（蔬菜学专业论文）白菜花粉发育相关基因BcMF3和BcMF4的转基因功能验证.pdf

浙江大学博士学位论文白菜花粉发育相关基因四彻和口晰的转基因功能验证 摘要 芸蓥属( 曰r a 目把口) 植物是杂种优势利用最为普遍的作物种类之一，其雄性不育的机理及雄 性不育系选育的研究一直深受重视。但是，雄性不育产生的机制仍然是一个尚未完全解开之谜， 还有许多问题需要深入研究。在国家自然科学基金委和浙江省科技厅的资助f ，本实验室在前一 阶段利j ；| m r n ad d p c r 、c 饼q a a f l p 技术结合r a c e 技术从普通白菜( bc 口川职s 加括s s p 幽胁g 眈- ( l ) m a k j n ov a l m m “m 瞎t s e ne t l e e ) 核雄性不育两用系中成功分离得到了与白菜核 褴牲而甫枢关基因c y p 8 6 m f ，b c m f i 、8 c m f 2 、8 c m f 3 和m f 4 。对其中桷8 c m f 3 积8 c m 阳 基因的r t _ p c r 分析表明，它们都只在普通白菜两片j 系可育株系的中蕾和大蕾中特异表达。为进 一步了解m 和b c m 基田的生物学功能，将普通白菜花蕾按大小进行更细分级，首先采用 n o r n l e m 杂交分析对肌m 即和口c 删在白菜中的表达特征进行了进一步的确认；接着构建了这 两个基因的组成型启动子c a m v3 5 s 的和绒毡层组织特异性启动子a 9 的反义r n a 和r n a 干涉 基因沉默植物表达载体；然后将所构建的载体，采用f l o r a id i p 法转化拟南芥( 爿m 6 f 却眈 腩础d ) ，通过组织培养途径转化与普通白菜同属于白菜亚种的菜心( 日c p e s ，s s p c f n e j 曲 ( l ) m a k i n ov a r p 口c 加p m 括( b a i l e y ) t s e ne t l e e ) ，获得了拟南芥3 个载体的共1 2 株转基因植株、 菜心1 0 个载体的共1 4 8 个转基因植株株系；随后对转基因拟南芥和菜心植株的花粉形态、花粉 萌发率与活力、花粉管的伸长、果胶甲酯酶的酶活性及不同载体的转化效率进行了观察和检测， 取得结果如f ： ( 1 ) 采用n o n h e r nb l o t 分析了加乃和曰c 腻附基因的表达特征。结果显示，肌d 4 f ；基因 只在普通白菜核雄性不育两用系( z 蜘 9 7 一o ) 可育株的直径为1 1m m 以上的花蕾中特异 表达，并且在12 25m m 的花蕾中强表达，而在可育株 1 1m mi nd i 唧e t c ro f t h ef e r t 1 ebl j n e ，a n ds t r o n 9 1 ye x p r e s s e di n 日o w e rb u d so f1 2 2 5m m b u tn oe x p r e s s i o nw a s d e t e c t e dj nn o w e rb u d sw i t l lo t h e rs i z e sa n dr o s e n e1 e a v e so ft h ef 色r t j l ebl i n ea n dt h em i x e dn o w e r b u d so ft h es t e r i l ea1 i n e ，t h er e s u 】t s s u g g e s t e dt h a tb c 彳f ? a n d 占c 彳f 4a r er e l a t e d t o p 0 1 l e n d e v e l o d m e n t ( 2 ) t e np l a n te x p r e s s i n gp l a s m i dv e c t o r so fa n t i s e n s er n a a n dr n a iw e r ec o n s t m c t e d ，a n dc a m v 3 5 sp r o m o i e fa n da 9p r o m o t e rw e r eu s e di nb o t ht y p e so fv e c t o r sr e s p e c t i v e l yt h e na | lt h ev e c t o r sw e i n t r o d u c e di n t o4 9 阳6 n c 地r f 圳f “m q 加c 把ws 订a i nl b a 4 4 0 4b yt “p a r e n t a lm a t i n g v a b s t r a c t ( 3 ) a l lt h ea b o v ev e c t o r sw e r eu s e dt oi n f e c t 五m 6 坳括腩日矗珊破b yf l o r a id ip ，a n d 12t r a n s g e n i c p l a n t so f 爿m 6 坷唧妇w e r eo b t a i n e dt h er e