领域都展开 了广泛的研究，成为又一个备受瞩目的研究热点。 2 2 n f r , b 在脑挫伤中的作用 8 研究证实有许多种促炎细胞因子在脑损伤后高度表达，并与脑损伤严重程度密 切相关 2 9 】。而n f x ：b 活化是机体效应细胞大量释放促炎细胞因子，导致组织炎症 反应过度和组织损伤的关键环节p 。n f k b 是一种具有多向性转录激活功能的调节 因子，可以被多种刺激因素或刺激物激活( 如应激、炎症、氧自由基、细胞因子等) ， 其主要作用是调控编码多种细胞因子、趋化因子、生长因子、细胞粘附分子、免疫 受体、氧化应激相关酶、转录因子、急性时相蛋白等) 参与免疫、炎症、细胞凋亡等 生理和病理过程中的基因表达调控p 。诱生型n f 1 c b 主要由p 5 0 和p 6 5 两亚基以 同源或异源二聚体形式组成的一组真核细胞转录因子p 川。在正常生理状态下， n f k b 与其抑制因子i x ：b 蛋白家族中成员相结合而滞留于细胞质中，不具有转录活 性p 川。当细胞受到刺激，启动细胞第二信使系统，1 1 c b 磷酸化及泛素化，发生降解 并与n f 1 c b 解离，n f k ：b 激活，由胞质移位至胞核p 制，与d n a 上的启动子区域相 应靶基因位点结合，从而启动一系列免疫和炎症反应相关基因的转录程序，诱导众 多细胞因子，如白介素1 、白介素6 、白介素一8 、等的高度表达。n f - k b 分布于多种 细胞中，在神经系统中也广泛存在l j 川。n o n a k a 等l 3 0 j 报道，在创伤性脑损伤大鼠中 大脑皮层n f x ：b 活性在伤后数小时内显著增高，并至少持续2 4 h 维持在高水平状态。 2 3n f k b 与脑挫伤时间关系 n f r j 3 是应激和炎症基因表达最重要的介质之一。n f r j 3 活化在中枢神经系统发挥 重要作用，特别是在新大脑皮质、嗅球、杏仁核、海马p 。机体在受创伤后早期，n f 1 出 即被活化参与炎症和急性期反应。n o n a k a 等l - s j 发现n f 心活性水平在大鼠t b i 后1 2 h ， 即在大脑皮层增高并持续至少2 4 h ，活化的n f 1 出首先出现在轴突，2 4 h 后在神经元中出 现并持续l 周。小鼠实验性脑烧伤后2 d ，n f 1 国即在损伤组织的单核细胞中表达，伤后 4 8 d 出现在损伤周围的星形胶质细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞p 引。在脊髓损伤中， 神经元、胶质细胞及损伤的邻近组织中n f r ：b 和i n o s 表达也增加，可见n f 1 c b 在创伤 后起重要作用。y a n g 等一w 在大鼠t b i 后1 、3 、5 、7 d ，观察受损伤皮质部位的细胞，发 现其n f r , b 活性增加，在第3 d 达高峰，1 0 d 后逐渐恢复。s a n z 等一u 研究发现9 d 龄的大 鼠实验性脑皮质损伤后，n f 1 c b 活性迅速激活，在损伤后2 4 h 达最高峰。 本实验研究发现大鼠脑挫伤l h 后n f 1 c b 即有表达，2 4 4 8 h 达高峰，1 周后表达下降基本 恢复正常。阳性细胞集中于挫伤区及周围带皮质和脑实质内海马区，不同程度脑挫伤组之 间伤后各个时间段n f 1 出表达无明显差异。从而认为脑组织中n f k b 表达增加可辅助诊断 脑挫伤的存在。该指标在蛋白水平的表达不受损伤程度的影响且有时间上的变化规律，故 对确定脑挫伤形成时间有意义。 9 山西医科大学硕士学位论文 结论 1 p - a p p 蛋白和n f r , b 在正常脑组织中不表达或偶有少量表达，脑挫伤后，在挫伤 灶及周围脑组织有i b - a p p 蛋白和n f r , b 的表达增高的表现。 2 f ；- a p p 蛋白和n f r , b 在正常对照组不表达或偶有少量表达。脑挫伤后挫伤区及周 围神经细胞可见p - a p p 蛋白和n f r b 阳性表达增加，b a p p 蛋白和n f r b 参与了脑挫伤 后细胞的损伤；脑挫伤后 3 - a p p 蛋白和n f k b 表达的时序性变化规律可作为判断脑挫伤 形成时间的指标。 1 0 山西医科大学硕士学位论文 参考文献 1 】张益鹄法医病理学理论与实践【m 第l 版武汉湖北科技出版社，1 9 9 6 ：6 9 8 7 2 】p e r p e rj a ，w e c h tc h m i c r o s p i cd i a g n o s i si nf o r e n s i cp a t h o l o g y j c h a r l e s ，1 9 8 0 ：1 7 3 3 【3 】赵经隆法医颅脑损伤【m 】增修版北京：群众出版社，1 9 8 6 ：5 3 1 5 5 4 】 王慧君，秦启生脑损伤时间推断研究新进展【j 】法医学杂志，1 9 9 9 ，1 4 ( 4 ) ：2 5 0 2 5 2 【5 】 周亦武，张益鹄，邓伟年，等8 7 例大脑及脑干挫伤h s p 7 0 变化的研究 j 】中国法医 学杂志，2 0 0 