（水生生物学专业论文）溶藻细菌和溶藻粘细菌的分离及溶藻效果研究.pdf

硕士擘位论走 m a s t e rsr h e s i s 中文摘要 富营养化导致的有害藻类水华的爆发已成为世界性的环境灾害，蓝藻水华的形 成影响了水生态系统的健康发展，也给水产养殖业、供水及旅游业带来极大的危害 其中铜绿微囊藻水华的危害最为严重。溶藻细菌作为水华生物防治的可能途径，已 经引起了国内外不少学者的关注。 本实验从武汉发生过“水华”的湖泊东湖狂欢岛、二渔场和关桥等采样点 采集水样，进行溶藻细菌的分离，分离出二十多株溶藻细菌，对其进行了稳定性实 验，经过连续传代培养后，从中筛选出了一株高效稳定的溶藻细菌，命名为m 4 ， 并对菌株m 4 进行了1 6 sr d n a 序列分析，鉴定为产碱杆菌似l c a l i g e n e s ) 。实验结果表 明：该菌株对实验室培养的铜绿微囊藻具有一定的抑制效果，其明显抑藻的闽浓度为 3 8 1 0 5 c f u m l ，这在已知的溶( 抑) 藻菌中是较低的。 本实验还从武汉不同地区采集土样分离粘细菌，从中筛选出株溶藻粘细菌 m y l ，其对实验室培养的铜绿微囊藻7 8 2 0 有较好的溶藻效果，对野生铜绿微囊藻、 铜绿微囊藻7 8 0 6 、铜绿微囊藻d s 、织线藻也有一定的溶藻效果。溶藻粘细菌m y l 在固体培养基上溶藻较彻底，优于在液体条件下的溶藻效果。 关键词：铜绿微囊藻；溶藻细菌；溶藻粘细菌；溶藻效果 硕士学位论丈 m a s l e rs t h e s i s a b s t r a c t t h ei n c i d e n c eo fh a r m f u la l g a lb l o o m s ( h a b s ) h a sr e c e n t l yi n c r e a s e di nf r e q u e n c y a sal o n g - t e r mt r e n do nag l o b a ls c a l e t h ef o r m a t i o no fh a r m f u la l g a lb l o o m sh a s a f f e c t e dt h eh e a l t hd e v e l o p m e n to fa q u a t i ce c o s y s t e m i ti sa l s oh a r mf o ra g f i c u l m r e ， w a t e rs u p p l ya n dt o u r m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s ab l o o m si sf b r e m o s t a 1 9 i c i d a lb a c t e r i ai s n o wt h o u g h tt h a tt h o s eb a c t e r i u mm a yt e r m i n a t eh a r m f u la l g a lb l o o m sa n dr e g u l a t ea l g a l p o p u l a t i o nd y n a m i c s m o r et h a nt w e n t ya l g a e l y s i n gb a c t e r i u mw e r ei s o l a t e df r o me a s tl a k eo fw u h a n c i t yw h i c hh a dh a p p e n e dh a b sb e f o r e t h es t a b i l i t ye x p e r i m e n t sw e r ed o n eo ft h e mb y c o n t i n u e dc u l t u r e a ne f f i c i e n ta n ds t e a d ya l g a e - l y s i n gb a c t e r i aw a ss c r e e n e do u tc a l l e d m 4 t h es e q u e n c eo fm 41 6 s r d n ai sa s s a y e da n di d e n t i t l e d t h er u s l ti st h a tm 4 b e l o n g st oa l c a l i g e n e s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l ti n d i c a t e dt h a t ，t h eb a c t e r i u mi s o l a t e d p r e s e n t e d h i g h l y a l g a e l y s i n ge f f e c to nm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a i tc o u l ds i g n i f i c a n t l yi n h