（果树学专业论文）柑橘及其近缘属植物分类与进化关系的cpDNA分析.pdf

摘要 柑橘及其近缘属植物分类与进化关系的 c p d n a 分析 硕士研究生：鲁振华 指导老师：周志钦教授 摘要 柑橘属( “友s ) 由林耐1 7 5 3 年订立，系芸香科( r u t a c e a e ) 柑橘哑科( a u r a n t i o i d e a e ) 植物。在过去2 5 0 余年的时间里国内外学者对柑橘属植物的分类和系统发生关系从形态到分 子开展了一系列研究。然而，现有的柑橘分类系统在属划分和种的数目等问题上分歧依然 很大。柑橘属植物系统进化的基本框架( 即原始野生类型的种类、起源及其系统进化关系) 迄今仍不清楚。s w i n 9 1 e ( 1 9 4 3 ) 年，根据雄蕊数目及汁胞构造将柑橘及其近缘的五个属，枳 属( 胁c j ，淞) 、金柑属( 胁f 册p j 儿) 、澳枳檬属( 鲋c 肋c j 咖由、澳砂檬属( 点h 肋c jt 埘曲、 多蕊檬属( a 朋鲫妇) 一起划分到真正柑橘果树类。由于柑橘芽变、栽培历史悠久以及与近缘 属之间的有性杂交等因素，柑橘及其近缘属植物之间的分类和系统进化关系迄今仍无定论。 柑橘类果树具有很高的经济价值，准确地弄清柑橘属的分类及其与近缘属植物之间的系统进 化关系，对柑橘属植物的遗传育种、种质资源的深入研究、保护和利用都具有重要的理论和 实践价值。 植物叶绿体基冈组分子量小、进化相对保守、单亲遗传、在绝大多数被子植物中是分析 母系遗传关系的理想数据。本论文以九里香属( f l f 2 z r r a 阳) ，酒饼勒属( 彳细j 朋t 妇) 和蚝壳 刺属( 融陀订刀妇) 作为外类群，对真正柑橘果树类3 0 个生物型的3 个叶绿体d n a ( c p d n a ) 片断( 尸鲥卜忍出，砌】l 一7 拼和7 塌一7 啪) 进行了序列分析，并用利用p a u p 幸v e r s i o n4 o b l o 软件构建了最大简约树。最后得到的严格一致性树表明，真正柑橘果树类的六个属构成单系 类群，得到1 0 0 的统计支持。在真正柑橘果树类内部6 属植物形成四个分支：( 1 ) 枳属 ( 户咖c j 川s ) 的三份材料形成一分支，得到1 0 0 统计支持；( 2 ) 金柑属( 胁 册p j 厶) 的全 部材料形成一独立的分支，得到1 0 0 统计支持：( 3 ) 沙橘( e a ，c a ) 、圆果指橘( 彪a 口s 芒r a j s ) 、 两南人学硕十学位论文 多蕊檬( c 秒p d 纱口刀d r 口) 、 枸橼( cm p 舭口) 和佛手( 历p 以ca v a r 鳓 d 出c j s ) 形成 一分支，得到1 0 0 统计支持；( 4 ) mn “s 肌l 五籍把口和剩余柑橘属植物构成一支，得到9 7 的统 计支持。最后，我们对柑橘及其近缘属植物间的系统进化关系进行了详细的讨论。 关键词：芸香科；柑橘亚科；真正柑橘果树类；c p d n a ；分子谱系 l i 独创性声明 学位论文题目挝插丞墓遁丝屉植物盆差曼进丝差丕的鱼卫巡盆盘 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南大学或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者字日期： 2 0 0 8年厂月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段猓存、汇编学位论文。 7 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：蛴保密，口保密期限至 年月止) 。 学位论文作者签名：酩 签字日期：獬年莎月多日 工作单位： 通讯地址： 茹譬旎日 签字日期： 锄年6 月( ) 日 邮编： 听南人学硕十学位论文 橙、枳等柑橘种类都有记载。而且很多古籍对于品种的概念也有详尽的阐述。特别是橘录 对树形、枝叶和果实等作了详细的描述，并提出了命名的依据和品种的区域化问题。对种间 的区别，古籍上也同样有精深的见解。如柑和橘的区别，群芳谱( 公元1 7 世纪) 载有：“柑 树似橘少刺，实亦似橘而圆大，皮未经霜犹酸，霜后始熟。子味甘甜，故名柑也。皮色生青 熟黄，比橘稍厚，理稍粗而味不苦。橘实可久留，而柑实易腐败。柑树畏冰雪，橘树犹稍 耐。此柑橘之异也”。这些区别与现在的分类标准，在很多方面是一致的 7 】。这些记载表明了 中国柑橘栽培的历史悠久。 我国又是柑橘的重要原产地之一，柑橘的资源十分丰富，有世界柑橘资源宝库的美称。 从云贵高原到东南海滨，从南疆的华南到柑橘北缘的陕、甘、豫、晋都有柑橘资源的发现， 有的还十分珍贵。枳原产于我国，广泛分布于西南和中南各省区，甚至陕、甘、晋、鲁、豫 各省都有分布。宜昌橙野生于我国大巴山、武当山、巴东三峡、云贵高原、娄山、雪峰山和 武陵山脉，2 0 世纪8 0 年代广两苗儿山也有发现。香橙伴生其间。云南红河大翼橙和湖南道县 等地野生橘的发现，更为我国柑橘资源宝库增光添彩。南岭和武夷山脉野生的山金柑、海南 岛的长叶金柑都是可贵的资源【5 】。 