s u l t so fp c ra 1 1 ds o u t h e mb l o ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h e f o r e i g ng o n e sw e r ei n t e g r a t e di n t ot h eg e n o m eo ft h et r a n s g e n i cp l a n t s ，a n df l o m ld j pi s ac o n v e n e n t a n di o 、v c o s ts h o n c u tf o rt r a n s f o r m a t i o no f 爿，口6 埘q 彤如 ( 4 ) a i it h ea b o v ev e c t o r sw e r eu s e dt oi n f e c t 门o w e n gc h i n e s ec a b b a g ev i at i s s u ec u i t u r ea n d1 4 8 t r a n s g e n i cp l a n t sw c r eo b t a i n e d a m o n gt h et r a n s g e n i cp l a n t sr e s i s t a n tt ok a n a m y c j n ，t h ef r e q u e n c yo f p i a n t sp o s i t i v et op c rr e a c h e d9 7 7 3 ，a n dt h er a t i o 。fp o s i t i v ep l a l l t si ns o u t h e r nb l o ta n a l y s i st ot h e p o s i t i v ep l a n t si np c rw a sa l s o a sh i g ha s9 5 1 2 t h er e s u l t si n d j c a t e dt h ef o r e i g ng e n e sw e r 。 i n t e 酎a t e di n t ot h eg e n o m eo f t h et r a n s g e n i cp l a n t so f f l o ，e r j n gc h i n e s ec a b b a g e ( 5 ) t h en o w e ro 曜a n sh a dn od i 恐r e n c e b e t 、v e e nt r 蛐s g e n i cp l a n t sa n dw dt y p ep l a n t so f r d 6 却曲，b u tt r a n s g e n i cp l a n t sh a do b v i o u s l y1 e s sa m o u n t so fp o i l e ng r a i n sc o m p a r e dw i t ht h e c o n 廿o i a v e r a g e ly 4 7 _ 8 ，4 6 3 a n d51 4 p o 】e ng r a i n sf b mi r a n s g e n i cp j a n t so fp b l b 3 ，p b l 一b 4 r a n dp b i b b 3 4e x h i b i t e da b n o r m a ls h a p e sr e s p e c t i v e l y ，a n dt h ea b n o r m a ls h a p e sw e r es m a l l e ro r s h r u n k e na p p m x j m a t e l y3 1 6 ，3 2 7 a n d2 5 6 o f p o | l e ng r a i n sf 而mt r a n s g e n i cp l a n t so f p b i - b 3 ， p b i - b 4 ra n dp b l b b 3 4 3g e r r n i n a l e d ，w h i c hw e r es i g n i n c a n t i y l o w e rt h a nt h a to fc o n t r o lp l a n t s ， m o r e o v e r4 57 o fp o 】e nt u b e sf r o mp i a n t so fp b i b 3b u r s td u “n gg e 丌n i n a t i o n o fp o l l e ng r a j n sf r o m t h e s et r a n s g e n i cp l a n t s ，o n l yas m a l 】p o r t i o no fp o l l e nt u b e sg r e wn o r m a l l yi nl h ep i s t i l t h e s er e s u 】t s s u