i b i tt h eg r o w t ho f ma e r u g i n o s aw h e nt h ei n o c u l a t i o nc o n c e n t r a t i o ni s 3 8 1 0 5c f u m lt h e c o n c e n t r a t i o ni sr e l a t i v e l yl o wc o m p a r i e dw i t ho t h e rr e p o r t e da l g a e q y s i n gb a c t e r i u m t h es o i lw a sc o l l e c t e df r o md i f f e r e n ta r e a so fw u h a a a a na l g a e l y s i n gm y x o b a c t e r i a w a si s o l a t e df r o mt h es o i ln a m e dm y l t h em y x o b a c t e r i ai s o l a t e dp r e s e n t e db e t t e r a l g a e l y s i n ge f f e c to nm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a 7 8 2 0t h a nm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a 7 8 0 6 ， m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a d s p l e c t o n e m d b o r y a n u m a n d w i l d i n gm i e r o c y s t i s a e r u g i n o s a t h ea l g a e l y s i n ge f f e c to ns o l i dc u l t u r em e d i u mi sb e t t e ra n dt h o r o u g ht h a n l i q u i dc u l t u r em e d i u m k e y w o r d s ：m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ，a l g a e l y s i n gb a c t e r i u m , a l g a e l y s i n g m y x o b a c t e r i a , i s o l a t i o n ，l y s i n ge f f e c t i i 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：绵庀 日期：口- ) 年月p 日 ， 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务。 作者豁影器张 日期：7 年，月，日 导师签名： e 1 期： 口 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。圃重监塞理变压溢盾! 旦圭生；旦：二：笙；旦三笙筮查! 作者签名：需：毫 日期：叼年6 j 月，日 弓b 劾 导师签名：己厶r e l 期：嗡6 月c 。日 第一章文献综述 1 蓝藻水华的成因与危害 随着科学技术的进步、社会的发展，人民生活不断丰富，生活水平不断提高。 因环保事业发展相对滞后，造纸、纺织、印染以及生产工艺落后的乡镇企业大量排 放的工业污水和城镇居民的生活污水未经处理摊入江河、湖泊，导致水体被污染， 氮、磷等营养物质大量增加，致使水体达到富营养化或严重富营养化状态，在一定 的温度、光照等条件下，某些藻类发生爆发性的繁殖，引起明显的水色变化，并在 水面形成或薄或厚的绿色或其他颜色的藻类的漂浮物现象。也有人认为，不一定产 生藻类的漂浮物，只要引起水的颜色变化即为水华现象。发生在海水中的这种现象， 通常称为“赤潮”或“红潮，l ”。在国际第三届藻类大会中报道，全球有毒藻类水华急 剧增长，有害水华业已成为国内外关注的环境问题t 2 1 。甚至有人将水华称作水体的 癌症，足见水华问题的严重性。因此，水华引起了全世界人民的广泛关注和重视。 各国政府的有关职能部门都对水华现象进行了大量的研究工作，投入了大量的人 力、物力和财力，采取许多防治措施。我国近2 0 年来水华现象异常严重，滇池、太 湖、巢湖三大湖的严重水华现象已是人所共知，北京城区的河、湖自2 0 0 0 年以来连 续几年大规模爆发的水华现象在社会上造成了很大的影响。更值得重视的是有不少 饮用水的水源也发生水华现象，直接影响人民的生活和身体健康。 藻类植物约3 万多种，广泛分布在各种淡水水体和海洋中，但是，并不是所有 的藻类都能形成水华。