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c p 0 在聚赖氨酸修饰电极上的电化学行为及其电催化研究 摘要 赖氨酸是碱性必须氨基酸，是构成生物体的基本物质之一，其兼有氨基和羧 基双功能团的独特性质。聚l 赖氨酸( p l l ) 分子中存在大量游离氨基，对蛋白 质具有广泛的亲和力，具有良好的耐热性、化学稳定性和机械性能，可有效增强 生物细胞或分子与电极表面问的吸附力从而促进酶或蛋白质的直接电子传递，是 一种固定化酶的优良载体。本研究工作选择电聚合p l l 为固定酶的载体。 本文先以与c p o 性质及分子量较为接近的血红蛋白( h e m o g l o b i n ，h b ) 作 为研究模型，探索其在p l l g c 电极上的固定化方法，继而应用于c p o ，提高 实验效率。最终确定应用电化学方法在玻碳电极上修饰聚l 赖氨酸膜，以1 - 乙 基( 3 二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐( e d c ) 做交联剂，固定c p o 。修饰 电极的循环伏安曲线呈现一对可逆的氧化还原峰，表明聚l 赖氨酸能够很好地 促进氯过氧化物酶在电极表面的直接电子传递，这是一个受吸附控制的准可逆电 子传递过程，还伴随有质子的转移。该电极有很好的稳定性，并能显著地电催化 氧的电化学还原反应。 在c p o p l l g c 修饰电极的基础上制得c p o p l l c p o p l l g c 修饰电极， 能观察到该电极上c p o 的直接电子传递反应，是表面控制过程，对氧气的电化 学还原具有显著的催化效应。不同p h 值缓冲溶液中循环伏安测试表明，式量电 位随溶液p h 值增大而负移呈现一斜率为3 9m v p h 的直线关系，表明直接电子 传递的同时伴随质子的转移，详细机理尚待深入研究。 本研究工作尝试将c p o p l l g c 修饰电极应用于催化m c d 的氯化。紫外光 谱跟踪测试结果显示，固定在p l l g c 电极表面的c p o 能够很好的催化m c d 转化为d c d ，初步探讨了c p o 的电催化机理。 关键词：氯过氧化物酶，聚l 一赖氨酸，电聚合，电催化，直接电化学，修饰电极 d i r e c te l e c t r o c h e m i s t r ya n di t sa p p l i c a t i o nf o rc a t a l y s i s r e a c t i o n so f c h l o r o p e r o x i d a s ea tg c m o d i f i e dw i t hs w n t s a b s t r a c t t h el y s i n ei st h eb a s i ce l e m e n tt oc o m p o s et h eo r g a n i s mw h i c hh a st h ef u n c t i o n o ft h ea m i n og r o u pa sw e l la st h ec a r b o x y lg r o u p t h e r ea r em a n yf r e ea m i n o e x i s t i n g i nt h e p o l y - l l y s i n ew h i c hh a sg r e a ta f f i n i t y t ot h ep r o t e i n , a sw e l la sh i g h t h e r m o s t a b i l i t y , c h e m i c a ls t a b i l i t ya n dm e c h a n i c s t h e r e f o r et h ep o l y - l - l y s i n ei sa n i d e a ls u p p o r tt oi m m o b i l i z et h ee n z y m eb e c a u s et h ea d s o r p t i o nb e t w e e nt h ec e l lo r m o l e c u l a ra n dt h es u r f a c eo ft h ee l e c t r o d ec a l la c c e l e r a t et h et r a n s f e ro ft h ee l e c t r o n i nt h i sw o r k ，t h ep l li sc h o s e na st h es u p p o r tt oi m m o b i l i z et h ee n z y m e w ef i r s tu s e dt h eh e m o g l o b i n ( h b ) w h i c hh a st h es i m i l a rm o l e c u l a rw e i g h ta n d p r o p e r t yt ot h ec p oa st h em o d e