g g e s t e dt h a tb c m f 3 a n db c m f 4p l a yi m p o r t a n tr o l e sd u r i n gi h ed e v e l o p m e n to fp o l l e na n dp 0 1 l e n t u b eg r o 、v t h ，a n dt h ed e v e l o p m e n to fc ”o p l a s mr e s p e c t i v e ly ， a n d s i l e n c i n gt h e ms e p a r a t e l y o r s y n c h m n o u s i yc a na 骶c tt h ed e v e l o p m e n to fp o i l e na n dp o l l e nt u b eg r 0 叭h ，a n dc o n s e q u e n t l yr e s u l ti n p a n i a 】p o l l e n sa b o r t j o no f 爿阳6 托如口捃p l a n t s ( 6 ) i na l lt r a n s g e n i cp l a n t so fn o w e r i n gc h i n e s ec a b b a g ef r o m v e c t o r sw j t ha 9p r o m o t e r ， p h e n o t y p e sh a dn od i 虢r e n c eb e t w e e nl r a n s g e n i cp l a n t sa n dc o n t r o lp l a n t s a m o n gt h e ”a n s g e n j cp l a n t s o fv e c t o r sw i t hc a m v3 5 sp r o m o t e la v e r a g e l y1 0 0 ，4 3 7 ，1 0 0 ，4 58 a n d1 0 0 o ft h ep o l l e n g r a i n sf r o ms o m et r a n s g e n i cp l a n t so fp b i b 3 ，p b i b 4 ，p b i b 3 r ，p b i b 4 ra n dp b i b b 3 4e x h i b i t e d a b n o r m a is h a p e ，a n dt h ea b n o r m a ls h a p e sw e r es m a l i e ro rs h r u n k e n a p p r o x i m a t e ly 13 4 1 ，2 4 7 ， 3 23 ，2 3 7 a n d1 6 7 o ft h ep o l l e ng r a l n sf r o m ”a n s g e n i cp l a n t so ft h e s ev e c t o r sg e m i n a t e d n o r m a l l y ，w h i c hw e r es i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nl h a t o fc o n t r o ip l a n t s ，b u tn ob u r s l i n gp o 】l e nt u b e a v e r a g e ly 2 9 7 a n d3 6 5 p o l i e ng r a i n sf r o mt r a l l s g e n ；cp l a n t so fp b i b 4a n dp b i b 4 rh a dn ov i g o l w h 1 em a n yo ft h ep o i l e ng r a i n sf r o mt r a n s g e n i cp l a n t so fp b i b 3 ，p b i b 3 ra n dp b i - b b 3 4w e r e d i f f i c u l li od e t e r m i n et h e j rv i g o r t h ep m ea c t i v j t yo f a m h e rf r o mt r a n s g e n j cp l a n t so f b i b 3 ，p b l - b b 3 4 a 1 1 dp b i - b 3 rd e c r e a s e d s i l e n c i n ge 塌c i e n c yo fa n t i s e n s er n av e c t o r so fb 硪a n d 曰c 必w e r e l8 7 a n d3 0 6 1 0 w e rt h a nt h o s eo ft h e j rr n a iv e c t o r sr e s p e c t i v e l y t h e s er e s u 怄s u