能够形成水华的藻类最主要的是蓝藻门的种类，其中最常见 的有微囊藻( m i c r o c y s t i s ) 、鱼腥藻( a n a b a e n a ) 、颤藻( o s c i l l a t o r i a ) 、平裂藻 ( m e r i s m o p e d i a ) 、束丝藻( a p h a n i z o m e n o n ) 阿氏项圈藻( a n a b a e n o p s 括) 、螺旋 藻( s p i r u l i n a ) 等。其他常见的水华藻类还有裸藻门中的裸藻( e u g l e n a ) ，绿藻门 中的衣藻( c h l a m y d o m o n a s ) 、硅藻门中的小环藻( c y c l o 把l l a ) 等。也有人把漂浮 在水面的水绵( s p i r o g y r a ) 、转板藻( m o u g e o t i a ) 等一些丝状藻均视为水华藻类。 水华藻类中以蓝藻在生物界的演化地位最原始，属于原核生物【l 】。 蓝藻长期的进化形成了极强的生态竞争优势，在适合的环境条件下即可获得最 大生长率，并以指数级迅速增长。研究发现蓝藻具有自我强化机制作用的生态生长 调节素，可使其产生尽可能多的后代，从而使产毒菌株密度增加，获得竞争优势， 形成种类少而数量大的蓝藻水华。蓝藻水华的形成影响了水生态系统的健康发展。 蓝藻大量生长改变了水体的理化环境。透明度降低，水体散发腥臭味，溶解氧减少。 硕士学位论文 m a s t e r + st h e s i s 当水体中的营养素被蓝藻耗尽时，蓝藻大量死亡，各种有害气体及蓝藻毒素大量释 放，最终导致水生态系统的迅速崩溃。蓝藻水华也给水产养殖业、供水及旅游业带 来极大的危害。 蓝藻门的许多种类都能形成水华，尤以微囊藻水华发生较普遍，据石志中等对 陕西关中地区精养池塘的随机抽样调查报道，微囊藻水华池塘占到总调查数5 4 以 上p 】。微囊藻水华是蓝藻水华中危害最大的一类，它持续时间长，生命力特别强， 一旦形成水华就难以彻底清杀。虽然它随着温度的下降而减少，但是，来年随着温度 的升高又会不断繁殖形成水华。不仅造成水体感观性状的恶化，而且多数产毒，流 行病学调查显示：饮用水中微囊藻毒素的浓度与原发性肝癌的发病率有显著的相关 性1 4 - 5 1 。除此以外，微囊藻毒素抑制其它藻类的生长川。因而微囊藻水华备受人们关 注 6 - o l 。 微囊藻属、鱼腥藻属、颤藻属和束丝藻属等都可以产生蓝藻毒素，不同藻株可 能产生相同的毒素，而同一株藻也可产生多种不同的毒素i 埘，产生的毒素包括：多 肤肝毒素、生物碱类神经毒素、脂多糖内毒素、叶碟吟类毒素等，其中又以微囊藻 毒素( m i c r o c y s t i n ，m c ) 最为常见i l l j 水体中高浓度微囊藻毒素可影响水生植物种群的 多样性，也可使鱼卵变异，蚤类死亡，鱼类行为及生长异常。蓝藻毒素同样威胁着人 体健康，1 9 9 6 年巴西一透析中心，因透析液遭蓝藻毒素污染，导致2 6 人最终死亡。我 国对蓝藻毒素曾作过相关的调查，结果表明南北几个省市的各种水体均有不同程度 的m c 污染，其中以沟塘水、河水、水库水较为严重。世界卫生组织制定了饮用水 中蓝藻毒素的控制标准为1 昭，l1 1 2 | 。 2 目前水华治理的主要方法简介 大量排放的工业污水和城镇居民的生活污水未经处理排入江河、湖泊，导致水 体被污染，氮、磷等营养物质大量增加，致使水体富营养化，进而导致了水华的爆 发。因此，治理水华最根本的是要截污，减少水体中氮和磷的含量，但是截污法见 效是很慢的，而且对一些已经污染的水体不起作用，就要采取一些应急性的措施， 主要的方法包括：物理方法、化学方法和生物学方法。 2 1 物理方法 目前，物理法主要包括机械或人工打捞、分层作用、黏土絮凝和遮光技术等方 法。物理法表现得最为直接，它直接清除水体中的藻类，不会产生二次污染，但是 需要昂贵的费用，因此该方法只能局限于小水体或大水体的局部水域。 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i $ 分层作用。人为地使水体水层混合，消除热分层化( t h e r m a l l ys t r a t i f i e d ) 及由此引 起的利于藻类繁殖的条件，如水体底层( h y p o l i n m i o n ) 缺氧、底泥氮磷大量释放等。 黏土除藻。一般来说，黏土是由许多种矿物质及杂质所组成，矿物包括高岭 土、伊利石、绿泥石及滑石等；杂质包括石英、各种铁矿、数种重金属、钙及镁的 碳酸盐和硫酸盐及有机质等。黏土在水中分散形成大量的悬浮颗粒，颗粒之间及颗粒 与藻细胞之间通过重力差异性沉降、布朗运动、水流切应力等作用发生碰撞集聚， 最后在重力的作用下沉降于水底，对消除水华、水中一些物质( 如无机、有机化合物 等) 的分布和迁移转化及水生态系统的营养结构、生产力结构与食物链结构等都有 重大影响。黏土来源充足，具有天然无毒、使用方便、耗资少等特点，曾一度受到 欢迎。但到目前为止，黏土除藻技术还局限于海水体系的研究和局部应急处理。面 对与人们日常生活息息相关的淡水资源，许多将黏土除藻技术应用于淡水湖泊中清 除藻华的尝试，都没有成功。