文献表明，柑橘传入欧洲最早在公元前3 2 0 年，由阿拉伯商人将原产予东南或中国的 枸橼经中亚传至希腊和古罗马，然后传遍欧洲。酸橙于9 2 2 年由阿拉伯人传入阿拉伯，然后 传入巴勒斯坦和埃及。甜橙和柠檬是1 0 一1 5 世纪由阿拉伯人从印度传至伊朗，再传至巴勒斯 坦、南非洲、西班牙和意大利。直至1 6 世纪在欧洲始盛栽培。原产中国的宽皮柑橘，向南向 东南哑和印度扩展，向东传至日本和朝鲜。1 0 世纪时日本南部已有广泛种植，至1 5 世纪，由 原产我国浙江的本地广橘引至日本鹿儿岛，产生实生变异“温州蜜柑”，对日本、其后对中国 乃至世界宽皮柑橘的生产发展产生巨大影响。宽皮橘传入欧洲甚迟，1 8 0 5 年英人始自广州带 两种至伦敦。金柑至1 8 4 8 年才从浙江传到欧洲。美洲柑橘是由两班牙人在1 7 0 1 年传去的。 总之，目前世界柑橘种类品种丰富多彩，美不胜收，但追本溯源，其原种大半传至我国，少 数出自印度，因之我国可称之为世界柑橘的主要发祥地【6 】。 1 2 真正柑橘果树类植物的分类与进化研究进展7 柑橘属( d 舰s ) 及其近缘的五个属金柑属( 而，m 行胡a ) ，澳枳檬属( 舭r d c f f r 淞) ，澳砂 檬属( 西啪d c f 触s ) ，多蕊檬属( 跏”朋缸) 、枳属( 尸d 以c f ，铘) 一起属柑橘亚族( c i t r i m e ) ， 柑橘族( t r i b ec i 眈a e ) ，柑橘哑科( s u b 鼠【i l i l ya u 捌1 t i o i d e ) 芸香科( r m a c e ) i l l os w i i l g l e ( 1 9 6 7 ) 根据果实汁胞高度特化和雄蕊数为花瓣数的四倍以上及相似的汁囊等，将这六个属 一起划分为真正柑橘果树类。其中，枳属( 尸o 力c f ，粥) 、金柑属( ，d ，m 以p 妇) 和柑橘属( c f 们憾) 被认为起源于中国【8 】，澳枳檬属c r d c f 们岱) 、澳砂檬属m d c 加凇) 、多蕊檬属( c 册删胁) 分 布于澳火利亚、新西兰和新几内亚【8 1 。由于柑橘果树的重要经济价值，过去的四十多年里，许 多学者对柑橘及其近缘属的分类、进化展开了研究。如：根据形态学数据，s 、i n g l ea n dr e e c e 2 文献综述 ( 1 9 6 7 ) 和t a n a k a ( 1 9 7 7 ) 【9 1 讨论了柑橘及其近缘属可能的系统发生关系。周忐钦( 1 9 9 1 ) 【i o 】 用形态学性状分析了真正柑橘果树类间的系统发生关系，认为真正柑橘果树类的直接祖先， 首先发生一次分裂形成二类群：一群是金柑属、柑橘属和多蕊檬属的共同祖先，另一群是枳 属、澳砂檬属和澳枳檬属的共同祖先，柑橘属与多蕊檬属亲缘关系最近。m o r t o ne ta 1 ( 2 0 0 3 ) 刚 通过对c p d n a 序列的分析，认为真正柑橘果树类为单系发生。加砸j o 等( 2 0 0 3 ) 】利用c p d n a 序 列分析了柑橘族植物的系统进化关系，m p 和n j 树均显示真正柑橘果树类为单系发生且获得较 高的统计支持值。 枳属分布于中国的北部。因其落叶性和花期的差异，s 、i n g l e 把枳属从柑橘属中独立出来， 恢复了其属的地位，并认为它是一个以孤立状态存在于柑橘果树群中。f e d 嘶c i 等【1 2 】利用r h j 和r a p d 分子标记研究了柑橘属及其近缘属的系统发生关系，认为枳属与柑橘属之间的关系比 蚝壳刺属或澳枳檬属与柑橘属之间的关系要远。根据形态特征，m a b b e r l e ，”】建议将澳枳檬属 和澳砂檬属重新归类到柑橘属中。花粉超微结构观察，同功酶分析研究发现，澳枳檬属 与柑橘属间存在着密切的亲缘关系。在形态性状的分支分析中，与该澳圆檬属和澳砂檬属地 理分布近缘的多蕊檬属被认为是柑橘属的姊妹群【1 0 1 。s s r 分子标记【1 6 】研究也表明多蕊檬属与 柑橘属间存在亲密关系，从地理分布上看，在多蕊檬属和金柑属的分布区域内，均有柑橘属 分布，但却未有枳属、澳枳檬属和澳砂檬属。1 9 1 5 年s w i n g l e 建立了金柑属l l 。s w i n 酉e 锄d r e e c e ( 1 9 6 7 ) 认为金柑属和柑橘属在形态上存在明显的差异，认为真正柑橘果树类中，金柑属 是最单一和原始的属，而柑橘属代表了最高级进化类型【l l 。这一观点得到c p d n a 证据的支持 【1 8 1 。但是，同功酶学研究结果表明，金柑属分支存在柑橘属中【1 5 1 9 】。i 江l p r a p d ，s c a r 分子 证据也显剥”，1 8 】，金柑属都不能与柑橘属分离。而c p d n a 数据1 8 1 能明显的将柑橘属和金柑属 分离。由此看来，真正柑柑果树群6 属植物间关系错综复杂，有待进一步研究。 1 3 柑橘属植物分类与进化研究进展 1 3 1 柑橘属植物的分类系统 s w i n g l e 将柑橘属划分为二亚属。第一亚属为大翼橙亚属( 尸印砒) ，包括6 个种；第二 亚属为真止柑橘属( 励c 咖姗) ，包括1 0 个种，共计1 6 个种并被称为大种分类系统【l l 。