l ，i no r d e rt oe x p l o r et h ew a yo fi m m o b i l i z a t i o n w h i c hw a st h e na p p l i e dt ot h ec p o p o l y - l l y s i n e ( p l l ) w a se l e c t r o p o l y m e r i z e do n t o t h es u r f a c eo fg l a s s yc a r b o n ( g c ) e l e c t r o d e 1 - ( 3 一d i m e t h y l a m i n o ) p r o p y l 一3 - e t h y l - c a r b o d i i m i d eh y d r o c h l o r i d e ( e d c ) w a su s e dac r o s s l i n k i n ga g e n tt oi m m o b i l i z e d c h l o r o p e r o x i d a s e ( c p o ) o n t ot h ep l l g ce l e c t r o d e ap a i ro fw e l l d e f i n e dr e d o x p e a k sw a so b s e r v e da tc p o p l l g ce l e c t r o d ec l e a r l ys u g g e s t e dt h a tp l lc a n p r o m o t et h ed i r e c te l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e nt h ec p oa n dt h eg ce l e c t r o d e t h e c y c l i cv o l t a m m e t r i cr e s u l t sa l s os h o w e dt h d t h ee l e c t r o nt r a n s f e ra tc p o p l l g ci sa s u r f a c ea d s o r p t i o n c o n t r o l l e dq u a s i r e v e r s i b l ep r o c e s s ，w h i c hi sa c c o m p a n i e dw i t h p r o t o nt r a n s f e r t h ec p o - p l l g ce l e c t r o d ee x h i b i t e dag o o de l e c t r o c h e m i c a l s t a b i l i t ya n de x c e l l e n t l ye l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yf o re l e c t r o c h e m i c a lr e d u c t i o no f0 2 t h ec p o - p l l - c p o p l l g ce l e c t r o d ew a sp r e p a r e db a s e do nt h e s i m i l a r p r e p a r a t i o nm e t h o do fc p o p l l g ce l e c t r o d e 1 1 1 ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so f i m m o b i l i z e dc p oo ne l e c t r o d ew e r ei n v e s t i g a t e db yc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) t h e c vr e s u l t so b t a i n e ds h o w e dt h a tc p ow a ss u c c e s s f u l l yi m m o b i l i z e do nt h ep l l g c e l e c t r o d ea n daf a s td i r e c te l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e nc p oa n de l e c t r o d eh a sb e e n a c h i e v e d a n dt h er e s u l t so fc y c l i cv o l t a m m e t r yw i t hd i f f e r e n ts c a nr a t e sr e v e a l e dt h a t t h ed i r e c te l e c t r o nt r a n s f e ri sar e