此外，即使黏土在淡水中可以絮凝沉降水华，但由于该 技术的定位是一种应急处理措施，不能防止浅水湖泊藻类的泛起、底泥的二次污染 和来年水华的复发，因而仍然难以在淡水湖泊中广泛使用，关键问题是治标不治 本。 物理法灭藻通常利用外力感应，使作用力深入藻细胞内，破坏内部结构，导致 死亡。例如：电子灭藻器的作用原理是产生电磁波振动，使藻细胞内结构混乱导致 死亡。还有微电解灭藻，此外利用水位、光调节乃至避光、高压放电、超声波及疏 浚底泥等方法也可破坏水源水中藻类的生存条件。 2 2 化学方法 目前，控制藻菌最行之有效的办法就是使用杀菌灭藻剂。应用最广泛的杀藻剂 是硫酸铜，其他的还有丙烯醛、次氯酸钙等。一般来说，化学法的时间效应比较快， 但由于其对除微囊藻外的其他生物的副作用和能够加速释放藻毒素等缺点而受到 限制。化学除藻法既不科学也不经济，它不可避免地将造成环境污染或破坏生态平 衡。这些除藻剂的化学成分均为易溶性的铜化合物，或者螯合铜类物质，这类化合 物对鱼类水草等水族生物产生一定程度的伤害甚至导致死亡，并且有致癌作用， 还会产生一些不可预测的不良后遗症。可以说，这是一种短视行为或是一种权宜之 计。 2 3 生物学方法 对藻类进行生物控制是指在较短的时间内大量削减藻细胞的数目或防止藻类 的爆发性增长为目的。主要从生态的角度，通过生物间的营养竞争和牧食关系来控 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 制蓝藻水华。生物方法强调的是整个生态系统的管理，从营养环节来控制蓝藻，使 水体的营养素转变为人类需要的终产品，具有经济、高效、合理的优点。目前主要 采用食藻生物、水生植物抑制、微生物防治等方法。 2 3 1 鱼类控藻 滤食性鱼类和杂食性鱼类能够直接滤食藻类，从而达到控藻的目的。基于武汉 东湖蓝藻水华消失的实践和原位围隔试验，促成了非经典生物操纵理论的提出，该 理论强调了滤食性鱼类鲢和鳙对蓝藻的直接摄食导致蓝藻的下降。 2 3 2 以藻制藻 通常选择水网藻，隶属绿藻门，体长可达2 m ，鲜黄绿色，由于其生长繁殖快、吸 收肥料能力强等特点而与藻类水华生长竞争水体的营养( 氮磷) ，从而抑制藻类水 华的发生。研究表明，水网藻对水体氨氮、总氮和总磷的去除率均在7 0 以上1 1 4 l 。 2 3 3 植物化感作用 近年来，水生植物对藻类的化感抑制作用的发现，使化感作用开始应用于富营 养化水体藻类控制领域，相关研究已受到国内外的关注l l5 1 。抑藻水生植物普遍存在 于水体中，它们一方面能吸收水体中的营养物质，为水中营养物质提供输出的渠道； 另一方面，它们能够分泌抑制藻类生长的化感物质，起到修复、净化富营养化水体 的作用，而且，这些化感物质是水生植物生长过程中产生的次生代谢物质，一般能 在自然条件下降解，不会在生态系统中长期积累，生态安全性好。将化感物质应用 于藻类控制具有良好的应用前景【l6 j 。 植物化感作用是通过向环境释放化学物质而实现的，这些起作用的化学物质称 为化感物质。植物化感物质主要是植物次生代谢物质，它们分布于植物的根、茎、叶、 花、果实或种子中。常见的释放方式有4 种：( 1 ) 挥发。一些挥发性化感物质( 主要是 萜类) 通过植物体表( 茎、叶、花) 进入环境而发挥作用。( 2 ) 淋溶。由于雨水或雾滴的 作用，一些有机酸、氨基酸、萜类和酚类等水溶性化合物易被从植株表面淋溶下来， 对周围植物产生影响。( 3 ) 根的分泌。次生代谢产物中的根系分泌物很大一部分是化 感物质。( 4 ) 植物残株的腐烂释放。植物及其某些器官死后，其中的复合物或聚合物 被微生物分解而释放出某些化合物，这对周围植物化感作用【l ”。化感物质的种类 很多，按照化学结构可将化感物质分为5 类：脂肪族、芳香族、含氧杂环化合物、 类萜和含氮化合物1 1 6 1 。 有关学者研究了不同生活类型的水生植物对藻类的化感作用。目前已有研究报 道的具有抑藻作用的高等水生植物约二十余种。 水生植物对藻类化感作用的研究对于利用生态学方法控制藻类爆发性生长有 4 重要意义，但在不适合种植大型水生植物的水域则具有局限性。同时，这种方法周 期长，不能在短期内见效，也限制了其应用【l 引。 2 3 4 微生物控藻 2 3 4 1 蓝藻病毒防治水华 藻类病毒最早是在蓝藻中报道的。1 9 6 3 年s a f f e r m a n 和m o m s 首先报道了同 时感染鞘丝藻( l y n b y a ) 、席藻( p h o r m i d i u m ) 及织线藻( p l e c t o n e m a ) 的l p p 病毒【1 9 】 最早对真核藻类病毒进行鉴定的是g i b b s 等【2 0 】，他们发现一种特异性地感染绿藻门 的珊瑚轮藻( c h a r a c o r a l l i n a ) 的病毒，取名为“c c v ”。随着越来越多的蓝藻病毒和 真核藻类病毒的分离和鉴定，人们发现这两类病毒无论从形态、结构，还是从生化 性质、感染情况来看都很不相同：根据宿主的不同，藻类病毒可分为原核藻病毒和 真核藻病毒，原核藻病毒即蓝藻病毒，它们与噬菌体的形态、结构、分子组成以及 对宿主的感染方式极为相似，被归于噬菌体一类，因而也被称作“噬蓝藻体”或“噬 藻体”1 2 l ，。