与 s w i n g l e 不同的分类系统是t a k a n a 小种分类系统，他将柑橘分为原生柑橘属( 么砌缸打s ) 及后生柑橘亚属( 朋叠细c f f 埘s ) ，其中原生柑橘亚属分为五区，即大翼橙区( ， a p p 幽) 、莱檬区 旺咖d 甩p 盯淞( r u m p h ) 1 h a k a 、枸橼区 a 舭脚d 朋甩( n e c k e r ) 1 锄a l 【a 、柚区( c 印j i l 口正d c f 仇岱 1 狄觚a ) 及橙区l 4 ”，口刀砌珑( t o 啪) 1 狄柚a ；后生柑橘贬属又分为三个区，即香橙区( 伽肌d c f f n 岱 1 酞勰a ) 、蜜柑区队c 朋m 删( g a l l e s i o ) t 觚a l c a 、金橘区( 风p “出膨，m 船砌1 觚a l ( a ) 。这八个区下 面再分为2 0 个亚区，有类、亚类和品类等次级分类单位，共有2 8 个基本型，包括1 5 9 种和 1 4 个变种【9 1 。对于这两个分歧很大的分类系统，美国的豪德逊提出了一个折中分类系统，它 包括施文格分类系统中柑橘属全部的1 6 个种，另加田中长三郎分类系统的2 5 个种共计4 l 3 两南人学硕十学位论文 种m 2 。 我国著名的柑橘分类学家曾勉( 1 9 6 0 ) 提出将旧的柑橘属分为大翼橙属( 脚e 出 ( h 嬲s k 砌) 1 孤a l 【a ) ( 6 个种) 、枸橼属( o 肋疗l i i l l l ) ( 4 个种) 、柚属( c 印 口，d c f 舰s ( a k a ) t s e n g ) ( 2 个种) 、橙属( 彳“r 口，l 砌mm i l l e r ) ( 2 个种) 、和柑橘属( s 跏d c 豇础st s e n g ) ( 1 6 个种) 、 共5 个属，3 0 个种2 2 1 。另外，西南大学蒋聪强教授( 1 9 8 3 ) 按照花、果实及种子的1 1 个主要 形态性状将柑橘三属，即柑橘属( c f 加s ) 、枳属( 尸i d n c 打伽) 、金柑属( 肋，m 力e 池) 划分为左 右线，用各类型在左右线上的位置代表它们的演化关系，最上为枳属，右线下为金柑属，柑 橘属居中而分左右线。左线代表柑橘属的原生柑橘亚属( 彳砌f c f f ，螂) ，包括( 按演化顺序排 列) 大翼橙类( r 矽p 妇) 、枸橼类( c f f 叩j i l d ，聊1 ) 、柚类( c 印i i l 口，d c f 触s ) 及橙类( 彳“r 口肋沁m ) 四类；右线代表柑橘属的后生柑橘属( 朋匆缸c f 仉岱) 即宽皮柑橘类( 跏l d c f 仉岱) ，包括( 按演 化顺序排列) 香橙亚类( 傀m d c f 办粥) 、橘亚类( 施c r d 口c ，聊l 删) 、柑亚类( 肘口c m 口c 删m 绷) 及 金橘弧类( 风p ”如励，m ，l e 耽) 【2 3 1 。从上述可以看出，目前主要的柑橘分类系统在亚属的划分、 物种的数目以及各主要类型的关系等一系列问题上分歧仍然很大。 1 3 2 重要生物类型的分类和进化关系研究进展 1 3 2 1 大翼橙类 周忠钦( 1 9 9 2 a ) 对柑橘属2 4 个分类群进行形态学分支分析，结果表明柑橘属内有5 个单 系类群，即马蜂柑( c 枷触) 、枸橼类( a 舭p d 朋m ) 、柚类( c 印i i l 口如c f 肌岱) 、宽皮柑橘类 ( 彳c 朋肼绷) 和橘哑类( 朋i 彻n c 删加p 玎) 【2 4 1 。其中，大翼橙是柑橘属植物中最原始的类型【2 3 9 2 2 1 ， 并逐渐演化成莱檬、柠檬、柚、橙、柑、橘等，田中【9 1 的假说认为，柑橘是3 千万年以前起源 于亚洲的，起源于马蜂柑、卡西大翼橙、美拉尼西亚大翼橙和越南大翼橙4 个生物型。庞晓 明以s s r 聚类图分析，发现马蜂柑与黎檬、来蒙关系密切，卡西人翼橙和红河橙与柚关系密 切，胡春根2 5 1 也有类似佐证。另外，人翼橙类与宜昌橙关系复杂，d n a 分子证据显示人翼橙可 能不是一个单系类群阱5 1 。t a n a k a ( 1 9 7 7 ) 认为，真正柑橘亚属的来檬( c 口“朋哟归砌) 由大 翼橙演化而来【9 1 。肖尊安( 1 9 8 4 ) 提出枸橼和柚可能来源于大翼橙1 0 8 1 ，并得到细胞学、化学 分类学以及d n a 分子证据的支持【1 2 蕊2 7 1 。上述研究报道表明，大翼橙是柑橘属植物的原始野生 类型。但同工酶和形态学证据都表明宜昌橙也是柑橘属植物中一个非常特殊的原始野生类型 【2 蚋。 1 3 2 2 宜昌橙 宜昌橙类主要有三个种或杂种：宜昌橙、香橙( c 珈刀傩s i e b e x t 锄a k a ) 、香圆( c w f 豇d 刀甜 t 柚a l 【a ) 。宜昌橙的植物学地位一直是分类学家的争论焦点，施文格以翼叶的大小，果实汁胞 含有苦油点等特征，将宜昌橙与大翼橙同归一类，均划为比较原始的种。而田中长三郎根据 宜昌橙为单花，无花序将宜昌橙列入较进化的柑橘类群( 后生柑橘亚属) 。叶荫刚2 9 1 通过对花 4 文献综述 粉形态的分析，认为宜昌橙和枸橼都是柑橘属中比较原始的种，但沿着不i 聪途径发展。