a c t i o nc o n t r o l l e db yt h es u r f a c ea d s o r p t i o np r o c e s s t h ec p o - - p l l - c p o - - p l l g cm o d i f i e de l e c t r o d es h o w e dag o o dc a t a l y t i ca c t i v i t yf o r e l e c t r o c a t a l y t i c a lr e d u c t i o no f0 2 t oi n v e s t i g a t et h ep hd e p e n d e n c e ，c y c l i c v o l t a m m e t r yw a sp e r f o r m e da td i f f e r e n tp h a ni n c r e a s ei np ho fb u f f e rs o l u t i o n sl e d t oan e g a t i v es h i f ti nb o t hr e d u c t i o na n do x i d a t i o np e a kp o t e n t i a l s ，l i n e a rr e l a t i o n s h i p o ff o r m a lp o t e n t i a lv s p hw i t has l o p eo f3 9m v p h i nt h i ss t u d y , m o d i f i e de l e c t r o d eo fc p o - p l l g ch a v eb e e na p p l i e dt oc a t a l y z e t h ec h l o r i n a t i o no fm o n o c h l o r o d i m e d o n e ( m c d ，h a v eu va d s o r p t i o na t2 7 8n n l ) t o d i d o c h l o r o d i m e d o n e ( d c d ，n ou va d s o r p t i o n a t2 7 8 n m ) u s i n gau n i q u e e l e c t r o c h e m i c a ls y s t e mw h i c hu s e du vs p e c t r u ma d s o r p t i o nt oo b s e r v et h er e a c t i o n t h er e s u l t so fu vs h o w e dt h a tm c dh a sb e e nc a t a l y z e dt od c dw i t hc p o p l l g c m o d i f i e de l e c t r o d e t h ec a t a l y z e dm e c h a n i s mo fc p ow a sd i s c u s s e d k e yw o r d s ：c h l o r o p e r o x i d a s e ，p o l y - l l y s i n e ，e l e c t r o d e p o s i t i o n ，e l e c t r o c a t a l y s i s ， d i r e c te l e c t r o c h e m i s t r y , m o d i f i e de l e c t r o d e i i i 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：进荧 论文使用授权声明 日期：乃吁娴，7 一 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名： 芬发 新签名：募躲 瞄6 7 c p 0 在聚赖氨酸修饰电极上的电化学行为及其电催化研究 第一章绪论 生物酶( e n z y m e ) 是由生物体内活细胞产生的、具有催化作用的有机物，其中 大多数由蛋白质组成，极少数为r n a 。作为生物催化剂，酶立体专一性、区域选择 性强，催化效率高，利用酶可通过有限的步骤实现诸多化学方法难以完成的反应。 酶催化反应勿须高温高压、强酸强碱等剧烈条件，常温常压下即可进行，能有效地 减少设备费用，极大节省能源。酶源于生物体，是无环境毒害的、生物可降解物质， 符合当代绿色化学的发展要求。尤其是，在有机化学反应选择性上更显示出了无可 比拟的优越性。由此，酶在生物催化应用领域具有广阔的前景m 2 】。然而，将酶作为 催化剂直接置于反应体系进行生产，其实际的选择性和催化活性尚不尽如人意，因 此，为改善这种状况而进行的探索极具意义。 赖氨酸是构成生物体的最基本物质，因其兼具氨基和羧基两种功能团而产生了 很多独特的性质。通过电化学方法将其聚合于电极表面、继而研究聚赖氨酸修饰电 极在生物分析中的应用已见报道【3 巧】。