而真核藻病毒或病毒类粒子( v i r u s - l i k ep a r t i c l e s ，v l p s ) 则一般为多面体的 粒子，它们是完全不同于蓝藻病毒或噬藻体的病毒类型，所以有关藻类病毒学的研 究，通常是将它们分开进行的。 早在七十年代就进行了原核藻病毒或噬藻体比较细致的研究，如感染l y n g b y a ， p l e c t o n e m a ，p h o r m i d i u m 三类藻的、分布最广的 l p p 型”噬藻体，和感染 a n a c y s t i s n i d u l a n s 和s y n e c h o c o c c u 的“a s 型”噬藻体，已经有了多年的研究积累；而 真核藻病毒或vl p s 虽然自七十年代初发现至今已经多年了，但是对它们的研究要 薄弱得多，可以说尚停留在很表面的层次上，除了感染与草履虫p a r a m e c i u m b u r s a r i a 管内寄生的“p b c v ”型之外，其它的真核藻病毒或v l p s 的定性和感染宿主 的情况所知甚少。 病毒或v l p s 不仅广泛存在于各种水环境中，同时也是浮游生物的活跃的成员 阎；病毒或v l p s 在海水中的浓度高达1 0 4 1 0 9 v l p s m l ，大大超过了传统的推断删。 淡水中的含量也高得惊人，例如对挪威r a u n e f i o r d e n 湖春季硅藻水华期间的病毒粒 子含量的测定，水华前为1 0 5v l p s m l ，水华高峰期间为1 3 x 1 0 7v l p s m l 2 4 1 。因 此病毒或vl p s 在浮游生物群落演替中可能具有极其重要的作用，是通过特异性溶 解宿主来维持种群关系平衡的关键因子【2 5 1 。病毒或v l p s 对浮游植物群落及初级产 物的影响也有不少报道1 1 6 1 。例如v a ne t t e n 等人1 2 6 1 。对自然水体中的p b c v 效价进 行了测定，p b c v 在c h l o r e l l a 藻苔上的噬藻斑单位( p f u ) 高达4 x 1 0 4p f u m l 水。最 近已有病毒溶解水华的报道。如1 9 8 5 年以来，美国纽约的罗德s b ( r h o d ei s l a n d ) 附 近的海湾每年夏季都发生一种q 做褐潮”( b r o w nt i d e ) 的大水华，高峰时藻密度高达 到1 0 9 个m l 尽管这种水华来势凶猛，但是总是突然地消失i 拥。经研究发现，这 种由金藻的au r e o c o c c i j s a n o p h a g e f f e r e n s 引起的水华之所以突然地消退，是由于藻 的细胞中出现了大量的病毒，这些病毒特异性地在该藻的细胞中繁殖，并且传染性 极强，所以很快将整片水华溶解掉。 由于在水华和产毒蓝藻中常发现藻细胞中含有病毒和v l p s ，病毒和v l p s 也许 能用于对水华的控制和抑制有毒藻类的生长 2 1 1 1 。p r o c t e r 和f u h r m a n 认为，病毒或 病毒类粒子是潜在的海洋生态的重要调节因子；病毒造成的藻溶解明显地导致微藻 群落的消亡，并且病毒作为藻种群的显著的控制因素一如调节藻种群的遗传基因 库、有机溶解物质的水平的保持者，受到了越来越广泛的关注和认可。 有的病毒或v l p s 有“共专一的宿主”( c o s p e c i f i ch o s t ) ，特异性地感染亲缘关系 近邻的一些藻 2 9 - 3 0 3 ，因此这类病毒可用作转移致死基因的载体，杀死有害或不需要 的藻类。 病毒在海水中含量相当高，通常高于细菌含量，般是细菌含量的l o 倍左右 3 1 1 0n a g 硒a i 【i 1 2 6 j 等研究了赤潮异弯藻( h e t e r o s i g m aa k a s h i w o ) v i r u sc l o n e0 1 ( h a v 0 1 ) 病毒生长特性，初步探讨了采用h a v 0 1 来治理赤潮异弯藻中的潜伏期为3 0 - - 3 3 h ， 在自然环境中，该病毒具有很高的增殖速度。h a v 0 1 的严格专一性，使其不会对其 他生物产生任何影响。这一研究初步表明，采用病毒治理水华和赤潮在理论上是可 行的。 病毒作为控藻因子是安全的，但是病毒对其宿主的侵染具有很高的特异性；病 毒能迅速降低水体中特定的藻类的数量：病毒的复制周期很短，如k e h e n n e s 在德 国c o n s t a n c e 湖中的研究发现，发生水华后的水体中病毒数量增加了7 0 - 3 8 0 ，估 计每个宿主藻可以释放2 1 1 2 1 个子代病毒。但是，它也有局限性如病毒的专一性使 得病毒不能裂解多种藻类，而且现在的研究还处于理论阶段，还没有实际应用。 2 3 4 2 原生动物控藻 原生动物是水生食物链中的重要环节，很多原生动物可以取食藻类，有些甚至以 藻类为惟一食物。食藻原生动物主要分为：鞭毛虫、变形虫和纤毛虫三个大类【3 2 1 在湖泊和海洋水生态系统中，藻类生物量的下降往往伴随着原生动物数量的急剧增 加1 3 ”5 1 。