方 德秋等吲以同工酶分析提出将柑橘属分为大翼橙亚属、宜昌橙亚属和柑橘弧属共包含七大类的 观点，将宜昌橙与大翼橙同列为亚属。钟广炎等【3 川分析8 个宜昌橙生物型，在随后的数值分类 研究中，q 分析表明宜昌橙远离柑橘属其他种类，与红河大翼橙也有很大不相似性，认为宜昌 橙可能是独立发生的古老种，其结果支持方德秋的观点。柑橘属植物中真正原始野生类型的 种类和数目仍无定论【2 ，3 l 】。 1 3 2 3 枸橼类 枸橼类包括枸橼( cm e d f c nl ) 、柠檬( c ，蛔d nb 嘲) 、黎檬( c 矗m d n 妞o s l ) e c k ) 、来 檬( c 口“朋玎f 扣，f 口s w i n g l e ) 等。方德秋等【2 1 认为枸橼和宽皮柑橘参与了红黎檬的起源，庞晓 明等【1 6 ，3 2 谰a f l p 和s s r 分子标记认为红黎檬的来源与粗柠檬和宽皮橘有关。在来檬的起源问题 上，他认为枸橼可能是来檬的一个亲本，而且来檬的起源还与大翼橙或宜昌橙有关p 3 1 。朱立 武认为是枸橼或黎檬与宽皮橘的杂种，而不是柠檬与宽皮橘的杂种。n i c o l o s i 等认为粗柠 檬可能是枸橼与酸橙的杂种。庞晓明等【i6 】也认为宽皮橘是粗柠檬的母本来源，而且1 j 枸橼关 系密切。上述各种证据表明，粗柠檬与枸橼和宽皮橘有关。枸橼作为一个重要的种参与了很 多柑橘种的起源，n i c o l o s ie ta l 【1 8 1c p d n a 数据表明它作为父本参与了柑橘种的起源。r f l p 和 r a p d 标记则显示，它和印度野橘具有最近的亲缘关系i 佗】。 1 3 2 4 柚类 柚类包括柚( cg r n n 挑o s b e c k ) 和葡萄柚( c 瑚朋矗函fm a c f ) 。葡萄枘是多胚品种，目 前所知的品种都来源于无性系，s w i n 9 1 e 【1 】认为它是柚和甜橙的杂种，数值分类研究、细胞学 研究均肯定了葡萄柚为杂交起源，柚是其亲本之一3 5 1 。刘勇等阳通过a f l p 和s s r 分析，认为 葡萄柚是与柚类种亲缘关系极为密切的一大群品种类型。s c o r a 等鲫利用同t 酶证据来支持葡 萄柚的母本是柚，父本是甜橙的假说。张太平掣3 8 1 通过r a p d 标记认为葡萄柚具有作为区别于 柚的另一个种的遗传特异性，并认为合江柚也应为沙田柚的无性系繁殖系。 1 3 2 5 宽皮橘类 周志钦( 1 9 9 2 b ) 利用中值淘汰法对中国宽皮橘1 6 个种类进行了形态学分支分析，结果表 明道县野橘( c 出弧缸胛删5 括) 是宽皮柑橘类最近缘的野生种3 1 1 。刘勇、吴波等( 2 0 0 5 ) 用s s r 分子标记和聚类图分析，表明分布于岭南山脉的莽山野橘是五个野橘类型中最古老的类 型，证实了我国岭南山脉地带应为宽皮柑橘类野生种原产中心。弄清它与印度野橘和立花橘 的关系以及这三个种在柑橘属植物系统进化中的作用是建立柑橘属植物系统进化基本框架急 需解决的关键问题。s w i n g l e r e e c e ( 1 9 6 7 ) l 】在以c 增加“肠细代表中国原产的全部宽皮橘类型 的同时又给予立花橘c 细c 汤伽口和印度野橘c 加妣口种的地位。t a n a k a ( 1 9 6 1 ) 【删将印度野橘作 为一个小种归入后生柑橘亚属s u b g e 曲s 胞纽c 咖淞的橘亚类s u b s e c t i o n 肘配厂d 口c 删m 删、水果蜜 5 矾南人学硕十学位论文 柑亚群s u b g r o 矗舰r d c a 伊口中。尽管近来年r f l p 、黜廿d 、s s r 等分子标记被用丁柑橘属及 其近缘属植物的起源、进化和谱系关系的研究。但在现有的文献报道中，宽皮柑橘同大翼橙、 宜昌橙、枸橼和柚等其它原始野生种类间的系统进化关系仍模糊不清2 ，1 8 ，3 2 ，3 4 1 。 1 4 植物分类与进化研究的方法及其在柑桔中的应用 1 4 1 形态分类学 形态分类学( m o 巾h o l o 百c a lt a ) 【o n o n l y ) 方法是早期植物分类研究使用的主要方法，通过 对植物的花、果、叶、树形等外部形态分析，依据表型分类原则划分分类系统。如：周志钦 研究了苹果属如胁sm i l l ) 4 9 个生物型的花嚣形态解剖学特征，研究证实了苹果属植物花器复 杂的变异，为属内种的划分及种间亲缘关系的探讨提供了丰富的形态学依据【4 l 】。周志钦 ( 1 9 9 2 b ) 【3 1 1 利用中值淘汰法对中国宽皮橘1 6 个种类进行了形态学分支分析，结果表明道县野 橘( c 如鲫缸盯p n s 括) 是宽皮柑橘类最近缘的野生种。自林奈订立柑橘属以来，迄今各柑橘分 类系统的建立均主要依据形态学方法，如上述的施文格分类系统、田中长三郎分类系统、曾 勉五属分类系统和蒋聪强的柑橘三属左右线分类系统等。