本研究小组也已经有关于l 赖氨酸修饰电极 的电化学行为研究的工作报道【6 】。 本研究工作则着重考察固定在电聚合制备的聚l 赖氨酸修饰电极上的酶的直 接电子传递行为，在获得对氧还原良好的电催化效果的基础上，探索生物酶在催化 有机化学反应中应用的可行性。 1 1 研究背景 酶是大分子，分子量一般在一万以上，其本质是具有催化功能的蛋白质。与其 它蛋白一样，酶由氨基酸长链构成，具有一、二、三、四级结构，其中一部分链呈 螺旋状，一部分呈折叠的薄片结构，两部分由不折叠的氨基酸链连接起来，从而使 完整的酶蛋白分子呈现特定的三维结构。酶的催化作用有赖于作为一级结构的氨基 酸的排列顺序和空间结构的完整，一级结构的变化将导致酶的变性或失活。酶分子 中与底物结合并发生催化反应的区域是酶的活性中心，它仅由酶分子结构中少数几 个氨基酸残基构成，这些残基在一级结构上可相距很远，甚至位于不同肽链，但借 助肽链的空间构型而彼此接近，构成特定的活性结构。 1 1 1 生物酶及其催化研究现状 尽管酶用于催化反应具有诸多优点，然其作为生物催化剂在大规模工业生产中 的应用并不十分普遍，主要基于以下原斟7 8 】：首先，酶源自生物体，大多数酶适应 细胞内部的稳定环境，而催化反应环境中存在的热、强酸、强碱、氧化剂、重金属 离子、表面活性剂等因素都可能使酶分子的三维结构发生改变，从而导致酶分子失 活，破坏酶的稳定性。其次，一些酶对辅酶( 一类可将化学基团从一个酶转移到另 一个酶的有机小分子) 具有很强的依赖性，而辅酶的价格一般较贵，这将大大提高 应用成本。此外，将酶作为催化剂直接置于反应体系中，其选择性和催化活性还不 尽如人意。同时，酶的来源及成本也限制了酶的广泛应用。许多工业用酶种类有限、 成本较高，目前工业生产所涉及的6 0 多种酶，仅占已知鉴定出的4 0 0 0 多种酶的1 7 ， 而其中真正达到工业规模的只有2 0 多种。因此，进一步研究酶的作用机理，寻找 更多成本合适、具有应用潜力的新型酶源以满足对酶种类的不断需求，探索相应辅 酶替代物的生化代i 隽 途径是实现酶工业化应用亟待解决的问题，也为绿色化学的发 展开拓了更加宽广的领域。随着现代分子生物学和生物化学技术的发展，生物印迹， 酶的固定化，酶的交联技术，酶的化学修饰，以及酶的定向进化等为解决上述问题、 提高酶的应用开辟了新的途型9 1 。 早在1 8 世纪初，科研工作者就丌始为酶的广泛应用而开展了积极的探索。1 9 5 3 年，s c l d e i t h 和g r u b h o f e r j 首次将聚氨苯乙烯树脂重氮化，成功将淀粉酶、羧肽酶。 胃蛋白酶和核糖核酸酶等结合在树脂上。现如今，酶己广泛应用于医药、印染、食 品加工、石油钻井和三废治理等方面，相关的研究也有了越来越多的报道。n o z a w a 等【】o 】将壳聚糖( c h i t o s a n ，c s ) 研磨成粉，与同为粉状的胰蛋自酶混合研磨，利用吸 附作用固定胰蛋白酶，研究表明，固定化效果与研磨时间呈正变关系。w a n g 等【l l ，1 2 】 采用具有双醛基功能团的戊二醛作交联剂，以脱乙酰壳多糖作载体，将辣根过氧化 物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e , h r p ) 固定在其表面。j i n 和s u 等1 1 3 】探究了一种用固 定化辣根过氧化物酶催化合成聚苯胺( p o l y a n i l i n e ，p a n i ) 的新方法，这种固定化酶， 在p h = 6 0 的缓冲溶液中室温保存7 2h 后，仍然具有相当大的活性，经吸收光谱表 征，证实其产物同用酶溶液作催化剂得到的产物相同。a r i a nv a i lw i j k 1 4 】等人通过对 近三十种伯醇的催化反应研究，就合成乙醛的前景和局限性，对酒精氧化酶( a l c o h o l 2 o x i d a s e ) 和半乳糖氧化酶( g a l a c t o s eo x i d a s e ) 进行了客观的比较。研究发现，这两 种氧化酶在合成方面的应用各自有其不同的领域。酒精氧化酶应用较广，在催化脂 肪族的直链伯醇方面效果显著，相比较而言半乳糖氧化酶应用稍窄，主要用于半乳 糖源底物，相对单一。然而，在温和的水溶液环境中，这两种氧化酶却又皆可用于 催化制备功能化乙醛的反应。与此同时，研究小组已发现利用酒精氧化酶结合另一 种醛缩酶，通过两步反应成功制备出具有手性特征的丁间醇醛的新方法。在国际形 势的引领下，国内学者也取得了不少科研进展。刘伟东【l5 】在丁二酸二酯磺酸钠( a o t ) 反胶束体系下，利用其实验室自制的脂肪酶c a n d i d as p 9 9 1 2 5 ，成功地催化了大豆 油合成出生物柴油。魏荣卿等【1 6 】以壳聚糖为载体，与双醛淀粉反应建立酶柔性固定 化模型( c h i t o s a nd a s 5 0 ) ，固定了木瓜蛋白酶。在p h = 8 0 、木瓜蛋白酶用量为 1 4 4 m g g ( 酶干球) 的条件下，经1 8 h 固定所得的木瓜淀粉酶的酶活力回收率达 7 2 ，相当于采用壳聚糖一戊二醛( c h i t o s a n ，g a ) 载体进行普通酶固定化的3 倍。 