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减数分裂重组对二核苷偏好性及 加工假基因分布的影响 摘要 进化论是整个生物学的指导思想。生命进化的物质基础是变异，而变异的主要来 源足突变和重组。如果没有重组，只有突变发生时才能改变基因组，这无疑将大大降 低生命进化的效率。减数分裂重组足真核细胞减数分裂过程中同源染色体之间遗传物 质的交换。重组过程通过形成交叉对减数分裂期同源染色体的正确分离起到至关重要 的作用。除此之外，重组可通过选择或突变的方式在基冈组进化过程中扮演着很多重 要角色。尽管随着许多真核基因组测序工作的完成和遗传图谱的不断完善，重组与序 列之间的相互作用机理一直在被人们探索并发现，但由于重组与各种序列特征之间的 相互影响在基因组这个大环境中显得尤为复杂，还有很多未知问题有待探索和解决。 二核苷相对丰度谱足反映基凶组整体水平上的选择压力或突变偏好性的“基因组 指纹”，它在基因组进化研究、系统发生分析中发挥着独特而重要的作用。因此，揭 示基因组指纹的形成与进化压力是基因组进化研究的重要内容之一。假基因是丧失 蛋白质编码能力的基因拷贝，它从分子水平上记录了基因组序列数百万年的进化路 线，为基因组动力学和进化研究提供了理想的材料。尤其，加工假基因由于其反转座 起源而在基因组进化研究中备受青睐。揭示加工假基因分布中所蕴含的进化压力对基 因组进化研究有重要意义。基于这一思路，本文主要研究了减数分裂重组对基因组序 列二核苷偏好性及加工假基因分布和进化的影响，并对其机理性的问题进行了探讨。 主要研究内容如下： 1 在得到果蝇重组率数据的基础上，研究果蝇基因组中二核苷偏好性和重组率 的相关性。结果发现，在整个基凶组范围内编码和非编码序列的总体二核苷偏好性均 与重组率显著正相关。我们给出了不同二核苷偏好性与重组率的关联模式，并讨论了 重组与二核苷偏好性的相互作用机理。就重组如何影响二核苷偏好性这一问题，我们 提出了一种新的解释模型，即重组可能通过一种在整个基因组范围内普遍存在的机制 依赖紧邻碱基的基因转换影响二核苷偏好性。 2 利用高密度人类遗传图谱得到重组率数据的基础上，研究人类基因组中二核 苷偏好性和重组率的关系。结果发现在整个基因组范围内编码序列的总体二核苷偏好 性与重组率显著负相关，而对非编码序列来说却显著正相关。另外，给出了具体二核 苷偏好性与重组率的关联模式，讨论了重组与二核苷偏好性的相互作用机理，并与果 蝇基因组进行了比较。研究结果表明，重组对基因组指纹的形成与进化有着重要作用。 3 传统的观点认为，加工假基因在染色体上的插入是随机的。然而，通过分析 发现人类加工假基因密度与重组率负相关，这有以下几种可能的解释：重组抑制模型 认为，i j n - r 假基因可能会通过降低同源染色体同源性的方式起到降低重组率的作用； 有害插入模型认为，若加工假基因在染色体上的插入突变是有害的，则在低重组区由 于h i l l r o b e r t s o n 干涉较多，选择效率降低，导致加工假基因偏好插入到低重组区： 异位重组模型认为，加工假基因在低重组区的偏好分布是对高重组区同源加工假基因 之间异位重组事件负选择的结果；弱选择模型认为，由于低重组区h i l l r o b e r t s o n 干 涉较多，选择压力会使加工假基因偏好插入到低重组区来减少干涉，促进相邻基因或 外显子之间的独立进化。我们还发现，加工假基因密度与基因密度正相关，有两种可 能的解释：一、加工假基因在基因密区的插入可能具有选择优势，因为这种插入突变 可能有助于提高弱选择位点间的重组频率，从而减少h i l l r o b e r t s o n 干涉并促进相邻 基因或外显子的独立进化；二、相比基因分布稀少的区域，异位重组在基因密区较少 发生，这可以导致加工假基冈较多地保留在基因密区。 4 重组抑制模型、有害插入模型、异位重组模型和弱选择模型均有可能解释人 类加工假基因密度与重组率之间的负相关性。区分验证这些不同的模型具有重要意 义。通过分析发现，相比其它加工假基因，具有异位重组潜能的加工假基因，即同源 相邻加工假基因更加偏好分布于低重组区( 0 0 0 4c m m b ) ，差异检验也显示同源 相邻加工假基因位点的重组率显著低于其它加工假基因重组率( 尸 5 0k b ) 的 1 6 种二核苷偏好性，即二核苷的相对丰度值沿着染色体的分布是相当稳定的，即它们沿染色 体变化很小。