此外，周志钦( 1 9 9 1 ) 用的l o 个形 态学性状采用甩相容性分析方法( c o m p a t a b i l l 锣a i l a l y s i s ) 分析了真正柑橘果树类植物内各属间 的分支学关系并讨论了其种系发生关系【1 0 】，李润唐还观察了柑橘类植物叶片气孔，并对湖南 野生、栽培宽皮柑橘的果实花器等植物学性状进行了调查，探讨了柑和橘的原始类型f 4 2 1 。 1 4 2 数值分类法 数值分类学( n u m e r i c a lt a x o n o r n y ) 方法是通过对植物性状采用均等加权，根据大量不加权 性状所得到的总相似度( o v e r a l ls i m i l 撕t ) r ) ，对分类单元进行分类和定级f 4 3 1 。b a r r e t t 和 r h o d e s 【删对4 6 个栽培柑橘及其近缘植物的1 4 6 个形态性状，进行了数值分类学研究。讨论了酸 橙( c 口”砌肋沁m ) ，柚( c 卿玎如) 等种内亲缘关系，并支持柚、枸橼和宽皮橘是真正的种的观 点。日本t a k 硒1 1 ih 锄d a 和c h i k io o g a i 【i 【4 5 荆用4 2 个形态学性状，采用4 种多变量数值分析法， 对3 0 个柑橘属和5 个金柑属的种和类型进行了研究，他们的结果除支持3 个基本种外，还将宽 皮橘分为2 个类群。刘勇【4 6 1 对3 3 份柚类种质根据形态进行综合性状聚类分析，研究性状和种质 之间的相互关系，选出对柚类品种影响力较大的果皮色泽，果皮厚，可食率，单果重，果肉 色泽，嫩梢茸毛，叶宽，叶基，果形，叶长，树性，花柄长，嫩梢色泽，雌蕊长，翼叶形状， 果皮粗细，柱头形状，正常种子数等1 8 个性状特征。 1 4 3 化学分类法 植物化学分类学( p h 蚋) c h e m o t a 】【o n o i n y ) 方法是以植物的化学成分及其生物合成途径为 依据并配合经典分类学及有关学科，共同研究植物类群起源及进化系统发育关系【4 7 1 。化学分 类作为经典分类重要的补充自上世纪7 0 年代以来受到了分类学家们的重视。化学分类在柑橘 中的应用相对较早，e s e n 和s c o r a ( 1 9 7 7 ) 【3 7 1 研究了柑橘及其近缘属植物淀粉酶的多样性。 6 文献综述 t a k a s h ih a n d a 等( 1 9 8 6 ) 【4 8 】对柑橘属植物的种和栽培品种的5 1 个生物型通过分离i 蛋白( 劬c t i o n ip r o t c i n ) 研究柑橘及其近缘属植物的种系发生关系。并根据分离i 蛋白等电聚焦电泳谱带带型， 建立了柑橘属及其近缘植物间的种系发生关系图。陈力耕等【例分析研究了柑橘亚科1 1 个属的 g o t 同工酶，实验结果支持枸橼、柚和宽皮柑橘为柑橘属三个基本种的观点。根据g o t 酶带和 形态分析，探讨柑橘属的进化顺序。朱立武【1 9 】通过分析柑橘叶片和种子蛋白质电泳带型，肯 定了在种间叶片蛋白质电泳带型有差异，种下分类单元间的种子蛋白质电泳带型有差异。龚 祝南( 2 0 0 4 ) 【5 0 】等通过对国产桑寄生科( l 0 m n t l l a c e 北) 的2 7 个分类群( 包括变种) 进行化学分 类研究，对国产桑寄生科植物类群进行初步的系统分类学研究。z h e n g 等( 2 0 0 7 ) 【5 l 】从化学分类 学的角度研究了宽叶泽苔草( c 口鼬胁胛疗如) 的亲缘关系及进化位置。 1 4 4 细胞分类学 细胞分类学( c y t o t 缸o n o n l y ) 方法主要是通过对细胞内细胞核、染色体、随体等细胞结构 研究为植物学分类和演化提供依据。r a 曲u v a n s h i 【5 2 1 通过研究柑橘类植物细胞减数分裂，认为 染色体结构的改变在柑橘类植物的物种形成方面起着支配作用，为柑橘属植物的进化提供了 细胞学证据。熊兴耀等【5 3 1 和粱国鲁【3 5 1 分别对柑橘属植物不同类型进行了细胞学研究和分类探 索。他们的研究结果肖定了染色体结构改变在物种形成方面的重要作用。并进二。步指出，除 染色体结构重组外，染色体结构不同的种、品种之间的天然杂交也起着重要作用。同时支持 柚作为柑橘属的一个基本种，排除h a n d a ( 1 9 8 6 ) 【5 4 】把克里曼j 。橘作为具宽皮柑橘基本种特性 的可能性。李润剧4 2 】通过对野生和栽培宽皮柑橘的核型进行比较研究，探讨通道野橘、道县 野橘、莽山野橘等橘类的分类地位，支持s t e b b i n s 根据着丝点的不同位置对核型分类的观点。 1 4 5d 分子标记 d n a 分子标记( m o l e c u l a rm a 血既) 是以生物的大分子，尤其是生物体的遗传物质( 核酸) 的多 态性为基础的遗传标记，它直接以d n a 的形式表现，因此不受组织类别、发育时期、环境条 件等干扰，相对于传统遗传育种研究的形态性状具有无与伦比的优越性。d n a 分子标记是指以 d n a 多态性为基础的遗传标记，分子标记不同于形态标记、细胞学标记和生化标记，它直接反 映了遗传物质d n a 的遗传变异，而不受取样部位和环境条件的影响【5 5 1 。 由于分子标记技术不断完善和发展，目前已经发展到几十种。