比较各种控藻生物因子的环境适应力、繁殖能力、控藻效力、宿主范围、 对宿主改变的适应能力以及不利环境下的抗逆性等多种因素，人们认为原生动物是 一种很有实用前景的控藻因子。 原生动物作为一种很有实用前景的控藻因子，在应用方面有很多优势：( 1 ) 取食 范围广；( 2 ) 食量大；( 3 ) 可以在不良条件下形成包囊，度过缺乏食物等不利的时期； 6 ( 4 ) 包囊结构具有很强的抗逆性，易于包装和运输；( 5 ) 容易繁殖。但是某种原生动 物可以取食某种藻类，并不意味着该原生动物可以作为这种藻类的控制因子，只有 当藻类可以被消化，并且为原生动物的大量繁殖提供物质和能量时，这种原生动物 才能显著降低目标藻类的生物量。但到目前为止，人为利用原生动物控制水华并没 有取得成功的例子州，天然水体环境的复杂性以及野生水华外被的酸性多糖的保护 等都有可能限制了原生动物控藻的实际应用。 在研究自然水体原生动物的食藻过程中，有很多关于原生动物大量繁殖导致水 华消退的报道【3 m 明。但人为主动利用原生动物控制蓝藻水华夺得成功的报道不多。 大都处于尝试阶段1 4 0 - 4 2 1 。食藻原生动物在实验室条件下对微囊藻、鱼腥藻、束丝藻 控藻效果非常好，但是对天然水华( 采自云南滇池) 的控制作用则不明显。以下因素 限s q t 食藻原生动物在天然水华中的控藻作用：( 1 ) 天然水体环境和实验室培养条 件之间的差异。天然水体的化学成分、温度、p h 值都可能影响到原生动物的食藻 能力。( 2 ) 原生动物数量的限制。当原生动物的数量相对藻类生物量达到一定优势 时，其控藻效果才会显现。天然水体中，原生动物增殖能力受到影响，而初次投加的原 生动物会被庞大的水体稀释到远远达不到控藻的浓度。( 3 ) 天然水华的复杂性。天 然水华中藻的种类很多，往往主要优势藻类( 如微囊藻) 数量的降低，反而引起次要藻 类( 如束丝藻或颤藻等) 的繁盛，成为优势种，总体藻类生物量并未明显降低。( 4 ) 天 然水华的顽固性。滇池野生铜绿微囊藻细胞外有一层黏液层，可以减小外界环境对微 囊藻细胞的影响，会对食藻原生动物的取食产生极大障碍【4 3 】。 2 3 4 3 放线菌防治水华 放线菌可以产生多种生物活性物质，如抗生素、酶及酶抑制剂，有机酸、氨基 酸、维生素、多体、生物碱、免疫调节剂等。故环境中必然存在着大量能分泌溶藻 物质的放线菌，但水体中的放线菌的数量和种类有限，目前大部分的研究中溶藻放 线菌都是从土壤中分离得到的。s a f e r m a l l 和m o r r i s ( 1 9 6 2 ) 研究了从土壤中分离到的 放线菌培养物滤液的抗微生物性质，在检测的4 0 3 株放线菌中有2 1 3 株对微生物具有 抑制作用，这2 1 3 株中的9 0 又可特异性的抑制蓝藻生长。w h y t e e t a l ( 1 9 8 5 ) 从土壤 中分离的s t r e p t o m y c e s a c h r o m o g e n e s ( 不产色链霉菌) 能够裂解a c y l i d r i c a ( 柱状鱼腥 藻) 、t o l y p o t h r i xt c n u i s ( 小单歧藻) 。a 1 t a i ( 1 9 8 2 ) 分离到的2 5 种可以抑制蓝藻生长 的放线菌，一株a n 6 分泌到细胞外的物质可以导致蓝藻、绿藻、真菌、细菌的裂解。 s i g e e 等分离到的脱叶链霉菌( s e x f o l i a t u s r g l 2 ) n - j 使9 种蓝藻裂解，其中包括可形 成水华的鱼腥藻、微囊藻和颤藻l “蜘。 2 3 4 4 真菌防治水华 7 硕士擘位论文 m a s t e r st h e s i $ 真菌对藻类的直接影响主要有两个途径：一是释放抗生素或抗生素类的物质， 二是寄生溶藻。 青霉素是青霉菌分泌的一种已广泛用于医药和科研的抗生素，青霉素不仅抑制 细菌的生长，而且对藻类也有很强的毒性。k u m a r l 4 6 1 用青霉素测试蓝藻的敏感性， 发现浓度仅o 0 2 “i m l 的青霉素就足以抑制组囊藻a n a c y s t i sn i d u l a n s 的生长。早在 6 0 年代就已知头孢菌素c ( c e p h a l o s p o r i nc ) 是由几个支项孢真菌a c r e m a n i u m c h r y s o g e n u m 的品系及一些丝胞壳属e m e r i c e l l o p s i s 的种类1 4 7 1 产生的。头孢菌素c 与青霉素一样，都是b 内酞胺( 1 3 a c t a m ) 类型的抗生素，其作用机制也可能同青霉素 一致；通过抑制粘肽合成的后期酶活性，和阻止初生粘肽与既有的完整粘肽上侧链 相联接，来阻止蓝藻细胞壁中的粘肽层( l 2 层) 的形成。由于失去了主要骨架结构的 粘肽层支持，细胞变形，大多数的细胞变成球形体或原生质体，随后被溶解掉。 r e d h e a d 和w r i g h t t 4 8 】用头孢菌素c 以及支顶孢属的a c r e m k i l i e n s e ( a l l - 6 2 ) 的滤液 作用于水华鱼腥藻之后，在电镜下观察到了球形体和原生质体的形成。