氯过氧化物酶( c h l o r a p e r o x i d a s e ，c p o ) 是生物酶蛋白的一种，具有生物酶通 性的同时又因其独特的活性腔结构而拥有优秀、多样的催化活性，在有机合成、生 物转化等众多领域引起了越来越多的关注。 1 1 2 氯过氧化物酶催化研究现状 c p 0 是h a g 一1 7 等人于上个世纪6 0 年代首次从海洋真菌c a l d 撕o m y c e s 如m a g o 中 分离得到的、一种应用广泛的过氧化物酶 1 8 之。玎。c p o 分子量约4 2 k d a ，等电点范围 3 2 4 o 【2 1 1 ，含3 1 2 个多属酸性的氨基酸残基。c p o 以高铁( ) 原卟琳为辅基，兼具过 氧化物酶和细胞色素p 4 5 0 的结构陷2 4 1 ，但与普通亚铁血红素过氧化物酶又有显著 差别。c p o 中铁卟啉环的的近端以半胱氨酸( c y s 2 9 ) 的硫原子代替组氨酸的氮原子作 为第五轴向配体【2 5 】，远端则以谷氨酸( g l u l 8 3 ) 而非组氨酸作为酸碱催化成分【2 6 之9 】。 此外，c p o 分子的铁卟啉环还包含一个疏水基团【3 0 1 ，该疏水基团有效增强了c p o 与 底物的结合能力。c p o 独特的活性位点结构使其成为已知血红素过氧化物酶中应用 范围最广的生物催化剂，它集过氧化氢酶、细胞色素p 4 5 0 和血红素过氧化物酶三者 催化活性于一身，能有效地催化环氧化【3 1 ，3 2 1 、氧化卤化、氧化去氢、双氧水歧化、 羟基化和氧传递等反应，更因其广泛的底物适应性、较高的立体选择性和稳定, 生t 3 3 , 3 4 】 显示了广阔的应用前景。c p o 已逐渐成为现代医药工业和合成化学领域极具魅力的 手性催化剂，相关的应用报道也已见报端。j o h 【35 】等用c p o 代替传统无机催化剂催 3 化氧化了对二甲苯，在获得对苯二酸的同时有效地避免了大量重金属离子污染源的 产生。r o b e r tl 。o s b o r n e 3 6 】等人将c p o 应用于催化烯烃环氧化，也取得了较为理想的 效果。h a g e r 矛i l a l n e r ”】将c p o 应用于多步反应、成功合成了手性r m e v a l o n o l a c t o n e ， 产率可达5 7 ，e e 值达9 3 。 然而，早期已有的报道大多是将c p o 作为催化剂直接应用于均相体系，极大地 增加了c p o 酶的用量及成本。同时，必需人为地加入h 2 0 2 以启动生成催化成分高的 活性态c p o ( f e i v = o ) ，而过量h 2 0 2 的加入会导致酶的失活，使得反应可控性难度 大大增加。为此，近年来，许多研究者作出了不懈努力，以期提高c p o 的催化活性 和单位用量的利用率。a a t z i a l l a 3 8 】等以苯乙烯环氧化和一氯二甲酮( m o n o c h l o r o d i m e d o n e m c d ) 的氯化作反应模型，对如何增强c p o 在自由三重水一有机溶剂体 系中的稳定性和催化性能进行了研究。结果发现，在低水分含量环境中c p o 自身的 活性位点结构并未遭到破坏。i v i c am a l n a r 【3 9 】等摸索了一系列实验条件，希望用c p o 催化氯化万古霉素，在其结构中引入氯原子以获得抗菌性能更优的药物。c a r l e l o v s o ng r e y l 4 0 使用咖啡酸作为抗氧化剂抗大大提高了c p o 的稳定性，4m m o l l h 2 0 2 、酸性条件下咖啡酸的加入可使c p o 转化数由2 8 7 0 0 提高至1 3 5 0 0 0 ，如进一步 降低h 2 0 2 浓度，转化数可再提高至后者的1 3 倍。h a g e r 等利用c p o 的催化特性， 在h 2 0 2 或叔丁基氢过氧化物( t b h p ) 存在下催化氧化2 炔为对应醛，该过程的 中间体不对称炔丙醇在c p o 和h 2 0 2 的水溶液中快速地转化成了醛，转化率9 5 。 由于c p o 是水溶性的，故在催化反应之后，难以与催化产物分离、回收，重 复利用率低。另一方面，游离态的c p o 在强酸、强碱、高温、有机溶剂和高离子 强度等剧烈条件下稳定性不佳，极易失活，造成巨大浪费。因此，旨在提高酶的稳 定性和环境适应能力的酶的固定化研究具有重要意义。a b u r t 0 1 4 2 以多功能型介孔材 料s b a 1 6 为载体通过物理吸附作用固定c p o ，若在酶的表面注入铯离子或通过共 价键将其与一种有机硅烷衍生物交联，则c p o 的稳定性和催化活性都将大大提高。 t r e v i s a n 等【4 3 】把c p o 装入多微孔硅胶笼，以h 2 0 2 为氧化剂催化氧化硫化物。固定 化的c p o 稳定性好、反应活性高，且对目标产物的生成具有相当高的立体选择性。 近年来，本研究小组分别利用单壁碳纳米管“ 4 5 1 、分子层层自组装方法【矧、室 温离子液体【4 7 】等将c p o 成功地固定到不同的电极表面，获得c p o 良好直接电子传 递的同时对氧气的还原有较好的电催化效果。