除了以上几种主要分子标 记外，还有单核苷酸多态性s n p ( s i n g l en u c 诺o t i d ep o l y m o 印i l i s m ) 、序列标签位点s t s ( s e q u e n c e t a g g e ds i t e s ) 、序列相关扩增多态性s r a p ( ( s e q u e n c e - r c l a t e da 玎叩l i f i e dp 0 1 ) ，1 1 1 0 印h i s m ) 、靶位 区域扩增多态性t r a p ( t a 唱e tr e g i o n 锄p l i f i e dp o l y l l r p l l i s m ) 等数十种分子标记。 1 4 5 1r f l p 标记 限制性片段长度多态性标记( r e s t r i c t i o nf m g i m n tl e n g mp o l y m o 神i s m ，r f l p ) 是以 s o u m e m 杂交为基础的分子标记技术，是b o t s t e i n 等【5 6 】在1 9 8 0 年首先提出的。r f l p 主要是由于 7 西南人学硕+ 学位论文 不同个体的等侮基冈之间碱基的代换、插入、缺火、重排等引起的【57 1 ，不同材料的基p 司组d n a 用已知的限制性内切酶酶切时，产生不同数目和大小的d n a 片段，电泳后利用s o u t h e r n 杂交分 析，就能得到d n a 的限制性片段多态性。对于每一个基因组d n a 和限制性内切酶来说，所产生 的片段具有特异性。其技术特点r f l p 标记是一种共显性标记，可区分纯合基因型和杂合基因 型，非等位的r f l p 之间不存在上位效应，结果稳定可靠，重复性好，被用来构建遗传图谱、 品种鉴定、居群遗传和系统发育研究等f 5 引。但该技术操作步骤繁杂、效率低、工作量大、成 本高、可能对人体造成危害。萧顺元【5 9 】利用四种探针一酶组合在宜昌橙、金柑和枸橼等柑橘类 型中检测到r f l p 差异，并探讨了柑橘及其近缘属植物的起源、进化。f e d e r i c i 等( 1 9 9 8 ) 【1 2 】 用r f l p 分子标记研究了柑橘及其近缘属间的系统发生关系， 1 4 5 2r a p d 标记 随机扩增多态性d n a ( r a n d o m 加n p l i f i e dp o l 煳h i cd n a ，r a j p d ) 是以p c r 技术为基 础的分子标记，1 9 9 0 年由荚国杜邦公司、i l l i a m s 和加利福尼弧生物研究所w d s h 领导的两个小 组几乎同时提出【删。它是以基冈组d n a 为模板，采用一个随机的通常为l o b p 的寡聚核营酸序 列作引物，由于不同基冈组d n a 序列存在差异，其随机产物数量、大小就不同，可通过凝胶 电泳检测、a 序列的多态性。黜埋d 技术与其它分子标记技术相比有以下优点：( 1 ) 合成一套 引物可以对没有任何分r f 生物学研究的物种进行d n a 多态性分析，不具种属特异性；( 2 ) 无 需制备克隆、标记探针、s 0 u t l l 唧印迹、分子杂交等工作，简便迅速，实验成本低；( 3 ) 样品 用量少，灵敏度高。r a p d 标记不足之处是它是一种显性标记，不能区别显性纯合基冈型和杂 合基因型，稳定性较筹。2 0 世纪9 0 年代以来r a p d 标记广泛应用于动、植物遗传多样性检测、 构建遗传图谱、品种鉴定等研烈5 8 】。范眸天删对柑橘1 5 个材料进行了黜心d 分析，将供试材料 聚为8 个类群。张太平等【7 0 1 对柚的主要品种和野生栽培种等7 9 个样品进行黜垤d 研究。支持柚 作为种的观点，并探讨了柚类部分晶种问、近缘种间的遗传相互关系。n i c o l o s ie ta 1 ( 2 0 0 0 ) 【1 8 1 应用鼬蟑d 和s c a r 分子标记探讨了柑橘及其近缘属的系统发育关系，表明金柑属和柑橘属 关系较近。 1 4 5 3s s r 标记 简单序列重复( s i i n p l es e q e n c er e p e a t ，s s r ) 是j e f f r e y s 等旧1 9 8 5 年第一次用杂交的 方法证实了人类基冈组上小卫星可变数量串联重复序列存在，正式提出小卫星这个术语，它 是以重复序列与p c r 技术相结合的分子标记技术，在真核生物基因组中，均存在许多由l 4 个碱基对组成的简单重复序列，如( c a ) 。、( a t ) 。、( g g c ) 。等。尽管微卫星d n a 分布于整 个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设 计一对特异引物，通过p c r 技术将其间的核心微卫星d n a 序列扩增出来，利用电泳分析技术 就可获得其多态性。s s r 标记具有共显性、高度重复性、高度丰富的多态性等优点：缺点是利 8 文献综述 用s s r 标记技术进行研究时，由于创建新的标记需要知道重复序列两端的序列信息，开发有 一定困难，费用也较高。由丁其在特定位点上按孟德尔方式分离，可提供高变的、选择中性 的、共显性的分子标记。