g g e s t e dt h a t b c m f 3a n db c m f 4p 】a y i m p 嘶a n tr o l e sd u r i n gp 0 1 】e ng r a i n s ，a n ds j l e n c i n g l h e ms e p a r a t e l yo r v 浙i 大学博士学位论文白菜花粉发育相关基因口c 4 删和詹c 脚的转基因功能验证 s y n c h r o n o u s l yc a na h 色c t t h ed e v e l o p m e n to f p 0 1 1 e na n dc o n s e q u e n t l yr e s u l ti np a 币a lp o l l e n sa b o r t e do f c h i n e s ec a b b a g ep l a n t s k e yw o r d s ： c o m m o nc h i n e s ec a b b a g e p a k c h o i ；西。口时地a 。唧p s 盯s s p 。 加p 琊打v a f c 。删卅“”曲； n o w e r i n gc h j n e s ec a b b a g e ；口s 记口c 口7 强p 口s 打括s s p c 向加e n s 曲v a lp 。，c 加日h s 插：p o l y g a c t u r o n a s e i n h j b t j n gp m t e i n ( p g i p ) ；a n t j s e n s er n a ；p e c t i nm e t h y l e s t e r a s e ( p m e ) o rp e c t i n e s t e r a s e ( p e ) ； 爿r 口6 耐印s 括f 厅日妇h 口；r n ai n t e r f e r e n c e ( r n a i ) ；p o 】1 e nd e v e l o p m e n t ；m a l es t e “l i t y ；t r a n s f o m l a t i o n 浙江大学博士学位论文白菜花粉发育相关基因丑c 胴和四甜倒的转基因功能验证 缩写词( a b b r e v i a t i o n ) a a b a a m p a p b a p b p b s a c c d n a c d n a a f l p c d s c m s d d e p c d n a d n t p d t t e b e d t a g g m s h h r i p t g k b k i n i ( d a a d e nl n e a b s c i s i ca c i d a m d i c i 川n a m m o n i u mp e r s u l f 吾t e b e n 可ia m i n op u r i n e b a s ed a i r b o v j n es e m ma l b u m i n c y t o s i n e c o m pj e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c le i ca c i d c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c i e i c a m p i i n e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m c o d i n gs e q u e n c e c y t o p l a s m i cm a l es t e “l l t y d a y d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c i e i ca c i d d e o x y r i b o n u c f e o s i d et p o s p h a t e d l d i t h i o i h r e i t o l e t h i d u mb r o m i d e e t h y i e n ed i a m i n e l e l r a a c e t i ca c j d g u a n i n e g e n i cm a l es t e r i i i t y h o u f i s o p r o p y n h i o 一口- d - g a l a c t o s i d e k i l o b a s e k a n a l l l y c i n k 1 0d a l t o n 腺嘌呤 脱落酸 氨苄青霉素 过硫酸铵 苄氨基嘌呤 碱基对 牛血清蛋白 胞嘧啶 互补脱氧核糖核酸 a c i d 扩增互补脱氧核糖核酸片断 i 圭度多态性 编码序列 、 胞质雄性不育 天 焦磷酸二乙酯 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三磷酸 二硫苏糖醇 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 鸟嘌呤 细胞核雄性不育 小时 异丙基硫代一b 一半乳糖苷 千碱基对 卡那霉素 千道尔顿 致谢 首先，值此论文完成之际，谨向导师曹家树教授表示最真挚的感谢! 