此外，将该修饰电极应用于一氯二甲 4 酮催化氧化为二氯二甲酮的反应液获得了成功。 1 1 3 赖氨酸的基本特性及其应用研究进展 赖氨酸是碱性必须氨基酸，是构成生物体的基本物质之一，其兼有氨基和羧基 双功能团的独特性质。聚赖氨酸膜修饰电极因其具有良好的稳定性、催化活性、高 选择性及修饰方法简单等优点，使其在化学和生物学等领域中得到了广泛的研究和 应用。 通过电化学的方法将l 赖氨酸聚合到电极表面制得的聚l - 赖氨酸 ( p o l y - l 1 y s i n e ，p l l ) 修饰电极可应用于对乙酰氨基酚 5 1 、去甲肾上腺素【4 1 、多巴胺 【3 1 等的检测。t o m i n a g a 等【4 8 1 把铁蛋白固定在p l l 修饰的氧化铟电极上研究它的氧化 还原反应。r u s l i n gj a m e s 等【4 9 5 3 】利用e d c 将肌红蛋白( m y o g l o b i n ，m b ) 固定到已 修饰p l l 的热解石墨( p g ) 电极上，显示出卓越的催化活性和热稳定性。众多实 验结果都表明，p l l 具有良好的耐热性、化学稳定性和机械性能，可有效增强生物 细胞或分子与电极表面的吸附力，从而促进酶或蛋白质的直接电子传递。另一方面， p l l 分子中存在大量游离氨基，对蛋白质具有广泛的亲和力，其既可与酶以共价方 式交联，又可结合各种金属离子，极大地降低了酶中毒的可能性，是一种固定化酶 的优良载体。r u s l i n g 研究小纠5 2 1 发现，将p l l 和m 或其它过氧化氢酶通过共价 交联交替修饰在预处理过的p g 电极表面得到的修饰电极可用于催化苯乙烯的环氧 化，且转化率高，p l l 膜中的m b 在9 0 0 c 溶液中依然可稳定存在长达9h ，电极表 现出良好稳定性。而未经p l l 修饰的酶同样条件下仅能维持存在2 0m i n 左右。陈 佳龙等【删将p l l 肝素和胶原多层膜组装于金属钛表面改善血液相容性。s u y e 等 将葡萄糖氧化酶( g l u c o s eo x i d a s e ，g o d ) 固定到修饰了p l l 的聚碳酸酯膜上制得 的复合膜应用于葡萄糖传感器的研发，经p l l 修饰的g o d 对不同酸度的缓冲溶液 有更好的适应性和热稳定性。这些研究为p l l 修饰膜在催化体系中的应用开拓了新 思路。 1 2 本论文的主要研究内容及意义 血红蛋白( h e m o g l o b i n ，h b ) 与c p o 共有催化结构铁卟啉。本实验中首先尝试 以h b 作模型化合物【5 6 】，研究其在电聚合p l l 膜修饰电极上的固定及其电化学行为， 5 在此基础上进一步进行c p o 的固定及催化应用研究。 尝试利用简单易行的循环伏安法在玻碳电极上电聚合l 赖氨酸膜，再将h b 或 c p o 固定到p l l g c 电极表面，以获得其在g c 电极表面的直接电子传递。在此基 础上，将固定c p o 的p l l g c 修饰电极应用于对m c d 氯化反应的催化，结合紫外 吸收光谱和不同条件下的循环伏安表征，对反应机理进行初步探究。以期在有效利 用c p o 在氧气环境中自身产生h 2 0 2 的同时达到催化目的，降低成本，提高c p o 利用率，为大规模的工业应用开辟道路。 在单层修饰电极的基础上，进一步探索多层修饰膜的制备、提高修饰电极的催 化性能和稳定性。 1 3 本文的创新性 c p o 在电聚合l 赖氨酸膜修饰电极上的固定化研究目前尚未见报道。本研究工 作以循环伏安法在g c 电极表面聚合p l l 膜，并用以固定c p o 。经考察，修饰电极 电化学性能稳定，具有良好的耐高温性，7 0 0 c 时仍可保持较稳定的氧化还原峰，为 进一步研究酶在高温条件下的催化奠定了基础。该电极用于催化氯化m c d 的反应， 并初步讨论了相关的反应机理。应用本实验技术，有效地利用c p o 原位产生的h 2 0 2 在m c d 分子上引入氯原子，避免了人为加入h 2 0 2 以启动反应而引起的c p o 失活 问题，降低了反应成本。 在此基础上实现双层c p o 、p l l 膜的交替修饰，同步实现其在电极表面的直接 电子传递，该电极在除氧条件下的循环伏安响应电流和氧气气氛下对氧的电催化还 原均优于单层修饰的c p o p l l g c 电极，为c p o 在电极表面的多层固定及相应电 化学行为研究提供了有价值的信息。 6 第二章生物酶在聚赖氨酸修饰电极上的固定化 及其电化学性能研究 天然生物大分子血红蛋白( h e m o g l o b i n ，h b ) 是生物体内存储和运输氧气的主 要物质，相对分子量在6 4 0 0 0 6 7 0 0 0 之间，是由四条肽链( 其二级结构瓠口多肽 链各两条) 构成的一种寡聚蛋白质。四条肽链中各自所含的亚铁血红素分子相互接 近，可发生f e ( i i i ) f e ( i i ) 电对得失电子的氧化还原反应。尽管h b 在生物体系中并 非作为电子传递媒介而存在，但因其低廉的价格，已知确定高度类似辣根过氧化物 酶的结构，以及其极类似于过氧化物酶的氧化、还原催化活性，日益成为研究亚铁 血红素( h e m e ) 蛋白电子转移的理想模型。 