5 ，2 0 ( 4 ) ：2 0 9 2 1 2 【6 】 郭学荣，周亦武，章诗伟，等大鼠脑挫伤后脑组织c o x i c o x - 2 的表达【j 】中国 法医学杂志，2 0 0 4 ，1 9 ( 4 ) ：2 1 0 2 1 2 【7 】f e e n e yd m ，b o y e s o nm g ，l i n nr t ，e ta 1 r e s p o n s e st oc o r t i c a li n j u r y ：i m e t h o d o l o g y a n dl o c a le f f e c t so f c o n t u s i o n si nt h er a t j b r a i nr e s ，1 9 8 1 ，2 11 ( 1 ) ：6 7 7 7 【8 】 c o u l s o ne j p a l i g ak ，b e y r e u t h e rk , e ta 1 w h a tt h ee v o l u t i o no ft h ea m y l o i dp r o t e i n p r e c u r s o rs u p e r g e n ef a m i l yt e l l su sa b o u ti t sf u n c t i o n j n e u r o c h e mi n t e m a t i o n ，2 0 0 0 ， 3 6 ：1 7 5 1 8 4 9 m a t t s o nm p c e l l u l a ra c t i o no fb e t a - a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i na n di t s s o l u b l ef i b r i l l o g e n i cd e r i v a t i v e s j p h y s i o lr e v ，1 9 9 7 ，7 7 ( 4 ) ：10 81 113 2 【9 】唐文渊，孙晓川。颅脑损伤基础及临床研究的一些进展【j 】创伤外科杂 志2 0 0 2 ；4 ( 2 ) ：6 5 6 7 1 0 】l e c l e r c q p d ，s t p e h n e s o n m s ，m u r r a yl s ，e ta 1 s i m p l em o p r h o m e t r y 【1 1 】o fa x o n a ls w e l l i n gc a n n o tb eu s e di ni s o l a t i o nf o rd a t i n gl e s i o na f t e rt r a u m a t i cb r a i ni n j u r y i nr a t s j jn e u r o t r a u m a ，2 0 0 2 ；1 9 ( 1 0 ) ：11 8 3 - 11 9 2 【12 】a m a r af m ，j u n a i d ，a ，c l o u g hp r ，e ta 1 t g f - b e t ar e g u l a t i o no f 【13 】a l z h e i m e ra m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i nm r n as t a b i l i z a t i o n r e s ，m o l 【1 4 】b r a i nr e s 1 9 9 9 ；7 1 ( 1 ) ：4 2 【1 5 】c h e ns t ，j e n ，ag e n t a l m a n s m ，e t a 1 e f f e c t so f b f g fa n dt g f b e t a 16 】o nt h ee x p r e s s i o no fa m y l o i dp r e c u r s o ra n dbc e l ll y m p h m o a 【17 】p r o t o - o n c o g e np r o t e i n si nt h er a tr e t i n a n e u r o r e p o r t19 9 9 ：10 ( 3 ) ：5 0 9 【18 】y a n gy ，q u i t s c h k ew w ，b r e w e rg j u p r e g u l a t i o no fa m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i ng e n e p r o m o t e ri nr a tp r i m a r yh i p p o c a m p a ln e u r o n sb yp h o r b a le s t e ，i l - 1a n dr e t i n o i ca c i d ，b u t n o tb yr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r