他们还对头 孢菌素c 的致敏浓度进行了测试，发现只使用o 0 2 m l 的浓度为1 0 1 a g m l 头孢菌素 溶液，水华鱼腥藻的周围就形成了溶藻圈。 真菌在藻类的寄生是比较普遍的，报道最多的寄生的宿主是水绵属s p i r o g y r a s p , 的藻类，寄生物有卵菌纲( q o m y c e t e s ) 1 4 卅；细长腐霉( p y t h i u mg r a c i l e ) 、噬藻丝 水霉( a p h a n o m y c e s p h y c o p h i l u s ) 和星状水霉( s a p r o l e g n i aa s t e r o p h o r a ) 等真菌。 v a nd o n k 和r i n g e l b e r g 在冬季及早春的硅藻水华中发现有壶菌寄生。其中浮游接根 壶菌( z y g o r h i z i d i u m p l a n k t o n i c u m ) 对美丽星杆藻( a s t e r i o n e l l a f o r l n o $ d 1 ) 有很强的 寄生溶藻效果，是所记录到的最高感染的例子。例如，在合适的环境条件下，它在 美丽星杆藻中的寄生和繁殖使该藻的生长受到强烈的抑制并使藻水华很快消失。 2 3 4 5 细菌控藻 溶藻细菌( a l g a e 1 y s i n gb a c t e r i a ) ，作为水生生态系统生物种群结构和功能的重要 组成部分，对维持藻的生物量平衡具有非常重要的作用 4 0 + s o l 近年来，不少学者认为， 水华的突然消亡可能与溶藻细菌的感染有关1 5 1 - 5 3 1 。筛选对水华藻类有特异抑制作用 的细菌己经引起了广泛的关注，许多研究人员己经把溶藻细菌作为缓解有害藻类水 华危害的一种潜在的生物l ”】。细菌对有害藻类的溶解作用为有害藻类水华的防治 提供了新的生物控制可能性。随着全球水体富营养化的加剧，水华的爆发日趋频繁， 其造成的环境和经济问题日益引起人们的重视，在利用物理、化学和其它生物方法 防治水华不甚理想的情况下，溶藻细菌作为水华防治的可能生物，引起了众多科研 人员的关注，溶藻细菌的研究已成为一个富有挑战性的课题。 8 硕士学位论文 m a s t e r 。s t h e s i s 3 溶藻细菌治理水华的研究 3 1 溶藻细菌研究概况 所谓溶藻细菌是指：通过直接或间接方式，抑制藻类生长，或杀死藻类，从而溶解 藻细胞的细菌。溶藻细菌的研究在国外已有数十年历史。早在1 9 2 4 年, g e i t l e r 报道 一种粘细菌p o l y a n g i u m p a r a s i t i u m 寄生在刚毛藻a 删劬砌朋上，使藻死【柏】。溶藻细菌 在国内外文献中陆续有一些报道，主要有：粘细菌( m y x o b a c t e r i a ) 5 7 】、噬胞菌属 ( c y t o p h a g a ) 1 5 s , 5 9 1 、纤维弧菌属( c e l l v i b r i o ) 、节杆菌( a r t h r o b a c t e r ) 嗍、屈挠细菌 属( f l e x i b a c t e r ) 、蛭弧菌( b d e l l o v i b r i ob a c t e r i o u s ) 、杆菌( b a c i l l u s ) 、黄杆菌属 ( f l a v o b a c t e r i u m ) 、 菌( v i b r i o ) j 、腐生螺旋体属( s a p r o s p i r a ) 、假单胞菌 ( p s e u d o m o n a s ) 6 2 - 6 4 1 、鞘氨醇单胞菌属( s p h i n g o m o n a s ) 1 6 5 1 、交替单胞菌( a l t e r o m o n a s ) 6 6 】、交替假单胞菌( p s e u d o a l t e r o m o n a s ) 等。这些细菌多为革兰氏阴性菌，它们的作 用对象比较广泛，既有蓝藻，也有硅藻和甲藻。 3 2 溶藻细菌的溶藻方式及机理 溶藻菌对藻细胞作用的方式和可能机理主要有以下5 种：直接接触溶藻、释放 杀藻物质、细菌与藻竞争营养物、形成菌胶膜及进入藻细胞内杀灭藻细胞。 ( 1 ) 直接接触溶藻 一些溶藻菌直接与藻细胞接触，通过释放可溶解纤维素的酶而消化藻细胞的细 胞壁，进而逐渐溶解整个藻细胞。如前所述的粘细菌对蓝藻、鱼腥藻、束丝藻、微 囊藻以及多种颤藻的溶解作用【6 7 一，噬胞菌属( j 1 8 m 0 1 ) 和腐生螺旋体属( s s 9 8 5 ) 能 够特异性地与横裂甲藻和硅藻接触溶解藻细胞陋, 7 0 1 。 ( 2 ) 释放杀藻物质 细菌可以通过释放特异性或非特异性的胞外物质杀死藻细胞，目前报道的细菌 杀藻物质主要有蛋白质、多肽类物质以及抗生素。这类细菌常见的有弧菌、假单胞 菌、黄杆菌、交替单胞菌、假交替单胞菌等。l e e 从海水中分离的一株交替假单胞 菌a2 8 能杀死骨条藻。将a2 8 的上清液经超滤所获得的浓缩上清液显示出杀藻活性。 