二核苷偏好性在近亲物种之间也比较相似，而在远亲物种之f b j 贝l j 存在很大差异。 因此每个物种基因组可被称作“基因组指纹 的独一无二的二核苷相对丰度值所表征1 75 i 。 正因为这样，基因组指纹在系统发生分析中发挥着与传统的序列比对方法不同的、独到的作 用7 7 1 。根据基因组指纹差异，也可以发现基冈组中水平转移的序列片段f 7 9 1 。l u o 等人发现核 苷酸序列以短程关联为主，从语义学角度对短程关联中所蕴含的偏好语言进行了分析，同时 发现短程关联随进化增强的相关性【”】。然而这些工作笼统地将短程关联归因于自然选择， 忽略了基因组本身固有的背景突变偏好性，对短程关联的形成与进化的内在原因或分子机制 并没有作出充分的估计和解释。k a r l i n 等人指出，基因组指纹与g c 含量没有必然的联系，而 可能是反映与d n a 结构( 即碱基堆积能和d n a 构象倾向性) 、复制、修复、重组和邻近碱 基依赖突变有关的细胞机制或偏好性 3 2 - 3 3 】。但是k a r l i n 等人并没有严格证实那些对基因组指 纹形成和进化机理的推测。根据k a r l i n 等人提供的线索，我们将对减数分裂重组对基因组指 纹或二核苷偏好性有无影响进行检验。人类基因组计划产生的大量基因组序列图谱和越来越 完善的遗传图谱( 据此得到重组率数据) 为重组相关研究带来了很好的机遇。另外，在后基 因组时代的大背景下，基因注释也在快速发展，编码区与非编码区的区分也越来越精细。这 些进展使得我们可以在更精细、更广泛的尺度上展开重组研究。若重组对二核苷偏好性产生 影响，这种影响无非与两种方式有关，即与重组事件对基因组序列的选择或中性作用有关。 例如特定二核苷在重组率不同的区域可能会受到不同程度的选择p 引，或重组可能通过与 d n a 错配修复机制有关的邻近碱基依赖突变 8 2 , 8 3 1 影响二核苷偏好性。基因组中重组率沿染 色体分布是很不均匀的 3 4 , 8 4 。另外，虽然二核苷偏好性沿染色体分布非常稳定，但它也并非 是个绝对不变量【8 5 】。因此，在同一基因组的重组率和二核苷偏好性之间作相关分析并考察 重组率能否捕捉到二核苷偏好性的变化是检验重组对二核苷偏好性有无影响的策略之一。重 组对不同类型基因组序列的二核苷偏好性的影响有何差异? 具体的二核苷偏好性与重组率 之间的相关模式如何? 作何解释? 重组对整体水平上的二核苷偏好性有何影响? 基因组在 这些方面有无规律性进化? 重组效应在不同物种基因组之间是否存在差异? 带着这些问题， 我们以果蝇和人类基因组为研究对象，对基因组二核苷偏好性与重组率之间的相关性进行分 1 0 博f ：学位论文：减数分裂霞组对二核苷偏好性及加t 假幕岗分布的影响 析。本文第三和第四章中将详细介绍这方面的工作。 1 2 4 假基因 假基因是源于功能基因、与起源基因非常相似的、不编码蛋白质的基因组d n a 序列。 假基因的来源有两种 8 6 。8 8 】：一种是基因组d n a 重复或染色体不均等交换过程中基因编码区 或调控序列发生突变( 如碱基置换、插入或缺失) ，导致复制后的基因丧失正常功能而成为 假基因，这种假基因称为重复假基因( d u p l i c a t e dp s e u d o g e n e ) ；另一种是m r n a 转录本反 转录成e d n a 后整合入基因组，由于插入位点不合适或序列发生突变而失去正常功能，这 样形成的假基因称为加工假基因或返座假基因( p r o c e s s e dp s e u d o g e n eo rr e 仃o p s e u d o g e n e ) 。 重复假基因具有与功能基因非常相似的结构，在相应的位置上有相当于外显子和内含子的序 列，而加工假基因没有内含子。加工假基因被认为是在活性l 1 编码的逆转录酶的辅助下进 行转座的非自主性反转录转座子 8 9 习2 1 。核基因组中还发现从线粒体d n a 转移过来的假基因 9 3 , 9 4 】，这些假基因的祖先基因是线粒体d n a 中的基因，这使得基因注释等工作更加复杂化。 假基因是失去活性的基因拷贝，失活是由基因表达过程中的一个阶段或全部阶段有阻断作用 的突变导致的。这些变化包括消除起始转录的信号，阻止在外显子内含子的连接点进行剪 接或过早地终止翻译等。在大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇、小鼠、人等多种基因组( 包括原 核和真核生物) 中都发现了假基因【9 5 。