e sm o lb r a i nr e s ，1 9 9 8 ：6 0 ( 1 ) ：4 0 【19 】r i n g h e i mg e ，a s c h m i e ss , p e t k ow a d d i t i v ee f f e c t so fb a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o ra n d p h o r b o le s t e ro nb e t a - a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i ne x p r e s s i o na n ds e c r e t i o n n e u r o c h e m i s r y i n t e r n a t i o n a l ，19 9 7 ；3 0 ( 4 5 ) 4 7 5 【2 0 】朱金龙，朱少华，任亮，等大鼠弥散性轴索损伤后b a p p 的表达【j 法医学杂志， 2 0 0 5 ，2 1 ( 3 ) ：1 6 5 1 6 8 山西医科大学硕士学位论文 【21 】b r a m l e t th m ，k r a y d i e hs ，g r e e ne j ，e ta 1 ab e t a - a r n y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n i m m u n o c y t o c h e m i c a ls t u d yi nr a t s jn e u r o p a t h o le x pn e u r o l ，1 9 9 7 ，5 6 ( 1 0 ) ：11 3 2 11 4 1 【2 2 】g r a h a md i ，s m i t hc ，r e i c h a r dr ，e ta 1 t r a i l sa n dt r i b u l a t i o n so fu s i n gb a t a - a m y l o i d p r e c u r s o rp r o t e i ni m r n u n o h i s t o c h e m i s t r y t oe v a l u a t et r a u m a t i cb r a i n i n j u r y i n a d u l t s j f o e n s i cs c i e n c ei n t e r n a t i o n a l ，2 0 0 4 ，1 4 6 ：8 9 - 9 6 【2 3 】o e h m i c h e nm ，m e i s s n e rc ，s c h m i d tv ，e ta 1 p o n t i n ea x o n a li n j u r ya f t e rb r a i nt r a u m aa n d n o n t r a u m a t i ch y p o x - i s c h e m i cb r a i nd a m a g e i n tj l e g a lm e d ，19 9 9 ，112 ( 4 ) ：2 61 - 2 6 7 【2 4 】朱金龙，朱少华，任亮，等大鼠弥散性轴索损伤后1 3 a p p 的表达 j 】法医学杂志， 2 0 0 5 ，2 1 ( 3 ) ：1 6 5 1 6 8 2 5 】m u r a k a m in ，a m a k it ，1 w a m o t oy ，e ta 1 e x p e r i m e n t a lb r a i ni n j u r yi n d u c ee x p r e s s i o no f a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ，w h i c hm a yb er e l a t e dt on e u r o n a ll o s si nt h eh i p p o c a m p u s j j n e u r o t r a u m a ，1 9 9 8 ，15 ( 11 ) ：9 9 3 1 0 0 3 【2 6 】h a l l e d ，o o s t v e e nj a d u r me ，e ta 1 i c r e a s e d a m y l o i dp r o t e i np r e c u r s o ra n d a p o l i p o p r o t e i nei m m u n o h i s t o c h e m i s t r yi nt h es e l e c t i v e l yv u l n e r a b l eh i p p o c a m p u s f o l l o w i n g t r a n s i e n tf o r e b r a i n i s e h e m i a i n g e r b i l s j e e