p l l 具有良好的耐热性、化学稳定性和机械性能，可有效增强生物细胞或分子 与电极表面间的吸附力从而促进酶或蛋白质的直接电子传递；p l l 分子中存在大量 游离氨基，对蛋白质具有广泛亲和力，既可与酶以共价方式交联，又可结合各种金 属离子，极大地降低了酶中毒的可能性，是一种优良的固定化酶载体。 本文选择与c p o 性质及分子量( 4 2 k d a ) 较为接近的h b 作为研究模型，探索 其在p l l 修饰的g c 电极上的固定化方法，然后将探索所得的p l l 电聚合及其固 定化的实验条件应用于c p o 的固定，并在c p o 修饰电极的电化学行为进行研究的 基础上，探索应用于有机催化反应的可行性。 2 1 实验部分 2 1 1 实验试剂 e n z y m e ：c p o ( s i g m a 公司) ，h b ( 上海博奥生物科技有限公司) ；1 乙基 ( 3 - 二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐( 1 一 ( 3 - d i m e t h y l a m i n o ) p r o p y l 一3 e t h y l c a r b o - d i i m i d eh y d r o c h l o r i d e ，9 9 ，e d c ，上海共价化学科技有限公司) ；l 赖氨酸( s i g m a 公司) ，使用前用磷酸缓冲溶液( p b s ，p h = 9 0 ，5 0r e t o o l l ) 配制成1 0m m o l l 储 备液；5 0m m o l l 磷酸缓冲溶液( p b s ，k h 2 p 0 4 - n a 2 h p 0 4 ) 用超纯水( h e a lf o r c e 超 纯水器，上海康雷分析仪器公司) 配制，根据实际需要调至相应p h 值，内含0 1m o l l k c l 支持电解质。其它试剂皆为分析纯，所有溶液均用超纯水配制。 7 2 1 2 实验仪器 电聚合及相关电化学测试使用计算机软件控制的c h i6 5 0 电化学工作站( 上海 辰华公司) ，采用常规三电极体系。其中，工作电极为g c 电极( 由= 3m m ) 或修 饰电极，参比电极为饱和甘汞电极( 文中所示电位均相对于此电极) ，对电极为铂 片电极。考察氧还原反应的电催化效应须在氧气气氛中进行，其它电化学测试测量 前均先通高纯氮气除氧，在氮气气氛下进行。除特别说明外，实验均于室温下进行。 2 1 3e n z y m e p l l g c 修饰电极的制备 g c 电极( 咖= 3m m ) 用6 _ i f i 金相砂纸打磨，并在麂皮上依次用0 3l a m 和0 0 5b t m 的0 【a 1 2 0 3 粉末抛光至镜面，然后分别用纯水和无水乙醇超声清洗、氮气吹干备用。 将上述玻碳电极置于已配制好的1 0m m o l lp h = 9 0 的l 赖氨酸储备液中，通 高纯氮至饱和除氧后以1 0 0m v s 的扫速，在1 0 2 5 v 电位范围内进行循环伏安扫 描，以聚得p l l 膜，而后用超纯水轻轻淋洗电极表面、室温干燥，制得p l l g c 电 极；另取2p lh b 溶液( o 5m m o l l ) 和3g le d c 溶液( 2 4 m m o l l ) 混合后滴于 p l l g c 电极表面，室温干燥，制得h b p l l g c 电极，如换作取lu lc p o ( 2 3 1 0 4 m m o l l ) 和4g le d c 溶液( 2 4m m o l l ) 混合后滴于p l l g c 电极表面，室温干燥， 则制得c p o p l l g c 电极。 2 2h b p l l g c 修饰电极的电化学行为研究 2 2 1 电聚合条件对h b - p l l g c 修饰电极的电化学行为影响 图1 为应用循环伏安扫描进行l 赖氨酸电聚合时的实验结果。从图中可以看出， 氧化峰电流随着扫描圈数的增加而不断增大，表明l 赖氨酸在电极表面发生氧化聚 合。聚合物膜厚度与扫描圈数密切相关，当循环扫描达8 次后，可观察到峰电流几 乎不再增大，表明l 赖氨酸在电极表面的聚合已接近饱和。此时，可观察到电极表 面形成了一层光亮的p l l 薄膜。为了获得最佳的修饰膜，分别采用循环扫描6 、8 、 1 0 次进行l 赖氨酸的电聚合，再用于h b 的固定、考察修饰电极的电化学性能为最 佳电聚合条件的选择提供依据。 8 2 5 2 0 1 5 e 1 0 迨 0 5 0 o o 5 1 5 1 0 o 50 oo 51 o1 52 o2 53 o e vv ss c e 图1 l 赖氨酸在玻碳电极上电聚合的循环伏安曲线( 扫描速率：1 0 0m v s ) f i g 1c y c l i cv o l t a m m o g r a m so fe l e c t r o p o l y m c r i z a t i o no fl l y s i n ea tg ce l e c t r o d e ，s c a nr a t ei s10 0 m v s 图2 为分别采用6 、8 、1 0 次为循环数电聚合l 赖氨酸所制得的h b p l l g c 修 饰电极在氮气饱和的磷酸缓冲溶液中的循环伏安曲线图。