微卫星分析几乎是可以无限制的应用到分子生态、系统发育与进化 研究，在分子标记辅助育种的实践中也显出巨大潜力5 8 】。刘勇等( 2 0 0 5 ) 【3 9 1 用s s r 分子标记 和聚类图分析，表明分布于岭南山脉的莽山野橘是五个野橘类型中最古老的类型，证实了我 国岭南山脉地带应为宽皮柑橘类野生种原产中心。庞晓明等( 2 0 0 3 ) 【6 3 1 用s s r 标记分析了2 9 份柑橘属及近缘属植物的亲缘关系。 1 4 5 4a f l p 标记 扩增片段长度多态性( 触印l i f i e d 胁g m e ml e n g mp o 驷o r h i s m ，a f l p ) 是基于p c r 与酶 切相结合的分子标记技术。是荷兰科学家z a b e 孤等f 叫发明的一项专利技术，该技术是对基因 组d n a 进行限制性酶切片段的选择性扩增，具体是将基因组d n a 进行限制性酶切后，将特 定的接头连接在d n a 酶切片段的两端，从而形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和p c r 引物3 端的识别，进行p c r 扩增，然后用电泳检测扩增的酶切片段多态性。a f l p 继承了 r f i ，p 的稳定性和p c r 的快速、灵敏的特点，实验结果稳定可靠，重复性强，多态性高，是 显性和共显性共存的一种标记。冈此，在构建高密度遗传图谱、定位克隆目的基因、遗传多 样性检测、种间关系检测、亲缘关系鉴定等研究中a f l p 是较理想的分子标记【5 引。其缺点是 费用相对昂贵、用时较多、对操作人员素质要求较高。熊光明6 5 1 利用a f l p 技术对柑橘属及其 近缘属的1 6 个种( 施文格分类系统) 8 7 个生物型进行了研究，探讨了柑橘各属、种、品种之 间的系统发生关系。刘勇等3 6 1 结合a f l p 和s s r 分子标记，对1 2 2 份柚类资源及野生近缘种 进行了遗传多样性研究。并认为葡萄柚应作为品种而不应上升到种的地位。p a n g 等( 2 0 0 7 ) 【3 2 1 用a f l p 分子标记研究了柑橘及其近缘属2 9 种基因型之间的系统发育关系，n j 树表明枳、澳 洲指橘、澳沙檬和柑橘属之间的关系较远。另外，剐凡p 分子标记也被应用到李属【6 6 1 和苹果属 7 】的系统发育的研究。 1 4 5 5 序列分析 植物分子系统学的基本研究方法之一就是对所研究的植物的特定d n a 序列进行同源性 比较，构建系统发育树，以此探讨它们的系统演化关系。在众多的植物分子系统学分析手段 中，核酸序列分析具有很多优点：( 1 ) 核酸序列测定相对较快，方便，能够获得大量性状， 远远超过可利用的营养性状和生殖性状数量；( 2 ) 序列之间的可比性强，可通过g e n b a n k 等 获取相关序列，对不同的序列进行比较；( 3 ) 许多类群差异显著的序列提供的信息可以解决 一些限制性位点图谱难于解释的问题；( 4 ) d n a 片段扩增和测序的日益简化，用于系统分析 的软件和方法的不断创新和完善，大大提高了重建系统发育过程的可能性。从少数作者的个 别研究到多个实验室合作，从单一基因到多基冈再到与形态结合，是植物分子系统学的最新 进展或趋势。目前，大多数被子植物类群在科级水平上已利用分子序列进行了较为可靠的系 9 两南人学硕十学位论文 统发育重建6 9 ，7 0 7 l 】。目前，己利川多种植物的叶绿体、线粒体和核基因组( 如i t ss e q u e n c e ) ， 这三个基因组的基因或d n a 片段研究植物类群的系统发育和渐渗杂交现象，如利用核和质d n a 来揭示水兰属( h a w k 、e e d s ) 原始种间杂交的系统发育关系( j u d i 廿lf e h r c e ，2 0 0 7 ) 【7 2 】，最经典一 个例子就是s e n j oe ta 1 ( 1 9 9 9 ) 利用叶绿体d n a 和线粒体研究松科的亲本【7 3 】，t i n g t i i 培f e n g ， z h i q i nz h o u i t s 序列支持变叶海棠杂种起源。在柑橘中，m o n o ne ta l2 0 0 3 ) 【4 】利用叶绿体 d n a 序列为真正柑橘果树群作为一个单系类群提供了有力的证据。 l o 两南人学硕七学何论文 2 2 论文研究的主要思路 1 2 u 总d n a 提取 8 对c p d n a 引物进行筛选，选择合适的引物进行p c r 扩增 9 c p d n a 片段纯化并测序 e r 比较分析叩d n a 序列，揭示其系统发生关系 两南大学硕十学位论文 a ，c i 帆sr e s e a r c hi i l s t i t u t e ，c h i n e s ea c a d e m yo fa 鲥c u l t u r a ls c i e n c e s ，b e i b e i ，c h o n g q i n g ，c h i i l a b ，u s d a a r sn a t i o m lc l o n a lg e n n p l 弱mr 印o s i t o r yf o rc i 仇i s 锄dd a t e s ，黜v e r s i d e ，c “f o n l i a ， u s a 3 2 实验方法 3 2 1 总d 的提取 基因组d n a 的提取采用常规的c t a b 法( d o y l ea n dd o y l e1 9 8 7 ) 【鲫。 