本论文的研究工作是在导师的悉心指导r 完成的，在论文的选题、实验的设计、实验过程以及 论文的写作等各个环节中，导师都倾注了大量的心血。儿年的博士生学习期间，无论我走到哪里， 导师的指导和关怀就延伸到哪里，为我的学习和研究源源不断地输送力量。导师是我学习的楷模， 他渊博的知识、敏锐的洞察力、严谨的治学态度、忘我的f 作精神和宽广的胸怀，是我学习的楷模， 将使我受益终生! 在浙江火学学习和研究期间，浙江大学蔬菜研究所的喻景权教授、朱祝军教授、寿森炎教授、 吕家龙教授、张明方教授、汪俏梅教授、郭得平教授、汪炳良副教授、陈丽萍副教授、钱亚榕博士 以及其他老师给予了许多的关心和支持。浙江大学蔬菜研究所细胞与分子生物学实验室中】：作雨f 学 习的卢钢副教授、叶纨芝博士、余小林博士、向殉老师、王永勤博士、严继勇| 尊士、黄科博十、崔 辉梅博士、李志邈博士、王玲平博士、吴才君副教授、虞惠芳博十、张驶博士、褚丽婷、符庆功、 姚祥坦、帅琪峰、陈石头、洪薇、黄鹂、孙保娟、周生茂、王华新、董德坤、黄细松、张强、武涛、 王神云、李晋豫、庄晓英、邹风莲、李建勇、任彦、张艳、冯壮志、王贺飞、张海峰等等，这些老 师和同学在我的实验和写作过程中给予了大力帮助。 在研究过程中，浙江大学生物技术研究所、浙江大学果树所等单位在仪器设备上提供了许多便 利；井得到了浙江大学生物所的娄沂春教授，浙江大学果树所徐昌杰副教授、许文平博士，浙江大 学生命科学学院的金维正博士、姜华武博士，浙江大学农业与生物技术学院本科生教学实验中心肖 建富副教授等老师和同学的热情帮助。 此外，澳大利弧两澳大学的c r a i g a t “n s ，w a l l a c ec o w l i n g ，s u s a nb a r k e r 和m a n h e wn e l s o n 等在 思维方法、实验态度和英语交流等方面对我开展研究j r 作有较大的影响。 在此对所有关心、支持和帮助过我的老师、同学和朋友们一并表示衷心的感谢! 特别感谢我的妻子侯爱琴女士和儿子刘思晓，是他们的理解与支持，一直伴随着我漫艮的博十 求学生涯! 最后，谨向本论文的评阅人和答辩委员致以最真诚的感谢! 纠再承 2 0 0 6 年4 月2 0 日 浙江大学博士学位论文白菜花粉发育相关基因占c 丹和b c f h 的转基因功能验证 日【舌 芸薹属( 所口w f c 。) 作物包括白菜类、甘蓝类和芥菜类蔬菜以及甘蓝型、白菜型和芥菜型油 菜等几大类作物，其变种与类型众多、生产效益高，是我国栽培面积最大、总产量最高的一类蔬 菜与油料作物，因而在我国农业生产中占有极其重要的地位。芸薹属作物也是杂种优势利用最为 普遍的一类作物，而雄性不育系是白菜类等芸薹属作物杂种优势利用的最理想方式，因而其雄性 不育的选育及其应用基础的研究深受人们重视。雄性不育与花粉发育关系密切，同时，由于发育 在生命科学中的重要性，花粉发育的研究也一直是植物科学研究领域中的热点。雄性不育在植物 中是一种十分酱遍的现象。雄性不育和可育构成育一| 生的一对对应性状，它们属于遗传因素与生境 互作控制的一类发育性状。雄性不育的研究，在理论上可以丰富花粉发育、细胞核遗传、细胞质 遗传和核质互作等方面的知识，在实践上可以作为一种遗传工具，减少人_ l 二去雄的麻烦，在作物 杂种优势利用、群体改良中有重要的应用价值。近一个世纪以来，对植物花粉发育及雄性不育的 研究，国内外学者做了大量的理论和实验探讨，在理论和方法上都有了长足的进步。但是，全面 了解花粉发育及雄性不育产生的机制还有许多问题需要深入研究。现代分子生物学理论与技术为 花粉发育以及雄性不育机制的研究提供了有力工具。 植物雄性不育产生的机理十分复杂。雄性可育是一系列生理生化和形态建成的结果，涉及到 上千个基因，任何一个基因失活都将导致雄性不育。影响雄性育性的基因有些是花药、雄性细胞 所特有的，但有些并不是特异性的。冈此，雄性不育既有由孢子体控制的，也有由在单倍体小孢 子或花粉中表达的基因控制的，前者表现为孢子体雄性不育，后者表现为配子体雄性不育。雄性 不育的现象表现出多样性，不仅有胞质雄性不育、核质互作雄性不育和核雄性不育，而且在核雄 性不育中还有隐性、显性及其互作核雄性不育，这使得弄清植物雄性不育的机理十分困难。 白2 0 世纪6 0 年代以来，人们相继在芸薹属蔬菜和油料作物中发现了隐性单基因、显性单基 因、多基因互作控制的核雄性不育材料同时也发现了一些胞质基因控制的雄性不育材料。随后 的研究推测核雄性不育是由于细胞核中的基因组缺乏雄性可育所必需的遗传信息所造成的，而胞 质雄性不育则被认为与线粒体或叶绿体d n a 的重排、插入、缺失有关。 对芸薹属植物雄性不育的细胞学观察结果显示，白菜型油菜核雄性不育和甘蓝型油菜胞质雄 性不育的花粉都发生在减数分裂时期( z u b er i “口f ，1 9 8 8 ) ，而白菜核雄性不育小孢子败育则在四 分体以前或四分体前后的多个时期( 孙日1 毛等，1 9 9 5 ) 。