由图可见，不同扫描圈数 电聚合制得的修饰电极的c v 曲线上均有氧化还原电流峰出现，说明固定在p l l g c 电极表面的l i b 均发生了直接的电子传递反应。聚合圈数为6 ( 图2 a ) 圈和8 ( 图2 b ) 圈的修饰电极其循环伏安曲线基本重合，而聚合圈数为1 0 ( 图2 c ) 圈的修饰电 极其氧化还原峰电流及可逆性均不如前两者，这可能由于电聚合于g c 电极表面的 p l l 膜过厚，一定程度上阻碍了酶与电极间的直接电子传递。 9 e nv ss c e 图2 循环扫描6 ( a ) 、8 ( b ) 、1 0 ( c ) 圈制得的h b p l l g c 电极在p h = 7 0 的磷酸缓冲溶液中 的循环伏安曲线( 扫描速率：1 0 0m v s ) f i g 2c y c l i cv o l t a m m o g r a m so fh b p l l g c e sw i t h6 ( a ) ，8 ( b ) ，1 0 ( c ) e l e c t r o p o l y m e r i z a t i o nc y c l e s r e s p e c t i v e l yi na n a e r o b i c5 0m m o l lp h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o nc o n t a i n i n go 1m o l lk c i ，p h = 7 ，s c a n r a t e ：1 0 0m v s 图3 是分别采用循环扫描6 ( 图3 a ) 、8 ( 图3 b ) 次电聚合所制得的p l l g c 修饰电极上固定了h b 后在氧气饱和的磷酸缓冲溶液中测得的循环伏安曲线图。由 图可见，电聚合8 圈( 图3 b ) 的修饰电极的氧还原峰位( - 0 4 0 7 v ) 比电聚合6 圈 ( 图3 a ) 的修饰电极氧还原峰位( 0 4 8 4v ) 正移了7 7 m v ，此外，8 圈的氧还原催 化峰电流也明显增大。最后确定8 次循环扫描圈数为最佳电聚合条件。 1 0 e nv ss c e 图3 电聚合圈数分别为6 ( a ) 、8 ( b ) 的h b p l l g c 电极在氧气饱和的磷酸缓冲溶液中的循 环伏安曲线图( 扫描速率：1 0 0m v s ) f i g 3c y c l i cv o l t a m m o g r a m so fh b p l l g c e sw i t h6 ( a ) ，8 ( b ) e l e e t r o p o l y m e r i z a t i o nc y c l e s r e s p e c t i v e l yi n0 2 - s a t u r a t e d5 0m m o l lp h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o nc o n t a i n i n go 1m o l lk c l ，p h = 7 0 ， s c a nr a t e ：1 0 0m v s 2 2 2h b p l l g c 修饰电极的电化学行为 图4 是有无固定h b 的修饰电极在磷酸缓冲溶液中测得的循环伏安曲线。可以 清楚地看到，没有修饰h b 的p l l g c 电极上未出现氧化还原电流峰( 图4 曲线a ) ， 而固定了f i b 的p l l p g 修饰电极上呈现出一对典型的氧化还原电流峰( 图4 曲线 b ) 。这可归因于固定在修饰电极上的i i b 电化学活性中心卟啉环中f e ( i i i ) f e ( i i ) 电对的氧化还原反应，表明h b 在p l l 修饰的g c 电极上发生了直接的电子传递反 应。 e v ss c e 图4 p l l g c ( a ) 和h b p l l g c ( b ) l 邑极在p h = 7 0 的磷酸缓冲溶液中的循环伏安曲线( 扫描速率： 1 0 0m v s ) f i g 4c y c l i cv o l t a m m o g r a m so fp l l g c ( a ) a n dh b - p l l g c ( b ) e l e c t r o d ei nn 2 一s a t u r a t e d5 0m m o l lp b s ( p h = 7 0 ) c o n t a i n i n go 1t o o l lk c l ，$ c s j lr a t ei s10 0m v s 图5 是不同扫描速率下测得的h b p l l g c 修饰电极在p b s 中的循环伏安曲线。 从图中可以看到，氧化还原峰电流随扫速的增加而增大，在1 0 - - 一1 2 0 0 。m w s 扫速范 围内，氧化、还原峰电位随扫描速率的增大分别向正、负方向移动，即峰峰电位差 z l e p