3 2 1 1 药品 2 c t a b ：1 0 0 唧o l 几t r i s - h c l ( p h 8 o ) ，1 4 m o l ln a c l ，2 0 姗0 1 几e d t a ，2 c t a b ；0 1 b m e r c a p t o e t l l 孤o l ( b 一巯基乙醇，现用现加) ； o 1 t e ：1 o 删o l lt r i s h c l ( p h 8 0 ) ，0 1 咖o l 几e d t a ； r n a s e a ：1 0 m m l ； 氯仿：异戊醇= 2 4 ：1 无水乙醇，异丙醇 3 2 1 2 实验用具 研钵，镊子，勺子，2 0 n 1 l 的离心管，1 5 l n l 的离心管，枪头( 1 i i l l ，1 5 0i il ) ，石英砂， 离心机，水浴摇床。 3 2 1 3 实验步骤r ( 1 ) 加入适量石英沙( 灭菌) 和叶片及少量p v p 干粉，加液氮研磨。 ( 2 ) 将以上转入2m l 离心管，再加入预热至6 0 以上的2 c 刖心液8 5 0 此和6 u lb 一巯 基乙醇( o 1 2 ) ，6 5 水浴l 小时( 其间不断摇均) 。 ( 3 ) 加入8 5 0p l 氯仿异戊醇混合液( 2 4 ：1 ) ，缓慢( 防止剪裂) 颠倒混匀l o 分钟，然后4 ，1 2 0 0 0 转分，离心1 0 分钟。 ( 4 ) 取上清液，重复步骤3 ( 第一次抽提后，可向水相中加入l om g m i 肭r n a s e a 储备 液4 弘l ) ，在3 7 保温2h 裂解l 矾a ) 。 ( 5 ) 两次抽提后，取上清液于2m l 管中，加入5 0 0 p l 预冷的异丙醇( 混均) ，于2 0 冰箱 l 小时或过夜。 ( 6 ) 4 ，1 0 0 0 0 转份离心1 0 分钟，收集沉淀。 ( 7 ) 加2 0 0 3 0 0 弘l 的7 0 的乙醇洗涤沉淀，4 ，l 0 0 0 0 转分离心4 分钟 1 4 西南人学硕十学位论文 3 2 2 3 扩增程序分别为： ( 1 ) 引物n 瑚一n 出 1 ) 9 4 4m i l l 2 ) 变性9 4 5 0s e c 3 ) 退火5 7 3 0s e c - 3 5 次循环 4 ) 7 2 延伸6 0s e cj 5 ) 7 2 延伸1 0 m i n ( 2 ) 引物乃玎l 胁f 6 ) 9 4 4m i n 7 ) 变性9 4 5 0s e c 8 ) 退火5 8 3 0s e c - 3 5 次循环 9 ) 7 2 延伸6 0s e cj l o ) 7 2 延伸l o m i i l ( 3 ) 引物7 锄g 7 h s l i ) 9 4 4m i n 1 2 ) 变性9 4 5 0s e c 1 3 ) 退火5 9 3 0s e c砷5 次循环 1 4 ) 7 2 延伸6 0s e cj 1 5 ) 7 2 延伸1 0 m i i i 然后将扩增产物在1 5 的琼脂糖凝胶上，l t b e 缓冲液中电泳分离，电泳胶用溴化乙锭 ( 髓) 染色，d n a 的分子量标记为d l m a r k e r 2 0 0 0 。 3 2 2 4 扩增产物的纯化 1 6 从琼脂糖胶上将目标片断切下( 条带宽窄要适合) ，产物回收使用鼎国d n a 片断快速 纯化回收试剂盒过柱纯化，纯化步骤根据试剂盒操作指南略作修改，具体步骤如下： ( 1 ) 切取含d n a 片断的琼脂糖，按重量比1 ：3 ( 切取重量：溶液a 的体积比) 加入溶 液a ； ( 2 ) 5 0 水浴1 0l i l i n ，胶完全溶化即可，其间可振荡助溶2 3 次，待溶化后置室温加入 1 5 肚溶液b ，充分混匀。 ( 3 ) 将溶液置于离心柱中静置2n i i i l ，8 ，0 0 0 r p m 离心2 0s ，若一次加不完，可分两 次离心； ( 4 ) 倒掉液体，加入5 0 0 肚溶液c 于离心柱中，8 ，0 0 0 叩m 离心2 os ，弃液体； 西南人1 学硕十学何论文 第四章结果与分析 4 1 p c r 扩增结果 我们通过对4 0 对引物分别在1 个外类群九里香( 似r 似炉p 口甩f c “肠尬) 和3 个基本种( b a s i c s p e c i e s ) 的佛手( c 脚p 加以v a r 5 口m d 出c 凰) ，沙田柚( 鲫门以s s h a t i a n y o u ) ，朱橘( c s “c c o s 口) 中的扩增，筛选出3 对特异性强、多态性好引物，其分别对应于柑橘叶绿体基冈组的 7 砌l 研l f a 6 h n f b 和7 h s z h g 区域。然后用3 对引物分别对全部分析材料进行了扩 增，结果表明所筛选的引物特