引】，其中哺乳动物基因组中分布较多，尤其在人类基 因组中存在大量假基因【1 0 1 , 1 0 2 ，其中多数为加工假基因【1 0 1 1 。研究假基因有着重要的生物学 意义【1 0 1 , 1 0 4 , 1 0 5 】。例如，可以通过假基因来估计基因重复或转座活动的频率和年代；利用假基 因这类中性( 或近中性) 分子来估计不同基因组中的中性突变谱和突变率；有利于正确注释 基因等。假基因的研究主要集中在以下几方面： 首先是假基因的识别。识别假基因是假基因相关研究的基础。目前这方面的工作主要是 由耶鲁大学的g e r s t e i n 实验室研究小组z h a n g 等人来完成的f 9 3 9 6 。o 。他们从果蝇、线虫、 小鼠、人等很多物种基因组中系统地搜索识别假基因，并创建了专门的假基因数据库 ( h t t p ：w w w p s e u d o g e n e o r g ) ，可供研究人员免费下载使用。当然，也有一些其他的研究 小组识别假基冈的工作，在全基因组范围内识别人类假基因的代表性工作除了z h a n g ( 称为 g e r s t e i n 假基因数据集) 等人的工作1 0 1 1 以外还有t o r r e n t ( 称为b o r k 假基因数据集) 1 0 2 1 和 k h e l i f i ( 称为h o p p s i g e n 假基因数据集) 等人的工作【1 0 3 1 。这些工作采取的策略( 或思想) 是基本相同的，那就是基于与己知功能基因的序列相似性搜索方法识别假基因。当然，相似 性搜索方法中参数标准( 如e 值) 和外加条件( 如序列结构特征或演化特征信息) 以及所 使用的基准基因库的不同都会造成所识别出的假基因在数量和结构上都有较大差别。例如 博f ：学位论文：减数分裂蕈组对一二核仔偏好性及加t 假堆阂分布的影响 z h a n g 等人识别出的人类加工假基因大约有8 0 0 0 条，而t o r r e n t 等人识别出的却有1 7 0 0 0 余 条，h o p p s i g e n 人类加工假基因却只有5 0 0 0 条左右。不同的数据集间的比较显示，5 0 ( 以 小样本数据集为标准) 以上比例的加工假基因是在不同数据集问共有的【1 0 3 】。值得注意的是， 我们所看到的只是在目前种群中幸存下来的假基因，其它一些假基因在过去可能早已被淘汰 1 0 2 。淘汰是指假基因在选择压力或突变的作用下退出基因组舞台或变得不可识别。 其次是假基因的特征分析和进化研究。加工假基因序列有一些明显的结构特征8 6 , 8 7 , 1 0 1 ， 如不含内含子，两边侧翼序列中存在正向重复序列，3 端存在p o l y ( a ) 尾等，这些特征与加 工假基因的产生机制反转录转座机制有关。当然，随着假基因的退化，这些特征将逐渐 消失，而随之出现的是在随机突变的累积过程中产生的移码突变、终止密码子的提前出现和 散置重复序列的插入等【1 0 1 1 。假基冈的进化研究包括假基冈进化年代( 或距离) 的估计，进 化特征，进化过程中所受选择压力分析等几方面【1 0 6 , 1 0 7 】。假基因是基因组d n a 进化的“遗迹”， 从分子水平上记录了基因组序列数百万年的进化路线，为基因组进化研究提供了理想的材 料。从假基因与其祖先功能基因的比较中可以获得和判断假基因产生的时间1 0 1 , 1 0 6 1 、突变( 碱 基置换、插a 缺失突变) 谱1 0 8 】、演化方向【1 0 9 1 等等。研究表明，目前所识别出的绝大部分 人类加工假基因是哺乳动物辐射( m a m m a l i a nr a d i a t i o n ) 之后( 即约7 5 0 0 万年前啮齿类和灵 长类分歧之后) 产生的【川j 。随着进化进程的推进，假基因在组分( 包括g c 含量、假想密码 子和氨基酸组分) 上呈现出向基因问序列漂移的趋势 1 0 9 1 。通过人类加工假基因的研究，人 们还发现假基因序列中发生的碱基置换突变对其紧邻碱基存在依赖性【1 0 8 l 。基因组中加工假 基因总的数量受到三种因素的约束：转座活动( t r a n s p o s i t i o na c t i v i t y ) 的频率、假基因受到 的选择压力和基因组背景突变速率。加工假基因是在相关酶的作用下反转录转座而产生的， 因此转座