研究结果表明，植物雄性不育所涉及到育 性基因在一定时空上的表达与否，以及体内外网子对这种表达的影响和调控等肉素。目前其研究 虽然取得了一些进展，但这些零散和不完整的材料还不足以建立起对雄性不育现象理解的总体框 前言 架。 随着分子生物学实验手段日臻完善，从分子水平上阐明芸墓属植物雄性不育的机理已成为可 能。从雄- 性不育的遗传基础着手，了解花粉发育相关的基闪以及抑制花粉发育的基因，是揭示雄 一性不育产生的机理的有效途径。但迄今为止，从芸薹属植物中分离的花粉、花药特异表达基因为 数不太多，且多数基因功能尚不清楚。a l b a n i 等( 1 9 9 0 ，1 9 9 l ，1 9 9 2 ) 对甘监型油菜( bn 印“s ) 的花药特异基因进行了研究，发现其花药特异基因成族存在，一般由1 0 1 5 个密切相关的基因 组成。在拟南芥( 4 m 6 砒脚打腩d 砌n d ) 中，a a n s 等( 1 9 9 3 ) 通过转座子插入法获得核雄性不育 株，并分离到一个核不育基因m s 2 的序列结构。y a n g 等( 2 0 0 0 ) 在拟南芥中发现了个小孢子 发生初始阶段的必需基因，即即基田，它是在花筠中的孢原细胞和小孢子母细胞中表达，其 主要功能是促进孢母细胞的形成。在其突变体印，花药中花药壁和绒毡层的形成被破土4 i ，说明 妒l 基因与花药壁的发育也有定关系。通过蛋白质分析表明，小孢子形成和花粉发育的各个时 期都有特异的蛋白质台成( m a n d a r a n “4 f ，1 9 9 0 ；傅彬英等，1 9 9 6 ：阎隆飞等，1 9 9 9 ) 。 白菜( b 7 印p s 一西s s p 曲折p n s 曲( l ) m a k i n o ，s y n 曰r 印ds s p c 厅加g ”s 打) 隐性核雄性不育两 用系经多代自交而成，遗传性状稳定可育株与不育株分离比例为1 ：1 ，育性由一对等位 基因控制，遗传背景简单，是研究雄性不育机理的理想材料。前一阶段，在国家自然科学基 金委和浙江省科技厅的资助f ，本实验室利用m r n ad d p c r ( m r n ad j f i b r e n t i a ld i s p l a y ) 技 术和c d n a - a f l p ( c o m p i e m e m a r yd e o x y r i b o n u c l e i c a c i d a m p 】i n e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ) 技术分别与r a c e ( r a p i da m p i i 6 c a t l o no f c d n ae n d s ) 技术结合，从普通向菜( 口 c 口卅p p s 驴打s s p 幽加p m 5 妇( l ) m a k i n ov a r c o 卅埘抽t s e ne t l e e ) 核雄性不育两用系中成功分离得 到了与花粉发育相关的c 卯8 跚f 、b c 彳f 7 、占c m n 、b c m 乃和b c m ( y e “口f ，2 0 0 3 ；千永勤， 2 0 0 3 ) 。对其中的m 乃和& m 基因的r t _ p c r 分析表明，它们都只在普通白菜两用系可育 株系中蕾( 1 o 1 5m m ) 和大蕾( 25m m 以上到开花前) 中特异表达。但是，包括口c 扩，和 曰c m 在内的这些基因通过何种途径、何种机制影响花粉的发育尚未明了。 反义r n a 技术( h 锄i l l o n 甜口f ，1 9 9 0 ) 和r n a 干涉( r n ai n t e r f e r e n c e ，i u q a i ) 技术( f i r e 吖 d f ，1 9 9 8 ) 都能特异地使特定基因沉默，从而获得功能丧失或降低的突变，是基因功能研究的种 强有力的手段。为了进步了解占c 删 和b c 朋f ￥基因在白菜花粉发育中的功能，本研究在构建 反义技术和r n a i 植物表达载体后，利用它们将在可育株中高表达的口洲f 3 和丑c m 刖基因的片 段导入正常拟南芥和菜心( bc 硎p e 5 护妇s s p c 厅折e s o ( l ) m a l ( i n ov a r p 舢c 向f h 删s 捃( b a i l e y ) t s e n e tl e e ) 中，然后对转基因植株及其对照株之间的花粉形态进行观察，分析b c 懈i 和占c 朋基因 在植物花粉发育过程中的表达特性，以期为揭示白菜类等芸薹属作物雄性不育的分子机理提供重 要的理论和实验依据，为人为控制育性表现，迅速获得可供生产上利用的雄性不育系提供理论依 据和应削指导。 2 浙江大学博士学位论文白菜花粉发育相关基因丑c f 耶和删的转基因功能验证 1 文献综述 1 1 植物果胶甲酯酶的研究 果胶甲酯酶( e c3 1 1 1 1 ) ，英文名p e c t i nm e l hv l e