这表明a2 8 能产生细胞外大分子物质杀藻，经分析该大分子物质为一种胞外丝氨酸 蛋白酶i7 1 】。一种被囊交替假单胞菌( d 2 ) 能够分泌一种分子质量为1 9 0k d 的毒性蛋白 a l p p ，该蛋白也具有杀藻活性l r z 。在日本湖泊中分离出铜绿假单胞菌，其分泌的 绿脓杆菌素以及碱性蛋白酶，可能是溶解微囊藻的主要物质【7 3 1 。从具有强烈杀藻活 性的芽孢杆菌的s y - 1 菌株中分离出一种新的溶藻物质b a c i l l a m i d e ，通过二维n m r 技术分析出其结构为一种多肽，它对多环旋沟藻有特异性的杀灭作用，半数致死量 9 ( l c 5 0 ) 为3 2l a g m l 1 。对由多环旋沟藻引起的有害水华有明显的抑制作用1 7 4 。 k a w a n o 等从柄细菌属的p k 6 5 4 菌株中分离出一种抗生素t h i o t r o p o c i n ，此抗生素对赤 潮中的中骨条藻和赤潮异湾藻有明显的抑制作用【7 5 1 。 ( 3 ) 细菌与藻竞争营养物 有些细菌可通过c 、n 、p 、k 等物质与藻类产生直接或间接的联系。如芽孢杆 菌的生长需要氮磷等物质的营养支持，从而会使水体中的氮磷含量下降，进而使水 体无法满足微囊藻的生长需要。同时芽孢杆菌还可以微囊藻藻体作为碳源加以利 用，另外部分真菌和放线菌也会同藻类抢夺有限的营养物质，抑制藻类的生长【柏j 。 ( 4 ) 形成菌胶膜 如腐败菌、亚硝酸菌、大肠杆菌、枯草杆菌等大量出现时，单细胞藻类培养 物会产生沉淀而颜色交黄，同时发生化学变化而发出氨臭味，另一方面，可在静 止的水面集结形成菌胶膜，有碍气体交换和光线的透射，导致水环境恶化，致使 藻类死亡。 ( 5 ) 进入藻细胞内杀死藻细胞 这种溶藻方式极其少见，有人从水华铜绿微囊藻中分离出一种类似蛭弧菌的细 菌，这种细菌能够进入铜绿微囊藻的细胞并使藻细胞溶解口6 1 。 3 3 溶藻细菌的一般分离方法 溶藻细菌的分离一般可分为液体感染分离法和固体感染分离法，液体感染分离 法适用范围广，但过程比较复杂，工作量大；固体感染分离法虽然简单、直观，但 是仅能筛选在固体培养基中生长的细菌。 ( 1 ) 液体感染法筛选溶藻细菌 利用液体感染方法筛选溶藻细菌，h a y a s h d as t 7 7 l 和y o s h i k a w ak 等首先采用随 机分离方法，即先从水样中分离细菌，获得纯培菌株，然后将纯培菌株分别加入藻 类的培养物中进行共同培养，通过检测能够导致藻类生物量下降或藻细胞溶解的菌 株即为溶藻细菌。但是这种方法劳动量较大，如果水样中不含有溶藻细菌，前期的 工作就成了无用功。因此研究者一般先确定水样中是否含有溶藻细菌，确认水样中 含有溶藻细菌后再进行分离筛选。利用液体感染方法分离溶藻细菌，一般采用下述 程序：水样的采集及预处理；水样和藻类的共同培养；黄化培养体系中优势 细菌的分离；溶藻细菌的筛选。 ( 2 ) 固体感染法筛选溶藻细菌 采用固体培养基分离溶藻细菌主要利用空斑形成( p l a q u ef o r m a t i o n ) 的方法进 l o 行。主要有涂布平板法、软琼脂项层平板法( s a o l d 。涂布平板法即将宿主藻在琼 脂培养基中预培养至藻落出现，然后将水样涂布藻落上继续培养，待出现扩展的溶 藻空斑后，从单个空斑取样，转入细菌培养基，最后划线获得溶藻菌株。由于涂布 接种的方法易于机械性损伤藻类，同时也难以分离一些抑制藻类生长细菌，效果不 太理想，目前采用者甚少。 获得细菌溶藻空斑的另一个方法是s a o l t 法，1 9 “年s a f f e r m a n 首先采用 s a o l t 法分离和检测蓝藻病毒，1 9 7 0 年s 1 1 i l o 始用于分离检测溶藻细菌【7 8 1 ，后经 许多研究者的不断发展和完善，目前己成为一种分离溶藻细菌，尤其是淡水生态系 统中溶藻细菌的常用方法嗍。 其基本操作思路如下：制备两种藻类固体培养基，琼脂培养基( a g a rm e d i u m ) 和 软琼脂培养基( s o m a g 盯m e d i u m ) ，以琼脂培养基作底层平板，水样、预培养的藻和 熔化并冷却至4 7 的软琼脂培养基混合均匀迅速倾注到底层平板，琼脂固化后进行 培养，至扩散的溶藻空斑出现后，通过单斑纯化获得溶藻菌株1 8 0 1 。 3 。4 溶藻细菌的研究趋势 3 4 1 分离高效稳定的溶藻细菌 目前，分离到的溶藻细菌的溶藻效果都不十分稳定，而且有效的溶藻浓度都比 较高，因此分离高效稳定的溶藻细菌必将是溶藻细菌研究的一个重要趋势。 3 4 2 在分子水平上研究溶藻细菌的作用机制 目前，在分子水平上对溶藻机制的研究还是一片空白，因此研究和分离溶藻基 因( 或质粒) ，阐明溶藻机制，尤其是对于溶藻细菌和宿主之间相互作用关系的分子 生物学研究更需要加强，在此基础上通过基因工程操作。在此基础上构建能溶藻的 工程菌株必将是藻类污染生物防治领域中富有挑战性的研究课题3 1 l 。 4 粘细菌溶藻 粘细菌是最早被报道的溶藻细菌。s l l i l o 【5 6 】是从发生水华的湖泊中分离出来的一 株粘细菌，分子鉴定其为粘球菌属或多囊菌属，属于嗜细菌类群的粘细菌